RESPUESTA INMUNE INNATA FRENTE A INFECCIONES BACTERIANAS: SU FUNCIÓN EN LA DEFENSA Y EN LA PATOGÉNESIS DE LA SEPSIS Jacquelin, María Josefina* y Basso, Beatríz ** RESUMEN El síndrome séptico es una causa importante de morbilidad y mortalidad, con una letalidad promedio de 40%, que se incrementa más allá del 60% en pacientes con shock séptico. El sistema inmune innato es la primera línea de defensa contra microorganismos invasivos y es activado cuando un patógeno cruza las barreras de defensas naturales del huésped. Instantáneamente los componentes celulares (fagocitos) y solubles (vía alterna del complemento) de este sistema inducen una respuesta defensiva. La unión de estructuras conservadas del patógeno a receptores de superficie celular, activa a los fagocitos a eliminar al microorganismo y a liberar mediadores inflamatorios como citoquinas. Si la bacteria resiste a este ataque inicial, pasa a sangre, donde induce una inflamación sistémica caracterizada por una activación masiva de macrófagos del sistema retículo-endotelial y leucocitos circulantes, liberación de citoquinas, expresión de moléculas de adhesión en células endoteliales y desarrollo de hipotensión. Si esto no es rápidamente controlado, la inflamación sistémica puede progresar a sepsis, shock séptico y falla multiorgánica. Uno de los principales logros para entender la patogénesis de la sepsis ha sido reconocer el rol principal del sistema inmune innato en la defensa contra microorganismos invasivos. El objetivo del presente trabajo es describir cómo las bacterias desencadenan las funciones del sistema inmune innato en la defensa del huésped. Localizando la atención en el rol que juegan los productos bacterianos (endotoxinas, pared celular de bacterias gram positivas), proteínas de fase aguda, receptores y citoquinas en la patogénesis de la sepsis. La terapia de la sepsis y shock séptico debería estar centrada en mantener la homeostasis, erradicar las bacterias y restaurar el balance entre la respuesta proinflamatoria y antiinflamatoria. Palabras Clave: sepsis- inmunidad- bacterias Laboratorio de Bacteriología. Servicio de Neonatología del Hospital Universitario de Maternidad y Neonatología. Fac. Cs. Médicas. UNC. Santa Rosa 1045. 5000 Córdoba

INTRODUCCIÓN

El síndrome séptico es una causa importante de morbilidad y mortalidad, con una letalidad promedio de 40%, que se incrementa más allá del 60% en pacientes con shock séptico. La piel, el tracto digestivo, el tracto respiratorio alto, órganos urogenitales externos y conjuntiva, están conectados al “ambiente externo” y contienen bacterias comensales que no causan enfermedad. En particular, el tracto intestinal contiene billones de bacterias, que como Escherichia coli contribuyen a la función de los intestinos. De la misma manera, bacterias como Lactobacillus acidophilus son involucrados en el mantenimiento del ambiente ácido de la vagina, mientras que el objetivo de bacterias como Staphylococcus epidermidis en la piel, es la defensa contra la invasión de microorganismos por la producción de varias sustancias bactericidas. Los microorganismos patógenos así como los comensales inducen una respuesta inmune si ellos, o sus constituyentes, pasan la barrera entre el medio externo e interno normalmente estéril. Después del reconocimiento de la bacteria o de sus productos, el organismo lanza un ataque, mata a la bacteria y repara el daño producido. En este síndrome, la respuesta inflamatoria sistémica es iniciada por la liberación de componentes microbianos, incluyendo endotoxinas, peptidoglicanos ácido teicoico y varias exotoxinas. Esta secuencia de eventos es altamente regulada, permitiendo al organismo combatir la infección a través de un ataque que es agresivo para erradicar la bacteria pero no tan violento como para causar un daño innecesario al huésped. En sangre, las bacterias o productos bacterianos producen una inflamación sistémica caracterizada por una activación masiva de macrófagos en el sistema reticuloendotelial y de leucocitos en circulación, liberación de citoquinas, moléculas de adhesión expresadas en células endoteliales y desarrollo de hipotensión. La consecuencia de esta inflamación sistémica puede

progresar a sepsis, shock séptico y falla multiorgánica. (Fig.1) (1,2) La principal función del sistema inmune es proteger al huésped contra microorganismos patógenos, tradicionalmente ha sido dividido en inmunidad innata e inmunidad adquirida. Las principales diferencias entre ambas respuestas son los mecanismos y los tipos de receptores usados para el reconocimiento antigénico (3). Es importante mencionar que constantemente se describen nuevos factores, moléculas y proteínas con diversas propiedades inmunológicas, las cuales son producidas por células consideradas como parte del sistema de defensa del huésped. Asimismo, los mecanismos de regulación de las citoquinas y su posible aplicación en la medicina clínica permanecen aún por esclarecer, por lo cual el estudio de las citoquinas y sus efectos se mantiene como un campo amplio de investigación.

El objetivo de este trabajo es estudiar los diferentes componentes bacterianos, su interacción con los componentes del sistema inmune innato a través de receptores, activación celular y producción de citoquinas pro y anti- inflamatorias generadas a partir de esa interacción, que contribuyen a la defensa del huésped y a la patogénesis de la sepsis. Además conocer nuevas estrategias terapéuticas para el manejo del paciente séptico.

MICROORGANISMOS

FIG.1. Representación esquemática de las defensas del huésped contra las infecciones. Los microorganismos patógenos invasivos atraviesan la barrera epitelial y mucosa del huésped e instantáneamente el mismo prepara un a respuesta inmune innata defensiva formada por componentes solubles (vía alterna del complemento, lectinas que fijan manosa) y componentes celulares (fagocitos). La unión de patrones moleculares asociados al patógeno (PAMPs) a los receptores de superficie celular activa a los fagocitos y eliminan al microorganismo. La liberación de mediadores inicia la respuesta inflamatoria. La mayoría de las veces el sistema inmune innato elimina al microorganismo. Pero si el patógeno resiste al ataque inicial, puede causar sepsis severa o shock séptico. La persistencia del patógeno gatilla la respuesta inmune adaptativa con activación de linfocitos T y B.

INFECCIÓN POR BACTERIAS. INMUNIDAD INNATA Y ESPECÍFICA

Las principales células del sistema inmune innato (SII) son los macrófagos/monocitos, polimorfonucleares, neutrófilos, eosinófilos, mastocitos y células NK (natural killer). Las principales moléculas secretadas o de membrana producidas por estas células e implicadas en la función del SII son: 1- moléculas circulantes: proteína C reactiva (PCR), proteína amiloide sérica (PAS), proteína que fija manosa (PFM), proteína que fija lipopolisacárido (PFL), CD14s (soluble), factor 3 del complemento (C3). 2- Moléculas receptoras de membrana: receptores manosa del macrófago, DEC-205, receptores “scavenger” (tipo I y II, MARCO), CD14, receptores del complemento (CD35-CR1, CD21-CR2 y CD11b, CD18-CR3). Todas estas moléculas tienen como funciones estimular la fagocitosis, fijar glúcidos, glucolípidos, aumentar la depuración de bacterias por los macrófagos (en sus diferentes variantes tisulares, como las células de Kupffer) y monocitos de la sangre. Algunas moléculas, como DEC-205, fijan los componentes mencionados, ubicados principalmente en las cápsulas y membranas bacterianas, sobre las células dendríticas (4).

Las principales células del sistema inmune específico (SIE) son los linfocitos B y T (Th y Tc) y las CPA. Las moléculas solubles de este sistema son los anticuerpos específicos (Igs) y las citoquinas, las cuales son también muy importantes en el SII. Las principales moléculas de membrana son los receptores del linfocito B (BCR), los del linfocito T (TCR) y los antígenos de histocompatibilidad (CMH). En todas las células se han reconocido casi 200 moléculas solubles o de membrana diferentes (clasificadas

COMPLEMENTO FAGOCITOS MEDIADORES

SOLUBLES

SHOCK SÉPTICO

PATÓGENOS

RESPUESTA INMUNE ADQUIRIDA

RESPUESTA INMUNE INNATA

en general como CD1,2.). Muchas de ellas participan directamente o indirectamente en el SI (4).

En la inmunidad específica, los receptores reconocen a los microorganismos infecciosos e identifican antígenos propios y del medio. En cambio, en la inmunidad natural, los receptores reconocen estructuras altamente conservadas presentes en los microorganismos. Estas estructuras se conocen con el nombre de patrones moleculares asociados al patógeno, en inglés PAMPs. Los ejemplos más conocidos de PAMPs son: LPS (lipopolisacáridos) bacterianos, PGN (peptidoglicano), ALT (ácidos lipoteicoicos), mananos, DNA bacteriano, RNA y glucanos. Aunque estas estructuras son químicamente diferentes, todos los PAMPs tienen un punto en común:

1. Los PAMPs son producidos solamente por microorganismos patógenos, y no por sus huéspedes. Por ejemplo el LPS es sintetizado sólo por bacterias; los receptores que reconocen a estos patrones, reconocen al LPS, por lo que alertan al huésped de la presencia del microorganismo infeccioso.

2. Las estructuras reconocidas por el SII son esenciales para la sobreviva o patogenicidad del microorganismo.

3. Los PAMPs son estructuras usualmente invariables compartidas por diferentes clases de microorganismos, y por lo tanto, el receptor del huésped que reconoce patrones de LPS, puede detectar la presencia de virtualmente todas la bacterias gram negativas infectantes (3).

Después de la identificación del microorganismo, los receptores activan una cascada de eventos intracelulares resultando en la producción de moléculas efectoras incluyendo mediadores proinflamatorios como las citoquinas. Las señales producidas por la inmunidad inespecífica, controlan aspectos de la inmunidad específica.

Los mecanismos de las respuestas inmune innata y adquirida forman un sistema integrado de defensa del huésped, en el cual numerosas células y moléculas funcionan colectivamente. La respuesta inespecífica temprana es un factor de suma importancia, influye en el tipo de respuesta específica que se desarrollará subsecuentemente

(4). De igual manera, la inmunidad adquirida puede intervenir durante la inmunidad natural. Los fagocitos mononucleares son importantes participantes en ambas interacciones. Después de haber ingerido al patógeno, los macrófagos respondedores durante una reacción de inmunidad innata, actúan como células presentadoras de antígenos (CPA), en este sentido los macrófagos tienen un importante papel en el secuestro y procesamiento antigénico. La CPA expresa péptidos de ese microorganismo procesado a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) clase II que se encuentra sobre su superficie y expresa además moléculas co-estimoladoras. Ambas señales son requeridas para la activación de la célula T helper. De esta manera, los macrófagos y la célula T helper activada liberan ciertos tipos de citoquinas que controlan los componentes de la respuesta inmune adaptativa como la activación de linfocitos T citotóxicos, linfocitos B, etc. Mientras, las células T y B producen citoquinas tales como el IFN-γ, con la finalidad de incrementar las funciones microbicidas de los macrófagos. Por lo tanto, la interrelación entre la inmunidad natural y la específica es bidireccional y está mediada en gran parte por las citoquinas (5).

SEPSIS Y SHOCK SÉPTICO

Durante los años 70 Lewis Thomas popularizó la teoría de que la sepsis es más una incontrolada respuesta defensiva del huésped que un efecto directo de los microorganismos. Tal afirmación cobra fuerza hoy en día una vez que numerosas investigaciones ponen de manifiesto que un gran número de mediadores humorales y de productos celulares están involucrados en esta exagerada respuesta sitémica (6).

La activación de células en respuesta a la bacteria o sus componentes de pared resulta en la liberación de mediadores inflamatorios, como citoquinas, prostaglandinas, mediadores lipídicos y especies oxidantes. Estos componentes inducen vasodilatación y aumento de la expresión de las moléculas de adhesión, resultando en la extravasación de neutrófilos y monocitos; activación de leucocitos, linfocitos y células endoteliales; y supresión miocárdica. Junto a la estimulación de la coagulación por citoquinas, los componentes bacterianos pueden interactuar directamente con el sistema de coagulación. El resultado es la coagulación intravascular

diseminada que causa hipoperfusión e hipoxia y junto al daño causado por células fagocíticas intra y extravasculares, conducen a falla orgánica. Puede iniciarse así, el estado letal de sepsis, en el cual la falla multiorgánica, involucra principalmente pulmón (síndrome de diestrés respiratorio), hígado y riñón (7). Además la hipoperfusión causada por coagulación intravascular diseminada puede dañar la mucosa intestinal y como resultado de eso trasladar bacterias a los nódulos linfáticos mesentéricos y bajo condiciones de estrés, a varios órganos y a la circulación. La liberación de las bacterias alimentará aún más la falla multiorgánica y empeorará el pronóstico. Si la sepsis persiste, hay un cambio hacia un estado antiinflamatorio inmunosupresor. Esta es una de las razones por lo cual la estrategia antiinflamatoria falla como terapia de sepsis (8). Los pacientes con sepsis se caracterizan por inmunosupresión, que incluye pérdida de la hipersensibilidad tardía, incapacidad para actuar frente a la infección y predisposición a las infecciones nosocomiales. Por lo tanto, el tipo de respuesta inmunológica está determinado por muchos factores, incluyendo la virulencia del microorganismo, tamaño del inóculo y condiciones de base del paciente como estado nutricional, edad, y polimorfismo en los genes de citoquinas u otras moléculas inmunoefectoras (6).

Hay marcada diferencia en la respuesta frente a bacterias gram positivas y gram negativas. Todas las bacterias gram negativas contienen lipopolisacáridos (LPS) en su pared, como su mayor determinante patogénico. Las bacterias gram positivas contienen un importante número de componentes de pared inmunogénicos, además de exotoxinas. La respuesta inmunológica frente a bacterias gram negativas involucra principalmente a leucocitos y la producción de citoquinas como factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), interleuquina-1(IL-1), e IL-6. La liberación de exotoxinas, muchas de las cuales son superantígeno, por bacterias gram positivas activan células T, resultando así en una respuesta celular diferente y diferencias en el perfil de citoquinas, con relativamente bajos niveles de TNF-α, IL-1 e IL-6, pero incrementados niveles de IL-8. (9)

EPIDEMIOLOGÍA

Por sepsis, cada año mueren más de 135.000 pacientes en Europa y 215.000 pacientes en Estados Unidos. A pesar de contar con mejores

medios de soporte en las unidades de cuidados intensivos la mortalidad por shock sigue siendo muy alta y la incidencia de bacteriemias y sepsis hospitalarias en los últimos años se ha incrementado. La sepsis severa es una amenaza vital, que compromete más de 18 millones de personas al año a nivel mundial, lo que equivale aproximadamente a 1.400 personas fallecidas por día, cifra equivalente a la población total de Dinamarca, Finlandia, Irlanda y Noruega juntas. En tres estudios distintos, la proporción de infecciones debido a bacterias gram negativas varió entre un 30 y un 80 % y las infecciones por bacterias gram positivas entre 6 y 24 % del total de números de casos de sepsis. (10). Sin embargo, la contribución de bacterias gram positivas a la sepsis se ha incrementado, y al principio de la década del 90 fue superior al 50% de todos los casos de septicemia con Staphylococcus aureus y S. epidermidis como responsables de más de la mitad de los casos de sepsis por bacterias gram positivas (2). El incremento en el grado de septicemia, probablemente se deba al incremento del uso de catéteres y otros instrumentos invasivos, por quimioterapia, y por inmuno-supresión en pacientes transplantados. La mortalidad por sepsis y shock varía desde el 20 al 80% de los casos, y la misma está relacionada con la severidad de la sepsis así como también con la enfermedad de base del paciente que siempre está presente (9,11).

DEFINICIONES

El diagnóstico de sepsis sigue siendo eminentemente clínico si bien se están desarrollando diferentes marcadores que permitan un diagnóstico precoz de estos pacientes y diferenciar los síntomas de otros procesos inflamatorios sistémicos no infecciosos. Ya en 1992 en un intento de identificar precozmente a los pacientes que presentaban un alto riesgo de desarrollar sepsis, el American College of Chest Physicians / Society of Critical Care Medicine llevaron a cabo un consenso para intentar definir los diferentes estadios de infección, bacteriemia, Síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis, sepsis severa, shock séptico, síndrome de disfunción multiorgánica. A pesar de todo, en la práctica clínica, algunos de sus conceptos han sido cuestionados (12) (Tabla I).

Tabla I. Definición de Sepsis.

Critical Care Medicine Consensus Conference*

Síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS) Taquicardia > 90 latidos por min. Taquipnea > 20 respiraciones por minuto o PaCo2 < 32 mmHg Fiebre > 38ºC o hipotermia < 36ºC Leucocitos en sangre > 12.000 células/mm3 o < 4.000 células/mm3 o > 10% en bandas

Sepsis SRIS con infección documentada

Sepsis Severa Sepsis más

Disfunción orgánica

Acidosis metabólica PaO2 < 75 mmHg o PaO2/FiO2 < 250 Oliguria: < 30 ml/h (3 h) o 700 ml/24 h Coagulopatía: TP prolongado, descenso de un 50% de las plaquetas, plaquetas < 100.000 × 109 Encefalopatía: GCS < 14 Hipotensión

Shock séptico Sepsis severa con hipotensión durante al menos una hora a pesar de la fluidoterapia.

Síndrome de disfunción multiorgánica Incapacidad de un paciente en shock séptico de mantener su homeostasis sin ayuda.

(*)American College of Chest Physician/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference. Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. Chest. 1992.101. 1644-1655

1.

Infección es un fenómeno microbiano que se debe a la invasión de los tejidos estériles por microorganismos y/o la respuesta inflamatoria consecuente con la presencia de microorganismos.

2. Bacteriemia-fungemia se entiende, como la existencia de hemocultivos positivo a una bacteria-hongo, y esta terminología hace referencia estrictamente a un criterio microbiológico. La bacteriemia polimicrobiana es también un criterio microbiológico y se define por la existencia de hemocultivos positivo a dos o más bacterias. Su frecuencia varía entre el 5 y el 22% del conjunto de bacteriemias.

3. Síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) representa la variante severa de

la inflamación. No es un término que indique una etiología en concreto y se puede deber tanto a la infección como a otras causas que puedan desencadenar una inflamación generalizada por ejemplo: pancreatitis, isquemia, traumatismo, shock hemorrágico, autoinmunidad o la administración de inmunomoduladores. Es una apreciación eminentemente clínica y se caracteriza por la presencia de dos o más de las siguientes manifestaciones clínicas detalladas en Tabla I. (12).

4. Sepsis es la activación inflamatoria sistémica infecciosa aguda. Indica un síndrome de toxicidad sistémica grave. Se debe a la respuesta inflamatoria del sistema inmune del huésped frente al estimulo antigénico microbiano y no al

efecto directo del microorganismo invasor. Por tanto, no es preciso aislar al microorganismo para hablar de sepsis (45% al 50% de los pacientes presentan hemocultivos positivos), pero sí es necesario tener evidencia de la infección (fiebre o hipotermia, hipotensión, taquicardia, fenómenos cutáneos mucosos de CID (coagulación intravascular diseminada), trombocitopenia, etc.) (12).

5. Sepsis severa es una sepsis asociada con disfunción orgánica, anormalidades de la perfusión o hipotensión dependiente de la sepsis y que responde a la adecuada administración de líquidos (12).

6. Shock séptico, se entiende, como la presencia de sepsis acompañada de una deficiente perfusión tisular, lo cual se traduce clínicamente por una presión arterial sistólica inferior a 90 mm de Hg o un descenso de 50 mm de Hg en un paciente con hipertensión establecida, por oliguria inferior a 20 ml hora ó 400 ml en 24 horas, por un pH inferior a 7,25 o por un descenso de nivel de conciencia a pesar de la adecuada reanimación con fluidos (12).

7. Síndrome de disfunción multiorgánica (MODS) se define como la presencia de alteraciones de diferentes órganos en un paciente enfermo en el cual la homeostasis no puede mantenerse sin medidas extraordinarias. En un primer lugar el MODS es el resultado directo de la agresión y la disfunción orgánica ocurre de inmediato y es directamente atribuible a la misma. Posteriormente el MODS se desarrolla como consecuencia de la respuesta del huésped y se identifica en el contexto del SIRS (12).

El shock endotóxico implica un criterio patogénico, y hace referencia a los efectos de la endotoxina de las bacterias gram-negativas como mediadoras del desarrollo del shock.

COMPOSICIÓN DE LA ENVOLTURA CELULAR BACTERIANA

La mayor parte de las bacterias producen una envoltura celular que incluye la membrana plasmática, la pared celular y las proteínas y los polisacáridos asociados. Algunas bacterias producen cápsulas o cubiertas mucosas. La pared celular es una estructura rígida que contiene y protege a la bacteria del daño físico y de condiciones de baja presión osmótica externa. La

estructura y la naturaleza química de las envolturas se correlacionan con el hecho de que una bacteria se coloree como gram negativa, gram positiva o que sea ácido-alcohol resistente. Los tres grupos de microorganismos presentan diferencias como la presencia de una membrana externa en las bacterias gram negativas, la que no aparece en las bacterias gram positivas o en las ácido-alcohol resistente, y por la presencia en estos dos últimos grupos de polisacáridos ligados al peptidoglicano, que no se observa en las células gram negativas (13). (Fig. 2). El LPS de bacterias gram negativas y otros componentes de pared celular bacteriana como PGN, ALT, LAM (lipoarabinomananos) y DNA bacteriano son factores microbiológicos implicados en el inicio de la respuesta inmune (14). Se describe a continuación los distintos componentes de la pared celular bacteriana y luego la interacción de los mismos con los componentes del SII. Esta interacción puede ser significativamente diferente en lo que respecta a los factores involucrados, bacterianos y del huésped

FIG.2. Estructura de la pared celular de las bacterias. Todas las bacterias contienen una membrana celular rodeada por una capa de Peptidoglicano (PGN). Los Ácidos lipoteicoicos (ALT) y Lipoarabinomananos (LAM) están insertos en la membrana celular. El Lipopolisacárido (LPS) forma la parte externa de la membrana externa de las bacterias gram negativas. Las micobacterias también contiene una capa de PGN, pero no todas las bacterias presentan cápsula. Microbiología y Parasitología. USAL. Universidad del Salvador. Directora científica: Alicia Farinati.

LIPOPOLISACÁRIDO. (LPS)

Estructura. La pared celular de las bacterias gram negativas está compuesta por tres capas, las cuales incluyen: membrana interna y externa que envuelven a una delgada capa de peptidoglicano.

La membrana externa es una estructura trilaminar que se diferencia en su composición química de la membrana citoplasmática, ya que presenta en su capa externa lipopolisacáridos. Estas moléculas se encuentran cargadas negativamente y se unen de forma no covalente con cationes divalentes. Esto estabiliza a la membrana y provee una barrera para moléculas hidrofóbicas. El desplazamiento de los LPS por antibióticos policatiónicos como polimixinas, aminoglucósidos o agentes quelantes, vuelven a la membrana externa más permeable a grandes moléculas hidrofóbicas. El LPS se encuentra sólo en bacterias gram negativas (1). E.coli contiene aproximadamente 3.5 X 10 6. Otros componentes de la membrana externa son glicerofosfolípidos y proteínas (por ejemplo: proteínas porinas como OmpA en E.coli) que se encuentran en la capa interna de la membrana externa, algunas de las cuales están firmemente asociadas con las moléculas del LPS. El LPS es un componente esencial de la pared celular, no es tóxico cuando está incorporado dentro de la membrana externa, pero liberado de la pared celular, su parte tóxica, el lípido A, es expuesto a las células inmunes y así evoca una respuesta inflamatoria. El LPS y otros constituyentes de pared son liberados desde las células bacterianas cuando estas se multiplican pero también cuando se mueren o se lisan (15).Varios factores endógenos como proteínas bactericidas y el complemento, pueden causar desintegración de la bacteria y así la liberación del LPS. Además, es conocido que algunos antibióticos liberan el LPS de la bacteria.

La molécula de LPS consiste en tres regiones diferentes: el lípido A, el núcleo polisacárido y el polisacárido O específico. (Fig. 3) (16). La primera parte y esencial es el lípido A. Seis o más residuos de ácidos grasos están unidos mediante uniones éster amina a un disacárido compuesto por N-acetilglucosaminafosfato. Cuatro de éstos ácidos grasos contienen un grupo hidroxilo en el carbón tres, mientras que los otros dos no están hidroxilados. El disacárido está unido al núcleo polisacárido a través de KDO (cetodesoxioctonato). Entre los ácidos grasos que se hallan habitualmente en el lípido A están el ácido caproico, láurico, mirístico, palmítico y esteárico. Distintas experiencias con lípido A sintético han mostrado que esta porción de la molécula del LPS es responsable de las actividades endotóxicas.

El núcleo polisacárido es similar en todas las bacterias gram negativas y está compuesto

principalmente de N-acetilglucosamina, glucosa, galactosa, heptosa, fosfato y etanolamina. Las cuales están unidas por medio del KDO al disacárido del lípido A.

El polisacárido O específico está formado por una secuencia de azúcares que es altamente variable. Está unido al núcleo y consta generalmente de galactosa, glucosa, ramnosa y manosa, todos ellos azúcares de 6 átomos de carbono. Estos azúcares están unidos entre sí formando secuencias de cuatro o cinco unidades que a menudo se hallan ramificados. La repetición de estas secuencias de azúcares da lugar a la formación del polisacárido O.

La estructura exacta del lípido A y de los componentes del polisacárido varía según la especie de bacterias gram negativas de que se trate. Si bien, la secuencia de los elementos principales (Lípido A-KDO-Núcleo polisacárido-Polisacárido O específico) es por lo general uniforme. El Polisacárido O específico cambia mucho según la especie por lo que allí reside la especificidad serológica (17).

FIG.3. Estructura del Lipopolisacárido de bacterias gram negativas. KDO, cetodesoxioctonato; HEP, heptosa; GLU, glucosa; GAL, galactosa; GluNac, N-acetilglucosamina; GlcN, glucosamina. Brock Biología de los microorganismos, 8º ed. Mitigan, Martinko, Parker. Ed. Printice Hall.

ÁCIDOS LIPOTEICOICOS Y TEICOICOS.

Estructura. Muchas bacterias gram positivas contienen considerables cantidades de ácidos teicoicos (AT) y ácidos lipoteicoicos (ALT) en la pared celular. Las moléculas son polímeros solubles en agua. Contienen residuos de ribitol o glicerol unidos a través de enlaces fosfodiéster y transportan uno o más aminoácidos o azúcares sustituyentes. La unidad repetida puede ser glicerol, unidos por enlaces 1,3 o 1,2, o por ribitol, unidos por enlaces 1,5. Pueden ocurrir uniones

más complejas en las cuales glicerol o ribitol se une a residuos azúcares como glucosa, galactosa, o N-acetilglucosamina. El número de unidades repetidas varía ampliamente, dependiendo de las especies, de la cepa, de las condiciones de crecimiento pero generalmente varían entre 4 y 30 para S.aureus (13). El aminoácido sustituyente más común es D-Alanina, usualmente se une en la posición 2 o 3 del glicerol o posición 3 o 4 del ribitol o se une a uno de los residuos de la azúcar. Diferentes especies pueden tener uno o más tipos de azúcares sustituyentes. El AT está covalentemente unido al peptidoglicano, participando en la adhesión bacteriana y el ALT está covalentemente unido a la membrana glicolípidica, anclando la pared celular a la membrana (1).

El ALT se asemeja al LPS de bacterias gram negativas, por lo tanto es considerado la contrapartida del LPS (2). (Fig 4) El ALT es esencial para el crecimiento bacteriano. Está involucrado en la regulación de la concentración de Ca 2+ y Mg 2+ en la pared celular y en la regulación de la actividad de las enzimas autolíticas. Varias condiciones pueden llevar a la liberación de los ALT desde la pared celular, incluyendo la presencia de ciertos antibióticos (7).

Fig 4. Estructura del Ácido lipoteicoico de S.aureus. Ala: alanina. Clin.Microbiol.Rev. July 2003, p.379-414.

PEPTIDOGLICANO

Estructura. Debido a la estructura del peptidoglicano (PGN), la pared celular de las bacterias gram positivas y gram negativas es rígida, por lo que protege a las bacterias contra la ruptura osmótica. El PGN de las bacterias gram positivas está formado por 50 a 100 moléculas de espesor representando el 90% de la pared, mientras que la pared celular de las bacterias gram negativas está formada por una o dos moléculas de espesor, constituyendo sólo el 10% de la pared

(13). El PGN es un heteropolímero de largas cadenas de polisacárido, en donde dos azúcares N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico están alternados en forma lineal. La cadena péptidica que incluye a L-alanina, D-alanina, D-glutámico y lisina o en otros casos ácido diaminopimélico (DAP), está unida a cada ácido N-acetilmurámico. Estos componentes se unen entre sí para formar una estructura que se repite a lo largo de la pared y que se llama tetrapéptido del glicano. La estructura básica del PGN está constituida por una fina lámina en la que las cadenas de azúcares se conectan entre sí por puentes, formados por aminoácidos. Los enlaces glucosídicos que unen los azúcares en las cadenas de glucano son muy fuertes, pero estas cadenas por si solas no son capaces de conferir rigidez. De ahí que solo cuando se entrecruzan a través de puentes peptídicos se logra la rigidez característica de la pared. En las bacterias gram negativas los puentes se establecen por lo general mediante enlaces peptídicos directos del grupo amino del DAP y el grupo carboxilo de la D-alanina terminal. En bacterias gram positivas habitualmente se establece mediante el enlace de varios aminoácidos cuyo número y tipo dependen de los diferentes organismos. En S. aureus, el puente está formado por cinco glicinas conectadas por enlaces peptídicos (17). (Fig. 5). La inhibición de la síntesis del PGN es el objetivo principal de varias clases de antibióticos, incluyendo: Penicilinas, Cefalosporinas y Glicopéptidos.

Fig. 5. Estructura de una de las unidades repetitivas integrantes del peptidoglicano de la pared celular: el glicano -tetrapéptido. NAG: N-acetilglucosamina. NAM: N-acetilmurámico. Microbiología y Parasitología. USAL. Universidad del Salvador. Directora científica: Alicia Farinati.

INTERACCIÓN ENTRE PRODUCTOS BACTERIANOS, PROTEÍNAS

PLASMÁTICAS Y RECEPTORES DE CÉLULAS INMUNES

Tan pronto como la bacteria entra al cuerpo, esta confronta con dos líneas celulares de defensa: una línea humoral y una línea celular. Los factores humorales comprenden complemento, anticuerpos y proteínas de fase aguda. En la línea de defensa celular, las células mononucleares (monocitos y macrófagos) y los neutrófilos son de gran importancia ya que estas células pueden reconocer constituyentes de pared celular bacteriana directa o indirectamente después de que anticuerpos o el complemento se unan a la bacteriana o a sus constituyentes (opsonización). Normalmente, las células inmunes están expuestas continuamente a bajos niveles de LPS derivados de bacterias gastrointestinales que pasan a sangre a través de la vena porta. Estos LPS son captados por los macrófagos y pueden ser esenciales para mantener al sistema inmune bajo un nivel basal de atención (18).

BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

El LPS y otros componentes bacterianos son reconocidos por anticuerpos, y el complemento, produciendo la opsonización y la lisis de la bacteria. Los fagocitos (monocitos, macrófagos y leucocitos polimorfonucleares (PMN)) son capaces de reconocer componentes bacterianos opsonizados a través de receptores Fc de la Ig G (Inmunoglobulina G) y del complemento. Además expresan receptores que reconocen componentes bacterianos. En la respuesta del huésped a la bacteria los fagocitos mononucleares son de mayor importancia. El reconocimiento del LPS y de otros componentes bacterianos por estas células, inician una cascada de liberación de mediadores inflamatorios, cambios vasculares y reclutamiento de células inmunes. Un macrófago activado por LPS, se vuelve activo metabólicamente y produce depósitos intracelulares de radicales libres de oxígeno y otros agentes microbicidas (lisozima, proteínas catiónicas, hidrolasas ácidas y lactoferrina) y secretan mediadores inflamatorios (19). Uno de los principales mediadores secretados es el Factor de necrosis tumoral – alfa (TNF-α). Esta después de la exposición al LPS, es la primera citoquina liberada por los macrófagos. El RNAm de TNF-α se transcribe constitutivamente en células de Kupffer, permitiendo una rápida liberación después del desafío inflamatorio.

La liberación de TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, factor activador de plaquetas (PAF), eicosanoides, produce un profundo efecto sobre el tejido circundante (20). Las anafilotoxinas, C3a y C5a derivadas del complemento y varios de estos mediadores inflamatorios atraen PMN desde la circulación y los activan. La extravasación de PMN es posible por la vasodilatación y el aumento de la expresión de moléculas de adhesión en células endoteliales, PMN y macrófagos (21). Los PMN reaccionan a éste estímulo por agregación intravascular, adherencia al endotelio, diapédesis y la producción de mediadores inflamatorios como, leucotrienos B4, FAP (21). Los PMN activados expresan CD14, CD11/CD18, y varios receptores del complemento y receptores para la porción Fc de la Ig G y por lo tanto están capacitados para reconocer y fagocitar LPS, fragmentos bacterianos y bacterias completas.

Los PMN producen una serie de agentes microbicidas, como lisozima, proteína inductora de permeabilidad/bactericida (PIP), enzimas y radicales libres de oxígeno. Estos agentes son usados para la muerte lisosomal de los microorganismos. No obstante, la adherencia de los PMN a las células endoteliales y la presencia de altas concentraciones de estímulo puede también resultar en la liberación de agentes microbicidas; muchos de los daños endoteliales observados en la sepsis son causados por estos agentes (4).

Los mecanismos por el cual al LPS activa a las células e inicia la respuesta inflamatoria fueron explicados recientemente. El CD14 y la PFL son los principales mediadores de la activación de las células inflamatorias (22, 23,24). CD14 no es una proteína de transmembrana, por lo que una molécula de transmembrana era necesaria para explicar la estimulación celular mediada por el complejo LPS-PFL y CD14 unido a membrana. Los receptores Toll (TLR4) funcionan como componentes de transmembrana y traducen las señales enviadas por el LPS. Después de la activación de la cascada de señales se transcriben las citoquinas codificadas en los genes (25,26). Las células endoteliales o epiteliales responden al LPS a través del receptor CD14 soluble estimulándolas a liberar citoquinas a circulación. Los mediadores inflamatorios secretados por poblaciones de células diferentes atraen y activan linfocitos T y B. Además, la liberación de mediadores como IL-2, Interferon – gama (IFN- γ), Factor estimulante de colonias granulocítica-macrófago (GM-CSF), están involucrados en la

proliferación y activación de más células mononucleares. La acción de las células inmunes activadas combinada con los efectos de los mediadores inflamatorios causan síntomas como fiebre, daño endotelial, derrame capilar, dilatación vascular periférica, desordenes en la coagulación, microtrombos y depresión miocárdica. Este fenómeno puede resultar finalmente en fallo multiorgánico, shock y muerte (6).

BACTERIAS GRAM POSITIVAS

En comparación con el LPS, se conoce relativamente poco acerca de la acción del ALT in vivo e in vitro. Contrario a las bacterias gram negativas, donde el LPS es la porción biológicamente activa, en bacterias gram positivas; los ALT, PGNs y exotoxinas son altamente relevantes con respecto a la respuesta inmunológica (27). El ALT y el PGN son capaces de inducir la liberación de óxido nítrico (NO), IL-1, IL-6, y TNF-α por monocitos y macrófagos y activar la muerte oxidativa (28). Las bacterias gram positivas pueden causar sepsis por dos mecanismos: el primero por producción de endotoxinas y el segundo por estimulación de la respuesta inmune a través de mecanismos similares a los identificados en la sepsis por gram negativos. La sepsis por bacterias gram positivas difiere de la sepsis por bacterias gram negativas, en que las primeras, a menudo provienen de la piel, heridas, tejidos blandos y catéteres más que de fuentes genitourinaria o entérica. Además, los microorganismos gram positivos, requieren de una respuesta inmune altamente orquestada, con muerte intracelular por neutrófilos y macrófagos (27). Esto no es el caso de los patógenos gram negativos, los cuales pueden ser eliminados rápidamente en el espacio extracelular por anticuerpos y el complemento (29).

Las exotoxinas pueden actuar como superantígenos, las cuales son potentes moléculas proteicas que estimulan células T, producidas por S. aureus y S. pyogenes. Estos superantígenos son capaces de inducir síndrome de shock tóxico y pueden algunas veces causar falla multiorgánica (30). Los superantígenos son moléculas bifuncionales que interactúan con al menos dos receptores expresados en diferentes células, CMH clase II de la CPA (célula presentadora de antígeno) y cadenas Vβ del receptor de las células T, y forman un complejo trimolecular (31,32). Esta interacción trimolecular conduce a una liberación descontrolada de numerosas citoquinas pro-inflamatorias, especialmente INF-γ y TNF-α.,

las cuales son las causantes del síndrome de shock tóxico (33).

Las bacterias gram positivas presentan, además otros componentes inmunogénicos de pared celular, como PGN y ALT (11,27). Los ALT presentan actividad biológica que median la inducción de citoquinas como IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 y otras moléculas activadas en la inflamación. En estudios experimentales en ratas, la administración de ALT causa la liberación de TNF-α, producción de óxido nítrico sintetasa y falla circulatoria. La patogénesis mediada por los ALT puede variar entre las especies bacterianas. El PG de S.aureus induce la transcripción del RNAm de IL-6 e IL-10 en monocitos y células T. A diferencia de los ALT, el PG de S.aureus no induce la liberación de óxido nítrico. Pero la coadministración de ALT y PG resulta en un incremento de cuatro veces en la producción de óxido nítrico que lo liberado por los ALT solos (1).

El CD14, el principal receptor del LPS, también reconoce componentes bacterianos como ALT. Los ALT pueden actuar sinérgicamente o como antagonista del LPS (34). El PG de bacterias gram positivas también se une al CD14, sugiriendo que este receptor está involucrado en la inducción de citoquinas en la infección por gram positivas (35,36). Estudios utilizando líneas celulares transfectadas con receptores Toll (TLR2) y factor nuclear de transcripción NF-κB luciferasa o macrófagos deficientes en el receptor TLR2, mostraron que el mismo está implicado en la respuesta a bacterias gram positivas (Staphylococos sp., Streptococos sp., Listeria

monocytogenes) y a componentes de las mismas: PGNs, ALT. Se observó una interesante cooperación entre los receptores TLRs, llamados TLR2 y TLR6 necesarios para el reconocimiento del PGN en los macrófagos murinos. Ambos receptores son requeridos para la inducción de NF-κB luciferasa y producir TNF-α en respuesta a bacterias gram positivas y PGNs. Los ratones con deleción en el gen TLR6 son resistentes a la estimulación con PGN, indicando que dicho receptor es crítico para la respuesta frente al PGN. Por el contrario, el reconocimiento de lipopéptidos bacterianos requiere sólo de TLR2 o en combinación con otro TLR distinto a TLR6 (37,38,39). Además de estar involucrado en la respuesta celular a bacterias gram positivas, TLR2 media la respuesta del huésped contra varios microorganismos incluyendo: micobacterias, micoplasmas, espiroquetas y levaduras. También

TLR2 está implicado en la respuesta inmune innata hacia lipoproteínas y lipopéptidos microbianos y componentes de pared celular de micobacterias como lipoarabinomananos (40,41).

EL SISTEMA COMPLEMENTO

Está constituido por una serie de enzimas proteolíticas que interactúan y funcionan como un efector inmunológico de la respuesta inflamatoria aguda (13). Estas enzimas pueden ser activadas a través de 3 vías distintas: clásica, alterna o properdina y MASP (ver receptores del SSI). Cada una de las cuales se activa en presencia de microorganismo o constituyentes de pared celular bacteriana como: antígeno O, cápsula, LPS, lípido A y ALT. La activación del complemento sobre la superficie celular da como resultado alteraciones funcionales y estructurales de la membrana que conducen a la muerte de la célula. Durante la activación secuencial del complemento se inician una serie de episodios biológicos que facilitan la localización y destrucción del microorganismo por las células efectoras. La vía clásica es activada por el complejo antígeno-anticuerpo generados por el huésped ante una exposición previa. La vía alterna es dependiente de una glicoproteína plasmática, properdina, la cual junto con receptores y un grupo de cofactores (factor B, D, H e I), reconocen directamente al microorganismo, guiados por la interacción entre el factor B y la superficie del microorganismo. La vía MASP es activada por el receptor lectina que une manosa de la superficie microbiana (42).

Los efectos de la activación de la cascada del complemento por cualquiera de las tres vías son:

1. Activación de C3b, el cual se une al microorganismo y lo opsoniza para su posterior fagocitosis por neutrófilos y macrófagos.

2. Generación de C3a y C5a agentes vasoactivos y quimioatractivos. Ellos incrementan la permeabilidad vascular, aumentan la expresión de moléculas de adhesión en células endoteliales y neutrófilos, y atraen y activan a estos fagocitos. Además activan a granulocitos basófilos que liberan sustancias vasoactivas como histamina, facilitando la invasión de los fagocitos (21,43).

3. La inserción del complejo de ataque de membrana (CAM) C5-C9 dentro de la superficie celular, llevando a la lisis de la bacteria. El CAM tiene una superficie externa relacionada con los

lípidos, y un centro hidrofílico a través del cual pasan libremente los iones. De este modo, la inserción del CAM altera el equilibrio osmótico y químico.

Durante la infección, las células hepáticas (hepatocitos) son estimuladas por TNF-α, IL-1 e IL-6 a producir proteínas de fase aguda. Estas proteínas son: proteínas C reactiva, proteína amiloide sérica A y P , proteína que fija LPS (PFL), hemopexina, haptoglobina, C3 y C9 del complemento, glicoproteína ácida α -1, α 2-macroglobulina y algunas proteínas inhibidoras de proteasas. Algunas de las proteínas de fase aguda, como PFL, modulan la respuesta inmune por activación de fagocitos y células presentadoras de antígeno, pero básicamente la respuesta de fase aguda se produce para aliviar los daños causados durante la infección. La albúmina es considerada una proteína de fase aguda negativa, ya que su producción es mínima durante la inflamación (42).

Como se ha mencionado anteriormente, los macrófagos juegan un rol esencial en la respuesta celular al LPS. El sistema reticuloendotelial consta de macrófagos titulares especializados responsables de la respuesta primaria frente a microorganismos en la mayoría de los tejidos. Ellos tienen por objetivo erradicar al microorganismo invasor (lisis, fagocitosis) y prevenir la diseminación del microorganismo o sus componentes tóxicos al resto del organismo. Se ha demostrado también, que los macrófagos son capaces de remover endotoxinas y bacterias de la circulación linfática y sanguínea y responden a esa unión con producción de mediadores inflamatorios. Las células del sistema reticuloendotelial adquirieron característica específica de tejido, por lo cual, hay diferencias de respuesta frente al LPS. Durante el desafío con LPS, ALT, u otros componentes bacterianos, los macrófagos liberan una serie de mediadores inflamatorios como; TNF-α, IL-1, IL-6, eicosanoides, factor activador de plaquetas ( FAP), óxido nítrico (NO) y reactivos del oxígeno. No solamente, el LPS, el ALT y el PG en sus formas libres, sino también bacterias vivas o muertas pueden inducir la liberación de TNF-α (44). Los mediadores lipídicos, eicosanoides y FAP, liberados por macrófagos y células hepáticas tiene funciones importantes. Además de sus funciones vasoactivas, las prostaglandinas PGE1-2, inhiben la transcripción del RNAm del TNF-α en macrófagos, resultando en un período largo de inhibición de la liberación del mismo. El último

grupo de productos liberados en respuesta al LPS son las especies reactivas del oxígeno. La activación de los macrófagos y PMN por componentes bacterianos y por TNF-α y otros mediadores inflamatorios induce la producción de O2

-, H2O2 y otros productos microbicidas potentes. Si bien, estos componentes son responsables de la muerte de los microorganismos fagocitados, frente a altas concentraciones del activador se liberan a circulación y causan daño tisular. El óxido nítrico (NO) es un producto microbicida que es producido por macrófagos, células endoteliales y hepatocitos. Una vez secretado, este es rápidamente convertido a nitratos y nitritos. Además de su efecto bactericida, el NO causa vasodilatación, daño endotelial, daño hepático e inhibición de la producción de proteínas de fase aguda (45).

Un estudio in vitro con macrófagos esplénicos y células de Kupffer, mostró que los macrófagos esplénicos producen más significativamente TNF-α vía inducción por LPS, que las células de Kupffer. Además, Lichtman y colaboradores, mostraron que hay grandes diferencias entre las vías de activación de ambos tipos celulares. Mientras la respuesta de los macrófagos esplénicos es dependiente del CD14, las células de Kupffer lo hacen a través de una vía CD14 independiente. La vía de ingreso del LPS al organismo también puede hacer variar la respuesta inmune. Asari y colaboradores demostraron que los niveles máximos y la cinética de liberación del TNF-α después de la inyección vía intraperitoneal (i.p.) versus intravenosa (i.v.) es diferente, confirmando que los macrófagos de órganos importantes responden distinto (7).

RECEPTORES DEL SISTEMA INMUNE INNATO.

Los receptores de reconocimiento de patrones que reconocen PAMPs, pertenecen a varias familias de proteínas. Estructuralmente se dividen en: dominios ricos en leucina, dominios lectinas dependientes de calcio y receptor “scavenger”. Funcionalmente estos receptores pueden ser divididos en tres clases: los que son secretados que funcionan como opsonina uniéndose a la pared celular bacteriana y alertando a los fagocitos y al sistema de complemento para su reconocimiento. El receptor mejor caracterizado de esta clase es el receptor lectina que une manosa, miembro de la familia de lectinas dependientes de calcio. El receptor une los carbohidratos de la bacteria e inicia la activación

del complemento. El receptor lectina que une manosa es sintetizado en el hígado y secretado al torrente circulatorio como un componente de la respuesta de fase aguda. Este receptor puede unir carbohidratos de bacterias gram negativas, gram positivas y levaduras, así como también de virus y parásitos. Las lectinas que unen manosa están asociadas a dos Serin- proteasas 1 y 2. Estas serin protesasa están relacionadas con las serin proteasas de la vía clásica del complemento C1r y C1s. De la misma forma que C1r y C1s, las proteasas asociadas al receptor lectina, una vez activadas, clivan el tercer componente del complemento C3 y activan a C3 convertasa, lo cual resulta en la activación de la cascada del complemento. Si bien, la proteasa C1 requiere la unión antígeno anticuerpo para su activación, la proteasa asociada a el receptor lectina que une manosa para ser activada sólo requiere la unión a su ligando microbiano (3, 42).

Los receptores con acción endocítica se encuentran en la superficie de la célula fagocítica, los mismos unen microorganismos a través de sus PAMPs y conducen al patógeno a los lisosomas, donde el microorganismo es destruído, las proteínas derivadas del patógeno, pueden ser procesadas y el péptido resultante ser expresado en la superficie del macrófago a través de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad. Uno de los receptores con acción endocítica es el receptor manosa del macrófago, el cual también es un miembro de la familia lectina dependiente de calcio. Este receptor reconoce específicamente los carbohidratos con un gran número de manosas que es característico de los microorganismos y media su fagocitosis por los macrófagos. Otro receptor con acción endocítica es el receptor “scavenger” del macrófago, el cual es esencial en la eliminación de las bacterias de la circulación (3).

Los receptores que traducen señales, como los de la Familia Toll, al unirse con los PAMPs activan varias vías de traducción de señales intracelulares resultando en la activación de factores de transcripción como NF-κB, AP-1, Fos y Jun. De ellos, tal vez el más estudiado es el NF-κB, el cual está compuesto de una familia de proteínas que regula la transcripción de una variedad de citoquinas, moléculas de adhesión y genes productores de enzimas involucradas en el SIRS, las cuales, se encargan de orquestar la respuesta inmune innata o adquirida contra el patógeno invasor (20).

RECEPTORES QUE UNEN COMPONENTES DE PARED CELULAR BACTERIANA

Durante varios años, el principal objetivo fue dilucidar la secuencia de eventos que se producen cuando se une el LPS a la célula y la respuesta de la célula. Uno de los primeros receptores en ser caracterizado fue el CD11b/CD18 o CR3, pero debido a que la célula no era suficientemente activada a través del mismo, nuevos estudios fueron necesarios para identificar el receptor del LPS que active a la célula (46). En 1990, CD14 fue identificado como el receptor involucrado en la activación celular. Sin embargo debido a que CD14 carece de dominios de señales de transmembrana, fue propuesto un receptor accesorio. Recientemente, los receptores tipo Toll (TLR) fueron identificados como receptores que traducen señales a través de su dominio de transmembrana para el LPS, ALT y otros constituyentes microbianos. Las interacciones entre TLR- CD14 y entre la proteína sérica que fija LPS con el receptor soluble CD14, que funciona como receptor accesorio, se describirá con más detalles (47,48).

PROTEÍNA QUE FIJA LIPOPOLISACÁRIDO (PFL)

El LPS liberado a la circulación forma complejos con diferentes proteínas y glicoproteínas circulantes que van a tener un importante papel en la activación de la inflamación o en el bloqueo y eliminación del LPS. Aunque la endotoxina se puede unir a proteínas transportadoras inespecíficas como la transferrina, la albúmina y los factores del complemento son sus uniones con proteínas específicas como la proteína fijadora de LPS (PFL), la proteína inductora de permeabilidad (PIP), las lipoproteínas de alta densidad (HDL) implicadas en la activación o neutralización fagocitaria.

PFL es una proteína de fase aguda, y es inducida por IL-6 e IL-1 (49). Además del hígado, los pulmones, los riñones y el corazón también están involucrados en la producción de PFL. Los niveles séricos de PFL son bajos (1 a 15 ug/ml) pero su concentración aumenta durante la infección. En los humanos durante la fase aguda de un trauma o sepsis, los niveles máximos de dicha proteína se alcanzan a los dos o tres días.

PFL une al LPS y al lípido A. La afinidad de la PFL por el lípido A es alta, con una Kd que varía desde 1 a 58 nM. El sitio de unión para el lípido A está situado en la porción N-terminal entre los aminoácidos 91 y 108. La porción C-terminal de la molécula es la que media la transferencia del LPS al CD14. La PFL tiene mayor afinidad por bacterias muertas que por bacterias vivas (49). Al igual que otros fosfolípidos de membrana, el LPS forma agregados en medios acuosos. Estos agregados impiden una difusión espontánea de los monómeros del LPS al CD14 sin la ayuda de lipoproteínas transportadoras (LTP). La PFL es un catalizador que permite transferir los monómeros de la LPS desde los agregados al receptor CD14 sensibilizando las células con el LPS. Esta transferencia del LPS al CD14, incrementa la activación inducida por el LPS, de los monocitos, macrófagos y PMN de 100 a 1000 veces (50). La activación mediada por el CD14 de macrófagos peritoneales por S. aureus inactivados por calor, ALT, PGN de pared celular o proteínas micobacterianas no es incrementada por la PFL (2). En presencia de la PFL, el LPS induce un aumento de la muerte intracelular y secreción de TNF-α y NO por macrófagos e incrementa la adherencia de los PMN a las células endoteliales. Además de su rol pro-inflamatorio, la PFL realiza acciones anti-inflamatorias, ya que media la transferencia de los LPS y los ALT a las HDL y a otras lipoproteínas (7). Como se mencionó anteriormente, la PFL no es esencial para unir los componentes de pared celular de bacterias gram positivas al CD14, pero sí promueve la neutralización de los ALT por lipoproteínas, sugiriendo que solo cumple un rol anti-inflamatorio frente a bacterias gram positivas. CD14

El CD14 se puede unir al LPS, al PGN a otros constituyentes de la pared de bacteria gram positivas y al lipoarabinomano (LAM) de las micobacterias. Este hecho no quiere decir que estos diferentes productos bacterianos a través del CD14 generen la misma señal intracelular. Aunque algunos grupos de investigadores suponen que el CD14 es un patrón de reconocimiento de proteínas, la composición estructural de los ligandos que interaccionan con el CD14 no se han determinado. Una hipótesis alternativa es que el CD14 podría unirse a una gran variedad de antígenos microbianos sin un reconocimiento específico (51).

Estructuralmente el CD14 es una glicoproteína de membrana con una porción glicosilfosfatidilinositol (GPI) que carece de dominios de transmembrana, por lo que necesita una molécula accesoria para la traducción de señales. El receptor accesorio identificado, es un miembro de la familia de receptores Toll. La unión del LPS a la célula no resulta en una respuesta inmediata. Se observa un lapso de tiempo de 15 a 30 minutos entre la unión del LPS y la inducción de respuesta como la liberación de citoquinas y moléculas de adhesión, lo que sugiere que es un tiempo necesario para la internalización y para la traducción de las señales (52).

El CD14 es expresado por células de linaje mieloide (monocitos, macrófagos y PMN), células B, células hepáticas y fibroblastos gingivales (53). Se observó una expresión diferencial del CD14: los macrófagos pleurales y peritoneales tienen un alto nivel de expresión constitutivo, mientras que células de Kupffer (ratones), macrófagos alveolares, monocitos y PMN tienen bajo nivel de expresión de CD14 constitutivo. El CD14 está ausente en la célula mieloide progenitora pero su expresión se incrementa con la maduración. El desafío de ratones con LPS resultó en un incremento de la expresión de CD14 en células de Kupffer pero también en células del corazón, pulmón, bazo y riñones. La expresión del CD14 en PMN humanos es de bajo nivel, pero la misma puede ser inducida por TNF-α, factor estimulante de colonias granulocítica y factor estimulante de colonias granulocíticas – monocíticas, dentro de los 20 minutos, indicando que CD14 se encuentra almacenado a nivel intracelular.

CD14 SOLUBLE

La forma soluble de CD14 carece de la porción glicosilfosfatidilinositol (GPI) y está presente en suero (54). Monocitos, macrófagos y células del parénquima hepático están involucrados en su liberación. La cual depende de la inducción del LPS y del TNF-α, mientras que INF-γ e IL-4 la inhiben. En estado normal, la concentración sérica de CD14s es de 2 a 6 ug/ml. En pacientes en shock séptico, los niveles de CD14s se encuentran incrementados y se correlacionan con la muerte (55).

Las células endoteliales y epiteliales no expresan CD14 de membrana pero se hacen 10000 veces más sensibles al LPS en presencia de

la proteína en el suero. La sensibilidad al LPS puede ser bloqueada por anticuerpos anti-CD14 o por inmunodeplesión de CD14s desde el suero. La presentación del CD14s-LPS a las células endoteliales o epiteliales resulta en la expresión de moléculas de adhesión, excreción de IL-6 e IL-8 y daño a nivel endotelial. El papel de PFL en transferir el LPS al CD14s todavía no ha sido aclarado (54).

Además de su acción pro-inflamatoria, el CD14s ejerce acción anti-inflamatoria. La inyección de CD14s a ratones inoculados con LPS, fue protectivo contra la muerte inducida por el LPS. A través de otras experiencias se reveló que concentraciones moderadas de CD14s aumentan la activación de monocitos, macrófagos y PMN estimuladas por el LPS, mientras que la inhibición de la activación mediada por el LPS se observó cuando la relación CD14s/PFL era muy alta (56).

FIG. 6. Unión de componentes bacterianos a CD14 y CD14s. PFL, CD14 y TLR2 o TLR4 en la activación de células que expresan CD14 (macrófagos) y de células que no expresan CD14 (células endoteliales). LPS (izquierda) y PGN (derecha) representan ligandos específicos de TLR4 y TLR 2 respectivamente. Clin. Microbiol.Rev. July 2003, p379-414.

FAMILIA DE RECEPTORES TOLL.

Es una familia de proteínas conservada a lo largo de la evolución ya que se han descripto proteínas homólogas no solamente en Drosophila

sino también en una gran variedad de organismos incluyendo plantas, reptiles, pájaros y humanos. Presenta un papel central en la iniciación de la respuesta inmune innata celular. Esta familia está provista de moléculas de transmembrana que unen el espacio extracelular, donde ocurre el contacto y el reconocimiento de los patógenos microbianos, y el espacio intracelular, donde una cascada de señales lleva a iniciar una respuesta celular (57).

Toll y sus homólogos en humanos, son proteínas de transmembrana tipo I, con un dominio rico en leucina y una o dos regiones ricas en cisteína. El dominio intracelular de los receptores del tipo Toll contiene un dominio (TIR) Toll/IL-1 basado en la homología de la región con el dominio intracelular del receptor de la IL-1 (58).

El primer miembro de la familia Toll fue descubierto por mutaciones que establecían alteraciones en la polaridad dorso-ventral en embriones de Drosophila melanogaster. Luego se determinó que Toll participaba de la respuesta inmune innata de moscas Drosophila adultas, debido a mutaciones en el gen Toll que reducía la habilidad de activar la expresión de péptidos antifúngicos y la sobrevida a la infección fúngica.

La vía de señales activadas por el receptor Toll mostró una extensa analogía con una cascada de señales en humanos que activa al factor de transcripción NF-κB, conocido por su importante papel en la activación de genes inmuno-reguladores y pro-inflamatorios. Un homólogo humano al Toll de Drosophila llamado receptor del tipo Toll 4 (TLR4) fue descripto por primera vez por Medzhitov y colaboradores en 1997. La expresión del RNAm de TLR fue detectada en muchos tejidos y líneas celulares humanas, e indujo la activación del factor de transcripción NF-κB y los genes controlados por dicho factor, además indujo la expresión de moléculas co-estimulatorias como B7, requeridas para la activación de células T nativas (57).

En el presente todos los esfuerzos están enfocados a caracterizar la cascada de señales que es activada por los TLRs. La transcripción del factor nuclear NF-κB es esencial para regular la inducción de mediadores pro-inflamatorios que contribuyen a la respuesta inmune. La activación de NF-κB involucra la fosforilación y degradación de IκB, un inhibidor de NF-κB, lo que conduce a la translocación del heterodímero NF-κB al núcleo para ejercer su acción. El sistema NF-κB/ IκB puede ejercer regulación transcripcional en los genes pro-inflamatorios. La mayoría de los genes que codifican para moléculas de adhesión y citoquinas tienen elementos de unión para NF-κB en su región promotor. Se conoce además, que NF-κB puede ser activado por varias citoquinas como IL-1, IL-6 y TNF-α. Para la activación de NF-κB, TLR necesita de la activación de moléculas adaptativas intracelulares y de quinasas que traducen sus señales. Los componentes de la

vía de señales en mamíferos son los siguientes: CD14 – TLR4 – My88 – IRAK – TRAF6 – IκB – NFκB para mediadores inflamatorios. Donde IRAK es una quinasa asociada al receptor de IL-1 y TRAF6 es el receptor de TNF asociado al factor 6 (59).

Actualmente, han sido identificados 10 genes TLR en humanos que codifican para 10 proteínas TLR: TLR1 al TLR10 y todos están involucrados en la respuesta inmune. En el cromosoma 4 residen los genes TLRI, TLR2, TLR3, TLR6 y TLR10, en el cromosoma 9, TLR4, en el 1 TLR5, en el 10, TLR7 y TLR8 y en el cromosoma 3, TLR9 (60).

Los receptores TLR reconocen patrones microbianos específicos (PAMPs). Desde la década pasada se ha incrementado el número de ligandos. Diferentes TLRs tienen un papel importante en la activación de la respuesta inmune frente a los PAMPs. A pesar de su especificidad ligando –receptor, los estudios indican que la respuesta inmune innata es la suma de señales generadas por la interacción de múltiples TLRs y otras moléculas cooperadoras. Se discutirá los diferentes receptores TLRs y la interacción con sus ligandos.

TLR1: se expresa en células sanguíneas y en bazo en altas concentraciones. No ha sido identificado un ligando directo. TLR1 actuaría como co-receptor, ya que mostró estar asociado con TLR2 en respuesta a lipopéptidos. Pero aún resta aclarar su función.

TLR2: está involucrado en el reconocimiento de múltiples productos de bacterias gram positivas (PGN, lipoproteínas, ALT), micobacterias y levaduras. Los primeros estudios describían que TLR2 mediaba la respuesta al LPS, pero nuevos estudios indicaron que TLR4 es el principal receptor para el LPS. El análisis de ratones deficientes en TLR2 demostró claramente que este receptor es esencial para la respuesta frente al PGN. TLR2 también interactúa con lipoarabinomananos, constituyentes de la pared celular de Micobacterium tuberculosis. Además TLR2 coopera con TLR6 o TLR1 para responder frente al factor soluble de estreptococos grupo B o lipopéptidos y lipoproteínas de bacterias gram positivas (61).

TLR3 reconoce RNA viral de doble cadena, un patrón molecular asociado a infecciones virales.

TLR4 es el principal receptor de LPS, mayor constituyente de membrana externa de bacterias gram negativas. Como ya ha sido mencionado, además de TLR4, el LPS necesita de una molécula CD14 que cataliza su traslado hacia el TLR4. Estudios realizados con ratones deficientes de TLR4 -, confirmaron que el mismo es crítico para la respuesta al LPS. Estudios realizados más tarde en humanos sugirieron un rol similar; mutaciones en TLR4 se asocian con una falta de respuesta frente al LPS. No todos los LPS de bacterias gram negativas estimulan la respuesta inflamatoria a través de TLR4, ya que, LPS derivados de bacterias como Leptospira sp. o Porphyromonas sp. lo hacen a través de TLR2. Esto se debe a diferencias estructurales de LPS de bacterias como E.coli sp. o Salmonella sp (60,41).

TLR5 reconoce la proteína flagelina de bacterias gram positivas y gram negativas. Flagelina es la subunidad monomérica del flagelo bacteriano. Esta proteína presenta una potente actividad proinflamatoria induciendo la expresión de IL-8. TLR5 se expresa en bazo, leucocitos de sangre periférica y células epiteliales. Se ha demostrado que las bacterias flageladas y no las no flageladas estimulan la respuesta a través de TLR5, indicando que es flagelina el ligando específico de TLR5 (38).

TLR6 es expresado en leucocitos de sangre periférica y en bazo. Al igual que TLR1 actúa como co-receptor.

TLR7 se expresa abundantemente en placenta, pulmón, bazo y leucocitos de sangre periférica. Esta relacionado genéticamente con TLR8 y TLR9. Su ligando natural todavía no ha sido definido.

TLR8 fue identificado junto con TLR7 y TLR9, y se expresa en pulmón y leucocitos de sangre periférica. Su ligando natural es desconocido.

TLR9 está localizado intracelularmente. Reconoce secuencias específicas DNA bacteriano no metiladas.

TLR10 es el último miembro descubierto de la familia de TLRs humanos. Su función y su ligando natural todavía no han sido caracterizados. Este receptor se expresa en células inmunes presentes en tejidos linfoides como nódulos linfáticos, timo y bazo. Su análisis genético revela una extensa relación con TLR1 y

TLR6, por lo que posiblemente actúe como co-receptor (60).

FIG.7. Vía de traducción de señales TLR: a través de la activación de diferentes ligandos, TLRs inducen la atracción de MyD88 vía su dominio TIR, lo cual activa por fosforilación a IRAK quinasa asociada al receptor IL-1. IRAK activada se combina con TRAF6 e induce señales que conducen a la activación de NF-κB, el cual a su vez induce la producción de citoquinas pro-inflamatorias. Este es un simple esquema, ya que existen muchas otras moléculas involucradas en esta vía. Current Science. Vol.85.Nº.8.25 october 2003

Por lo anteriormente descripto, se concluye que, el papel principal de los TLR es alertar a sistema inmune de la presencia de microorganismos. La unión ligando – TLR conduce a la producción de citoquinas pro-inflamatoria y moléculas efectoras dependiendo del tipo celular. Estudios en ratones TLR- han sugerido su importancia in vivo. Por ejemplo, ratones deficientes en TLR2 son altamente susceptibles al shock séptico causado por S.aureus. En otro estudio, ratones deficientes en TLR4 tuvieron infecciones persistentes con Haemophilus influenzae o virus sincitial respiratorio, lo que indica la importancia de este receptor en la defensa frente a infecciones (3, 4).

Β2 INTEGRINAS

Los antígenos CD18, o Β2 integrinas comprenden una familia de tres glicoproteínas de membrana celular íntimamente relacionadas, cada una de las cuales poseen dos cadenas, una α y otra β. Las tres proteínas comparten la misma cadena CD18 β, pero tienen diferentes cadenas CD11 α. La cadena α confiere especificidad de sustrato y la cadena β asegura la localización adecuada del receptor en la membrana celular. Las tres glicoproteínas son: I. α1β2 – integrina o LFA-1 o CD11α/CD18β; II. α2β2 – integrina o CR3 (receptor del complemento) o MAC-1, o

CD11β/CD18β; y III. α3β2 – integrina o CR4 o p150,95, o CD11c/CD18β. LFA-1 se expresa en todos los leucocitos, CR3 se expresa en monocitos, macrófagos, PMN y linfocitos, mientras que CR4 se expresa en monocitos y macrófagos. LFA-1 reconoce a las moléculas de adhesión ICAM-1 e ICAM-2, CR3 reconoce a C3bi unido a la superficie celular y fibrinógeno, y CR4 también une fibrinógeno (13).

Muchas cepas de E.coli son reconocidas por los macrófagos sin la intervención de anticuerpos ni del complemento. CD18 en la superficie celular puede ser responsable para el reconocimiento de la bacteria. En varios estudios se demostró que la activación de monocitos por antígenos microbianos, incluyendo LPS, es parcialmente inhibida por anticuerpos contra CD18, CD11β o CD11c, lo que indica que las Β2 integrinas están involucradas en la activación celular. CD11/CD18 y CD14 pueden tener vías de traducción de señales en común. Hay indicaciones que CD11/CD18 también utilizan la vía TRL4 para la activación vía LPS, aunque con muy baja eficiencia, demostrado por las diferencias de cinética de activación. Debido a la baja eficiencia de CD11/CD18 –TLR4 con respecto a CD14-TLR4, la relevancia fisiológica de este modelo es limitada. Mientras que la contribución de CD11/CD18 a la activación inducida por bacterias gram positivas a través de TLR2 resta ser determinada (43).

RECEPTOR “SCAVENGER” (SR-A)

Los SR-A son glicoproteínas de transmembrana, expresadas por los macrófagos tisulares (Ej. células de Kupffer) y células endoteliales. Estructuralmente, están formados por tres dominios extracelulares C-terminal ricos en cisteínas, los que se conectan con un dominio de transmembrana a través de una larga fibra de colágeno. Se han identificado tres SR-A, siendo SR-AI y SR-AII expresados en la membrana plasmática. La región C-terminal del dominio extracelular es el sitio de unión de ligandos polianiónicos. Además de unir bacterias y componentes bacterianos (Ej. LPS, ALT), los SR-A reconocen un amplio espectro de ligandos incluyendo: LDL acetilados, LDL oxidados. MARCO SR (receptor macrófago con estructura de colágeno), también pertenece a la clase de SR-A, y reconoce bacterias gram positivas y gram negativas (62).

La unión a los receptores “scavenger” puede formar un mecanismo protectivo, ya que remueve el exceso de microorganismos o sus componentes, por lo tanto previene la unión al receptor CD14 y el desarrollo de shock séptico. Aunque la incubación de macrófagos con LPS no resultó en la activación mediada por el SR-A, otros estudios revelaron que ligandos de SR como LDL modificado pueden inducir la liberación de IL-1 y TNF-α, aumentar la expresión del factor activador del plasminógeno en macrófagos, y las moléculas de adhesión en células endoteliales (63).

PROTEÍNAS QUE UNEN COMPONENTES DE PARED CELULAR BACTERIANA

PROTEÍNA INDUCTORA DE PERMEABILIDAD/BACTERICIDA (PIP):

Esta proteína catiónica de 55KDa reside en los gránulos azurófilos de los PMN y en menor medida en monocitos y macrófagos. Se une con una elevada especificidad a bacterias gram negativas y mata a las mismas incrementando la permeabilidad de la membrana externa y por activación de enzimas que degradan su pared celular. La actividad bactericida de PIP frente a bacterias gram positivas no fue observada. La unión de PIP a bacterias gram negativas es mediada por el LPS. Esta unión neutraliza la actividad biológica del LPS, y por lo tanto, atenúa el daño endotelial, así como también la producción por parte de los macrófagos de NO, TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8. Los PMN pueden secretar PIP, y la misma tiene idénticos efectos bactericidas que la PIP intracelular. Esta doble capacidad de la PIP (la neutralización de la LPS y su acción bactericida) le confieren capacidad para actuar clínicamente como anti-endotoxina (64,42). Debido a esto se ha desarrollado una PIP recombinante (rPIP, rPIP23, rPIP21) para la utilización en humanos. En estudios "in vitro" se ha visto que las PIPr inhiben la respuesta inflamatoria de los leucocitos. También se han ensayado en modelos animales y se ha podido comprobar que previenen la mayoría de los efectos hemodinámicos de la LPS y que su administración incrementa la supervivencia. La corta vida media en el suero de la PIP es uno de los inconvenientes en su utilización en la clínica (65).

LACTOFERRINA.

Es una glicoproteína que está presente en los gránulos neutrófilos, en la leche, y en secreciones mucosas. Une al LPS y es bacteriostática para la bacteria, indirectamente quela iones hierro y directamente desestabiliza las membranas celulares de las bacterias gram negativas (66,42). La lactoferrina es el principal componente producido y liberado por PMN activados, que neutraliza al LPS. Esta proteína al unirse al LPS, previene la unión del mismo a la PFL y a su vez que el complejo LPS-PFL se una al CD14 y por lo tanto habrá una reducción en la liberación de TNF-α e IL-6. Baveye y col. demostraron que esta proteína es capaz de unir CD14s o LPS-CD14s, e inhibe la activación de las células endoteliales y por ende la expresión de moléculas de adhesión (67).

LISOZIMA

Es una proteína que destruye la pared celular de bacterias gram positivas y gram negativas, a través de un mecanismo enzimático (42). Se ha demostrado que la lisozima une al LPS y que esta unión inhibe la inmuno-estimulación de las células B. Con respecto a la habilidad de la lisozima de afectar la liberación de citoquinas, los datos son contradictorios (7).

PROTEÍNAS DE FASE AGUDA

Las proteínas surfactante A y D unen al LPS y a bacterias y por lo tanto previenen la unión del mismo a los macrófagos alveolares. La proteína amiloide sérica (PAS) une al LPS e inhibe la activación de PMNs mediada por la inducción del LPS, pero contrario a la acción anti-inflamatoria, PAS inhibe la neutralización que ejerce la lipoproteína HDL al unirse al LPS, sugiriendo que bajo condiciones fisiológica, PAS tiene principalmente un papel pro-inflamatorio (68).

LIPOPROTEÍNAS

Aparte de las proteínas neutralizantes producidas por los PMNs el organismo utiliza otras lipoproteínas para este fin. En estudios in vitro se ha detectado que las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), baja densidad (LDL), alta densidad (HDL) y la apolipoproteína neutralizan la actividad biológica de la LPS al ser eliminadas a través del metabolismo del colesterol (69). Los ensayos efectuados en animales indican que las

lipoproteínas podrían ser importantes en la protección contra la endotoxemia. En humanos los estudios realizados hasta la fecha muestran resultados contradictorios.

CITOQUINAS

La unión de los componentes bacterianos a los receptores, como TLRs, inducen una vía de señales intracelulares en las células del sistema inmune innato. Esta cascada de eventos intracelulares resulta en la activación del factor de transcripción nuclear NF-κB implicado en la expresión de genes de respuesta inmune y la liberación de moléculas efectoras (3). Los mediadores pro-inflamatorios juegan un papel crítico en la erradicación del microorganismo invasor. Ellos inician la respuesta inflamatoria y dirigen la respuesta humoral y celular. Las citoquinas son una importante clase de mediadores liberados por varios tipos celulares, incluyendo linfocitos, monocitos, macrófagos y células no inmunes. TNF-α, interleuquinas, factores estimulantes de colonias, son miembros de esta familia de moléculas mensajeras. Una estimulación excesiva y no controlada de estos mediadores pueden ser responsables una vez que han alcanzado el torrente circulatorio de la mala perfusión tisular, del fracaso multiorgánico y en última instancia del shock (4).

Las citoquinas son pequeñas proteínas usualmente menor a 30 KDa, cuya expresión es mayormente inducida que constitutiva. Dos rasgos típicos de las mismas es su pleiotrofismo (es la capacidad que tienen las citoquinas de estimular a varios tipos celulares) y su redundancia (es la habilidad de diferentes citoquinas para ejercer efectos similares). Además tienen la capacidad de inducir la expresión de otras citoquinas y así ampliar la red de moléculas que interactúa. Su acción puede ser autócrina o parácrina mediada por la interacción con receptores específicos expresados en las células diana. Las citoquinas ejercen efectos quimiotácticos para células inmunes, aumentan la expresión de las moléculas del CMH clase I y II y participan en la activación y proliferación de linfocitos T y B (5).

Cuadro 1: Características de las principales citoquinas de la inmunidad innata.(5).

AVANCES CIENTÍFICOS: ESTRATEGIAS PARA PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE SEPSIS Y SHOCK SÉPTICO

El tratamiento de la sepsis severa y el shock séptico involucra una gran variedad de aspectos a corregir que van desde los mecanismos moleculares de respuesta al patógeno invasor, pasando por la regulación de la respuesta inflamatoria, el control de variables hemodinámicas y la óptima oxigenación tisular.

Se han realizado numerosos estudios para crear una estructura que al unirse al LPS lo neutralice, y que pueda ser aplicable en la clínica para el tratamiento de pacientes sépticos. Se han creado péptidos basados en PIP, PFL y Lactoferrina. A los que se les estudió su capacidad bactericida y su capacidad de neutralización. Los resultados son alentadores, pero se necesitan futuras investigaciones para determinar la estructura óptima del sitio de unión para que la neutralización del LPS y de los ALT sea altamente específica (70).

Las nuevas estrategias apuntan a bloquear la interacción ligando-receptor, actuando principalmente en la cascada de eventos inducida por los microoganismos. Así, PFL, CD14 y TLR4 en bacterias gram negativas y CD14, TLR2 y TLR6 en bacterias gram positivas serían las estructuras diana de las nuevas drogas. Están en marcha, estudios en fase I con anticuerpos monoclonales anti-CD14. Sin embargo, estas intervenciones con el objetivo de inhibir la respuesta inmune innata, acarrean un importante riesgo para el paciente. Como ya se observó, en ratones C3H/HeJ y C57BL/10ScCr con mutaciones o deleciones espontáneas en los genes que codifica para el receptor TLR4, cuando son expuestos a dosis letales de LPS, ellos presentan una elevada sensibilidad a las infecciones bacteriana y mueren rápidamente cuando son expuestos a dosis no letales de bacterias (3).

La patogénesis de la sepsis es muy compleja. Sin embargo, el trabajo en conjunto entre la ciencia y la investigación clínica continúa para proveer mayor información para la identificación de un nuevo blanco terapéutico. Se han obtenido, recientemente, resultados exitosos con una nueva estrategia terapéutica, Proteína C activada recombinante, diseñada para corregir las alteraciones de la coagulación inducidos por la sepsis. La Proteína C activada recombinante inactiva los factores V y VIII previniendo la

generación de trombina, mientras que promueve la fibrinólisis. También inhibe la inflamación ya que reduce los niveles de IL-6. Sin embargo, el uso de esta proteína recombinante incrementa el riesgo de sangrado, por lo que debería ser administrada a pacientes con sepsis severa y con razonables expectativas de vida sin contraindicaciones absolutas relacionadas al sangrado (71).Por otra parte, la administración intratraqueal de surfactante recombinante, puede prevenir el shock endotoxico en el recien nacido (72)

Numerosos estudios demostraron que altos niveles de mediadores pro-inflamatorios se asociaban con una menor sobreviva del paciente séptico, por lo que la inmunosupresión parecía ser la elección obvia en el tratamiento de la sepsis, pero se observó que esta incrementa la mortalidad. TNF-α es el principal mediador en la patogénesis de la sepsis, debido a esto, fueron probados en el tratamiento de la sepsis, preparaciones de anticuerpos anti-TNF-α recombinante. Los ensayos clínicos de estas preparaciones fueron ineficientes. Otra importante citoquina en la inflamación y sepsis es IL-1. Un receptor antagonista IL-1 recombinante fue probado en dos ensayos clínicos en fase III, pero también fue ineficiente (73).

El uso de corticoides ha sido un tema de debate durante muchos años. Se conoce que los corticoides regulan la respuesta inmune. Ellos inhiben los procesos inflamatorios como la migración de leucocitos, producción de citoquinas y tienen un efecto positivo a nivel cardíaco ya que bloquean la síntesis de NO. Basados en estos efectos los pacientes han sido tratados en dos ensayos clínicos usando corticoides en la fase temprana de la sepsis. Los resultados de estos ensayos indicaron que no hay efecto benéfico en el tratamiento de la sepsis temprana.

Si bien el bloqueo o la modulación de los distintos componentes de la respuesta inmune como factores del complemento, de la coagulación, adherencia de neutrófilos y liberación de NO son exitosos en animales, falta determinar si esta terapéutica pueda ser efectiva en humanos (73).

CONCLUSIONES

El Sistema Inmune presenta una gran variedad de receptores para reconocer microorganismos

invasores y así producir la expresión de genes asociados con el desarrollo y mantenimiento de la respuesta inmune. Las bacterias han desarrollado diversos mecanismos o estrategias para evadir o manipular esa respuesta inmune.

La sepsis no debe ser atribuida solamente a un Sistema Inmune descontrolado, ya que puede indicar un sistema inmune dañado o comprometido incapaz de erradicar al microorganismo invasor. Se observó en ratones deficientes en TNF-α y deficientes en su receptor, una disminución de la sensibilidad al LPS pero se vieron afectados por pequeñas concentraciones de bacterias vivas (6).

Los pacientes con sepsis se caracterizan por ser inmunosuprimidos, incapaces de controlar una infección e incluso con alta predisposición a las infecciones nosocomiales. Como se expuso anteriormente, las terapias anti-inflamatorias en pacientes con sepsis fueron ineficientes. ¿Por qué ocurre esto? Inicialmente la sepsis se debe a un incremento en los mediadores inflamatorios, pero si la sepsis persiste, las células inmunocompetentes son capaces de inducir una respuesta antiinflamatoria, con producción de mediadores que inhiben a las citoquinas proinflamatorias, intentando establecer un balance entre ambos tipos de mediadores. Hay evidencia de inmunosupresión en sepsis, en estudios que muestran una liberación marcadamente menor de TNF-α e IL- 1β de células de pacientes con sepsis estimuladas con LPS con respecto a los pacientes controles.

La respuesta inmune durante la sepsis está determinada por varios factores, la virulencia del microorganismo invasor, el tamaño del inóculo y las condiciones coexistentes del huésped como edad, estado nutricional, enfermedad de base, y el polimorfismo de genes que codifican para citoquinas, receptores y otras moléculas efectoras.

La evaluación del bazo post-mortem de pacientes con sepsis demostró que en estado de sepsis prolongado con persistencia de infección, desarrollaron una respuesta hipo-inmune prolongada con pérdida de células T y B. Ocurren muchas muertes durante el estado hipo- inmune y revertir o prevenir la deficiencia inmune debería ser el objetivo de la terapia. Mientras que la terapia antiinflamatoria aplicada tempranamente en pacientes con respuesta hiperinmune podría salvar la vida (73).

Por lo tanto medir la concentración de los mediadores inflamatorios circulantes puede proveer información valiosa para evaluar el estado de sepsis y aplicar la terapia correspondiente. El objetivo principal del la terapia de la sepsis y shock séptico debería estar apuntado a mantener la homeostasis, erradicar las bacterias y restaurar el balance entre la respuesta proinflamatoria y antiinflamatoria.

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ABREVIATURAS USADAS EN EL TEXTO ALT: ácidos lipoteicoicos AT: ácidos teicoicos BCR: receptores del linfocito B C3: factor 3 del complemento CD14s: CD14 soluble CID: coagulación intravascular diseminada CMH: complejo mayor de histocompatibilidad CPA: célula presentadora de antígeno CR3: receptor del factor 3 del complemento DAP: ácido diaminopimélico DNA: ácido desoxirribonucleico FAP: factor activador de plaquetas GM-CSF: factor estimulante de colonias granulocítica-macrófago GPI: glicosilfosfatidilinositol HDL: lipoproteína de alta densidad IDL: lipoproteína de baja densidad IFN-γ: interferón-gamma Igs: inmunoglobulinas IL: interleuquina IRAK: Quinasa asociada al receptor de IL-1 KDO: cetodesoxioctonato LAM: lipoarabinomananos LPS: lipopolisacáridos LTP: lipoproteínas transportadoras MODS síndrome de disfunción multiorgánica NAG: N-acetilglucosamina NAM: N-acetilmurámico NK: natural killer NO: óxido nítrico PAMPs: patrones moleculares asociados al patógeno

PAS: proteína amiloide sérica PCR: proteína C reactiva PFL: proteína que fija lipopolisacáridos PFM: proteína que fija manosa PGN: peptidoglicano PIP: proteína inductora de permeabilidad/bactericida PMN: polimorfonucleares RNA: ácido ribonucleico RNAm: ácido ribonucleico mensajero SIE: sistema inmune específico SII: sistema inmune innato SIRS: síndrome de respuesta inflamatoria sistémica TCR: receptores del linfocito T TLR: receptor del tipo Toll TNF-α: factor de necrosis tumoral-alfa TRAF6: receptor de TNF asociado al factor 6 VLDL: lipoproteína de muy baja densidad