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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA SELVA

REPORTE DE ESTADÍA TITULADO “AISLAMIENTO DE BACTERIAS ACIDO

LÁCTICAS QUE CAUSAN AROMA Y SABOR DEL QUESO BOLA”, REALIZADO

EN LA CIUDAD DE OCOSINGO, CHIAPAS,

QUE PRESENTA LA

C. DAFNE ABIGAIL ALMARAZ CALVO.

COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TÍTULO DE:

TÉCNICO SUPERIOR UNIVERSITARIO EN PROCESOS ALIMENTARIOS

ASESOR EMPRESARIAL M. en B. ANTONIO MAGDIEL

VELAZQUEZ MENDEZ

ASESOR ACADÉMICO ING. ROBINSON MARCONI VAZQUEZ

VELAZQUEZ

REVISOR ACADÉMICO

ING. LIZBETH REYES LÓPEZ

OCOSINGO, CHIAPAS, AGOSTO DE 2012

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AGRADECIMIENTOS

“A Dios, que es la luz de la vida y de la superación”

“A la Universidad de Tecnológica de la Selva, por ser un instrumento para lograr una

carrera técnica y por brindarme lo necesario para culminar esta etapa en mi

preparación como profesionista”.

“A mi asesor, Ing. Robinson Marconi Vázquez Velázquez que con sus sabios

consejos e indicaciones me dono con cariño el maravilloso tesoro del saber sin

recibir nada a cambio”.

“A cada uno de los profesores, quienes me abrigaron con cariño y respeto,

brindándome conocimientos y experiencias, haciendo de mi una persona útil y

preparada”.

“A mis padres, quienes han sido el cimiento de lo que soy y seré en la vida, quienes

de manera desinteresada me brindan oportunidades para desarrollarme como

persona y profesionista, gracias”.

“A mis hermanas, por su apoyo incondicional y motivación, que me ha permitido

seguir adelante”.

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CONTENIDO

I. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 5

I.1 Conceptualización de la estadía ................................................................................................ 5

I.2 Contextualización ......................................................................................................................... 6

I.2.1 Localización geográfica de la empresa (nivel estatal y municipal) ............................... 6

I.2.2 Giro y tamaño de la empresa ............................................................................................. 9

I.2.3 Área de influencia (área específica de mercado) .......................................................... 10

I.2.4 Objetivos de la empresa .................................................................................................... 11

II. DESARROLLO ............................................................................................................................ 13

II.1 Marco referencial ...................................................................................................................... 13

II.1.1. Microeconomía de la empresa ....................................................................................... 13

II.1.2 Área motivo de estudio ..................................................................................................... 14

II.1.3 Desarrollo del Objetivo (solución a un problema). ...................................................... 14

II.2 Estado del arte .......................................................................................................................... 14

II.3 Materiales y métodos ............................................................................................................... 18

II.3.1 Preparación de las muestras para el análisis (Método de la AOAC) ........................ 18

II.3.2 Determinación de Grasa por el Método de Gerber ...................................................... 19

II.3.3 Determinación de Proteína por el método de Kjeldahl ................................................ 19

II.3.4 Determinación de cenizas ................................................................................................ 20

II.3.5 Determinación de Humedad ............................................................................................ 20

II.3.6 Obtención de las muestras .............................................................................................. 21

II.3.7 Procesado de las muestras ............................................................................................. 22

II.3.8. Aislamiento y selección de las posibles cepas ............................................................ 22

II.3.9 Características morfológicas de las cepas .................................................................... 23

II.3.10 Identificación bioquímica de las bacterias ácido lácticas .......................................... 25

II.3.11. El sistema API 50 CHL .................................................................................................. 25

II.4 Procesamiento de resultados, análisis y discusión. ........................................................... 28

II.4.1 Resultados bromatológicos .............................................................................................. 28

III. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................................................ 31

4

ANEXOS ............................................................................................................................................... 33

Anexo 1: Sepas aisladas ................................................................................................................ 33

Anexo 2 ............................................................................................................................................. 33

Resultados de API 50 CHL ........................................................................................................ 33

Anexo 3 ............................................................................................................................................. 34

Resultados del software ............................................................................................................. 34

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I. INTRODUCCIÓN

I.1 Conceptualización de la estadía

La estadía se refiere al tiempo en el que el estudiante permanece en una

organización ininterrumpidamente, aplicando conocimientos, habilidades y destrezas

adquiridas en los cuatrimestres anteriores cursados en la Institución, con el objetivo

de mostrar un panorama real a lo que el egresado se enfrentara al culminar un grado

académico y con miras, a obtener un trabajo, a fin con la carrera que eligió.

Realizar la estadía, implica responsabilidad y compromiso de el alumno, alumnos

deseosos de aprender y de aplicar sus propios conocimientos; como de la empresa

o institución donde laboren, mediante las facilidades que brinde para llevar a cabo

ideas, considerarlas o brindarlas; además de compartir experiencias para que el

alumno pueda adquirir conocimientos y por ultimo el apoyo que la Universidad

Tecnológica de la Selva brinda, que sin lugar a dudas el asignar un asesor para

cada alumno es fundamental, ya que juegan el papel de guías que resulta

fundamental para la realización de el proyecto.

El beneficio, resulta para todos los que forman parte; escuela, empresa y alumno.

Como escuela, permite evaluar si el aprendizaje fue significativo durante el periodo

de clases y practicas que se le impartió a la escuela; como empresa, la realización

de cada proyecto surge con el objetivo de ayudar mediante la mejora, detección de

problemas que permiten mejorar, hasta la innovación; y por ultimo y mas importante,

el alumno, se enfrenta a la vida real como profesionista, obtiene experiencia y

comienza abrir un panorama mayor, del área a la que quiere dirigirse.

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I.2 Contextualización

I.2.1 Localización geográfica de la empresa (nivel estatal y municipal)

Nivel Estatal

Chiapas, estado situado en el sureste de México, al este del istmo de Tehuantepec,

dentro de la región Pacífico Sur. Limita por el norte con el estado de Tabasco, por el

este con Guatemala (comparte la Frontera Sur), por el sur y sureste con el golfo de

Tehuantepec del océano Pacífico, y por el oeste con los estados de Veracruz y

Oaxaca. Ocupa el 8º lugar en el conjunto del país en cuanto a extensión territorial

que es de 75,634 km, representa el 3.8% de la superficie del país.

Chiapas se sitúa entre los paralelos 14º 32’ al sur y 17º 59’ de latitud norte y los

meridianos 90º 22’ al este y 94º 15’ de longitud oeste.

La Universidad Tecnológica de la Selva se encuentra ubicada en la ciudad de

Ocosingo, Chiapas. El municipio de Ocosingo es el más extenso del Estado y

actualmente el número 27 entre los municipios de mayor superficie en el país.

(Juarez, D. 2011)

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Fig. 1 Localización de la Universidad Tecnológica de la Selva en el municipio

de Ocosingo; Chiapas.

Fuente: modificado de http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ocosingo_-_Chiapas.PNG

Chiapas

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Nivel Municipal

La Universidad Tecnológica de la Selva se encuentra ubicada en la ciudad de

Ocosingo, Chiapas. Se localiza en la carretera Ocosingo –Altamirano, entronque

Tonina Km 0.5.

Fig. 2 Ubicación de la empresa a nivel Municipal (Fuente).

Fuente: INEGI, Abril 2011.

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I.2.2 Giro y tamaño de la empresa

La UT Selva en el que a través de la administración de sus recursos, del capital y del

trabajo, se producen bienes y/o servicios educativos tendientes a la satisfacción de

las necesidades de la comunidad estudiantil. De acuerdo a la prestación que brinda

esta casa de estudios indican que su giro pertenece a Servicios de educación pública

descentralizado donde el capital pertenece al Estado y generalmente su finalidad es

satisfacer las necesidades de carácter social en la cual se desarrollan actividades

que competen al Estado y que son de interés social, pero que está dotando

personalidad y patrimonio. (Juarez, D. 2011)

La Universidad Tecnológica de la Selva ha crecido enormemente durante los últimos

años, aumentando el números de empleados a 200 aproximadamente que elaboran

en esta institución y ascendió el número de estudiantes a 2,000 aproximadamente.

La Universidad Tecnológica de la Selva es una institución que oferta servicios

educativos de calidad, al estar evaluada, acreditada y certificada bajo la norma ISO

9001-2008.

La norma ISO 9001-2008 tiene como objetivo llegar a un consenso con respecto a

las soluciones que cumplan con las exigencias comerciales y sociales (tanto para los

clientes como para los usuarios). Esta norma se cumple de forma voluntaria ya que

la ISO, siendo una entidad no gubernamental. No cuenta con la autoridad para exigir

su cumplimiento. (Normas 9000, 2003).

En la actualidad la Universidad Tecnológica de la Selva imparte educación de nivel

superior de tipo tecnológico para formar técnicos superiores universitarios, ingenieros

técnicos e ingenieros competentes y comprometidos con el desarrollo

socioeconómico de la entidad.

La estructura organizacional de la Universidad contempla los siguientes

departamentos para la administrar eficientemente de sus recursos: Administración y

10

Finanzas, Vinculación, Planeación y Evaluación, Servicios Escolares, Servicios

Bibliotecarios, Sistema de Gestión de la Calidad, y Servicios Generales y control

patrimonial. Conjuntamente la gestión educativa se delega en cuatro divisiones:

División de Tecnologías de la Información, Carrera de Administración Área Empresas

Turísticas, Carrera de Administración y Evaluación de Proyectos y División de Agro-

alimentos. Con un total aproximado de 200 colaboradores, la Universidad.

I.2.3 Área de influencia (área específica de mercado)

El área de influencia de la Universidad Tecnológica de la selva Comprende cuatro

regiones económicas, con 28 municipios, a saber: I centro, II Altos, III Fronteriza y IV

Selva. Dentro de estas regiones económicas, se encuentran inmersos los siguientes

municipios: Venustiano Carranza, Altamirano, Amatenango del valle, Chalchihuitan,

Chamula, Chanal Chenalho. Huistán, La raizar, Mitoctic, Oxchuc, Pantelhó, Las rosas

San Cristóbal de las casa, Tenejapa, Teopisca, Zinacantan, Comitán; Las margaritas,

Chilón, Ocosingo, Palenque, Sabanilla, Sitalá, Tila, Tumbalá, Ya jalón y San Juan

Cancúc. Tiene 27,842.3 Km², que es 36% de la superficie Estatal.

Generalmente los alumnos que ingresan a la Universidad provienen de familias de

bajo y medio nivel; de las instituciones como: COBACH, CBTA, CECYT, CBTIS,

TELEBACHILLERATO, CEBACH Y Preparatorias Particulares. (Juarez, D. 2011).

Gracias a la certificación de la Universidad Tecnológica ha obtenido un gran auge en

la red nacional de Universidades Tecnológicas, logrando obtener importantes

terrenos en el campo laboral en todo el sureste mexicano y parte del centro. Por tal

motivo, muchos alumnos chiapanecos se brindan la oportunidad de estudiar en tan

reconocida Institución.

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I.2.4 Objetivos de la empresa

Objetivo general

Ofrecer a los egresados de nivel medio superior, servicios educativos de calidad

certificada, que aseguran el compromiso del personal docente, administrativo y

directivo para la mejora continua en la formación de Técnicos Superiores

Universitarios.

Objetivos específicos

Impartir una educación integral que aspire siempre a la excelencia en lo científico

y tecnológico complementando una formación humanística.

Mantener una vinculación con el sector productivo, que se dará desde la

incorporación del sector en el cuerpo de gobierno de la institución, hasta en la

determinación de requerimientos de empresas y organismos para la creación de

nuevas carreras, programas de investigación y educación continua.

Conservar relaciones armónicas con el sector económico, público y social,

procurando una participación constante y permanente mediante la aportación de

alternativas de solución a sus problemas, a través de sus funciones sustantivas y

de acuerdo a su capacidad y recursos.

Adoptar estructuras administrativas, académicas y jurídicas que le permitan

realizar sus funciones con eficiencia y eficacia, y que le permitan adecuarse a los

requerimientos del momento histórico que vive.

Planear a corto, mediano y largo plazo, serán instrumentos que siempre guiarán

las acciones y actividades de la Universidad.

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Tomar en cuenta el principio de excelencia académica, ofreciendo oportunidad de

formación a los jóvenes, sin importar su condición económica, política o social, sin

más limitaciones que la capacidad derivada de sus recursos de profesores y

planta física.

Ser un reto permanente para sus administradores el mantener el equilibrio

financiero, revisando anualmente las cuotas fijadas para la prestación de

servicios, logrando la participación de los Gobiernos Federal y del Estado de

Chiapas, e incentivando la colaboración del sector productivo.

Misión

Formar Técnicos Superiores Universitarios de excelencia, comprometidos con el

desarrollo socioeconómico de le Entidad mediante la presentación de servicios

educativos de la calidad certificada.

Visión

Ser una institución de excelencia en la Formación de Técnicos Superiores

Universitarios creativos y emprendedores, que promuevan el desarrollo rural del

Estado de Chiapas.

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II. DESARROLLO

II.1 Marco referencial

II.1.1. Microeconomía de la empresa

La Universidad Tecnológica de la Selva es una institución educativa de carácter

público y, gracias a esta ultima característica a recibido durante estos últimos años

una gran cantidad de apoyos por parte de tanto el gobierno federal como estatal.

Esto ha dado como resultado el desarrollo rápido e impresionante de esta

universidad, tanto en estructura y calidad, educativa catapultándola a ser la máxima

casa de estudios de la región selva de Chiapas, así como una de las principales en

todo el estado.

Por otra parte, la Universidad tecnológica de la Selva tiene una gran cantidad de

convenios firmados que la vinculan con muchas empresas y universidades tanto a

nivel estatal, nacional e internacional.

Todas estas razones le dan nuestra universidad una gran competitividad con la cual

puede competir con muchas otras universidades de todo el país y la coloca como

una de las principales a nivel estatal

14

II.1.2 Área motivo de estudio

Debido a que el queso bola producido en Ocosingo posee características propias que

lo diferencian de otros productos lácticos; surge la idea de aislar las bacterias lácticas

que intervienen en su maduración y son causantes de su propio sabor y aroma; así

mismo, continuar con el estudio de este producto y brindar información necesaria

para posteriores trabajos.

II.1.3 Desarrollo del Objetivo (solución a un problema).

Actualmente el queso de bola de Ocosingo presenta características sensoriales

singulares debido al proceso de maduración que sufre el queso por 21 días, con la

presente investigación se lograra identificar las bacterias ácido lácticas que causan el

aroma y el sabor al queso.

II.2 Estado del arte

El queso de bola de Ocosingo es un producto característico del municipio de

Ocosingo, Chiapas. El proceso de elaboración de este derivado lácteo es herencia

de conocimientos ancestrales que le confieren características particulares pero que

también han dado lugar a la creación de una amplia gama de sabores, formas y

tamaños. La producción actual de este producto se lleva a cabo a nivel artesanal, a

partir de leche sin pasteurizar, sin la adición de cultivos iniciadores, la maduración

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ocurre por un proceso natural a temperatura ambiente y en frío, consta de dos

partes: una interna de queso crema madurado y una externa o forro doble de pasta

hilada.

El queso de bola de Ocosingo es un queso con identidad propia, producido en

Ocosingo Chiapas México de manera artesanal, este queso presenta características

distintivas debido a la calidad de la leche y a las condiciones climáticas de la región

que ayudan a diferenciar la flora microbiana presente en cada una de las etapas de

elaboración del queso, incluyendo la maduración el queso crema a los 21 días.

Como la mayoría de los quesos artesanales, el queso “bola de Ocosingo” se elabora

con leche cruda lo cual conlleva el riego potencial de desarrollar enfermedades como

brucelosis, botulismo, tuberculosis, (CDC, 2005) u otras asociadas a lácteos no

pasteurizados. Pese a que hace más de 15 años se publicó la Norma Oficial

Mexicana 121-SSA1-1994, donde se establece que la elaboración de cualquier

queso debe llevarse a cabo con leche pasteurizada; solo recientemente se ha puesto

gran interés en esta actividad, bien por cumplir las regulaciones sanitarias o con

miras a comercializar los productos en otros países donde tienen gran aceptación,

como lo es el mercado de los EU donde para 2004 se fabricaron 142 millones de

libras de queso estilo hispano (Van Hekken et al., 2006). La principal razón para

continuar fabricando queso sin pasteurizar la leche es que, al realizar este proceso

en la leche las características organolépticas del queso de bola de Ocosingo se

modificarían (Centeno et al., 1996; Méndez et al., 1998).

Es indudable entonces que la pasteurización de la leche es una etapa que se debe

tener como un punto crítico de control (PCC), para asegurar que los

microorganismos patógenos presentes sean destruidos, sin embargo para esto debe

contarse con cultivos o fermentos lácticos, que puedan desarrollarse en forma rápida,

para que por competencia puedan reducir los posibles microorganismos indeseables,

además de conferir las características propias del producto, tales microorganismo

son conocidos como iniciadores y se definen como preparaciones que contienen

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microorganismos vivos aplicados con el objeto de hacer uso de su metabolito

microbiano (Hammes, 1990), estos cultivos están constituidos por bacterias ácido

lácticas y principalmente pertenecientes a los géneros Lactococcus, Lactobacillus y

Leuconostoc. La primera y principal función de estos es la formación de ácido

orgánicos, tanto no volátiles como el ácido láctico y volátiles principalmente el ácido

acético (Cox, 1997).

BAL (Bacterias Ácido Lácticas)

El término bacterias lácticas engloba a un grupo heterogéneo de microorganismos

cuya característica definitoria es la producción de ácido láctico a partir de la

fermentación de azúcares. Las bacterias lácticas se han venido utilizando

inadvertidamente durante miles de años para la producción de alimentos tales como

queso y yogur. Sin embargo, no fue hasta mediados del siglo XIX cuando Louis

Pasteur demostró que la producción de ácido láctico en fermentaciones se debía a la

acción de microorganismos (fermentos lácticos). El aislamiento y obtención de un

cultivo puro de Bacterium lactis por Joseph Lister marcó el inicio del estudio

microbiológico de las bacterias lácticas. En 1900 Henry Tissier aisló de las heces de

un lactante la primera bifidobacteria a la que llamó Bacillus bifidus. Se trataba de un

organismo Gram positivo y productor de ácido láctico por lo que en la primera

clasificación se incluyó con las bacterias lácticas. En 1917 Winslow propuso la familia

Lactobacillaceae para agrupar bacterias con los siguientes rasgos: bacilos Gram

positivos, a menudo largos y delgados, inmóviles, no esporulados, comúnmente

producen ácido láctico a partir de azúcares, pueden producir gas (dióxido de

carbono), no producen hidrógeno, ocasionalmente termófilos, difícilmente cultivables

en medio gelificado incubado en atmósfera microaerófila. Dentro de esta familia se

incluía Bacillus bifidus.

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Clasificación de las BAL

La clasificación de las BAL en géneros diferentes es basada en principio en la

morfología, modo de fermentación de la glucosa (homofermentativas y

heterofermentativas), el crecimiento a diferentes temperaturas, la configuración del

ácido láctico producido habilidad para crecer a alta concentración de sal y tolerancia

ácida o alcalina. En la naturaleza existen los siguientes géneros: Aerococcus,

Alloinococcus, Carnobacterium, Dolosigranulum, Enterococcus, Globicatella,

Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus,

Stresptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus y Weisella (Axelsson, 1998; Carr y

col., 2002).

Características de Lactobacillales

Las bacterias lácticas propiamente dichas pertenecen a 19 géneros distribuidos en 6

familias dentro del orden Lactobacillales. Forman un grupo muy heterogéneo de bajo

contenido en G+C dentro del filo Firmicutes. La mayor parte de estas bacterias

comparten el hecho de ser bacilos o cocos Gram-positivos, catalasanegativos

(aunque en algunos casos pueden presentar una actividad pseudocatalasa),

anaerobios facultativos, microaerófilos o aerotolerantes, desprovistos de citocromos,

no esporulados, acidófilos o acidotolerantes, de metabolismo quimioorganotrofo y

estrictamente fermentativo produciendo ácido láctico como principal producto final de

la fermentación de azúcares. Los géneros con morfología celular esférica, o cocoide

“cocos” son entre otros, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus o

Streptococcus, con número de especies limitado, y el género que reúne mayor

número de especies, Lactobacillus, se caracteriza por la forma de bastoncillo

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“bacilos”. actualidad son más de 100 las especies que han sido descritas como

pertenecientes al género Lactobacillus y se encuentra en continuo aumento.

La principal característica del metabolismo de las bacterias lácticas es la

fermentación de los azúcares, siendo su producto final, en la mayor parte de los

casos, el ácido láctico. Pueden fermentar hexosas como glucosa, manosa, galactosa

o fructosa utilizando la llamada "vía homofermentativa", en la que el único producto

final es ácido láctico, o la "vía heterofermentativa" en la que, además de ácido

láctico, se forman etanol (o ácido acético) y CO2. La utilización de una u otra vía

depende de la presencia de los enzimas que intervienen en la transformación del

azúcar en ácido, la fructosa-1,6-bifosfato-aldolasa en el primer caso, y una

fosfocetolasa, en el segundo.

Los productos derivados del metabolismo de las bacterias lácticas tienen un papel

decisivo y les confieren sus características distintivas a gran variedad de alimentos

tales como yogur, queso y otros productos lácteos fermentados, encurtidos,

etc.

II.3 Materiales y métodos

II.3.1 Preparación de las muestras para el análisis (Método de la AOAC)

Los quesos fueron llevados al laboratorio y en ese momento se procedió a la

preparación de las muestras: Cortar una capa del forro para dejar expuesto el queso

crema, marcando un triangulo, sacar el queso crema de todo el triangulo, vaciando

hasta el fondo del queso. Partir en trozos pequeños con cuchillo. Se homogeneizo la

muestra y se procedió a realizar el análisis bromatológico proximal.

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II.3.2 Determinación de Grasa por el Método de Gerber

Se tapa por la parte estrecha el butirometro para queso; se le añaden 15 ml del ácido

sulfúrico y agua a 40°C hasta formar una capa de 6 mm de espesor sobre el ácido.

Se pesan 3 g de queso en el tubo que tiene un tapón y se inserta en el butirometro;

se añade 1 ml de alcohol isoamilico y se añade más agua hasta 5 mm debajo del

borde del butirometro, se mezcla hasta la disolución de la muestra y se coloca en

un baño de agua a 65°C durante 10 minutos. Se saca y centrifuga a 1100 rpm; se

regresa al baño 5 minutos y se lee el porcentaje de grasa en la columna graduada.

II.3.3 Determinación de Proteína por el método de Kjeldahl

Pesar exactamente sobre un papel tarado 5 gramos de la muestra seca o húmeda,

se dobla el papel cuidando no tirar su contenido se pasa al fondo del matraz kjeldahl

seco. Se le agregan proporcionalmente 0.1 a 0.5 g de sulfato cúprico como

catalizador; de 10 a 70 ml de ácido sulfúrico concentrado y de 3.3 a 25 g de sulfato

de potasio para elevar el punto de ebullición del ácido e impedir que se pierda

rápidamente por el calentamiento. Se coloca el matraz en un dispositivo para la

eliminación de gases o en un campana; se calienta al principio lentamente y después

enérgicamente, girándolo ocasionalmente, se continua calentando hasta su oxidación

completa, punto donde la mezcla forma un sólido incoloro o una solución de color

azul claro. Es necesario extraer la grasa antes de la digestión. Terminada la digestión

se deja enfriar el matraz kjeldahl, se le añade aproximadamente 200 ml de agua y

algunos cuerpos de ebullición, una gota de fenolftaleina y un poco de antiespumante.

Llevar a cabo la destilación de la mezcla hasta que una gota del destilado no cambie

el papel tornasol rojo. Valorar el destilado por titulación y calcular la cantidad de

proteína presente en el queso.

20

II.3.4 Determinación de cenizas

Se determina por calcinación de la muestra en mufla según el método de la AOAC.

Se puso a peso constante un crisol o cápsula de porcelana por cada muestra que se

analizo, lo cual significo dejarlo durante 15 minutos en la mufla a una temperatura de

550° a 600°C y se dejo enfriar el crisol en un desecador durante 15 a 20 minutos.

Posteriormente, se peso el crisol en balanza analítica y se registro el dato.

Sobre un crisol se pesaron 1-2 gramos de la muestra, la cual fue preincinerada ;

exponiéndola a la flama del mechero de bunsen y posteriormente se incinero la

muestra en la mufla precalentada entre 550° y 600°C durante 2 horas. Por ultimo, se

peso el crisol con cenizas.

% de Cenizas en base seca = P3 – P1 *100

P2 – P1

P1 = Peso de la cápsula

P2 = Peso de a muestra

P3 = Peso de cápsula con muestra calcinada

II.3.5 Determinación de Humedad

Por determinación de materia seca según el método de la AOAC

Se puso a peso constante una charola de aluminio y se registró el peso,

posteriormente se pesaron de 3-4 gr de muestra sobre la charola en una balanza

analítica y se puso a secar la muestra a 120°C durante 2 horas.

21

Al transcurrir el tiempo, se sacaron las muestras y se dejaron enfriar dentro de un

desecador durante 10 minutos, se realizo la primera pesada y así sucesivamente

hasta alcanzar peso constante.

Al finalizar se calculo el % de humedad mediante la siguiente fórmula:

P2 – (P3 – P1) X 100 = % de Humedad

P2

En donde:

P1 = Peso de charola

P2 = Peso de muestra

P3 = Peso de muestra seca + crisol

II.3.6 Obtención de las muestras

Las muestras de queso bola de Ocosingo fueron obtenidas en las empresas

productoras de Queso de Bola Ocosingo (Queso de Doble Crema):

Quesos La Regional

Quesos Santa Rosa

Una vez obtenidas las muestra, adecuadamente identificadas y acompañadas de las

fichas correspondientes, se procedió a su envío en condiciones controladas de

refrigeración hasta el laboratorio de Microbiología de la Universidad Tecnológica de

la Selva para su posterior análisis.

22

II.3.7 Procesado de las muestras

1. De las muestras a analizar se pesaron sobre un vidrio de reloj asépticamente 10 g

y se homogenizaron en 90 mL de citrato de sodio (pH 8.75) al 2% (Fitzimons et

al., 1999).

2. Se realizaron diluciones seriadas hasta 10-8 y se sembraron por duplicado en

placas Petri conteniendo medios selectivos para bacterias ácido lácticas

(dilusiones, 10-5, 10-6, 10-7 y 10-8: medio MRS (Alvarado et al., 2007) para

Lactobacillus incubada a 37°C y agar M17 (Alvarado et al., 2007) para

Lactococcus incubado a 25°C, con la técnica de vaciado en placas, (hasta 5

días).

3. Las colonias seleccionadas se sembraron en caldo (siembra por picadura) MRS

para Lactobacillus o Elliker para Lactococcus incubándose a 37°C por 24 h.

4. Posteriormente, al obtener resultados (Anexo 1), las bacterias fueron aisladas

mediante siembras por el método de estría cruzada y se formo una colección de

12 cepas de Bacterias Ácido Lácticas.

II.3.8. Aislamiento y selección de las posibles cepas

A partir de las cepas aisladas de las muestras de leche y de queso de bola se

procedió a la selección en base a su pureza de las placas específicas para este

género de bacterias.

23

II.3.9 Características morfológicas de las cepas

Las pruebas iniciales podemos diferenciales en:

Observación macroscópica de las colonias.

Tinción de Gram.

II.3.9.I Observación macroscópica de la colonia

Las colonias pueden ser diferenciadas con base a las características morfológicas a

partir de cultivos puros.

En la tabla N° 1 características a considerar en la diferenciación de una colonia

bacteriana.

No CARACTERISTICAS OBSERVACIONES

1 FORMA Puntiforme, circular, irregular, alargada, fusiforme,

filamentosa, rizoide.

2 TAMAÑO Estimar el diámetro en mm (pequeña, mediana,

grande)

3 SUPERFICIE Lisa, granulosa, filamentosa, ondulaciones.

4 ELEVACION Aplanada, elevada, pulvinada, convexa, embonada,

umbilicada

5 BORDE Continuo, ondulado, lobulado, erosionado, festonado,

filamentoso.

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6 FORMA DE

CRECIMIENTO

Filiforme, punteada, espinosa, arborescente,

granulosa, rizoide.

7 COLORACION

Según sea observado por la luz reflejada o por la luz

transmitida, puede ser blanco, amarillo, rojo ladrillo,

anaranjado, etc.

8 OPACIDAD Transparente, opaca, etc.

9 CONSISTENCIA Dura, viscosa, membranosa, gelatinosa, mucosa, etc.

Se determina mediante el asa de Nicrom

II.3.9.2 Tincion de Gram

1. Se extiende una colonia bacteriana sobre un cubreobjetos con una gota de agua

y se fija en la llama.

2. Se realiza la tinción con el primer colorante (violeta de genciana) y se deja en

contacto 1 minuto. Se lava con agua, eliminando el exceso de colorante.

3. Se añade lugol y se mantiene en contacto durante 1 minuto. Nuevamente se lava

con agua y se trata con alcohol – acetona.

4. Posteriormente se añade safranina durante 1 minuto (colorante de contraste). Se

seca a calor suave y se procede a la observación bajo microscopio óptico.

El fundamento radica en las diferencias estructurales de la pared celular de ambos

grupos bacterianos. Las bacterias Gram positivos tienen una gruesa capa de

peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram negativas tienen una

capa de peptidoglicano más fina y una capa de lipopolisacarida externa.

25

Al añadir alcohol –acetona se arrastrara el colorante sólo en las Gram negativas,

mientras que en las Gram positivas queda retenido y las células permanecerán de

color violeta. Las células Gram negativas se teñirán de color rosado por el colorante

de contraste utilizado (safranina).

II.3.10 Identificación bioquímica de las bacterias ácido lácticas

Todas las cepas seleccionadas fueron transferidas al medio de cultivo, MRS con

campana de Durham para cepas del genero Lactobacillus y M17 con tubos Durham

para cepas del genero Lactococcus, se incubaron a 30°C por 48 h, para evaluar la

formación de burbujas, que fueron considerados como positivos a la formación de

CO2.

II.3.11. El sistema API 50 CHL

Este sistema fue usado para la identificación bioquímica de Lactobacillus.

Principio

La galería API 50 CH esta compuesta por 50 microtubos y permite el estudio de la

fermentación de substratos pertenecientes a la familia de hidratos de carbono y

derivados (heterosidos, polialcoholes, ácidos uronicos).

Durante el periodo de incubación, la fermentación se traduce en un cambio de color

en el tubo debido a una producción de ácido en anaerobiosis revelada por el

26

indicador de pH del medio elegido. El primer tubo, sin principio activo, sirve como

testigo negativo.

Preparación de las galerías

Cada galería esta constituida por 5 filas conteniendo cada una 10 tubos numerados

Preparar una cámara de incubación

Anotar la referencia de las cepas

Repartir unos 10 mL de agua destilada o desmineralizada en los alvéolos el

fondo para crear una atmósfera húmeda.

Sacar cada una de las filas de su embalaje, separar en dos las filas 0-19 y 20

-39 y colocarlas en el fondo de la cámara de incubación

Completar la galería con la fila 40 – 49.

Preparación del Inóculo

Cultivar el microorganismo sobre un medio adecuado para su crecimiento.

Verificar la pureza de la cepa, mediante la diferenciación correspondiente a su

morfología colonial.

Tomar este cultivo mediante escobillon en un medio sólido, o mediante la

centrifugación en un medio liquido.

Preparar e inoculo en el medio apropiado, la suspensión debe ser utilizado de

inmediato.

27

Inoculación de las galerías

Repartir la suspensión bacteriana con la ayuda de una pipeta estéril en los 50 tubos

de la galería teniendo en cuenta las precauciones siguientes:

Inclinar ligeramente hacia delante la cámara de incubación.

Evitar a formación de burbujas apoyando la punta de la pipeta en el borde de la

cúpula.

Cuando solo se inocule el tubo, no rebasara el límite superior del mismo con el fin

de conservar una buena anaerobiosis.

Cuando el tubo y la cúpula deban llenarse completamente, evitar la formación de

un menisco cóncavo o convexo.

Incubar las galerías a la temperatura óptima de crecimiento del grupo de

microorganismos estudiado: 30°C, 37°C, 55°C.

Lectura e interpretación

La lectura de las galerías se realiza con tiempos de incubación definidos (24 h 48 h)

dependiendo del microorganismo y del tipo de reacción estudiada. (Anexo 2)

Interpretación

Interpretar cada resultado positivo (+), negativo (-), dudoso (?) y anotarlo en la hoja

de resultados. (Anexo 3)

28

II.4 Procesamiento de resultados, análisis y discusión.

II.4.1 Resultados bromatológicos

Tabla No. 2: Composición del Queso de Bola de Ocosingo

MUESTRA HUMEDAD (%) CENIZA (%) GRASA (%) PROTEINA (%)

QUESO SANTA ROSA

1° 33.86 2.08 38.86 21.56

2° 34.03 2.01 38.73 21.62

QUESO REGIONAL

1° 34.47 2.13 38.65 20.86

2° 34.09 2.02 38.21 20.74

En la tabla se presenta la composición del queso crema, parte interior del queso

Bola Ocosingo. La muestra corresponde a 2 productores principales de este

queso en el municipio de Ocosingo Chiapas.

Los resultados se aprecian variaciones mínimas entre una muestra y otra esto se

debe a la materia prima obtenida en las queserías proceden de diferentes tipos

de ranchos y razas de vacas.

II.4.2 Resultados microbiológicos

II.4.2.1 Observación macroscópica

Tabla No. 3: Morfología colonial

Nombre Forma Superficie Elevación Borde Forma de

crecimiento Color Opacidad Consistencia

Qs 1 Circular Lisa Convexa Entero Puntiforme Amarillo Opaca Gelatinosa

Qs 2 Circular Lisa Convexa Entero Puntiforme Beige Opaca Gelatinosa

Qs 3 Circular Lisa Convexa Entero Puntiformes Amarillo Opaca Gelatinosa

Qr 1 Circular Lisa Convexa Entero Puntiformes Amarillo Opaca Gelatinosa

Qr 2 Circular Lisa Convexa Entero Puntiformes Amarillo Opaca Gelatinosa

29

En la tabla 3 se presentan los resultados de las sepas seleccionadas en base a

su pureza y mayor diferenciación entre una y otras, con el objetivo de identificar el

mayor numero de bacterias diferentes.

II.4.2.2 Observación microscópica y formación de gas:

Tabla No. 4

Nombre Forma Afinidad Gram Formación de gas

Qs1 Cocos Dudoso (+)

Qs2 Bacilos Dudoso (+)

Qs3 Bacilos Dudoso (+)

Qr1 Bacilos Dudoso (+)

En la tabla 4 se presentan los resultados que se le realizo a cada sepa

seleccionada con anterioridad.

La morfología y la formación de gas debido a la fermentación de carbohidratos

realizada por las bacterias, nos da pauta a continuar con las pruebas bioquímicas,

para su identificación final; sin embargo, el resultado de la tinción no es el

esperado, ya que deberían teñirse de color violeta y la coloración que presentaron

no fue tal cual; pudiéndose deber a la calidad de los reactivos con que se realizo

la tinción (caducidad y/o pureza).

II.4.2.3 Resultado en API 50 CHB

Nombre Nombre de bacteria

Qs1 Perfil inaceptable

Qs2 Lactobacillus plantarum

Qs3 Lactobacillus acidophilus

Qr1 Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii

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Los resultados en el API 50 CHB, permitieron identificar error en la tinción, ya que

el crecimiento de las bacterias se dio en el lapso establecido, obteniendo

resultados positivos de los sustratos fermentados por las bacterias ácido lácticas.

El perfil inaceptable que nos refleja el API 50 CHL en el Qs1, se debe a que la

pureza de la colonia seleccionada no es del 100%; ya que, refleja dentro de las

galerías resultados positivos en lugar de negativos

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III. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Las bacterias ácido lácticas son las responsables del aroma, sabor y textura del

queso de Bola de Ocosingo debido a la lipolisis y proteólisis en los componentes del

queso.

Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus delbrueckii ssp

delbrueckii son las BAL presentes en el queso bola de Ocosingo.

Realizar un cultivo iniciador para agregarlo a la leche si se quiere realizar un queso

de Bola de Ocosingo con leche pasteurizada.

Recomendaciones

Es necesario mencionar que para corroborar la identificación de las especies antes

mencionadas, deberá realizarse la identificación mediante técnicas moleculares.

32

BIBLIOGRAFÍA

Anderson, P., & Hannesen, G. (s.f.). Agar Culture medium for lactic acid streptoccoci

and lactobacilli.

Aznar, R., & Zúñiga, M. (s.f.). Dpt. Biotecnología de Alimentos, Instituto de

Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA-CSIC). Recuperado el 2012, de

http://redbal.iata.csic.es/documentos/sabiasque/Que%20son%20las%20bacter

ias%20lacticas.pdf

Mayeux, J. (1999). European Food Information Council. Recuperado el 2012, de

http://www.eufic.org/article/es/nutricion/alimentos-funcionales/artid/bacterias-

acido-lacticas/

Pérez Lamela, C., Simal Lozano, J. Á., Simal Gándara, J., & Cano González, M.

(s.f.). Análisis Bromatológicos. Recuperado el 2012, de

http://www.usc.es/caa/MetAnalisisStgo1/PROGRAMA.htm

Ramírez Ramírez, J. C., Rosa Ulloa, P., Velázquez González, M. Y., Ulloa, J. A., &

Arce Romero, F. (2011). ISSN 2007 - 0713. Recuperado el 2012, de

http://fuente.uan.edu.mx/publicaciones/03-07/1.pdf

Solorzano García, R. (2010). Los Alimentos. Recuperado el 2012, de

http://alimentos.org.es/queso-bola

Vázquez Velazquez, R. M., Vázquez Solis, R., & Castellanos Ruiz, A. (s.f.).

Recuperado el 10 de Junio de 2012, de

http://www.utselva.edu.mx/pai/8/5/16.4%20DENOMINACION%20DE%20ORI

GEN%20DEL%20QUESO%20DE%20BOLA%20DE%20OCOSINGO.PDF

Walstra , P., Geurtz, T. J., Normen, A., Jallema, A., & Van Boelkel. (2001). Ciencia de

la leche y tecnología de los productos lácteos. España: Acribia S.A.

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ANEXOS

Anexo 1: Sepas aisladas

Anexo 2

Resultados de API 50 CHL

Medio M17

Muestra Qs1

Medio M17

Muestra Qs2

Medio MRS

Muestra Qr1

Qs1 Qs2

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Anexo 3

Resultados del software

Qs3 Qr1

Qs2

35

Qs3

Qr1