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4.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1.- CARACTERIZACIÓN IN VIVO DE LAS POSIBLES DIFERENCIAS

ENTRE LAS RATAS SDU Y W EN LOS EFECTOS FARMACOLÓGICOS

DE MORFINA.

Un aspecto relevante para la utilización clínica de analgésicos opioides, es el

optimizar sus efectos analgésicos, minimizando sus efectos no deseados. Para

abordar este punto, se estudiaron las diferencias, en cuanto al efecto de morfina,

sobre los distintos tipos de nocicepción, entre ratas de las cepas SDU y W, y las

diferencias entre las mismas en cuanto al desarrollo de tolerancia, dependencia física

y adicción a este opioide.

4.1.1.- EFECTO ANTINOCICEPTIVO.

Los métodos nociceptivos que se han utilizado para el estudio del dolor son

numerosos, presentando cada uno de ellos sus ventajas y desventajas

correspondientes. Estos tests podrían clasificarse en función de distintos parámetros,

como: duración y/o naturaleza del estimulo nociceptivo, tipo de dolor que evalúan,

tipo de respuesta que se considera como señal de dolor, etc., (Le Bars y cols, 2001).

En la evaluación del efecto antinociceptivo de un fármaco concreto, se ha de

considerar que se han descrito diferencias genéticas en la sensibilidad a opioides

dependientes del test nociceptivo utilizado, y se ha sugerido que se deben a los

diferentes procesos implicados en cada uno de ellos (Mogil y cols., 1996). Así, por

ejemplo, la supresión de un receptor opioide puede producir alteraciones en la

respuesta antinociceptiva determinada por un test, sin modificar la respuesta

analizada con otro test diferente (Martin y cols., 2003b). Por este motivo se estudió el

efecto antinociceptivo de morfina con distintos tests nociceptivos, intentando centrar

la búsqueda de la/s causa/s de las diferencias entre estas dos cepas de ratas.

89


4.1.1.1.- TEST DE TAIL FLICK.

Mediante este test de respuesta predominantemente espinal se ha analizado la

respuesta nociceptiva de retirada de la cola tras aplicar un estímulo térmico en

condiciones basales y tras dosis crecientes de morfina, con el fin de obtener curvas

dosis-efecto antinociceptivo, en ambas cepas de ratas.

En el presente estudio se analizaron los valores de latencia basal, con la

finalidad de determinar posibles diferencias entre cepas en la sensibilidad

nociceptiva en este test. Los valores de latencia basal en ambas cepas no presentaron

diferencias estadísticamente significativas (SDU: 3.9±0.1 s, n = 51 y W: 3.8±0.1 s, n

= 68; p>0.05). Por consiguiente, este resultado no parece apuntar a la existencia de

diferencias entre las cepas SDU y W en los mecanismos moduladores de la

nocicepción basal en este test.

Se realizaron curvas dosis-efecto antinociceptivo de morfina en ambas cepas

de ratas y se observó que las curvas obtenidas son distintas (figura 10). Además, los

valores estimados de DE50 fueron significativamente menores en SDU que en W

(DE50=0.75±0.04 mg/Kg en SDU y 1.45±0.06 mg/Kg en W; p<0.001). Por otra parte,

los valores de %MEP obtenidos con 0.6, 0.85 y 1.2 mg/Kg de morfina fueron

significativamente superiores en la cepa SDU que en la cepa W (SDU vs W:

45.3±13.8 vs 4.8±2.2, 61.4±9.1 vs 19.8±6.5 y 76.4±5.1 vs 38.5±14.9%,

respectivamente, p<0.01 en todos los casos). La dosis de morfina requerida para

obtener el 100% de %MEP fue 3.4 mg/Kg en SDU y 9.6 mg/Kg en W. Todo ello

indica una mayor potencia de morfina en las ratas de la cepa SDU con respecto a las

W.

90


0.1 1 100

20

40

60

80

100SDUW**

****

Dosis de morfina (mg/Kg)

%M

EP

Figura 10. Curva dosis-efecto antinociceptivo de morfina evaluado en el test TF. Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla de la figura. Los valores de %MEP, obtenidos con cada dosis de morfina, se analizaron con un test de Bonferroni: ** p<0.01 SDU vs W. n=5-16 animales por dosis y cepa.

Factor F (g.l. factor, residual) Valor pDosis F(10, 157)=44.87 p<0.001Cepa F(1, 157)=24.09 p<0.001

Dosis-Cepa F(10, 157)=2.66 p<0.01

91


Esta diferencia entre ratas de las cepas SDU y W en la potencia

antinociceptiva de morfina, sin diferencias en la sensibilidad nociceptiva basal en el

test de TF ya había sido descrita previamente (Más y cols., 2000). En dicho trabajo

se descartó que la farmacocinética de morfina explicara las diferencias descritas.

Otros grupos han identificado diferencias entre cepas de roedores en la sensibilidad

al efecto antinociceptivo de agonistas µ, evaluado en el test de TF, con y sin

diferencias en la sensibilidad nociceptiva basal en este test (Morgan y cols., 1999;

Kest y cols., 2002).

Un aspecto a tener en cuenta en la realización de estos tests es la importancia

de la intensidad del estímulo nociceptivo, así como la eficacia del agonista utilizado,

puesto que éstas son más notables al utilizar estímulos dolorosos de elevada

intensidad y agonistas opioides µ de baja eficacia (Morgan et al., 1999). En este

estudio utilizamos un agonista con elevada eficacia, siendo el estimulo nociceptivo

utilizado en el test térmico (TF) de elevada intensidad. A pesar de ello observamos

estas diferencias, por lo que es de esperar que si se utilizaran fármacos con menor

eficacia las diferencias podrían ser más acusadas.

4.1.1.2.- TEST DE HOT PLATE.

Mediante este test, de respuesta predominantemente supraespinal, se ha

analizado la respuesta nociceptiva basal y tras distintas dosis de morfina, con el fin

de obtener curvas dosis-efecto en ambas cepas de ratas.

En este trabajo, no se encontraron diferencias significativas en cuanto a los

valores de latencia basal entre ambas cepas (SDU: 7.2±0.3 s, n = 28 y W: 7.9±0.3 s,

n = 29; p>0.05). Por ello, se puede descartar la existencia de diferencias en los

mecanismos moduladores de la nocicepción entre ambas cepas de ratas, al menos en

las condiciones experimentales utilizadas.

Se realizaron curvas dosis-efecto antinociceptivo de morfina en cada cepa, y

se observó que las curvas obtenidas son distintas (figura 11). Los valores estimados

de DE50 fueron significativamente menores en SDU que en W (DE50=5.80±0.30 mg/

Kg en SDU y 8.61±0.59 mg/Kg en W; p=0.01). Además, los valores de %MEP

92


obtenidos con 9.6mg/Kg de morfina fueron significativamente mayores en la cepa

SDU que en la cepa W (SDU vs W: 88.9±6.1 vs 43.8±13.5; p<0.01).

93


1 100

20

40

60

80

100SDUW

**


%M

EP

Figura 11. Curva dosis-efecto antinociceptivo de morfina evaluado en el test HP. Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla de la figura. Los valores de %MEP, obtenidos con cada dosis de morfina, se analizaron con un test de Bonferroni: ** p<0.01 SDU vs W. n=6-15 animales por dosis y cepa.

Factor F (g.l. factor, residual) Valor pDosis F(6, 114)=24.57 p<0.001Cepa F(1, 114)=8.43 P<0.01

Dosis-Cepa F(6, 114)=1.25 n.s.

94


Las curvas dosis-efecto antinociceptivo de morfina, así como los valores de

DE50 son diferentes entre las dos cepas de ratas en estudio, estando dentro del rango

descrito por otros autores para rata (Gilbert y Franklin, 2002; Stoffel y cols., 2003).

De manera similar al presente estudio, otros grupos han identificado diferencias entre

cepas en la sensibilidad al efecto antinociceptivo de agonistas µ en el test de HP,

asociadas o no a diferencias en la sensibilidad nociceptiva basal en este test (Plesan y

cols., 1999; Bulka y cols., 2004).

Los analgésicos opioides ejercen acciones a distintos niveles. En concreto, el

efecto antinociceptivo de estos fármacos puede ejercerse a nivel supraespinal,

espinal, e incluso periférico (ver Yaksh, 1997). En este sentido, las estrategias para

determinar el nivel donde se originan determinadas acciones opioides han sido

varias: administraciones localizadas (i.t. y i.c.v.), y/o utilización de tests de respuesta

predominantemente espinal (TF) o supraespinal (HP) (Ossipov y cols., 1995;

Langerman y cols., 1995; Mogil y cols., 2000). En el presente estudio, los fármacos

se administraron vía sistémica. Por consiguiente, cabe suponer que podrían estar

actuando en todos los niveles donde se ha descrito la existencia de receptores

opioides, tanto a nivel periférico como central (Stein, 1993; Yaksh, 1997). Por ello,

es difícil discernir entre posibles localizaciones de los mecanismos implicados en

estas diferencias, si bien el hecho de que las diferencias entre cepas aparezcan tanto

en un test de respuesta principalmente espinal (TF) como en un test de respuesta

predominantemente supraespinal (HP), podría sugerir la implicación de ambos sitios.

4.1.1.3.- TEST DE LA FORMALINA.

Mediante este test nociceptivo de estímulo químico, en ambas cepas de ratas

se ha analizado la respuesta nociceptiva a diferentes concentraciones de formalina, y

el efecto de distintas dosis de morfina sobre la nocicepción.

La solución de formalina al 1.5% indujo una respuesta similar en ambas

cepas, tanto en la primera fase de respuesta nociceptiva (0-10 min tras la inyección

de formalina; tiempo de lamido + elevación de la pata inyectada: 296±61 y 346±20 s,

en SDU y W respectivamente, p>0.05) como en la segunda (10-60 min tras la

inyección de formalina; 2160±331 y 2681±59 s, en SDU y W respectivamente,

95


p>0.05). Sin embargo, al utilizar formalina a una concentración de 2.5%, apareció

una respuesta nociceptiva significativamente menor en las ratas de la cepa SDU que

en las de la cepa W, tanto en la primera (257±18 y 452±40 s, respectivamente,

p<0.01) como en la segunda fase (2369±129 y 2722±51 s, respectivamente, p<0.05)

(ver fig 12).

96


A

Formalina 1.5% Formalina 2.5%0

100

200

300

400

500

SDU

W **

Tiem

po d

e la

mid

o +

elev

ació

n (s

eg)

B

Formalina 1.5% Formalina 2.5%0

1000

2000

3000 *

Tiem

po d

e la

mid

o +

elev

ació

n (s

eg)

Figura 12. Efecto nociceptivo en el test de la formalina: (A) durante la primera fase de respuesta nociceptiva (0-10 min tras inyección), (B) durante la segunda fase de respuesta nociceptiva (10-60 min tras inyección). Las barras representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones entre cepas para los valores de tiempo de lamido + elevación de la pata inyectada se analizaron con el test de la t de Student: * p<0.05, ** p<0.01. n=6 animales por grupo.

97


Por lo tanto, aunque el efecto nociceptivo inducido por las dos

concentraciones de formalina utilizadas en este estudio fue de similar cuantía al

descrito para rata por otros autores (Abbott y cols., 1995), se observaron diferencias

entre ambas cepas al utilizar la concentración más elevada de formalina. Otros

autores han descrito la existencia de diferencias en la respuesta nociceptiva en el test

de la formalina entre distintas cepas de roedores (Abbott y cols., 1995; Wilson y

cols., 2002). Una posible explicación al hecho de que las diferencias entre cepas en la

respuesta nociceptiva a la inyección de formalina se observen sólo a concentraciones

del 2.5%, y no a concentraciones inferiores, es que la variabilidad en la respuesta

comportamental a la inyección de formalina aumenta al disminuir la concentración

de ésta, y así, al utilizar medidas de nocicepción compuestas (como en el presente

estudio), el poder estadístico para detectar diferencias crece al aumentar la

concentración de formalina (Guy y Abbott, 1992; Franklin y Abbott, 1993; Abbott y

cols., 1995).

En el presente estudio aparecen diferencias entre ambas cepas de ratas en la

sensibilidad nociceptiva basal en un test donde el estímulo nociceptivo es de tipo

químico (test de la formalina), sin que se detecten diferencias en la sensibilidad basal

a los estímulos nociceptivos de tipo térmico (TF y HP). Este hecho podría explicarse

por los hallazgos descritos por Mogil y cols. (1999b), donde se describe la existencia

de tres “tipos” de nocicepción, independientes entre sí desde el punto de vista de la

herencia genética: nocicepción basal a estímulos térmicos, respuesta espontánea a

estímulos nocivos de tipo químico, y nocicepción basal a estímulos mecánicos e

hipersensibilidad cutánea.

Los mecanismos responsables de la diferente sensibilidad a estímulos

químicos no están clarificados, aunque se ha abordado su estudio desde diferentes

aproximaciones. Mediante abordajes genéticos, se han identificado dos locus en los

cromosomas 9 y 10 del ratón, que podrían estar relacionados con la sensibilidad a los

mismos. El primero de ellos parece estar implicado en la respuesta durante la primera

fase del test de la formalina, y por su situación podría tratarse de genes que codifican

la subunidad α2 de la proteina G, el receptor 5-HT-1B, la colecistocinina, los canales

de sodio SNS/PN3 y SNS/NaN, y una proteína que controla el clustering de los

98


mastocitos. El segundo, que parece estar involucrado en la respuesta durante ambas

fases del test de la formalina, podría tratarse de genes que codifican el interferón-γ y

el insulin-like growth factor (Wilson y cols., 2002).

Por otro lado, distintos estudios también han implicado al sistema opioide

endógeno como modulador de la respuesta nociceptiva en el test de la formalina,

aunque con resultados controvertidos. Así, los ratones knockout de proencefalina

presentan una menor nocicepción en la primera fase del test, y los knockout de

prodinorfina, sin presentar diferencias en la primera fase, en la segunda fase se

comportan como hiperalgésicos (König y cols., 1996; Wang y cols., 2001). Otros

estudios, realizados en ratones knockout de los distintos tipos de receptores opioides,

han relacionado al receptor µ con el tono inhibitorio de la nocicepción en las fases

aguda y tónica, así como al δ en la fase tónica (Martin y cols., 2003b; Zhao y cols.,

2003). Por otro lado, estudios farmacológicos combinados con la utilización de

anticuerpos específicos de los distintos ligandos endógenos, sugieren que en el tono

inhibitorio de la nocicepción por formalina estarían implicados la leuencefalina y la

dinorfina a través de receptores δ y κ, así como receptores µ y δ1 espinales, y la β-

endorfina a través de receptores ε y µ supraespinales (Ossipov y cols., 1996; Wu y

cols., 2002). Por consiguiente, resulta complicado discernir el fenómeno implicado

en la diferente sensibilidad a estímulos químicos entre estas cepas.

Un aspecto a tener en cuenta es que en muchos de estos trabajos se realiza

una valoración del total de respuesta nociceptiva en cada una de las dos fases,

impidiendo sacar conclusiones sobre la evolución temporal de la nocicepción, así

como del periodo comprendido entre ambas fases, denominado interfase (König y

cols., 1996; Ossipov y cols., 1996; Wang y cols., 2001; Wilson y cols., 2002). Por lo

tanto, se decidió realizar el estudio temporal de dicha respuesta nociceptiva.

Al analizar las curvas temporales del efecto nociceptivo de formalina al 2.5%

se observó que las curvas son distintas en ambas cepas (figura 13). Al comparar los

valores de respuesta nociceptiva a diferentes tiempos tras la inyección de 2.5% de

formalina se comprobó que eran significativamente menores en SDU que en W a los

99


10, 15 y 20 minutos (SDU vs W: 44±24 vs 186±42; p<0.001, 102±51 vs 206±31;

p<0.05 y 104±48 vs 257±18 s; p<0.001, respectivamente).

0 10 20 30 40 50 60 700

100

200

300

400 SDUW

***

***

*

tiempo tras formalina (min)

tiem

po d

e la

mid

o +

elev

ació

n (s

eg)

Figura 13. Evolución temporal del efecto nociceptivo de la inyección de formalina al 2.5%. Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla. Los valores de tiempo de lamido + elevación, obtenidos para cada cepa, en los distintos periodos de 5 minutos tras la inyección de formalina se compararon con un test de Bonferroni: * p<0.05, *** p<0.001 SDU vs W. n=6 animales por grupo.

Factor F (g.l. factor, residual) Valor pTiempo F(11, 120)=15.02 p<0.001

Cepa F(1, 120)=25.70 p<0.001Tiempo-Cepa F(1, 120)=3.70 p<0.001

100


El curso temporal de respuesta nociceptiva observada tras la inyección de

formalina, tanto al 1.5% como al 2.5%, fue similar a la respuesta típica ampliamente

descrita en la literatura. Tras la aparición brusca de la respuesta nociceptiva (fase

aguda) se produjo una disminución de la respuesta (interfase), para posteriormente

aumentar y mantenerse elevada de manera prolongada (fase tónica) (Abbott y cols.,

1995). En el presente trabajo, se aprecia que los animales de la cepa SDU

presentaron una interfase más acusada y prolongada que los de la cepa W. Se ha

sugerido recientemente que el periodo entre ambas fases corresponde a una

inhibición activa del dolor que no precisa de centros supraespinales, y que el estrés

disminuye la nocicepción en el test de la formalina al prolongar la interfase, aunque

sin disminuir ninguno de los dos picos de respuesta nociceptiva (Abbott y cols.,

1995; Henry y cols., 1999). Por ello, estos resultados apuntan a que los animales de

la cepa SDU presentan un mayor tono inhibitorio de la nocicepción que los de la

cepa W durante la interfase, lo que podría ser debido a un mayor efecto del estrés.

Para la evaluación del efecto antinociceptivo de morfina se utilizó formalina a

una concentración del 1.5%, debido a las diferencias intercepa en la nocicepción

inducida por formalina al 2.5%. De esta manera partimos de una nocicepción basal

semejante en ambas cepas de ratas, que permite la valoración de posibles diferencias,

entre ellas, en el efecto antinociceptivo de este analgésico opioide. Al analizar las

curvas dosis-efecto antinociceptivo de morfina realizadas en animales de ambas

cepas no se encontraron diferencias en la primera fase de respuesta nociceptiva,

mientras que en la segunda fase de respuesta aparecieron diferencias significativas

entre cepas en dichas curvas (figura 14), siendo los valores de DE50 estimados

significativamente menores en SDU que en W (DE50=1.25±0.34 mg/Kg en SDU y

3.15±0.48 mg/Kg en W; p<0.05). Además, los valores de respuesta nociceptiva tras

administrar morfina a dosis de 1.2 y 2.5mg/Kg, fueron significativamente inferiores

101


en la cepa SDU que en la cepa W (SDU vs W: 1029±416 vs 2094±199 s y 856±132

vs 1900±133 s, respectivamente; p<0.01 en ambos casos).

102


A

00

100

200

300

400 SDUW

1 10Dosis de morfina (mg/Kg)

Tiem

po d

e la

mid

o +

elev

ació

n (s

eg)

B

Factor F (g.l. factor, residual) Valor

pDosis F(3, 39)=2.96 p<0.05Cepa F(1, 39)=1.52 n.s.


103


00

1000

2000

3000

****

1 10Dosis de morfina (mg/Kg)

Tiem

po d

e la

mid

o +

elev

ació

n (s

eg)

Figura 14. Curva dosis-efecto antinociceptivo de morfina en el test de la formalina: (A) durante la primera fase de respuesta nociceptiva (0-10 min tras inyección), (B) durante la segunda fase de respuesta nociceptiva (10-60 min tras inyección). Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla. Los valores de tiempo de lamido + elevación de la pata inyectada, obtenidos con cada dosis de morfina, se compararon entre cepas con un test de Bonferroni: ** p<0.01 SDU vs W. n=5-7 animales por dosis y cepa.

El efecto de morfina en la primera fase de este test, aunque significativo, es

más bien escaso comparado con el obtenido en la segunda fase, lo que concuerda con

lo descrito previamente por otros autores (Jourdan y cols., 1997). Los rangos en los



104


que morfina ejerce su efecto antinociceptivo en la segunda fase del test observados

en este estudio son semejantes a los descritos por otros autores (Abbott y cols., 1995;

Watson y cols., 1997; Jourdan y cols., 1997; Gilbert y cols., 2002).

Por otro lado, en el presente estudio aparecieron diferencias entre cepas en la

potencia de morfina para inhibir la respuesta nociceptiva en la segunda fase, sin que

se observaran en la primera. Resultado semejante al obtenido por Lutfy y cols.

(1996) en el modelo de ratones HA y LA.

Estos resultados sugieren que los mecanismos responsables del efecto

antinociceptivo de morfina o de la modulación del mismo difieren entre las dos fases

de este test, y que los involucrados en la segunda fase son diferentes entre las ratas

SDU y W. Así, el sistema opioide endógeno podría estar implicado en las diferencias

observadas en el presente estudio, ya que el mismo ejerce una modulación de la

nocicepción ejercida por formalina, que difiere según la fase (König y cols., 1996;

Wang y cols., 2001; Wu y cols., 2002; Martin y cols., 2003b; Zhao y cols., 2003).

Además, puesto que la interfase, más acusada y prolongada en SDU que en W, está

modulada por el estrés, que es capaz de potenciar el efecto antinociceptivo de

morfina (Appelbaum y Holtzman, 1985; Abbott y cols., 1995; Woolfolk y Holtzman,

1995; Calcagneti y cols., 1990), las diferencias en la interfase también podrían estar

relacionadas con las diferencias en el efecto antinociceptivo de morfina.

Al igual que las ratas SDU, los ratones HA son más sensibles al efecto

antinociceptivo de morfina en los tests térmicos, y en la segunda fase del test de la

formalina, presentando similar sensibilidad en la primera fase (Panocka y cols.,

1986; Kest y cols., 1993; Lutfy y cols., 1996). Ello sugiere la existencia de

diferencias entre, la primera fase de respuesta en el test de la formalina, y la segunda

fase y tests térmicos, en el mecanismo de acción de morfina o en su modulación. A la

vez que apunta la existencia de un gran paralelismo entre los fenómenos

responsables de las características de las ratas SDU y los ratones HA.

4.1.2.- EFECTOS COLATERALES.

105


En la clínica, el tratamiento del dolor con opioides dista de ser ideal debido,

entre otros factores, a sus efectos secundarios y al riesgo de que se desarrolle

tolerancia, dependencia y adicción (McQuay, 2001). En este sentido, distintos grupos

han intentado abordar el problema, con el fin de clarificar la existencia de correlación

en la sensibilidad a los distintos efectos de morfina (Way et al., 1969; Trujillo and

Akil, 1991; Lufty y cols., 1994; Kest y cols., 1998b; Zhu y cols., 1999; Kest y cols.,

2002b; Nitsche et al., 2002). En el presente trabajo se analizaron tres de los efectos

colaterales más importantes de la utilización de estos fármacos: la tolerancia al efecto

antinociceptivo, la dependencia tras una exposición continuada a morfina, y el efecto

adictivo de este agonista. Debido a la diferente sensibilidad a morfina de las cepas

utilizadas en este estudio, para evaluar los efectos derivados de la administración

crónica de morfina (desarrollo de tolerancia y dependencia), se adoptó una estrategia

experimental que consistió en el estudio de estos efectos tras la administración de

dosis equianalgésicas de morfina en ambas cepas, de manera que permitiera

determinar posibles diferencias en estos efectos indeseados al utilizar dosis

equivalentes.

4.1.2.1.- DESARROLLO DE TOLERANCIA AL EFECTO

ANTINOCICEPTIVO.

De manera similar a lo que ocurre con la sensibilidad o resistencia al efecto

analgésico de morfina, se ha comprobado que existe variabilidad interindividual en la

respuesta al tratamiento crónico con opioides. Así, mientras que determinados

pacientes requieren rápidamente incrementos en la dosis de estos fármacos para

aliviar su dolor, otros logran controlarlo durante largo tiempo con una dosis

constante (Foley, 1993). En este sentido, diversos estudios que han comparado

distintas cepas de roedores han encontrado diferencias entre éstas en el desarrollo de

tolerancia a opioides (Oliverio y cols., 1975; Vaccarino y Couret, 1995; Hoffman y

cols., 1998; Mas y cols., 2000; Kest y cols., 2002).

En las cepas de animales utilizadas en este estudio ya se había comprobado

que existian diferencias en el desarrollo de tolerancia. Así, con el tratamiento

continuado durante 9 días de morfina (10 mg/Kg/12h) en los animales SDU no se

106


producía el esperado descenso en el efecto antinociceptivo, dada su mayor

sensibilidad a morfina, aunque las curvas dosis-efecto se desplazaban a la derecha de

manera similar (Más y cols., 2000). En el presente trabajo, se pretendió valorar el

desarrollo de tolerancia en ambas cepas, pero utilizando las dosis mínimas con las

que se conseguía el 100% de MEP. Por ello, la cepa W fue tratada con 9.6 mg/Kg y

la cepa SDU con 3.4 mg/Kg, administrándose la morfina en ambas cepas cada 12

horas durante 9 días. Con esta pauta de tratamiento se evaluó la evolución temporal

del efecto antinociceptivo y se realizaron curvas dosis-efecto los días 1o y 9o de

tratamiento. Esta pauta indujo una disminución significativa del efecto

antinociceptivo en ambas cepas de ratas (figura 15), aunque no se detectaron

diferencias significativas entre cepas en el efecto antinociceptivo obtenido con estas

dosis de morfina a lo largo de dicho tratamiento.

107


1 3 5 7 90

20

40

60

80

100

WSDU

Día de tratamiento

%M

EP

Figura 15. Evolución del efecto antinociceptivo de la DE100 en el test TF (3.4 y 9.6 mg/Kg, en SDU y W respectivamente) inicial de morfina a lo largo del tratamiento crónico administrado cada 12h. Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las curvas se compararon con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla. n=9-16 animales por grupo.

Por lo tanto, si los animales SDU son tratados crónicamente con su DE100 (3.4

mg/Kg) se origina descenso del efecto antinociceptivo a lo largo del tratamiento

similar a los animales W. La discrepancia con los resultados anteriores obtenidos por

Más y cols. (2000) es debida a las diferentes dosis de morfina utilizada (10 mg/Kg),

que son dosis supramáximas para esta cepa y que siguen originando, tras varios días

de tratamiento el 100% de MEP.

Factor F (g.l. factor,

residual)

Valor p

Día F(4, 122)=16.45 p<0.001Cepa F(1, 122)=2.29 n.s.

Día-Cepa F(4, 122)=0.34 n.s.

108


En el presente trabajo, el análisis de las curvas dosis-efecto antinociceptivo de

morfina, obtenidas el día 1o y 9o de tratamiento, reveló que en ambas cepas de ratas

las curvas obtenidas el 9o día fueron significativamente diferentes de las obtenidas el

1er día. Así, los valores de %MEP obtenidos el 1er día fueron significativamente

mayores que los obtenidos el 9º con dosis de 0.6 a 3.4 mg/Kg en la cepa SDU, y al

administrar dosis de 1.7 a 13.5 mg/Kg en la cepa W (figura 16). Además, en ambas

cepas de ratas los valores estimados de DE50 obtenidos el 9o día fueron

significativamente superiores (p<0.001) a los del 1er día, apareciendo un grado de

tolerancia (indice DE50 9o día/ DE50 1er día) similar en ambas cepas (tabla VI). Por lo

tanto, estas pautas de tratamiento indujeron una perdida de la potencia

antinociceptiva de morfina significativa, pero similar en ambas cepas de ratas.

109


0.1 1 10 1000

20

40

60

80

100

*

***

***

***

*** **

*

SDU TolerantesSDU


%M

EP


residual)

Valor p

Dosis F(9, 122)=27.85 p<0.001Día F(1, 122)=160.20 p<0.001

Dosis-Día F(9, 122)=8.43 p<0.001

110


1 10 1000

20

40

60

80

100 *

*** **

* *** **

***

***

*

WW Tolerantes


%M

EP

Figura 16. Curvas dosis-efecto antinociceptivo de morfina evaluada en el test TF, correspondientes a animales que previamente no han recibido morfina y de animales tratados crónicamente durante 8 días (tolerantes) con la correspondiente DE100/12h (3.4 y 9.6 mg/Kg/12h, para SDU y W respectivamente). Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las curvas se compararon con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en las tablas. Las comparaciones entre animales tolerantes y no tolerantes para los valores de %MEP, obtenidos con cada dosis de fármaco, se analizaron con un test de Bonferroni: * p<0.05, *** p<0.001 tolerantes vs no tolerantes. n=6-16 animales por dosis y cepa.


residual)

Valor p

Dosis F(9, 174)=19.59 p<0.001Día F(1, 174)=161.30 p<0.001

Dosis-Día F(9, 174)=7.78 p<0.001

111


Tabla VI. DE50 en animales no tratados y tolerantes de las cepas SDU y W, y sus correspondientes índices DE50.

CEPA DE50 Índice DE50NO TRATADAS TOLERANTESSDU 0.75±0.04 3.82±0.25 *** 5.1

W 1.45±0.06 8.53±0.61 *** 5.9

*** p<0.001 vs no tratadas. Índice DE50 = DE50 9o día/ DE50 1er día.

Por otro lado, al comparar las curvas de ambas cepas obtenidas tras este tratamiento

crónico durante 8 días con la correspondiente DE100 de morfina cada 12 horas, se

comprobó que dichas curvas eran distintas. Además, los valores estimados de DE50

son significativamente menores (p<0.001) en las ratas de la cepa SDU, que en las de

la cepa que en W. Así mismo, los valores de %MEP obtenidos con 3.4, 4.8, 6.8 y 9.6

mg/Kg de morfina fueron significativamente mayores en la cepa SDU que en la cepa

W (SDU vs W: 54.6±13.9 vs 12.5±9.8; p<0.05, 67.4±16.9 vs 24.9±6.3; p<0.01,

79.7±14.7 vs 29.6±11.0; p<0.001 y 100±0 vs 62.0±7.1%; p<0.05, respectivamente).

Por lo tanto, sigue apareciendo una mayor potencia antinociceptiva de este fármaco

en las ratas de la cepa SDU con respecto a las de la cepa W tras el desarrollo de

tolerancia (figura 17).

112


1 10 1000

20

40

60

80

100 *** *

**

*SDU TolerantesW Tolerantes


%M

EP

Figura 17. Curvas dosis-efecto antinociceptivo de morfina evaluado en el test TF, en animales tolerantes de ambas cepas. Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las curvas correspondientes a ambas cepas se compararon con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla. Las comparaciones entre cepas para los valores de %MEP, obtenidos con cada dosis de fármaco, se realizaron con un test de Bonferroni: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 SDU vs W. n=6-16 animales por dosis y cepa.


residual)

Valor p

Dosis F(9, 145)=32.94 p<0.001Cepas F(1, 145)=26.44 p<0.001

Dosis-Cepa F(9, 145)=3.84 p<0.001

113


Por consiguiente, con la administración de dosis equianalgésicas de morfina,

ambas cepas desarrollan un grado similar de tolerancia a este fármaco, lo que sugiere

la existencia de una correlación entre efecto antinociceptivo y tolerancia. Sin

embargo, hay que considerar que cuando se utilizan las mismas dosis en ambas cepas

la tolerancia desarrollada también es semejante (Más y cols., 2000), lo que no apoya

dicha correlación, y sugiere que el grado de tolerancia desarrollado en los animales

SDU no depende de la intensidad del tratamiento recibido. En este sentido, distintos

estudios han demostrado que ambos fenómenos no están ligados, y que con distintas

manipulaciones se puede modificar uno sin alterar el otro (Trujillo y Akil, 1991;

Suzuki y cols., 1992; Kest y cols., 1996; Hepburg y cols., 1997; Zhu y cols., 1999;

Tsuji y cols., 2000; Nitsche y cols., 2002). Además, mediante estudios con diferentes

cepas de roedores, se ha confirmado que la sensibilidad al efecto antinociceptivo y la

tolerancia a opioides poseen diferentes bases genéticas (Lutfy y cols., 1994;

Vaccarino y cols., 1995; Kest y cols., 2002). Puesto que las ratas SDU y las W

desarrollan similar tolerancia al ser tratadas con igual dosis (Más y cols., 2000), ello

corroboraría la falta de relación entre ambos efectos.

En los últimos años, se ha descrito ampliamente un fenómeno, estrechamente

relacionado con la tolerancia a estos fármacos, denominado dolor inducido por

opioides (para revisión ver Vanderah y cols., 2001; Ossipov y cols., 2003). Este

fenómeno consiste en la aparición de hiperalgesia tras la administración de opioides.

En este sentido, se ha especulado que los opioides administrados durante un tiempo

prolongado mantienen su nivel de eficacia, pero el concurrente fenómeno de

hiperalgesia se contrapone al efecto antinociceptivo de estos produciendo la

impresión de tolerancia (Colpaert, 1996; Laulin y cols., 1999).

En este estudio, se observa que la administración crónica de dosis

equianalgésicas de morfina en ambas cepas de ratas originó un descenso significativo

de la latencia basal al estímulo nociceptivo térmico, a lo largo del tratamiento, siendo

este descenso similar en ambas cepas de ratas (figura 18).

114


1 3 5 7 93.0

3.5

4.0

4.5

5.0 WSDU

Día de tratamiento

Late

ncia

bas

al (s

eg)

Figura 18. Evolución de la latencia basal en el test TF a lo largo del tratamiento crónico con la DE100%/12h (3.4 y 9.6 mg/Kg/12h, en SDU y W respectivamente). Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se representan en la tabla. n=12-16 animales por grupo.


residual)

Valor p

Día F(4, 130)=8.49 p<0.001cepa F(1, 130)=0.01 n.s.

Día-Cepa F(4, 130)=0.19 n.s.

115


Por lo tanto, el tratamiento crónico equianalgésico utilizado en este trabajo

para desarrollar tolerancia desencadena de forma similar en ambas cepas, tanto la

tolerancia como la hiperalgesia. Este resultado concuerda con lo descrito

previamente por otros autores para ratón, en donde se ha observado la existencia de

una correlación entre la magnitud de la tolerancia y la de la hiperalgesia

desencadenada por morfina, lo que apoya la existencia de sustratos genéticos

similares en ambos fenómenos (Kest y cols., 2002).

En conjunto, los resultados de estos experimetos permiten concluir que la

utilización de dosis menores de morfina en SDU con respecto a W no se relacionan

con un menor desarrollo de tolerancia o de hiperalgesia inducida por este opioide,

aunque generan el mismo efecto antinociceptivo.

4.1.2.2.- DESARROLLO DE DEPENDENCIA FÍSICA: SÍNDROME DE

ABSTINENCIA A MORFINA PRECIPITADO POR NALOXONA.

Con el fin de analizar la dependencia física a morfina, se compararon los

signos del síndrome de abstinencia desencadenado por naloxona en animales de

ambas cepas. En ratas de la cepa SDU se utilizaron dos pautas de tratamiento

diferentes (ver material y métodos), con el fin de comparar el síndrome

desencadenado en W con el que apareciese en SDU con la misma pauta (de 9.6 a 48

mg/Kg/12h) y con una pauta equivalente en respuesta antinociceptiva (de 3.4 a 17

mg/Kg/12h). Se pretendía determinar si la mayor potencia antinociceptiva de morfina

en los animales de la cepa SDU se acompaña de diferencias en la magnitud de la

dependencia física a este opioide.

La administración de naloxona a ratas de ambas cepas, tratadas crónicamente

con la misma pauta de morfina, indujo un síndrome de abstinencia caracterizado por

diversos signos conductuales, hipotermia y pérdida de peso. Estos signos

conductuales y fisiológicos no difirieron de forma relevante de una cepa a otra. Los

animales SDU tratados con con la pauta de dosis bajas (de 3.4 a 17 mg/Kg/12h)

también mostraron signos del síndrome de abstinencia, algunos de los cuales fueron

significativamente menores que los obtenidos en los animales de la misma cepa

tratados con dosis altas, aunque similares a los originados en la cepa W (tabla VII).

116


Tabla VII. Signos fisiológicos y conductuales del síndrome de abstinencia a morfina desencadenado por naloxona.

SDU SDUe SDUc W WcHipotermia (ºC) 1.2±0.3 *** 0.8±0.3 ** 0.0±0.0 1.8±0.4 *** 0.0±0.0

Pérdida de peso (g) 9.0±1.0 *** 4.4±1.7 * ++ 0.8±0.2 7.4±1.0 *** 1.4±0.4Salivación (periodos) 1.0±0.7 0.1±0.1 0.0±0.0 0.4±0.3 0.0±0.0

Diarrea (periodos) 1.7±0.7 * 1.1±0.6 0.0±0.0 1.7±0.4 ** 0.1±0.1Ptosis (periodos) 5.8±0.2 *** 3.8±0.6 *** ++ 0.0±0.0 4.5±0.6 *** 0.0±0.0Masticación (nº) 13.8±4.0 * 10.0±5.6 * 0.0±0.0 9.8±4.1 0.5±0.5

Castañeteo dientes (nº) 1.7±1.5 12.3±4.0 ** ++ 0.2±0.2 16.2±3.6 ** + 1.0±0.7Salto (nº) 19.0±6.0 *** 0.1±0.1 +++ 0.0±0.0 8.5±4.4 0.0±0.0

SDUc y Wc: controles; SDU y W: dosis crecientes iguales; SDUe: dosis crecientes equianalgésicas. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 vs. control; +

p<0.05, ++ p<0.01, +++ p<0.001 vs SDU. n=6–13 animales por grupo.

Los valores de la Puntuación Global del síndrome de abstinencia fueron

significativamente mayores en los tres grupos de animales tratados con morfina que

en sus correspondientes controles (p<0.01 en SDU con la pauta de dosificación baja,

y p<0.001 en W y SDU con la pauta de dosificación mayor). Los animales SDU

tratados con la pauta de dosificación más baja muestran valores de Puntuación

Global (15.9±4.7) significativamente inferiores (p<0.05), que los tratados con la

pauta mayor de su misma cepa SDU (28.6±4.8). En los animales de la cepa W la

Puntuación Global (25.0±5.7) fue similar a la obtenida en la cepa SDU tratada con la

pauta de dosis equianalgésica (15.9±4.7 y 28.6±4.8, respectivamente; p>0.05) (figura

19).

117


SDUc SDUe SDU Wc W0

10

20

30

40***

**

***

+

Punt

uaci

ón g

loba

l

Figura 19. Puntuación Global del síndrome de abstinencia desencadenado por naloxona tras la administración de dosis crecientes morfina durante 6 días (SDU y W de 9.6 a 48 mg/Kg/12h, y SDUe pauta equianalgésica de 3.4 a 17 mg/Kg/12h). Los correspondientes animales control (SDUc y Wc) recibieron salino. Los valores representan los valores medios ± error estándar. ** p<0.01, *** p<0.001 vs control, +

p<0.05 vs SDU. n=6-13 animales por grupo.

Los signos bioquímicos de la abstinencia se analizaron midiendo la actividad

adenilato ciclasa. En los animales SDU tratados con la pauta alta de morfina, la

actividad adenilato ciclasa en membranas de caudado–putamen fue

significativamente mayor que en animales controles y que en animales tratados con

la pauta baja (SDU vs SDUc y SDUe: 57.3±2.2 vs 46.7±3.3 y 41.7±3.8 pmol/mg de

proteína/min; p<0.05), pero no significativamente diferente a la obtenida en W

(46.5±3.5 pmol/mg de proteína/min; p=0.0555).

En este estudio se ha comprobado que la administración de naloxona

desencadenó la aparición de distintos signos característicos del síndrome de

abstinencia en los animales tratados con morfina, sin que apareciesen en los tratados

118


con salino. Estos signos fueron similares cualitativa y cuantitativamente a los

descritos previamente por otros autores en rata (Maldonado y cols., 1995). En los

animales de la cepa SDU se han utilizado dos protocolos de dosis crecientes de

morfina para desarrollar dependencia debido a la mayor potencia antinociceptiva en

esta cepa de ratas. De este modo, estos animales han sido tratados con una pauta

estándar y con otra equianalgésica con respecto a la cepa W, lo que ha permitido

realizar comparaciones inter e intracepa más válidas. Con ello se ha podido

comprobar que el síndrome de abstinencia, tanto a nivel conductual, fisiológico (por

signos independientes y puntuación global), y bioquímico, no difiere entre ambas

cepas, y que en los animales SDU la intensidad del síndrome es mayor con pautas de

tratamiento más agresivas. Si bien es cierto que no existe un completo paralelismo

entre los resultados de la actividad adenilato ciclasa y los de la puntuación global, sí

que aparece gran similitud con el salto, que ha sido considerado como un signo

clásico de la abstinencia a morfina. Y en cualquier caso los resultados obtenidos con

la actividad adenilato ciclasa son coherentes con el resto de resultados apoyando la

fiabilidad de estos resultados.

A pesar de que otros autores han demostrado la existencia de diferencias entre

cepas de roedores en los síntomas del síndrome de abstinencia (Hoffmann y cols.,

1998; Kest y cols., 1998b), en el presente trabajo, no se observaron grandes

diferencias entre cepas. Con estos resultados, parece poco probable que el fenómeno

responsable del comportamiento de la cepa SDU esté afectando también el proceso

neurobiológico de la dependencia física a morfina. Esta disociación genética entre

sensibilidad al efecto antinociceptivo opioide y abstinencia, había sido descrita

previamente en ratón por otros autores. En los ratones HA, que son más sensibles al

efecto antinociceptivo opioide, no se encontraron diferencias en el síndrome de

abstinencia (Panocka y cols., 1986; Kest y cols., 1993; Lutfy y cols., 1996; Kest y

cols., 1998b).

En cuanto a la relación entre los efectos derivados de la administración

crónica de opioides, los resultados son contradictorios. Algunos estudios, sugieren

que los fenómenos de tolerancia y dependencia física tendrían una base diferente,

mientras otros apoyan la existencia de una relación entre ambos (Kest y cols., 2002;

119


Nitsche y cols., 2002). Los resultados del presente trabajo apoyan una base común

aunque independiente de la sensibilidad nociceptiva.

4.1.2.3.- EFECTO ADICTIVO: PREFERENCIA DE PLAZA

CONDICIONADA POR MORFINA.

La capacidad adictiva de los opioides es también otro de los principales

problemas derivados de la utilización de estos fármacos (Schnoll y Weaver, 2003).

Por lo tanto, al igual que con la tolerancia y la dependencia física, se planteó analizar

la posible relación entre la mayor potencia antinociceptiva de morfina en los

animales de la cepa SDU y los efectos recompensantes inducidos por este agonista

opioide. Para ello se utilizó un método comportamental ampliamente extendido que

permite evaluar los efectos de recompensa promovidos por la administración de

morfina, que es el denominado test de la preferencia de plaza condicionada

(Tzschentke, 1998).

En este trabajo, la permanencia en las cajas asociadas a morfina fue similar en

los animales SDU y los W durante la sesión de precondicionamiento (puntuación:

658±42 y 672±25 s, respectivamente; figura 20). Tras el periodo de

condicionamiento, morfina indujo preferencia de plaza en ambas cepas, aunque no se

observaron diferencias significativas entre ellas en las curvas dosis-efecto obtenidas,

estando los incrementos del tiempo de permanencia en el compartimento asociado a

morfina, con respecto a la fase de precondicionamiento, en el rango de los descritos

previamente para rata (Shoaib y cols., 1995).

A pesar de no observarse diferencias significativas en las curvas dosis-

respuesta, la dosis necesaria para inducir esta preferencia fue menor en SDU que en

W. Así, los animales de la cepa SDU, con 5 mg/Kg de morfina ya presentaron un

incremento significativo del valor de puntuación con respecto al de la fase de

precondicionamiento (902±67 vs 658±42 s, p<0.05), mientras que en los animales de

la cepa W la dosis de morfina necesaria fue 10 mg/Kg (911±39 vs 672±25 s, p<0.05)

(figura 20). Por lo tanto, estos resultados parecen apuntar a que, si bien no existen

diferencias importantes entre cepas en el tiempo de permanencia en la caja asociada a

120


morfina, las ratas de la cepa SDU presentan una sensibilidad ligeramente mayor al

efecto condicionante de morfina que las de la cepa W.

Precond.500

600

700

800

900

1000 SDUW

1.25 5 10

**

*


Punt

uaci

ón (s

eg)

Figura 20. Curva dosis-efecto de la preferencia de plaza condicionada por morfina. Los puntos representan los valores medios ± error estándar de puntuación, en la fase de precondicionamiento (Precond.) y en la fase de test tras el condicionamiento con distintas dosis de morfina (1.25, 5 y 10 mg/Kg). Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA


residual)

Valor p

Dosis F(3, 76)=6.46 p<0.001cepa F(1, 76)=0.83 n.s.


121


de dos vía, y los resultados se expresan en la tabla. Las comparaciones de los valores obtenidos en cada cepa con cada una de las dosis de morfina con respecto al precondicionamiento se realizaron con un test de Dunnett: * p<0.05 vs precondicionamiento. n=8-16 animales por grupo.

122


Las diferencias entre cepas de roedores en cuanto a preferencia de plaza

condicionada por morfina han sido descritas por distintos autores (Cunningham y

cols., 1992; Guitart y cols., 1992; Shoaib y cols., 1995; Semenova y cols., 1995). Así,

se han descrito diferencias entre las cepas Sprague-Dawley y Wistar (de otros

proveedores) en el efecto recompensante de morfina, así como en las dosis precisas

de este fármaco para la aparición de preferencia de plaza condicionada. De manera

similar, en el presente estudio se observa que las ratas de la cepa W precisan una

mayor dosis de morfina (10 mg/Kg) que las de la cepa SDU (5 mg/Kg) para

desarrollar preferencia de plaza de forma significativa, aunque, a diferencia del

estudio de Shoaib y cols. (1995), no se detectan diferencias entre cepas en la

magnitud de la preferencia de plaza observada.

En nuestro modelo, la mayor potencia antinociceptiva de morfina en la cepa

SDU y las otras diferencias observadas se acompañan de una mayor sensibilidad al

efecto recompensante de este fármaco. En otros modelos animales se sugiere que la

relación entre antinocicepción y adicción podría ser inversa o no existir. Así, las ratas

de la cepa F344, que son más sensibles a morfina que las ratas Lewis (Morgan y

cols., 1999; Cook y cols., 2000), presentan menor preferencia de plaza condicionada

por este fármaco (Guitart y cols., 1992). Por el contrario, estudios realizados en

distintas cepas de ratones sugieren la ausencia de correlación de cualquier tipo entre

la antinocicepción y la adicción a morfina (Semenova y cols., 1995). Sin embargo,

los resultados de este estudio si que parecen apuntar a que en SDU la sensibilidad a

los efectos antinociceptivos y recompensantes de morfina se deba a un mismo

mecanismo subyacente. Los múltiples factores implicados en estos procesos y/o

características genéticas individuales de las cepas de roedores podrían explicar las

divergencias.

123


4.2.- DISECCIÓN FARMACOLÓGICA DE LOS RECEPTORES OPIOIDES

IMPLICADOS EN LAS DIFERENCIAS NOCICEPTIVAS.

Se ha realizado un análisis farmacológico, mediante la utilización de

agonistas y antagonistas opioides, para intentar esclarecer el/los receptores

implicados en las diferencias observadas entre estas cepas.

4.2.1.- EFECTO ANTINOCICEPTIVO DE AGONISTAS OPIOIDES.

Se ha evaluado el efecto antinociceptivo de diversos agonistas opioides, que

difieren en la preferencia por los distintos tipos de receptores opioides y en otras

propiedades farmacológicas.

4.2.1.1.- AGONISTAS µ (FENTANILO, METADONA Y 3-d).

En este estudio se han utilizado distintos fármacos agonistas de los receptores

µ, los cuales podrían presentar diferencias farmacológicas entre ellos, en las que

estarían implicadas el subtipo de receptor µ que activan, la posibilidad de

interaccionar además con otros sistemas de neurotransmisión, como los receptores

NMDA, así como el grado de selectividad de la interacción fármaco-receptor, y

desde luego en su farmacocinética (Rossi y cols., 1996; Plesan y cols., 1999;

Jagerovic y cols., 2002).

FENTANILO.

Se decidió comprobar el efecto de fentanilo puesto que resultados previos de

otros grupos apuntaban la posibilidad de diferentes mecanismos receptoriales entre

morfina y otros agonistas µ. Rossi y Cols. (1996) han sugerido que este fármaco

podría actuar a través de un receptor diferente al de morfina, ya que los ratones

CXBK, que son relativamente insensibles a morfina, conservan la sensibilidad al

efecto antinociceptivo de fentanilo, heroína, 6-acetil-morfina, morfina-6β-

glucuronido y etonitazina. Además, el ratón knockout carente del exon-1 del MOR-1,

a pesar de carecer de efecto antinociceptivo inducido por morfina, conserva el

inducido por otros agonistas µ como morfina-6β-glucurónido, heroína y

124


[Dmt1]DALDA (Schuller y cols., 1999; Neilan y cols., 2003). Se ha descrito también

la potenciación entre distintos agonistas µ que actuarían a través de subtipos distintos

de este receptor (Bolan y cols., 2002). Por ello, se analizó el efecto antinociceptivo

de fentanilo con el fin de estudiar la posibilidad de que un agonista que actúa sobre

un receptor µ hipotéticamente distinto al de morfina, pudiera no diferir en su

potencia entre las ratas de las cepas SDU y W, lo que sugeriría que en las diferencias

intercepa encontradas con morfina se encuentre implicado sólo un “subtipo” de

receptor µ.

Al analizar las curvas dosis-efecto antinociceptivo de fentanilo de ambas

cepas de ratas se observó que las curvas obtenidas son distintas, estimándose valores

de DE50 significativamente menores en ratas de la cepa SDU que en W

(DE50=4.2±0.1µg/Kg en SDU y 17.2±2.0µg/Kg en W; p<0.001), lo que implica una

mayor potencia de este agonista µ en las ratas de la cepa SDU con respecto a las W

(figura 21). Además, los valores de %MEP obtenidos con 5, 10 y 20µg/Kg de

fentanilo fueron significativamente mayores en la cepa SDU que en la cepa W (SDU

vs W: 63.9±12.8 vs 10.1±3.3, 97.2±2.3 vs 16.5±5.1 y 100±0 vs 61.6±11.6%,

respectivamente; p<0.001 en ambos casos).

125


1 10 1000

20

40

60

80

100SDUW***

******

Dosis de fentanilo (µ g/Kg)

%M

EP

Figura 21. Curva dosis-efecto antinociceptivo de fentanilo evaluado en el test TF. Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla de la figura. Los valores de %MEP, obtenidos con cada dosis de fentanilo, se analizaron con un test de Bonferroni: *** p<0.001 SDU vs W. n=6-15 animales por dosis y cepa.


residual)

Valor p

Dosis F(6, 123)=29.82 p<0.001Cepa F(1, 123)=46.22 p<0.001

Dosis-Cepa F(6, 123)=8.70 p<0.001

126


El hecho de que fentanilo, a pesar de tratarse de un agonista µ que podría

actuar sobre un receptor distinto del de morfina (Rossi y cols., 1996; Schuller y cols.,

1999; Bolan y cols., 2002; Neilan y cols., 2003), sea también más potente en las ratas

de la cepa SDU con respecto a las de la cepa W, sugiere que el mecanismo es

independiente de las acciones selectivas de “subtipos” de receptor µ.

METADONA.

La metadona es un opioide activo por vía sistémica que difiere, en algunos

aspectos, de otros opioides clásicos como morfina. Así, si bien se trata de un agonista

opioide con mayor actividad intrínseca que morfina en la activación del receptor µ,

también posee considerable afinidad por el receptor δ, y además se une a los

receptores NMDA con baja afinidad, actuando como un antagonista no competitivo

(Paronis y Holtzman, 1992; Ebert y cols., 1995; Gorman y cols., 1997; Gourlay,

1999).

Se ha descrito la potenciación del efecto antinociceptivo de morfina vía

sistémica con la coadministración de antagonistas no competitivos de receptores de

NMDA como dextrometorfano y MK-801 o con antagonistas competitivos como

CGS-19755, por lo que se ha sugerido que el efecto de metadona podría derivar de

una combinación de su actividad opioide y su actividad como antagonista del

receptor NMDA (Grass y cols., 1996; Hoffmann y Wiesenfeld-Hallin, 1996; Bulka y

cols., 2002). Por ello, se ha insinuado que las diferencias entre algunas cepas de ratas

en la sensibilidad a morfina podrían estar mediadas por diferencias en la actividad

del receptor NMDA, que a su vez modulara el efecto de morfina (Plesan y cols.,

1999). Bulka y cols. (2002) encontraron diferencias en el efecto antinociceptivo de

morfina y metadona entre subcepas de ratas Sprague-Dawley, así como en su

potenciación por dextrometorfano, y por ello sugirieron la participación de los

receptores NMDA en estas diferencias.

Teniendo en cuenta las consideraciones previas, una posible explicación para

la mayor potencia antinociceptiva de morfina en las ratas SDU respecto a las W,

podría ser que esta cepa presente una menor activación de los receptores NMDA que

los animales de la cepa W. Así, al utilizar metadona cabría esperar que disminuyera

127


el efecto de la activación de los receptores NMDA, y con ello las diferencias entre

cepas en la potencia antinociceptiva de este fármaco con respecto a las observadas

con morfina.

En el presente estudio, los resultados obtenidos con metadona son semejantes

a los que aparecen con morfina y fentanilo. Las curvas obtenidas son distintas para

cada cepa, estimándose valores de DE50 significativamente inferiores en ratas de la

cepa SDU, que en las de la cepa que en W (DE50=0.82±0.01 mg/Kg en SDU y

1.31±0.19 mg/Kg en W; p<0.05), lo cual implica una mayor potencia también de este

agonista µ en las ratas de la cepa SDU con respecto a las W (figura 22). Además, los

valores de %MEP obtenidos con 0.85, 1.2 y 1.7 mg/Kg de metadona fueron

significativamente superiores en la cepa de ratas SDU que en la W (SDU vs W:

57.1±9.2 vs 15.9±6.3; p<0.01, 94.5±2.9 vs 55.5±11.4; p<0.05 y 95.9±4.1 vs

56.1±10.3%; p<0.01, respectivamente).

1 100

20

40

60

80

100SDUW

**

* **

Dosis de metadona (mg/Kg)

%M

EP

Figura


residual)

Valor p

Dosis F(5, 143)=25.80 p<0.001Cepa F(1, 143)=29.96 p<0.001

Dosis-Cepa F(5, 143)=4.30 p<0.01

128


obtenidos con cada dosis de metadona, se analizaron con un test de Bonferroni: * p<0.05, ** p<0.01 SDU vs W. n=11-16 animales por dosis y cepa.

Dados los resultados obtenidos, se puede concluir que las diferencias en

la actividad de los receptores NMDA no parece estar implicada en la mayor

potencia antinociceptiva obtenida en SDU, puesto que la metadona presenta

también una mayor potencia en las ratas de esta cepa, a pesar de ser un

antagonista no competitivo de receptores NMDA (Ebert et al., 1995; Gorman

et al., 1997).

3-d.

Recientemente se ha sintetizado un derivado del fentanilo, el 3-d, cuyas

principales características son la mayor duración de su efecto con respecto a los

análogos del fentanilo comercializados hasta la fecha, y una extraordinaria

selectividad por el receptor µ, siendo activo por vía sistémica (Jagerovic y cols.,

2002).

La modulación del efecto antinociceptivo de los agonistas µ con la

coadministración de agonistas δ y/o κ ha sido descrita ampliamente (Heyman y cols.,

1989; Jiang y cols., 1990; Porreca y cols., 1990; Miaskowski y cols., 1992; Adams y

cols., 1993; Traynor y Elliott, 1993; He y Lee, 1998; para revisión ver Smith y Lee,

2003). Se ha sugerido así mismo que morfina, fentanilo y derivados podrían actuar

sobre los receptores µ y δ conjuntamente potenciándose de esta forma el efecto

(Tiseo y Yaksh, 1993, Baker y cols., 1995; Verborgh y Meert, 1999). Según esta

teoría, podría hipotetizarse que el efecto antinociceptivo observado con los agonistas

µ utilizados hasta ahora en este trabajo, estuviese mediado tanto por los receptores µ

como por los receptores δ y/o κ, mientras que en el caso de 3-d, por su mayor

selectividad µ, su efecto antinociceptivo dependería con mayor exclusividad de la

activación de receptores µ. Por ello, y con el fin de analizar la respuesta tras una

129


activación más selectiva del receptor opioide µ, se estudió el efecto antinociceptivo

de éste fármaco.

Los resultados obtenidos con el 3-d son semejantes a los observados en este

estudio para los otros agonistas µ. Las curvas obtenidas en ambas cepas son distintas

(figura 23). Además, los valores estimados de DE50 son significativamente menores

en ratas de la cepa SDU, que en las de la cepa W (DE50=0.190±0.003 mg/Kg en SDU

y 0.380±0.050 mg/Kg en W; p<0.01), lo cual implica una mayor potencia

antinociceptiva de este agonista selectivo µ en las ratas de la cepa SDU con respecto

a las de la cepa W. Por otra parte, los valores de %MEP obtenidos con 0.3 y 0.6 mg/

Kg de 3-d son significativamente mayores en los animales de la cepa SDU que en los

de la cepa W (SDU vs W: 79.7±9.0 vs 35.0±13.8 y 93.6±4.1 vs 58.3±11.2%,

respectivamente; p<0.01 en ambos casos).

130


0.1 10

20

40

60

80

100

WSDU**

**

Dosis de 3-d (mg/Kg)

%M

EP

Figura 23. Curva dosis-efecto antinociceptivo de 3-d evaluado en el test TF. Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla de la figura. Los valores de %MEP, obtenidos con cada dosis de 3-d, se analizaron con un test de Bonferroni: ** p<0.01 SDU vs W. n=5-16 animales por dosis y cepa.

El compuesto 3-d había sido estudiado sólo en ratón, mediante el test de

HP y el test de las contracciones abdominales (Jagerovic y cols., 2002). En el

presente trabajo se ha comprobado su efecto en rata con el test de TF,


Dosis-Cepa F(5, 94)=2.35 P<0.05

131


obteniéndose en este caso curvas dosis-efecto similares a las descritas en ratón

para HP (Jagerovic y cols., 2002).

El hecho de que un agonista como el 3-d, con una elevada selectividad por el

receptor µ, también presente una mayor potencia antinociceptiva en las ratas de la

cepa SDU que en las de la cepa W, implica que la coactivación del receptor µ junto

con el δ y/o el κ por el fármaco opioide en cuestión, no es necesaria para originar una

mayor potencia antinociceptiva de los agonistas µ en la cepa SDU. Por consiguiente,

o bien se precisa unicamente la activación del receptor µ, o bien esta coactivación

receptorial de receptores δ y/o κ depende de receptores µ, lo que se analizará más

adelante con el uso de antagonistas selectivos (apartado 4.2.2.1.3.).

Los resultados obtenidos con los agonistas opioides µ, permiten concluir que

las diferencias en la potencia antinociceptiva que originan una mayor sensibilidad en

la cepa de ratas SDU con respecto a la cepa W, es común a todos los agonistas

utilizados en este estudio. Por lo tanto, no parece depender del subtipo de receptor µ

sobre el que actúan, la diferente activación de receptores NMDA o el grado de

selectividad µ. Por otro lado, puesto que encontramos diferencias entre ambas cepas

en estudio en la potencia antinociceptiva de distintos agonistas µ con diferentes

características farmacocinéticas, estos resultados corroboran los previamente

descritos por Más y cols. (2000), que apuntan a causas farmacodinámicas en estas

diferencias.

4.2.1.2.-AGONISTAS SELECTIVOS κ (U50488H).

Con la finalidad de analizar la participación del sistema opioide κ en la mayor

sensibilidad de las ratas de la cepa SDU, se realizaron curvas dosis-efecto

antinociceptivo con el agonista selectivo κ, U50488H, en ambas cepas de ratas.

El fármaco U50488H, que ha sido ampliamente utilizado como agonista

selectivo κ (Ki: 2, 837 y 14500nM por los receptores κ, µ y δ respectivamente;

Mattes y cols 1998), es un derivado de la arilacetamida de naturaleza no peptídica y

activo por vía sistémica (Millan y cols., 1989). La utilización de este derivado de la

132


arilacetamida, se debe a que este grupo de agonistas κ es el mejor caracterizado

farmacologicamente, y a que estos fármacos se unen con gran afinidad al receptor κ

recombinante expresado en células heterólogas (Kieffer 1995), mientras que su unión

es nula a membranas de cerebro procedentes de animales carentes del gen que

codifica el receptor κ (Simonin y cols., 1998).

Con las dosis utilizadas de U50488H tan solo encontramos efecto

antinociceptivo en los animales de la cepa SDU. Al comparar las curvas obtenidas en

ambas cepas, se observó que son distintas. Además, los valores de %MEP obtenidos

tras la administración de 19 y 38 mg/Kg de U50488H, son significativamente

superiores en los animales de la cepa SDU que en los de la cepa W (SDU vs W:

50.6±14.1 vs 1.4±1.0; p<0.01 y 87.7±7.7 vs 13.2±7.2; p<0.001, respectivamente).

Todo ello demuestra una mayor potencia antinociceptiva de este agonista selectivo κ

en las ratas de la cepa SDU con respecto a las de la cepa W (figura 24), siendo el

valor de DE50 en ratas de la cepa SDU de 18.5±2.7 mg/Kg. La curva dosis-efecto

obtenida en los animales SDU, es similar a las descritas previamente por otros

autores con este test nociceptivo (Pick y cols., 1991; Garner y cols., 1997; D´Anci y

cols., 2000; Gullapalli y Ramarao, 2002).

133


10 1000

20

40

60

80

100WSDU

**

***

Dosis de U50488H (mg/Kg)

%M

EP

Figura 24. Curva dosis-efecto antinociceptivo de U50488H evaluado en el test de TF. Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla de la figura. Los valores de %MEP, obtenidos con cada dosis de U50488H, se analizaron con un test de Bonferroni: ** p<0.01, *** p<0.001 SDU vs W. n=5-6 animales por dosis y cepa.


residual)

Valor p

Dosis F(3, 35)= 9.54 p<0.001Cepas F(1, 35)= 32.91 p<0.001

Dosis-Cepa F(3, 35)= 5.75 p<0.01

134


En la literatura existe controversia sobre la eficacia de los agonistas κ en los

test que utilizan estímulos térmicos (Pick y cols., 1991; Smith y Lee, 2003), pero

también hay que considerar que se han descrito diferencias en la sensibilidad al

U50488H entre ciertas cepas de roedores (Panocka y cols., 1986; Kest y cols., 1993;

Ikeda y cols., 1999). En el presente trabajo, se demuestra que el U50488H

únicamente fue eficaz en la cepa SDU en un test térmico, lo que podría sugerir que

dichas controversias fuesen debidas a diferencias intercepa. Así mismo, en el presente

estudio se ha encontrado una correlación entre el efecto antinociceptivo de los

agonistas µ y el agonista κ, confirmando lo descrito previamente por otros autores

(Wilson y cols., 2003).

Estos resultados obtenidos con el U50488H sugieren que en el mecanismo

subyacente en la mayor sensibilidad antinociceptiva de las ratas SDU estaría

participando de algún modo el sistema opioide κ.

4.2.1.3.-AGONISTAS SELECTIVOS δ (SNC-80).

Con el propósito de estudiar la participación del sistema opioide δ en la

mayor potencia de morfina en las ratas de la cepa SDU, se realizaron curvas dosis-

efecto antinociceptivo del agonista selectivo δ SNC-80 en ambas cepas de ratas.

La utilización de este agonista δ, se debió a que se trata de un agonista

selectivo (Ki: 1.78, 881.5 y 441.8nM para los receptores δ, µ y κ respectivamente) de

naturaleza no peptídica capaz de atravesar la barrera hematoencefálica, lo que

permite su utilización por vía sistémica (i.p.; Bilsky y cols., 1995). Ello presenta

ventajas en este estudio, puesto que otros agonistas selectivos δ, como el BW-

373U86 que es activo por vía sistémica, presenta el inconveniente de su escasa

selectividad y su toxicidad (Chang y cols., 1993; Comer y cols., 1993; Wild y cols.,

1993), y otros agonistas más clásicos como el DPDPE o la deltorfina no pueden

administrarse por vía sistémica, lo cual impide la valoración de las consecuencias de

la activación sistémica de los receptores δ (Bilsky y cols., 1995), por lo que se podría

135


pasar por alto fenómenos que precisen la activación de estos receptores

simultáneamente a distintos niveles.

En las curvas dosis-efecto antinociceptivo obtenidas con SNC-80 no se

observaron diferencias significativas entre cepas (figura 25). Además, los valores

estimados de DE50 son similares en ambas cepas de ratas (14.3±2.7 mg/Kg y

17.4±5.1 mg/Kg SDU y W respectivamente; p>0.05), sugiriendo una potencia

antincocieptiva de este agonista δ semejante en sendas cepas de ratas.

1 10 1000

20

40

60

80

100 SDUW

Dosis de SNC-80 (mg/Kg)

%M

EP

Figura


residual)

Valor

pDosis F(2, 44)=3.22 p<0.05Cepa F(1, 44)=0.01 n.s.


136


En el presente trabajo, sólo se ha podido llegar a dosis de 13.5 mg/Kg, dosis

que producian un efecto antinociceptivo moderado del 40%, pero importante

agitación e hiperexcitabilidad en los animales, dificultando la medición del propio

efecto antinociceptivo. A pesar de ello, el efecto antinociceptivo obtenido es dosis

dependiente (tabla de la figura 25), y similar al obtenido por otros autores (Baker y

cols., 2002). Se conoce que la eficacia antinociceptiva del SNC-80 es baja

comparado con otros agonistas opioides como morfina y U50488H, y que presenta

efectos convulsivantes y estimulantes de la actividad locomotora (Hong y cols.,

1998; Baker y cols., 2002; Jutkiewicz y cols., 2004), características que pueden haber

sido la causa de los comportamientos observados.

Las peculiaridades del agonista δ empleado y los comportamientos originados

por éste dificultan la comparación con estudios previos, que sugieren una relación

directa entre la potencia de agonistas µ y κ y la de agonistas δ en determinadas cepas

de ratones (Belknap y cols., 1987; Raffa y cols., 1992; Kest y cols., 1993, 1998,

1999). De manera que la disparidad con estudios previos podría deberse a las

alteraciones conductuales originadas, diferencias entre estos modelos, o bien a los

fármacos y/o vías de administración utilizadas, pues en nuestro caso se trata de un

agonista δ no peptídico administrado vía sistémica, mientras que en el caso de los

artículos antes referidos se trata de agonistas peptídicos δ1 y δ2, administrados vía

i.c.v. (Kest y cols., 1998, 1999). Por todo ello se consideró completar el estudio de la

participación del sistema opioide δ, mediante el análisis de las acciones de

antagonistas selectivos y métodos de fijación de radioligando (apartados 4.2.2.1. y

4.3.).

4.2.1.4.- AGONISTAS ENDÓGENOS: ANALGESIA INDUCIDA POR

ESTRÉS.

En situaciones de estrés se produce una inhibición de la respuesta nociceptiva

en animales de laboratorio y en humanos, conociéndose este fenómeno como

analgesia inducida por estrés (AIE) (Akil y cols., 1976; Hayes y cols., 1976; Willer y

cols., 1980). La AIE puede ser de naturaleza opioide o no, en función de la severidad

de los estímulos que la provoquen (Jackson y cols., 1989; Tierney y cols., 1991;

137


Girardot y cols., 1994; Terman y cols., 1986). En este sentido, se ha descrito que en

roedores, cuando el estimulo utilizado para provocar estrés es un baño en agua a 20-

22º C de una duración de tres minutos, se obtiene una AIE de naturaleza opioide en

su totalidad (Kitchen y Pinker, 1990; Tierney y cols., 1991; Muhammad y Kitchen,

1993), que es debida a la liberación de opioides endógenos (Vaswani y cols., 1988;

Mizoguchi y cols., 1997).

Así mismo, se han descrito diferencias en la AIE en función de la cepa y del

sexo de los animales utilizados, e incluso se han seleccionado cepas de ratones que

presentan grandes diferencias en la magnitud de la AIE (Baran y cols., 1975;

Panocka y cols., 1986; Marek y cols., 1992; ver Mogil y cols., 1996; Mogil y

Belknap, 1997).

En el presente estudio, el análisis de las curvas temporales de AIE reveló que

ésta es máxima en la primera determinación y que este efecto antinociceptivo

disminuía a lo largo del tiempo. Además, este efecto antinociceptivo era mayor en las

ratas de la cepa SDU que en las de la cepa W, apareciendo un %MEP

significativamente mayor en la cepa SDU que en la cepa W en la primera

determinación (60.3±8.7 vs 27.7±4.3%; p<0.001). Estas diferencias entre cepas

desaparecen cuando se administró previamente naloxona (10 mg/Kg) (figura 26). De

manera semejante a lo observado en este estudio, distintos autores han descrito

diferencias en la AIE entre cepas de roedores, así como diferencias en la

potenciación por estrés del efecto antinociceptivo de morfina (Nagase y cols., 1985;

Moskowitz y cols., 1985b; Rosecrans y cols., 1986; Woolfolk y Holtzman, 1995;

Mogil y cols., 1996).

138


5 10 10

20

40

60

80

100 SDUW

*** SDU NlxW Nlx

Tiempo tras baño (min)

%M

EP

Figura 26. Curva temporal de AIE, evaluada en el test TF en SDU y W con y sin administración de naloxona. Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías, y los resultados se muestran en la tabla. Los valores de %MEP, obtenidos en cada momento tras el baño en ambas cepas, se compararon con un test de Bonferroni: *** p<0.001 SDU vs W. n=5-11 animales por grupo.


residual)

Valor pES

TRÉS Tiempo F(2 ,53)=22.14 p<0.001

Cepa F(1, 53)=15.28 p<0.001Tiempo-Cepa F(2, 53)=2.24 n.s.

ESTR

.+N

lx Tiempo F(2, 27)=0.05 n.s.Cepa F(1, 27)=1.02 n.s.

Tiempo-Cepa F(2, 27)=0.69 n.s.

139


Así mismo, se analizó el AUC (de 1 a 10 min) del curso temporal de la

AIE, y se observó que el estímulo estresante indujo un efecto antinociceptivo

significativó en ambas cepas de animales con respecto a los animales que no

habían sido sometidos a estímulo estresante (SDU: 250.2±38.0 vs 30.3±12.6;

p<0.001 y W: 98.0±16.3 vs 22.7±8.9; p<0.01), siendo este efecto

significativamente (p<0.001) mayor en los animales de la cepa SDU que en los

de la cepa W. Tras la administración de naloxona (10 mg/Kg), en ambas cepas

disminuye de forma significativa el efecto antinociceptivo obtenido (SDU:

77.8±20.9 vs 250.2±38.0; p<0.001 y W: 32.8±31.8 vs 98.0±16.3; p<0.05),

desapareciendo las diferencias en el AUC, tanto entre cepas, como con

respecto a los correspondientes controles sin estresar (figura 27).

0

50

100

150

200

250

300

350

***

**

###

+ + - Estrés- 10 - Naloxona (10mg/Kg)

SDUW

AU

C

++++

Figura 27. Área bajo la curva del curso temporal (de 1 a 10 min) de AIE. Las barras representan los valores medios ± error estándar. En cada cepas las comparaciones entre los valores de AUC obtenidos con cada tratamiento se analizaron con un test Newman-Keuls, y las comparaciones entre cepas de los valores obtenidos con cada tratamiento se realizaron con el test de la t de Student. Los resultados se representan como: ** p<0.01, *** p<0.001 vs correspondientes controles no

140


estresados; + p<0.05, +++ p<0.001 vs animales estresados; ### p<0.001 SDU estrés vs W estrés. n=5-11 animales por grupo.

Dado que las condiciones del baño para originar estrés son generadoras de un

efecto antinociceptivo de naturaleza opioide (Tierney y cols., 1991; Vanderah y cols.,

1992) y que los resultados obtenidos demuestran que la naloxona suprime la AIE en

ambas cepas, se puede concluir que en la cepa SDU los sistemas opioides endógenos

responsables de la AIE son más efectivos que en W.

Existen trabajos que proponen la participación en este fenómeno de la β-

endorfina y la dinorfina, y otros que descartan la intervención de la proencefalina

(König y cols., 1996; Rubinstein y cols., 1996; McLaughlin y cols., 2003). En cuanto

al papel de los receptores opioides, se ha implicado a los tres tipos en la AIE, e

incluso se ha sugerido que éstos podrían variar en función del protocolo empleado y

de la edad del animal (Hart y cols., 1983; Panerai y cols., 1984; Calcagnetti y cols.,

1990; Kitchen y Piker, 1990; Menendez y cols., 1993). Así, parece que en el animal

adulto y cuando el estímulo es el baño, los receptores implicados serían los δ (Hart y

cols., 1983; Jackson y Kitchen, 1989; Kitchen y Piker, 1990; Vanderah y cols., 1992;

Mizoguchi y cols., 1997; LaBuda y cols., 2000). Por consiguiente, a pesar de no estar

completamente esclarecidos los mecanismos responsables de la AIE de naturaleza

opioide, se podría sugerir la posibilidad de que existiese una mayor actividad δ en la

cepa SDU. Por este motivo se decidió analizar este aspecto mediante la utilización de

un antagonista selectivo (apartado 4.2.2.1.1.).

4.2.2.- ESTUDIO IN VIVO DE LA IMPLICACIÓN DE LA MODULACIÓN

INTERRECEPTORIAL EN EL EFECTO ANTINOCICEPTIVO OPIOIDE.

Las evidencias que apoyan la existencia de una modulación interreceptorial

opioide en muchos de los efectos de estos fármacos, incluido el efecto

antinociceptivo, son numerosas (Vaught y Takemori, 1979; Heyman y cols., 1989;

Porreca y cols., 1990; Miaskowski y cols., 1990; Miaskowski y cols., 1992; He y

Lee, 1998; Suzuki y cols., 2001; para revisión ver Smith y Lee 2003).

141


Las modulaciones entre receptores tanto locales en el SNC como

modulaciones entre receptores situados en distintos lugares del SNC, han sido

descritas por varios autores utilizando diferentes aproximaciones experimentales

(Vaught y Takemori, 1979; Yeung y Rudy, 1980; Roerig y Fujimoto, 1989; He y

Lee, 1998).

En el presente trabajo, se ha planteado la realización de estudios in vivo sobre

dicha modulación en ambas cepas de ratas, ya que algunas de las discrepancias entre

los distintos estudios previos, en estas modulaciones, podrían ser consecuencia de

diferencias entre las especies, o cepas de animales empleadas (He y Lee, 1998; Smith

y Lee, 2003).

4.2.2.1.- ANÁLISIS DEL PAPEL DE LOS RECEPTORES δ.

Como se ha comentado previamente, el sistema opioide δ parece estar

participando en fenómenos como la AIE, la respuesta nociceptiva a formalina, y la

potencia de morfina (Hart y cols., 1983; Jackson y Kitchen., 1989; Kitchen y Piker,

1990; Vanderah y cols., 1992, Ossipov y cols., 1996; LaBuda y cols., 2000; Hurley y

Hammond., 2001). Las diferencias detectadas en estos fenómenos en las ratas de la

cepa SDU, con respecto a las controles, justifica el planteamiento del estudio de una

posible hiperactividad δ como responsable, total o parcial, de estas diferencias.

4.2.2.1.1.- ANALGESIA INDUCIDA POR ESTRÉS.

La AIE puede ser de diferentes naturalezas. En el presente trabajo, el

protocolo empleado y los resultados obtenidos sugieren que en la cepa SDU exista

una mayor actividad del sistema δ (Kitchen y Pinker, 1990; Muhammad y Kitchen,

1993). Para analizar este aspecto se planteó el estudio del efecto de un antagonista δ

sobre la AIE.

Tras la administración de 1 mg/Kg de naltrindol los animales de la cepa SDU

presentaron valores de AUC significativamente inferiores a los de los

correspondientes animales que no recibieron antagonista (144±35.8 vs 250.2±38.0;

p<0.001), desapareciendo también con esta dosis de naltrindol las diferencias entre

142


cepas en el valor de AUC (SDU vs W: 144.4±35,8 vs 86,8±26,7; p>0.05), aunque los

valores de AUC siguieron siendo significativamente superiores a los controles sin

estresar (SDU: 144±35.8 vs 30.3±12.6; p<0.001 y W: 86.9±26.7 vs 22.7±8.9;

p<0.001). La administración de 2.5 mg/Kg de naltrindol originó valores del AUC en

la cepa SDU (82.9±28.6) y en la cepa W (50.4±13.0) similares entre sí y semejantes

a sus correspondientes controles sin estresar, pero significativamente menores

(p<0.001 y p<0.05, respectivamente) que los obtenidos en los animales controles

estresados (figura 28).

0

50

100

150

200

250

300

350 ###

***

***

******

+ + + - Estrés - 1 2.5 - Naltrindol (mg/Kg)

+++

+

SDUW

AU

C

+++

Figura 28. Área bajo la curva temporal de AIE. Las barras representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones entre cepas de los valores de AUC se realizaron con el test de la t de Student, y en cada cepa las comparaciones entre cada uno de los tratamientos se realizaron con el test Newman-Kleus: ### p<0.001 SDU vs W; *** p<0.001 vs correspondientes controles no estresados; +++ p<0.001 y + p<0.05 vs estrés sin administración de naltrindol. n=5-11 animales por grupo.

143


Dado que en este estudio, se ha utilizado naltrindol a dosis bajas, lo que

se asegura en gran medida su selectividad δ (Portoghese y cols., 1988; Ossipov

y cols., 1994, 1996; Suzuki y cols., 1997), se comprueba que la AIE provocada

está mediada por el receptor δ, puesto que es revertida por naltrindol en ambas

cepas de ratas, lo cual concuerda con trabajos previos (Hart y cols., 1983;

Jackson y Kitchen, 1989; Kitchen y Piker, 1990; Vanderah y cols., 1992;

Mizoguchi y cols., 1997; LaBuda y cols., 2000). Dichos resultados indican así

mismo que las diferencias entre estas cepas en la AIE, se deben a una mayor

activación de los receptores δ en SDU, ya que éstas desaparecen con

naltrindol.

4.2.2.1.2.- SENSIBILIDAD NOCICEPTIVA BASAL EN EL TEST DE LA

FORMALINA.

Distintos estudios, tanto farmacológicos como con animales knockout, han

implicado en mayor o menor medida a los receptores opioides δ en el tono

inhibitorio de la nocicepción en el test de la formalina (Ossipov y cols., 1996; Wu y

cols., 2002; Martin y cols., 2003b). Las diferencias detectadas en la respuesta

nociceptiva a formalina al 2.5%, entre las cepas estudiadas, especialmente en la

interfase (apartado 4.1.1.3.), unido a que las ratas SDU presentan una mayor AIE que

las W, que es mediada por receptores δ (apartado 4.2.2.1.1.), justifica la necesidad de

valorar el efecto de naltrindol sobre la nocicepción inducida por formalina.

En este trabajo, los experimentos realizados mostraron que durante la fase de

respuesta aguda, la administración de naltrindol (1 mg/Kg) no modificó el efecto

nociceptivo de formalina (2.5%) con respecto a los controles (formalina 2.5% vs

formalina 2.5% + naltrindol; SDU: 257±18 vs 316±60 s; p>0.05, W: 452±39 vs

508±30 s; p>0.05). Además, las diferencias significativas entre cepas en la respuesta

nociceptiva aguda que aparecían con formalina (2.5%), siguen apareciendo con la

administración de naltrindol (p<0.01) (figura 29).

Sin embargo, durante la fase de respuesta nociceptiva tónica, la

administración de naltrindol (1 mg/Kg) indujo en ambas cepas de animales un

144


aumento significativo de la respuesta con respecto a los animales que no recibieron

este fármaco (formalina 2.5% vs formalina 2.5% + naltrindol; SDU: 2369±129 vs

2783±62 s; W: 2722±51 vs 2896±20 s; p<0.05 en ambos casos). Con la

administración de este antagonista desaparecieron las diferencias en la respuesta

entre ambas cepas de ratas (figura 29).

145


A

F2.5% F2.5%+NTI0

250

500

750SDUW

****

Tiem

po d

e la

mid

o +

elev

ació

n (s

eg)

B

F2.5% F2.5%+NTI

*#

#

2200

2400

2600

2800

3000

Tiem

po d

e la

mid

o +

elev

ació

n (s

eg)

Figura 29. Acción del antagonista δ naltridol sobre el efecto nociceptivo en el test de la formalina: (A) durante la primera fase de respuesta nociceptiva (0-10 min tras inyección), (B) durante la segunda fase de respuesta nociceptiva (10-60 min tras inyección). Los puntos representan los valores medios ± error estándar. Las comparaciones entre cepas para los valores de tiempo de lamido + elevación de la pata inyectada se analizaron con el test de la t de Student: * p<0.05, ** p<0.01 SDU vs W, # p<0.05 vs respectivos controles sin naltrindol. n=6 animales por grupo.

146


Por lo tanto, en el presente estudio la administración de naltrindol, a una dosis

selectiva para el receptor δ (Portoghese y cols., 1988; Ossipov y cols., 1994, 1996),

produce en ambas cepas de ratas un incremento de la respuesta nociceptiva a

formalina en la segunda fase, haciendo desaparecer las diferencias entre cepas, sin

que se produzca modificación alguna de la respuesta en la primera fase. Estos

resultados son concordantes con lo previamente descrito por Ossipov y cols. (1996),

en el sentido de que el bloqueo del receptor δ produce un aumento en la respuesta

nociceptiva de las ratas en en la fase tónica. Sin embargo, en el estudio de Wu y cols.

(2002), realizado en ratón, no observan este efecto con naltrindol (tanto tras

administrarlo vía i.c.v. como i.t.), aunque sí que observan este aumento de la

nocicepción con la administración i.t. del antagonista δ1 BNTX (7-benciliden

naltrexamina). Las diferencias entre los resultados presentados aquí y los descritos

por Ossipov y cols. (1996), con respecto a los descritos en el trabajo de Wu y cols.

(2002), podrían ser debidas a la distinta vía de administración utilizada para este

antagonista δ, máxime cuando se ha descrito la posibilidad de que el efecto

antinociceptivo de fármacos opioides como la morfina y la loperamida en este test

pueda estar mediado tanto a nivel periférico y a nivel central (Shannon y Lutz, 2002),

sin olvidar la importancia en estos estudios de la especie de animales utilizada.

Como previamente se ha mencionado, el periodo entre ambas fases

corresponde a una inhibición activa del dolor, y el estrés puede originar una

prolongación en la interfase en este test. De manera que, si la respuesta nociceptiva

se determina en un periodo que se solapa con el periodo de interfase, el nivel de

nocicepción puede parecer menor debido al retraso en la aparición de la segunda fase

(Abbott y cols., 1995; Henry y cols., 1999). Por estos motivos, con el fin de conocer

si el incremento en la nocicepción en la fase tónica originado por naltrindol es debido

a un efecto sobre la interfase fruto de la inhibición del efecto del estrés, como sugiere

Abbott y cols. (1995), se realizó un análisis de la evolución temporal del efecto de

naltrindol sobre la nocicepción en este test.

147


La administración de naltrindol, tanto en SDU como en W, originó curvas

temporales de nocicepción significativamente diferentes a las correspondientes a los

animales de la misma cepa que no recibieron la administración del antagonista. Así,

se originó un incremento significativo del tiempo de lamido y elevación de la pata en

el periodo de 15 minutos tras la inyección de la formalina en la cepa W (284.3±6.0

vs 205.5±30.6 s; p<0.01) y un incremento significativo de la respuesta nociceptiva a

los 15, 20 y 25 minutos tras la inyección de formalina en SDU (224.7±42.1 vs

101.8±50.8; p<0.01, 283.7±13.2 vs 104.2±48.2; p<0.001 y 291.5±6.5 vs 187.7±39.3

s; p<0.05, respectivamente) (figura 30).

148


A

0 10 20 30 40 50 60 700

100

200

300

400

W F2.5%W F2.5% + NTI

**


tiem

po d

e el

evac

ión

yla

mid

o (s

eg)

B


residual)

Valor p

Tiempo F(11, 120)=4.56 p<0.001Trat. F(1, 120)=12.32 p<0.001

Tiempo-Trat. F(11, 120)=1.11 n.s.

149


0 10 20 30 40 50 60 700

100

200

300

400 SDU F2.5% + NTISDU F2.5%

****

*

*


tiem

po d

e el

evac

ión

yla

mid

o (s

eg)

Figura 30. Efecto de la adiministración de naltrindol (1 mg/Kg) sobre la evolución temporal del efecto nociceptivo de formalina al 2.5% en ratas de la cepa W (A) y SDU (B). Los puntos representan valores medios ± error estándar. El análisis de los resultados se realizó con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en las correspondientes tablas. Los valores de tiempo de lamido + elevación, obtenidos para cada cepa, en los distintos periodos de 5 minutos tras la inyección de formalina se compararon con un test de Bonferroni: * p<0.05, ** p< 0.01 y *** p<0.001, formalina vs formalina + naltrindol. n=6 animales por grupo.

Al comparar las curvas obtenidas en ambas cepas tras la administración de

naltrindol, se observó que las curvas son distintas en ambas (figura 31). Además, la

cepa SDU presentó una respuesta nociceptiva significativamente menor que la cepa


residual)

Valor p

Tiempo F(11, 120)=14.01 p<0.001Tratamiento F(1, 120)=19.56 p<0.001Tiempo-Trat. F(11, 120)=2.97 p<0.01

150


W a los 10 minutos tras la inyección de formalina (116.2±59.5 vs 240.8±46.7 s;

p<0.001).

0 10 20 30 40 50 60 700

100

200

300

400SDUW**

*


tiem

po d

e el

evac

ión

yla

mid

o (s

eg)

Figura 31. Efecto nociceptivo de la inyección de formalina al 2.5% tras la adiministración de naltrindol (1 mg/Kg). Los puntos representan los valores medios ± error estándar. El análisis de los resultados se realizó con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en las correspondientes tablas. Los valores de tiempo de lamido + elevación, obtenidos para cada cepa, en los distintos periodos de 5 minutos tras la


residual)

Valor p

Tiempo F(11, 120)=5.63 p<0.001Cepa F(1, 120)=8.10 p<0.01

Tiempo-Cepa F(11, 120)=1.99 p<0.05

151


inyección de formalina se compararon con un test de Bonferroni: *** p<0.001, SDU vs W. n=6 animales por grupo.

152


Por lo tanto, en las dos cepas de ratas en estudio la administración de

naltrindol produjo una disminución en la duración de la interfase. Esta disminución

fue más acusada en la cepa SDU que en la cepa W, puesto que en la primera se

produjo un incremento significativo de la respuesta nociceptiva en tres periodos de 5

minutos tras la interfase mientras que en la segunda tan solo tuvo lugar en uno de

ellos. De manera que la mayor duración de la interfase de la respuesta nociceptiva a

formalina en SDU, con respecto a W, es revertida por naltrindol.

Se ha sugerido, que el estrés puede originar una prolongación de la interfase

(Abbott y cols., 1995). Así, el hecho de que el naltrindol revierta esta mayor

duración, abre la posibilidad de establecer un cierto paralelismo entre estos

resultados y los resultados de AIE (apartado 4.2.2.1.1.). Por lo tanto, podría

especularse que las ratas al ser expuestas a un lugar nuevo (caja de observación) y/o

al ser sometidas a la sujeción necesaria para posibilitar al operador realizar la

inyección de formalina, experimentasen un estrés que, principalmente a través de

receptores δ, originase un efecto antinociceptivo, más acusado y duradero en los

animales de la cepa SDU que en los de la cepa W.

Como previamente se ha mencionado, la respuesta nociceptiva a la formalina

es bifásica, coincidiendo temporalmente con la actividad de las neuronas

convergentes de la raiz dorsal (Dubuisson y Dennis, 1977; Dickenson y Sullivan,

1987). La inhibición de la nocicepción que supone la interfase, coincide

temporalmente con la liberación segmental de metencefalina en la médula espinal

(Bourgoin y cols, 1990). Teniendo en cuenta que en el test de la formalina, al utilizar

concentraciones de 2.5%, la interfase es mayor y más duradera en SDU que en W, y

que con el antagonista selectivo δ naltrindol se revierte esta mayor duración, se

podría especular que en las ratas SDU la actuación de este opioide endógeno es

mayor que en las ratas W. Apoyando esta hipótesis, recientemente se ha demostrado

mediante técnicas autorradiográficas que las ratas de la cepa SDU poseen niveles

detectables del receptor NPFF1 a nivel cervical, torácico y lumbar de la médula

espinal, mientras que en las ratas de la cepa W estos receptores no son detectables

(Gouardères y cols., 2004). Además, se sabe que el efecto antinociceptivo de la

153


administración espinal de (1DMe)NPYF (análogo del neuropéptido FF) está mediado

por la activación de receptores δ, y que la administración i.t. de neuropéptido FF

promueve la liberación espinal de metencefalina, antagonizándose esta liberación por

naltrindol y por nor-BNI (Ballet y cols., 1999; Xu y cols., 2001). Con todo ello se

podría hipotetizar que la mayor activación de los receptores δ en las ratas SDU

durante la interfase se debe a una mayor liberación de metencefalina, que estaría

originada por las mayores densidades de receptor NPFF1, posibilidad que deberá ser

estudiada en un futuro.

4.2.2.1.3.- EFECTO ANTINOCICEPTIVO DE MORFINA.

La morfina es un agonista que presenta preferencia por los receptores µ,

frente a los δ y los κ. A pesar de poseer cierta selectividad in vitro (70 y 38 veces

más afín por los receptores µ que por los δ y κ respectivamente), no es un fármaco

selectivo µ in vivo (Matthes y cols., 1998). Mediante estudios con animales knockout

se ha demostrado que el receptor µ es el principal implicado en los efectos

antinociceptivos de morfina, ya que en el knockout del receptor δ y en el del κ no se

modifica su efecto antinociceptivo, pero éste es suprimido en el knockout del

receptor µ (Mattes y clos., 1996; Simonin y cols., 1998; Zhu y cols., 1999). Sin

embargo, mediante estudios farmacológicos, se ha descrito que en determinadas

circunstancias los receptores δ también intervienen en este efecto farmacológico,

abriéndose la posibilidad de que exista una modulación biológica de dicho efecto a

través de estos receptores opioides (Takemori and Portoghese, 1987; Heyman y cols.,

1987; Kiefel y cols., 1993; Tiseo y Yaksh, 1993; Ossipov y cols., 1995b). Por ello, y

considerando el efecto de naltrindol sobre la AIE y sobre la sensibilidad nociceptiva

basal en el test de la formalina obtenidos en este estudio (apartados 4.2.2.1.1. y

4.2.2.1.2.), se planteó el estudio de la posible implicación de la modulación del

efecto antinociceptivo de morfina a través del receptor δ en las diferencias entre estas

cepas.

En la cepa de ratas W la administración de naltrindol, a dosis de 10 mg/Kg,

no modificó la curva dosis-efecto antinociceptivo de morfina, ni se modificó de

forma significativa el valor estimado de DE50 con la administración del antagonista δ

154


(DE50, morfina+naltrindol vs morfina: 1.70±0.03 vs 1.45±0.06; p>0.05). En la cepa

SDU, la administración de este antagonista δ desplazó la curva a la derecha,

apareciendo un efecto significativo del tratamiento. Así, para la cepa SDU la DE50

estimada de morfina tras la coadministración de naltrindol fue significativamente

superior a la estimada sin antagonista (1.40±0.12 vs 0.66±0.04 mg/Kg; p<0.05).

Además, en SDU, los valores de %MEP obtenidos con la administración de 1.2 mg/

Kg de morfina se reducen de forma significativa al administrar naltrindol (44.0±15.0

vs 76.4±5.1%; p<0.05). Con el tratamiento previo de naltrindol desaparecieron las

diferencias significativas (F1, 30 = 0.075; p>0.05) en las curvas dosis-efecto

antinociceptivo de morfina entre los animales de ambas cepas tratados con naltrindol,

así como entre las correspondientes DE50 (figura 32).

155


Factor F(g.l.factor,

residual)

Valor pSD

U Dosis F(2, 37)=10.61 p<0.001Tratamientos F(1, 37)=5.71 p<0.05Dosis-Tratam. F(2, 37)=1.57 n.s.

W Entre dosis F(2, 36)=30.56 p<0.001Entre tratamientos F(1, 36)=0.20 n.s.In. Tratam.-Dosis F(2, 36)=0.17 n.s.

1 100

20

40

60

80

100

SDUWSDU morfina + NTIW morfina + NTI

*


%M

EP

Figura 32. Efecto de la administración de naltrindol (10 mg/Kg) sobre las curva dosis-efecto antinociceptivo de morfina evaluado en el test TF. Los puntos representan los valores medios de %MEP ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla de la figura. Los valores de %MEP, obtenidos con cada dosis de morfina, se analizaron con un test de Bonferroni: * p<0.05 SDU morfina vs SDU morfina + naltrindol. n=5-11 animales por dosis y cepa.

156


Estos resultados demuestran que en la cepa de ratas SDU, pero no en la cepa

W, los receptores δ juegan un importante papel en el efecto antinociceptivo del

agonista µ, morfina, puesto que el naltrindol a una dosis selectiva sobre el receptor δ

(Portoguese y cols., 1988; Ossipov y cols., 1995b; Ossipov y cols., 1996), produce

una disminución del efecto antinociceptivo de este opioide. Además, el hecho de que

en los animales de la cepa W, esta misma dosis de antagonista no origine

disminución alguna del efecto antinociceptivo de morfina, apoya la idea de que el

antagonismo observado en SDU, es por actuación δ y no es debido a la actuación

directa del naltrindol sobre el receptor µ.

Una posible explicación a estos resultados es que en los animales de la cepa

SDU la morfina, debido a su baja selectividad, además de activar los receptores µ,

estuviese actuando también sobre los δ. Sin embargo, el hecho de que un agonista µ,

como 3-d, que presenta una gran selectividad por el receptor µ (Javerovic y cols.,

2002), presente también una mayor potencia antinociceptiva en la cepa SDU que en

la W hace rechazar esta suposición. Como se verá más adelante (apartado 4.3.2.3.),

basándose en los resultados de los experimentos de unión de radioligando, podría

hipotetizarse que en los animales de la cepa SDU los agonistas µ actúen además de

sobre los receptores µ, mediante la activación de otro sitio que también es reconocido

por el naltrindol.

Otra posible justificación es que en los animales SDU la administración de

morfina, bien por la propia acción del fármaco o por el estrés derivado de la

administración, origine una liberación de agonistas endógenos δ. En este sentido,

distintos autores han descrito, bajo determinadas circunstancias, el antagonismo del

efecto antinociceptivo de morfina con antagonistas δ, así como de otros agonistas µ

como la endomorfina-2, el sufentanilo, o la β-endorfina, habiéndose sugerido en

algunos de estos casos que el agonista µ utilizado promueve la liberación de

encefalinas que colaboran en el efecto antinociceptivo actuando sobre los receptores

δ (Takemori y Portoghese, 1987; Heyman y cols., 1987; Kiefel y cols., 1993; Tiseo y

Yaksh, 1993; Tseng y Collins, 1994; Ossipov y cols., 1995b; Verborgh y Meert.,

1999; Sakurada y cols., 2001; Ohsawa y cols., 2000). Así, por ejemplo se ha

157


demostrado que la β-endorfina, y la endomorfina-2 actúan a nivel supraespinal

estimulando la liberación espinal de metencefalina, que a su vez actuando sobre los

receptores δ contribuye al efecto antinociceptivo de estos fármacos (Tseng y Collins,

1994; Ohsawa y cols., 2000; Sakurada y cols., 2001). Si bien en el caso de morfina

no ha sido demostrado que promueva la liberación de encefalinas o dinorfina a nivel

espinal, se ha observado la modulación de la liberación de encefalinas por morfina,

en tejidos como el íleon, y en un área implicada en la nocicepción como el pallidum

(Tseng y cols., 1985; Xu y cols., 1989; Anagnostakis y cols., 1992; Tseng y Collins,

1993; Olive y cols., 1995).

4.2.2.1.4.- EFECTO ANTINOCICEPTIVO DE U50488H.

El U50488H es un agonista selectivo κ, el cual carece de efecto

antinociceptivo en los ratones knockout del receptor κ, pero sí lo produce en los

carentes del receptor δ o µ, lo que apoyaría que tan solo el receptor κ estuviese

implicado en su efecto (Von Voigtlander y cols., 1983; Simonin y cols., 1998;

Matthes y cols., 1998; Zhu y cols., 1999). Sin embargo, en otros estudios se ha

descrito la modulación del efecto antinociceptivo de agonistas κ por la

coadministración de agonistas δ (Miaskowski y cols., 1990). Por ello, también se

podría suponer que en la cepa de ratas SDU existiese una mayor activación δ que

modulase y explicase la mayor sensibilidad al efecto antinociceptivo de este agonista

κ. Con el siguiente experimento se pretendió analizar esta posibilidad, determinando

el efecto de la administración de un antagonista selectivo δ sobre la antinocicepción

producida por este agonista κ en los animales de la cepa SDU.

En los animales de la cepa SDU, la administración de 10 mg/Kg de naltrindol,

produjo un descenso significativo del efecto antinociceptivo de 19 mg/Kg de

U50488H (15.9±6.9 vs 50.6±14.1%; p<0.05) (figura 33). Este experimento no se

realizó en animales de la cepa W debido a que el agonista κ, a las dosis utilizadas, no

produjo efecto antinociceptivo en esta cepa (apartado 4.2.1.2).

158


U50 U50+NTI0

20

40

60

80

100

*

%M

EP

Figura 33. Efecto de la administración de naltrindol (10 mg/Kg) sobre el efecto antinociceptivo de U50488H (19 mg/Kg) en SDU evaluado en el test TF. Las barras representan los valores medios de %MEP ± error estándar. Las comparaciones de los valores de %MEP, se analizaron con el test de la t de Student: *p<0.05 SDU U50488H vs SDU U50488H + naltrindol. n=7-8 animales por tratamiento.

Puesto que en la cepa de ratas SDU el naltrindol, a una dosis selectiva sobre

el receptor δ (Portoghese y cols., 1988; Ossipov y cols., 1996), antagonizó de forma

significativa el efecto antinociceptivo del agonista κ U50488H, los resultados

obtenidos en este experimento sugieren que en estas ratas el receptor δ juega un

papel relevante en el efecto antinociceptivo del agonista κ U50488H. Si bien

diversos estudios realizados en ratón no han encontrado modificación del efecto

antinociceptivo de U50488H al administrar naltrindol, oligodesoxinucleótidos contra

el RNAm del receptor δ, o al escindir este receptor, otros estudios farmacológicos en

rata muestran que el efecto antinociceptivo de este agonista κ es antagonizado en

parte por la administración de naltrindol (Portoghese y cols., 1988; Tseng y Collins,

1994; Endoh y cols., 1999; Zhu y cols., 1999; Craft y cols., 2001).

159


Una posibilidad para explicar los resultados de este experimento, es que el

U50488H a la dosis utilizada (19 mg/Kg), haya perdido su selectividad y actúe

directamente sobre el receptor δ, sin embargo el antagonista selectivo κ nor-BNI a

dosis selectivas de este receptor bloquea completamente su efecto antinociceptivo

(apartado 4.2.2.2.1.). Otra posible explicación, basada en los resultados de los

experimentos de unión de radioligando (apartado 4.3.2.3.), sería que en los animales

de la cepa SDU el U50488H además de sobre el receptor κ, estuviese actuando sobre

otro estado de este receptor (dímero δ-κ), que fuese también reconocido por el

naltrindol.

Teniendo en cuenta que la coadministración de dosis subefectivas de un

agonista δ potencia el efecto antinociceptivo del agonista κ U50488H (Miaskowki y

cols., 1990), una tercera hipótesis sería que en la cepa de ratas SDU la administración

de este opioide promoviera una liberación de ligandos endógenos, que al actuar sobre

el receptor δ cooperaran al efecto antinociceptivo de este fármaco. Se ha descrito que

los agonistas κ bremazocina y U50488H promueven la liberación espinal de

dinorfina que contribuye a su efecto antinociceptivo, pero tan solo se ha demostrado

liberación de metencefalina con bremazocina (Tseng y Collins, 1993). Como se ha

comentado anteriormente, el estrés promueve la liberación de opioides endógenos, y

se ha comprobado que en las ratas SDU, como consecuencia del estrés, se produce

una mayor analgesia mediada por receptores opioides δ que en las W (apartado

4.2.2.1.1.). Por ello, también podría especularse la posibilidad de que la liberación de

estos opioides endógenos fuese debida al efecto del estrés originado en el animal por

su manipulación, y por consiguiente la mayor actividad δ, debida al estrés en las

ratas SDU, originase una mayor potenciación del efecto antinociceptivo del agonista

κ.

4.2.2.2.- ANÁLISIS DEL PAPEL DE LOS RECEPTORES κ.

Como ya se ha comentado, en las ratas SDU el efecto antinociceptivo de

U50488H fue revertido por naltrindol, sugiriendo la posibilidad de que éste fuese

producido por la activación de los receptores δ (apartado 4.2.2.1.4.). Además,

también se ha comentado con anterioridad, la modulación del efecto antinociceptivo

160


de agonistas µ por agonistas κ (Miaskowski y cols., 1992). Estos hechos justifican el

estudio del papel de los receptores κ en el efecto antinociceptivo de U50488H y de

morfina, mediante el uso del antagonista selectivo nor-BNI.

4.2.2.2.1.- EFECTO ANTINOCICEPTIVO DE U50488H.

Como se ha descrito en el apartado 4.2.2.1.4., en la cepa de ratas SDU el

efecto antinociceptivo del agonista κ fue revertido con la administración de un

antagonista δ. Ello podría deberse a que el U50488H estuviese actuando sobre el

receptor δ. Con el fin de comprobar esta posibilidad, se determinó el efecto de la

administración del antagonista κ nor-BNI sobre la antinocicepción inducida por

U50488H.

La administración del antagonista selectivo κ nor-BNI, a una dosis selectiva

sobre el receptor κ (Takemori y cols., 1988), originó en la cepa de ratas SDU un

descenso significativo del efecto antinociceptivo de este fármaco (8.8±8.8 vs

50.6±6.9%; p>0.05) (figura 34). Al igual que en el apartado 4.2.2.1.4., este

experimento no se realizó en ratas W debido a que en esta cepa de animales no se

obtuvo efecto antinociceptivo con las dosis utilizadas de agonista κ.

161


U50 U50+nor-BNI0

20

40

60

80

100

*

%M

EP

Figura 34. Efecto de la administración de nor-BNI (9.04 mg/Kg) sobre el efecto antinociceptivo de U50488H (19 mg/Kg) en SDU evaluado en el test TF. Las barras representan los valores medios de %MEP ± error estándar. Las comparaciones de los valores de %MEP, se analizaron con el test de la t de Student: SDU U50488H vs SDU U50488H + nor-BNI *p<0.05. n=6-7 animales por tratamiento.

Por consiguiente, estos resultados confirman que la activación de los

receptores opioides κ es precisa para que el U50488H ejerza su efecto

antinociceptivo en las ratas SDU, con independencia de que también sea necesaria la

activación de los δ, como se desprende de los resultados del apartado 4.2.2.1.4.

4.2.2.2.2.- EFECTO ANTINOCICEPTIVO DE MORFINA.

La morfina es un fármaco opioide que interactúa con los tres receptores

aunque con diferente afinidad. Se ha demostrado que el receptor µ es el principal

responsable de su efecto antinociceptivo, aunque también se ha sugerido que los

receptores κ también podrían intervenir en este efecto en determinadas circunstancias

(Kest y cols., 1993; Mattes y clos., 1996; Simonin y cols., 1998; Zhu y cols., 1999;

162


Omiya y cols., 2000), y que a través del receptor κ se puede modular el efecto

antinociceptivo de los agonistas µ (Miaskowski y cols., 1992). Con el fin de

determinar la participación de la actividad del sistema κ en la mayor potencia

antinociceptiva de morfina en la cepa SDU, se analizó el efecto la nor-BNI sobre la

antinocicepción inducida por morfina en ambas cepas de ratas.

En la cepa de ratas W la administración de nor-BNI, a dosis de 9.04 mg/Kg,

no modificó la curva dosis-efecto antinociceptivo de morfina, ni la DE50 estimada

(DE50, morfina+nor-BNI vs morfina: 1.57±0.10 vs 1.45±0.06; p>0.05). En la cepa

SDU, la administración de este antagonista κ desplazó significativamente la curva a

la derecha. Así, para la cepa SDU la DE50 estimada de morfina tras la

coadministración de nor-BNI fue significativamente superior que la estimada sin el

antagonista (DE50=1.26±0.21 mg/Kg con nor-BNI y 0.66±0.04 mg/Kg sin nor-BNI;

p<0.05). Además, en SDU, los valores de %MEP obtenidos con la administración de

1.2 mg/Kg de morfina se reducen de forma significativa al administrar nor-BNI

(32.6±10.2 vs 76.4±5.1%; p<0.001). Con el tratamiento previo con nor-BNI

desaparecieron las diferencias significativas entre ambas cepas (F1, 42 = 1.21; p>0.05)

en las curvas dosis-efecto antinociceptivo de morfina, así como entre las

correspondientes DE50 estimadas (figura 35).

163


Factor F(g.l.factor,

residual)

Valor pSD

U Dosis F(3, 54)=19.27 p<0.001Tratamientos F(1, 54)=11.34 p<0.01Dosis-Tratam. F(3, 54)=2.09 n.s.

W Entre dosis F(2, 44)=18.70 p<0.001Entre tratamientos F(1, 44)=0.00 n.s.In. Tratam.-Dosis F(2, 44)=0.61 n.s.

1 50

20

40

60

80

100SDU morfina+nor-BNIW morfina +nor-BNISDUW

***


%M

EP

Figura 35. Efecto de la administración de nor-BNI (9.04 mg/Kg) sobre las curva dosis-efecto antinociceptivo de morfina evaluado en el test TF. Los puntos representan los valores medios de %MEP ± error estándar. Las comparaciones se realizaron con un test de ANOVA de dos vías y los resultados se muestran en la tabla de la figura. Los valores de %MEP, obtenidos con cada dosis de morfina, se analizaron con un test de Bonferroni: ***p<0.001 SDU morfina vs SDU morfina + nor-BNI. n= 5-12 animales por dosis y cepa.

164


Los resultados de este experimento demuestran que los receptores κ también

están involucrados en la mayor potencia antinociceptiva del agonista µ morfina,

puesto que la nor-BNI, a una dosis selectiva sobre el receptor κ (Takemori y cols.,

1988) produce una disminución del efecto antinociceptivo de este opioide en SDU

sin modificarlo en las ratas W. Además, el hecho de que en los animales de la cepa

W esta dosis de nor-BNI no origine disminución alguna del efecto antinociceptivo

de morfina, sugiere que el antagonismo observado en SDU, es por actuación κ y no

es debido a la actuación directa del naltrindol sobre el receptor µ.

Una posible explicación a estos resultados, podría ser que en la cepa SDU se

produjese una mayor activación endógena del receptor κ, que potenciase el efecto de

morfina. A este respecto, se ha apuntado que determinados agonistas µ, como

endomorfina-2 y [Dmt(1)]DALDA, promueven la liberación espinal de dinorfina,

que participa en el efecto antinociceptivo (Ohsawa y cols., 2000; Ohsawa y cols.,

2001; Sakurada y cols., 2001; Szeto y cols., 2003). Si bien no se ha podido demostrar

que morfina promueva la liberación de este péptido endógeno a nivel espinal (Tseng

y Collins, 1993; Szeto y cols., 2003), sí se ha demostrado en otros lugares del SNC

como la substancia nigra (You y cols., 1996), que es un área encefálica implicada en

la nocicepción (Baumeister y cols., 1987). Sin embargo, se ha descrito que las

dinorfinas presentan efectos antinociceptivos y efectos pronociceptivos (Herman y

Goldstein, 1985; Fujimoto y cols., 1990; Tseng y Collins, 1993), resultando difícil

interpretar esta posibilidad. En cualquier caso, estos resultados muestran que la

activación de los receptores κ colabora con el efecto antinociceptivo de morfina en la

cepa de ratas SDU, originando una mayor potencia antinociceptiva de este fármaco

en esta cepa con respecto a la W.

Una interacción δ-κ, parecida a la encontrada en este proyecto, se ha descrito

en ratas hembra durante el periodo de gestación o al recibir continuadamente 17-β-

estradiol y progesterona. En estas circunstancias, se produce una hipoalgesia que

puede ser revertida por antagonistas δ o κ vía i.t., por lo que los autores sugieren que

para que tenga lugar este efecto antinociceptivo, se precisa una activación conjunta

por agonistas endógenos de ambos receptores (Dawson-Basoa y Gintzler, 1998). Sin

165


embargo, en trabajos previos de estos autores, si bien se observa que dicho fenómeno

produce una potenciación del efecto antinociceptivo de un agonista κ por vía i.t., no

se origina modificación alguna del efecto de un agonista µ (Dawson-Basoa y

Gintzler, 1996).

Globalmente, los resultados obtenidos en el presente estudio, presentan una

similitud sorprendente con los descritos previamente en el modelo de ratones HA y

LA. Los ratones HA, muestran una mayor sensibilidad al efecto antinociceptivo de

U50488H en tests térmicos, y al de morfina tanto en test térmicos, como en la

segunda fase del test de la formalina, aunque no en la primera. Además, esta cepa

posee una mayor AIE que la LA, y la nor-BNI revierte su mayor sensibilidad a la

antinocicepción de morfina (Panocka y cols., 1986; Marek y cols., 1992; Kest y cols.,

1993; Lutfy y cols., 1996). Por otro lado, también se ha comprobado que estos

ratones no difieren entre sí en la dependencia física a morfina (Kest y cols., 1998b).

Por lo tanto, esta gran similitud sugiere la existencia de una correlación inter-especie

entre los fenómenos observados y la/s causa/s de éstos. En este sentido, en el estudio

realizado por Mogil y cols. (1995) se propone que las acciones de 1 ó 2 locus

genéticos son capaces de aportar a los ratones HA una elevada sensibilidad a la AIE,

y a la originada por agonistas µ y κ. Por lo tanto, esta similitud entre modelos de

especies diferentes podría sugerir que este/os locus genético/s se conservan entre

estas dos especies proporcionando también esta sensibilidad a las ratas de la cepa

SDU.

En cualquier caso, la cooperación interreceptorial de receptores κ y δ con los

receptores µ, encontrada en las ratas SDU, es la base de la variabilidad a las

respuesta antinociceptiva de morfina observada en este estudio. Si bien, en estos

animales el receptor δ también parece estar implicado en las diferencias detectadas

en otras respuestas como AIE y nocicepción basal a la formalina.

166


4.3.- CARACTERIZACIÓN DE LOS RECEPTORES OPIOIDES MEDIANTE

ESTUDIOS DE UNIÓN DE RADIOLIGANDO.

Los resultados obtenidos en los experimentos in vivo, permitían plantear la

hipótesis de que los mismos pudieran deberse a diferencias en la densidad de los

distintos tipos de receptores opioides o en la afinidad de los ligandos por éstos. Por

ello se planteó inicialmente el estudio de las densidades de los distintos tipos de

receptores, así como su afinidad por distintos agonistas y antagonistas, mediante

estudios de unión de radioligando. Para ello, se utilizó los agonistas [3H]DAMGO y

[3H]U69593 y el antagonista [3H]naltrindol, como radioligandos µ, κ y δ

respectivamente.

Con el fin de determinar el rango de concentración de proteínas a utilizar, en

experimentos previos se determinó la relación entre fijación específica de

radioligando y la concentración de proteína. Se obtuvo una relación lineal (r2>0.95)

hasta valores de proteína de 3000, 1500 y 700µg/ml para [3H]DAMGO, [3H]U69593

y [3H]naltrindol, respectivamente.

4.3.1.- DETERMINACIÓN DE LA AFINIDAD DE LOS RADIOLIGANDOS Y

DE LA DENSIDAD DE RECEPTORES: ESTUDIOS DE SATURACIÓN.

Desde hace años se ha sugerido la posibilidad de que exista una relación entre

la densidad de receptores opioides y la sensibilidad al efecto antinociceptivo de estos

fármacos (Robson y cols., 1985). Por lo tanto, con el fin de analizar en nuestro

modelo si la diferente potencia antinociceptiva de los agonistas µ y κ se debe a

diferencias en la densidad o afinidad de estos receptores, se procedió a determinar

ambos parámetros mediante estudios de unión de radioligando en membranas

cerebro de ambas cepas de ratas, tal y como se describe en el apartado 3.2.3.3.

Además, se estudio la densidad y afinidad de los receptores δ con el fin de

comprobar si las posibles diferencias en la densidad o afinidad de estos receptores

pudieran estar modulando los efectos mediados por los receptores µ y κ.

167


4.3.1.1.- SATURACIÓN DE [3H]DAMGO.

El [3H]DAMGO, en un rango de 0.03 a 10nM, se unió de modo creciente a

las membranas de cerebro utilizadas. La fijación inespecífica fue lineal en el rango

de concentraciones utilizadas (r = 0.99), constituyendo entre un 6 y un 25%. A las

concentraciones utilizadas, el [3H]DAMGO muestra una unión específica que se

satura a concentraciones de aproximadamente 3.5nM (figura 36).

En ambas cepas de ratas los datos experimentales ajustaron

significativamente a un modelo de un sitio de unión, siendo los valores de Kd y de

Bmax obtenidos similares en las membranas de cerebro de ambas cepas de ratas

(tabla VIII). Por lo tanto no aparecieron diferencias entre los animales de las cepas

SDU y W en la densidad de receptores µ en membranas de cerebro, ni en la afinidad

del radioligando por este receptor (figura 36 y tabla VIII).

168


0 2 4 6 8 100

50

100

150

200

250

300

Concentración [3H]DAMGO (nM)

Uni

ón (f

mol

/mg)

0 2 4 6 8 100

50

100

150

200

250

300

Concentración [3H]DAMGO (nM)

Uni

ón (f

mol

/mg)

Figura 36. Saturación de la unión de [3H]DAMGO en membranas de cerebro de ratas de ambas cepas. Los símbolos negros corresponden a SDU y los blancos a W, unión total (triángulos), unión inespecífica (cuadrados) y unión específica (círculos). Los datos representan valores promedio de tres experimentos realizados por duplicado en lotes de membranas diferentes.

169


4.3.1.2.- SATURACIÓN DE [3H]U69593.

En la figura 37 se muestra la unión de concentraciones crecientes de

[3H]U69593, en un rango de 0.1 a 17nM, con membranas de cerebro de ratas de

ambas cepas. La fijación inespecífica fue lineal en el rango de concentraciones

utilizadas (r = 0.99), constituyendo aproximadamente entre un 25 y un 60% de la

unión total. A las concentraciones utilizadas, el [3H]U69593 muestran una unión

específica que se satura a concentraciones de aproximadamente 5nM.

En las membranas de cerebro de ambas cepas de ratas los datos

experimentales ajustaron significativamente a un modelo de un sitio de unión. Los

valores de Kd y de Bmax obtenidos fueron similares en las membranas de cerebro

correspondientes a ambas cepas de ratas (tabla VIII). Por consiguiente, como en el

caso anterior, no se observan diferencias entre las membranas de cerebro de los

animales de las cepas SDU y W, ni en la densidad de receptores κ, ni en la afinidad

del radioligando por este receptor (figura 37 y tabla VIII).

170


1 3 5 7 9 11 13 150

25

50

75

Concentración [3H]U69593 (nM)

Uni

ón (f

mol

/mg)

0 5 10 15 200

102030

B (fmol/mg)

B/F

1 3 5 7 9 11 13 150

25

50

75

Concentración [3H]U69593 (nM)

Uni

ón (f

mol

/mg)

0 5 10 15 200

102030

B (fmol/mg)

B/F

Figura 37. Saturación de la unión de [3H]U69593 en membranas de cerebro de ratas de ambas cepas. Los símbolos negros corresponden a SDU y los blancos a W, unión total (triángulos), unión inespecífica (cuadrados) y unión específica (círculos). Los datos representan valores promedio de tres experimentos realizados por duplicado en lotes de membranas diferentes.

171


4.3.1.3.- SATURACIÓN DE [3H]NALTRINDOL.

La incubación de membranas de cerebro de ambas cepas de ratas con

concentraciones crecientes de [3H]naltrindol, desde 0.02 a 0.8nM, originó la unión

específica de este radioligando. La fijación inespecífica fue lineal en el rango de

concentraciones utilizadas (r = 0.99), constituyendo aproximadamente entre un 20 y

un 60% de la unión total. A las concentraciones utilizadas, la unión específica de

[3H]naltrindol se saturó a concentraciones de aproximadamente 0.2nM.

En ambas cepas de ratas los datos experimentales se ajustaron a un modelo de

un sitio de unión. Los valores de Kd y de Bmax obtenidos fueron similares en las

membranas de cerebro de ambas cepas de ratas (tabla VIII), sugiriendo que no

existen diferencias, entre ambas cepas, ni en la densidad de receptores δ, ni en la

afinidad del radioligando por este receptor (figura 38 y tabla VIII).

172


0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00

100

200

300

400

Concentración [3H]NTI (nM)

Uni

ón (f

mol

/mg)

0 20 40 60 800

10002000

B (fmol/mg)B/

F

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00

100

200

300

400

Concentración [3H]NTI (nM)

Uni

ón (f

mol

/mg)

0 20 40 60 800

10002000

B (fmol/mg)

B/F

Figura 38. Saturación de la unión de [3H]naltrindol en membranas de cerebro de ratas de ambas cepas. Los símbolos negros corresponden a SDU y los blancos a W, unión total (triángulos), unión inespecífica (cuadrados) y unión específica (círculos). Los datos representan valores promedio de tres experimentos realizados por duplicado en lotes de membranas diferentes.

173


Tabla VIII. Valores de Kd de los tres radioligandos utilizados y densidad de receptores en membranas de cerebro de ambas cepas de ratas.

[3H]Ligando Cepa Kd (nM) Bmax (fmol/mg proteína)

[3H]DAMGO SDU 0.65±0.06 138.0±3.1W 0.58±0.07 133.4±3.9

[3H]naltrindol SDU 0.034±0.008 73.1±3.1W 0.031±0.007 75.2±3.8

[3H]U69593 SDU 0.92±0.21 16.3±4.5W 0.88±0.13 19.6±2.8

Los resultados de estos experimentos muestran valores de afinidad y densidad

de receptores µ, κ y δ semejantes en las membranas de cerebro de ambas cepas, y

similares a los descritos previamente por otros autores en cerebro de rata, y en

receptores clonados de rata expresados en células de mamíferos (Nock y cols., 1990;

Yamamura y cols., 1992; Wang y cols., 1993; Meng y cols., 1993; Albrecht y cols.,

1997; Clark y cols., 1997). En el presente trabajo, las densidades de los receptores µ,

κ y δ, y las afinidades de los distintos radioligandos son similares en ambas cepas,

por lo que no explican la diferencia en la potencia antinociceptiva de los agonistas µ

y κ observada in vivo. Por el contrario, utilizando técnicas similares a las de este

estudio, otros autores han detectado diferencias entre cepas de roedores en la

densidad de receptores o en la afinidad de radioligandos selectivos, que podrían estar

relacionadas con la variabilidad genética en el efecto de los opioides (Mogil y cols.,

1994; Kest y cols., 1998; Herradón y cols., 2003). Estos resultados, no excluyen la

posibilidad de que estas diferencias existan en áreas discretas del cerebro, y no se

puedan detectar mediante la aproximación utilizada en el presente trabajo.

174


4.3.2.- ANÁLISIS DE LA AFINIDAD DE DISTINTOS LIGANDOS:

ESTUDIOS DE DESPLAZAMIENTO.

Aunque los resultados de los experimentos de saturación descritos

anteriormente no expliquen las diferencias observadas in vivo, no se puede descartar

que existan interacciones de ligandos selectivos de un tipo de receptor con otro tipo,

para el que no son selectivos, que justifiquen la variabilidad en el efecto biológico.

Por ello, con el fin de intentar determinar si existen diferencias en la afinidad

por los receptores opioides de ligandos que poseen una distinta potencia

antinociceptiva en estas cepas de ratas, se planteó la realización de estudios de

desplazamiento de los tres radioligandos.

4.3.2.1.- AFINIDAD DE DISTINTOS LIGANDOS SOBRE EL RECEPTOR µ:

ESTUDIOS DE DESPLAZAMIENTO DE [3H]DAMGO.

En los estudios de desplazamiento de la unión específica de [3H]DAMGO se

empleó morfina y DAMGO como ligandos µ, U50488H como ligando κ, y pCl-

DPDPE y naltrindol como ligandos δ. Además, se realizaron experimentos de

desplazamiento de este radioligando con concentraciones crecientes GTP-γ-S, puesto

que los análogos no hidrolizables del GTP son capaces de desplazar los receptores

acoplados a proteína G a su estado de baja afinidad (Frances y cols., 1985;

Richardson y cols., 1992). De esta manera se pretende hacer una aproximación al

estudio de posibles diferencias entre cepas en cuanto a la afinidad de las proteínas G

por los análogos del GTP.

a) Ligandos µ.

Los resultados obtenidos revelan que en las membranas de cerebro de ambas

cepas de ratas, los agonistas µ, DAMGO y morfina, desplazaron la unión específica

de [3H]DAMGO de un modo dependiente de concentración, llegando a inhibirla

totalmente a concentraciones de 100nM. En ambos casos, el desplazamiento se ajustó

175


a un modelo de un solo sitio de unión, obteniéndose una afinidad similar en las

membranas de cerebro de ambas cepas de ratas (figura 39 y tabla IX).

Por otra parte, los valores de Ki obtenidos en el desplazamiento con DAMGO

frío fueron similares a los de Kd obtenidos en los experimentos de saturación con

este radioligando. Además, los valores de Ki obtenidos al desplazar este radioligando

con morfina son similares a los descritos previamente por otros autores en cerebro de

rata y en el receptor µ clonado de rata expresado en células COS (Wang y cols.,

1990; Chen y cols., 1991).

b) Ligando κ.

Los resultados obtenidos en los experimentos de desplazamiento de

[3H]DAMGO por el agonista κ U50488H, pusieron de manifiesto que en las

membranas de cerebro de ambas cepas de ratas, este agonista κ inhibe la unión del

radioligando selectivo µ de forma concentración dependiente, inhibiendo totalmente

la unión específica de éste a concentraciones de 10µM (figura 39). El desplazamiento

del radioligando µ se ajustó a un modelo de un solo sitio de unión, obteniéndose una

afinidad similar en las membranas de cerebro de ambas cepas de ratas (figura 39 y

tabla IX), hallándose los valores obtenidos en el rango de los obtenidos por otros

autores en el receptor µ clonado de rata expresado en células COS (Wang y cols.,

1993).

c) Ligandos δ.

Los resultados mostraron que en las membranas de cerebro de ambas cepas

de ratas los ligandos δ, p-Cl-DPDPE y naltrindol produjeron el desplazamiento de la

unión específica de [3H]DAMGO de forma dependiente de concentración, llegando a

inhibirla totalmente a concentraciones en el intervalo µM. Ambos ligandos

desplazaron este radioligando µ según un modelo de un solo sitio de unión, con una

afinidad similar en las membranas de cerebro de ambas cepas de ratas (figura 39 y

tabla IX), estando los valores de Ki obtenidos en el caso de naltrindol en el rango de

los descritos por otros autores en el receptor µ clonado de rata expresado en células

COS-1 (Bonner y cols., 2000).

176


d) GTP-γ-S

El GTP-γ-S inhibió la unión de [3H]DAMGO de forma concentración

dependiente, aunque la inhibición de la fijación no fue completa. Así, al aumentar la

concentración de GTP-γ-S se tendió a un porcentaje mínimo de receptores ocupados

por el radioligando a la concentración usada, similar en ambas cepas (28.1±2.4% en

SDU y 25.7±2.8% en W) (figura 39). Además, el valor de IC50 obtenido en estos

deplazamientos también fue similar en ambas cepas (324.6±65.6nM y 337.0±73.5nM

en SDU y W respectivamente).

Distintos autores han descrito la inhibición de la unión de [3H]DAMGO con

análogos del GTP (Childers y Snyder, 1980; Raynor y cols., 1995). Así, se ha

demostrado que el GTP-γ-S, a una concentración 100µM, reduce la unión específica

de este radioligando en receptor µ clonado de rata hasta un 45±7%, llegando a un

35±1.5% en el receptor µ clonado humano expresados en células COS-7 (Raynor y

cols., 1995), valores que son similares a los encontrados en el presente estudio.

177


00

20

40

60

80

100

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5log[DAMGO]

%U

nión

esp

ecífi

ca

00

20

40

60

80

100

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[Morfina]

%U

nión

esp

ecífi

ca

00

20

40

60

80

100

-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3log[U50488H]

%U

nión

esp

ecífi

ca

00

20

40

60

80

100

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[p-Cl-DPDPE]

%U

nión

esp

ecífi

ca

00

20

40

60

80

100

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[Naltrindol]

%U

nión

esp

ecífi

ca

00

20

40

60

80

100

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3log[GTP-γ-S]

%U

nión

esp

ecífi

ca

Figura 39. Inhibición de la unión específica de [3H]DAMGO (1nM) en membranas de cerebro de ratas de ambas cepas por DAMGO, morfina, U50488H, p-Cl-DPDPE, naltrindol y GTP-γ-S. Los círculos negros corresponden a SDU y los blancos a W. Los puntos representan valores promedio de experimentos realizados por duplicado en dos o tres lotes de membranas diferentes. Los resultados corresponden a la media de experimentos realizados por duplicado con 2-3 lotes diferentes de membranas.

178


Tabla IX. Valores de Ki obtenidos en los experimentos de desplazamiento de [3H]DAMGO en membranas de cerebro de ambas cepas de ratas.

Ligando Cepa Ki (nM) Hill

DAMGO SDU 0.92±0.03 0.90±0.03W 0.84±0.03 0.90±0.05

Morfina SDU 2.92±0.37 0.95±0.11W 2.09±0.12 0.83±0.06

U50488H SDU 317.3±16.4 1.19±0.06W 301.3±14.9 0.98±0.04

p-Cl-DPDPE SDU 24.2±1.4 0.95±0.05W 21.7±1.4 0.86±0.05

Naltrindol SDU 8.95±1.06 0.92±0.09W 7.46±0.73 0.92±0.07

Por consiguiente, se puede descartar que las diferencias entre cepas

observadas in vivo se deban a diferencias en la afinidad por el receptor µ en el

cerebro completo o en amplias zonas de éste que puedan ser detectadas mediante este

tipo de estudios.

Además, puesto que el desplazamiento por GTP-γ-S fue similar en ambas

cepas, se puede sugerir que los agonistas µ discriminan entre poblaciones

receptoriales acopladas y desacopladas de la proteína G de manera similar en ambas

cepas.

4.3.2.2.- AFINIDAD DE DISTINTOS LIGANDOS SOBRE EL RECEPTOR κ:

ESTUDIOS DE DESPLAZAMIENTO DE [3H]U69593.

En los estudios de desplazamiento de la unión específica de [3H]U69593 se

empleó morfina y DAMGO como ligandos µ, U50488H como ligando κ, y pCl-

179


DPDPE, SNC-80 y naltrindol como ligandos δ. Asimismo, se realizaron

experimentos de desplazamiento de [3H]U69593, con concentraciones crecientes

GTP-γ-S, con el fin de abordar el estudio de posibles diferencias entre cepas en la

unión de las proteínas G con los análogos del GTP.

a) Ligando κ.

En los resultados obtenidos, el U50488H desplazó, de manera dependiente de

concentración, la unión específica del radioligando [3H]U69593, consiguiendo

desplazarlo totalmente a concentraciones en el intervalo de 10-8M. Estos

desplazamientos se ajustaron a un modelo de un solo sitio de unión, obteniéndose en

ambas cepas un valor similar de Ki (figura 40 y tabla X), y que concuerda con los

descritos previamente por otros autores para el receptor κ de cerebro de rata y el

clonado de este animal expresado en celulas COS-1 (Nock y cols., 1990; Meng y

cols., 1993).

b) Ligandos µ.

Los resultados obtenidos en los desplazamientos de la unión específica de

[3H]U69593 a las membranas de cerebro de animales de ambas cepas por DAMGO y

morfina, revelan que ambos ligandos desplazaron al radioligando de un modo

dependiente de concentración, consiguiendo desplazarlo totalmente a

concentraciones en el rango de 1 y 10µM en el caso de morfina y DAMGO,

respectivamente. Estos desplazamientos se ajustaron mejor a un modelo de un solo

sitio de unión en ambas cepas de ratas, obteniéndose también en ambas cepas un

valor similar de Ki (figura 40 y tabla X).

La afinidad de los agonistas µ por la población de receptores marcados con

[3H]U69593 obtenida en estos experimentos es similar a la descrita previamente por

otros autores para el receptor κ en membranas de cerebro de rata, y esta en el rango

de los valores descritos en el receptor clonado de rata expresado en células COS-1

(Nock y cols., 1990; Meng y cols., 1993).

180


c) Ligandos δ.

Los resultados obtenidos en los experimentos de inhibición de la unión

específica del radioligando [3H]U69593 por SNC-80 y naltrindol, en las membranas

de cerebro de animales de ambas cepas, revelan que ambos fármacos desplazaron al

radioligando de forma dependiente de concentración, consiguiendo desplazar

totalmente su unión específica a concentraciones de 10µM y 100nM para SNC-80 y

naltrindol, respectivamente (figura 40). Los valores de Ki obtenidos en ambas cepas

fueron similares, tal y como se aprecia en la tabla X. Por el contrario, el pCl-DPDPE

a concentraciones de 10µM no desplazó este radioligando más que un 20%

aproximadamente, lo que impidió calcular la Ki del mismo.

Los valores de Ki obtenidos en el desplazamiento de la unión de [3H]U69593

por SNC-80 y naltrindol están en el rango de los descritos previamente por otros

autores (Izenwasser y cols., 1999; Thomas y cols., 1999).

d) GTP-γ-S.

El análogo del GTP inhibió de forma dosis dependiente la unión específica de

este radioligando, alcanzándose un porcentaje mínimo de receptores ocupados por el

[3H]U69593 de un 10.4±6.1 y un 16.9±8.5% en las membranas de SDU y de W,

respectivamente, siendo las IC50 similares en ambas cepas (2.28±0.68µM y

1.14±0.41µM en SDU y W respectivamente) (figura 40). Esto demuestra que las

membranas de cerebro de ambas cepas mostraron un comportamiento similar en el

desplazamiento de la unión de [3H]U69593 por GTP-γ-S

Estos resultados apoyan lo ampliamente descrito por otros autores sobre la

asociación de estos receptores a las proteínas G (Childers y Snyder, 1980; Raynor y

cols., 1995; Rusovici y cols., 2004), y coinciden en los valores de inhibición maxima

de la unión de [3H]U69593 con los descritos por otros autores en membranas de

células CHO expresando el receptor κ humano (Rusovici y cols., 2004). Aunque, los

valores de IC50 del presente estudio aparecen en un rango superior al descrito por

181


Rusovici y cols. (2004), dichas diferencias pueden deberse a la diferente

concentración de radioligando empleada.

00

20406080

100

-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6log[U50488H]

%U

nión

esp

ecífi

ca

00

20406080

100

-14-13-12-11-10-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3log[DAMGO]

%U

nión

esp

ecífi

ca

00

20

40

60

80

100

-12-11-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3log[Morfina]

%U

nión

esp

ecífi

ca

00

20406080

100

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[SNC-80]

%U

nión

esp

ecífi

ca

00

20406080

100

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[NTI]

%U

nión

esp

ecífi

ca

00

20

40

60

80

100

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3log[GTP-γ-S]

%U

nión

esp

ecífi

ca

Figura 40. Inhibición de la unión específica de [3H]U69593 (1nM) en membranas de cerebro de ratas de ambas cepas por U50488H, DAMGO, morfina, SNC-80, pCl-DPDPE, naltrindol y GTP-γ-S. Los círculos negros corresponden a SDU y los blancos a W. Los puntos representan

182


valores promedio de experimentos realizados por duplicado en dos o tres lotes de membranas diferentes.

183


Tabla X. Valores de Ki obtenidos en los experimentos de desplazamiento de [3H]U69593 en membranas de cerebro de ambas cepas de ratas.

Ligando Cepa Ki (nM) Hill

U50488H SDU 0.61±0.10 0.99±0.13W 0.57±0.11 0.96±0.15

DAMGO SDU 249.8±37.4 0.90±0.11W 350.4±43.2 0.97±0.10

Morfina SDU 56.3±7.8 1.25±0.19W 61.2±3.8 1.03±0.06

p-Cl-DPDPE SDU >10000 -W >10000 -

SNC-80 SDU 1332.9±284.5 1.78±0.61W 1010.6±161.4 1.77±0.41

Naltrindol SDU 7.23±1.36 0.84±0.12W 7.50±1.13 1.21±0.20

Teniendo en cuenta que todos los ligandos utilizados en la inhibición de la

unión del radioligando [3H]U69593 mostraron similar afinidad en las membranas de

cerebro de ambas cepas de ratas, estos resultados apuntan a que las diferencias entre

éstas cepas observadas in vivo no son debidas a diferencias en la afinidad por el

receptor κ en el cerebro completo o en amplias zonas de éste, que puedan detectarse

con una aproximación de este tipo.

Además, la ausencia de diferencias entre cepas en los valores de IC50 así

como en el porcentaje del desplazamiento máximo de la unión de este radioligando

por GTP-γ-S, sugiere que la fijación de análogos del GTP a la proteína G, y por tanto

en la activación del receptor κ, son similares en ambas cepas.

184


4.3.2.3.- AFINIDAD DE DISTINTOS LIGANDOS SOBRE EL RECEPTOR δ:

ESTUDIOS DE DESPLAZAMIENTO DE [3H]NALTRINDOL.

Por idénticos motivos que en los dos casos anteriores se planteó la realización

de experimentos de desplazamiento de la unión específica de [3H]naltrindol con los

agonistas de los recptores δ1 p-Cl-DPDPE, δ2 deltorfina II, κ U50488H y µ

DAMGO.

Además, dado que el [3H]naltrindol es un antagonista, y por tanto presenta

igual afinidad por el receptor acoplado y por el receptor desacoplado de la proteína

G, es posible estudiar el equilibrio entre estas dos poblaciones receptoriales. Para

ello, se realizaron experimentos de desplazamiento del equilibrio receptorial con

análogos no hidrolizables del GTP, que son capaces de desplazar los receptores

acoplados a proteína G a su estado de baja afinidad (Fang y cols., 1994). De esta

manera se pretende hacer una primera aproximación al estudio de posibles

diferencias entre cepas en la activación de las proteínas G.

a) Ligandos δ.

En los experimentos realizados en membranas de cerebro de ambas cepas de

ratas, el naltrindol frío inhibió la fijación específica del tritiado de manera

dependiente de concentración, consiguiendo desplazar la totalidad de la unión

específica a concentraciones en el rango de 10 nM. Esta inhibición siguió un modelo

de un solo sitio de unión, con una afinidad similar en las membranas de cerebro de

ambas cepas de ratas (0.122±0.018 y 0.149±0.019nM en SDU y W, respectivamente)

(figura 41).

En todos los desplazamientos con agonistas selectivos δ, los datos

experimentales ajustaron mejor a un modelo de dos sitios de unión, no apreciándose

diferencias entre las membranas de cerebro procedentes de ambas cepas de ratas en

los valores de afinidad tanto en el caso del agonista selectivo δ1 p-Cl-DPDPE, como

en el del agonista δ2 deltorfina II. En los experimentos realizados en ausencia, así

185


como los realizados en presencia Na+ y Gpp(NH)p, el porcentaje de receptores en

cada uno de los estados fue también semejante. (figura 41, y tabla XI).

00

20

40

60

80

100

-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6

SDUW

log[NTI]

% U

nión

esp

ecífi

ca

00

20

40

60

80

100

WW Gpp(NH)p

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[p-Cl-DPDPE]

%U

nión

esp

ecífi

ca

00

20

40

60

80

100

SDUSDU Gpp(NH)p

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[p-Cl-DPDPE]

%U

nión

esp

ecífi

ca

00

20

40

60

80

100

WW Gpp(NH)p

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[II-Deltorfina]

%U

nión

esp

ecífi

ca

00

20

40

60

80

100

SDUSDU Gpp(NH)p

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[II-Deltorfina]

%U

nión

esp

ecífi

ca

Figura 41. Inhibición de la unión específica de [3H]naltrindol (0.1nM) en membranas de cerebro de ratas de ambas cepas por naltrindol, p-Cl-DPDPE y deltorfina II en estos dos últimos casos en condiciones estándar y con Na+ y Gpp(NH)p en el medio. Los puntos representan valores

186


promedio de experimentos realizados por duplicado en tres lotes de membranas diferentes.

187


Tabla XI. Valores de Ki de pCl-DPDPE y deltorfina II obtenidos en los experimentos de desplazamiento de [3H]naltrindol en membranas de cerebro de ambas cepas de ratas.

Cepa Ki(1) (nM)

R(1) (%)

Ki(2) (nM)

Liga

ndo

pCl-D

PDPE Control SDU 1.14±0.22 66.8±4.8 308.0±145.4

W 1.17±0.23 62.6±4.4 103.6±32.1Gpp(NH)p

+ NaClSDU 1.07±0.35 30.5±2.0 702.7±125.8

W 0.77±0.31 30.5±2.4 408.9±76.9

Del

torf

ina

II

Control SDU 0.53±0.06 60.9±6.4 40.9±17.9W 0.41±0.05 57.6±2.8 130.4±54.0

Gpp(NH)p + NaCl

SDU 1.00±0.30 31.1±3.7 210.2±23.9W 0.60±0.13 38.3±2.6 198.3±20.8

Los valores de Ki de naltrindol obtenidos en estos experimentos, están en el

rango de los descritos previamente para cerebro de rata y para el receptor δ de rata

clonado y expresado en células de glioma C6 (Yamamura y cols., 1992; Contreras y

cols., 1993; Clark y cols., 1997). Estos valores tampoco difieren significativamente

de los valores de Kd obtenidos en los experimentos de saturación (0.03nM, apartado

4.3.1.3.).

De igual manera, en el caso de los agonistas δ1 y δ2, los valores de afinidad

por los receptores en alta y en baja afinidad obtenidos son semejantes a los descritos

por otros autores en cerebro de roedores (Vaughn y cols., 1989; 1.9nM, Buzas y

cols., 1992; Fang y cols., 1994). El presente estudio muestra que, para ambos

agonistas, el porcentaje de receptores de alta afinidad se encuentra en torno al 60%

cuando el equilibrio esta desplazado hacia el estado de alta afinidad, mientras que en

el estudio de Fang y cols. (1994) el porcentaje de sitios en alta difiere entre el 89%

en el caso de p-Cl-DPDPE y el 33% en el caso de deltorfina II, hecho que le sirve a

188


los autores para apoyar la hipótesis de la existencia de poblaciones heterogéneas de

receptores δ. Además, en el presente estudio el porcentaje de receptores en estado de

alta afinidad fue de un 30% en todos los casos cuando el equilibrio esta desplazado

hacia el estado de baja afinidad, mientras que en el estudio de Fang y cols. (1994) fue

del 50% también en todos los casos. Esta diferencia puede deberse a la especie

estudiada, puesto que Fang y cols. (1994) utilizan membranas de cerebro de ratón.

Se ha descrito la posibilidad de una modulación a través de los receptores δ

del efecto mediado por receptores µ y κ (para revisión ver Smith y Lee, 2003). Por lo

tanto, una posible explicación de los resultados de los experimentos in vivo es que los

ligandos endógenos poseyeran una mayor afinidad por el receptor δ de los animales

de la cepa SDU que por el de los animales de la cepa W, de manera que la mayor

potencia antinociceptiva de los agonistas µ y κ fuera debida a una modulación de

ésta a través de receptores δ. Los resultados obtenidos no apoyan esta hipótesis

puesto que los tres ligandos estudiados presentan una afinidad similar por este

receptor y, además, el efecto antinociceptivo del agonista δ SNC-80 es similar en

ambas cepas de ratas (apartado 4.2.1.3.).

Por otro lado, no parece haber diferencias en el equilibrio entre la población

receptorial δ acoplada y desacoplada a proteína G, ya que en las membranas de

cerebro de ambas cepas de ratas los porcentajes de receptores en estado de alta y baja

afinidad reconocidos por los agonistas δ, en ausencia y en presencia de 50µM de

Gpp(NH)p y 100mM de Na+, son similares.

b) Ligandos κ.

En cuanto a la inhibición con ligandos κ, la unión específica de [3H]naltrindol

fue desplazada, de manera dependiente de concentración, por el U50488H,

inhibiendo completamente la fijación específica de este radioligando a

concentraciones en el rango de mM. Los datos experimentales obtenidos en

membranas de cerebro de ratas de la cepa W, se ajustaron mejor a un modelo de un

solo sitio de unión, mientras que en el caso de las membranas de la cepa SDU, los

189


datos experimentales se ajustaron mejor a un modelo de dos sitios de unión (p<0.01)

(figura 42 y tabla XII).

00

20

40

60

80

100

-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2log[U50488H]

% U

nión

esp

ecífi

ca

00

20

40

60

80

100

-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2log[U50488H]

% U

nión

esp

ecíf

ica

Figura 42. Inhibición de la unión específica de [3H]naltrindol (0.1nM) en membranas de cerebro de ratas de ambas cepas por U50488H. Los círculos negros corresponden a SDU y los blancos a W. Los puntos representan valores promedio de experimentos realizados por duplicado en tres y cuatro lotes de membranas diferentes.

190


Tabla XII. Valores de IC50, coeficiente de Hill y Ki, de U50488H y DAMGO, obtenidos en los experimentos de desplazamiento de [3H]naltrindol en membranas de cerebro de ambas cepas de ratas.

Ligando Cepa

IC50

(µM)Hill Ki(1)

(nM)R(1) (%)

Ki(2) (nM)

U50488H

SDU 27,0±6.2 0.76±0.09 42.7±18.0 12.6±2.6 9846.4±743.0W 27.7±4.9 0.80±0.08 - - 5339.6±783.3

DAMGO SDU 3.4±0.8 0.73±0.09 23.9±5.6 21.3±3.8 1813.9±109.1W 4.0±0.3 0.97±0.07 - - 946.5±64.0

Con respecto a los valores de afinidad obtenidos, en el caso de W el valor de

Ki es de un rango similar al descrito previamente por otros autores en cerebro de rata

y en membranas de células COS transfectadas con el receptor δ clonado de este

animal (Kieffer y cols., 1992; Contreras y cols., 1993). Así mismo, el valor de Ki2

obtenido en las membranas de SDU también se encuentra en este rango. El hecho de

que en las membranas de cerebro de los animales de la cepa SDU, además de este

sitio, aparezca otro de alta afinidad podría guardar relación con los resultados de

Yamamura y cols. (1992), que obtienen un valor de coeficiente de Hill inferior a la

unidad al desplazar [3H]naltrindol con U69593. Por el contrario diversos estudios

encuentran valores de coeficiente de Hill no diferentes de la unidad al desplazar

[3H]naltrindol con agonistas κ, resultados que han sido similares al utilizar otros

radioligandos selectivos δ (Cotton y cols., 1985; Knapp y cols., 1991; Contreras y

cols., 1993; Fang y cols., 1994). El hecho de que en W no aparezca este sitio de alta

afinidad no permite descartar la existencia del mismo en estos animales, puesto que

podrían encontrarse en un porcentaje muy bajo, y por consiguiente no detectable con

la metodología utilizada.

191


Estos resultados podrían deberse a una falta de selectividad del radioligando,

a que el U50488H reconozca con distinta afinidad los receptores δ acoplados y

desacoplados de la proteína G, o que el sitio reconocido por U50488H con alta

afinidad corresponda al receptor κ2.

La primera posibilidad, es decir, que el sitio de alta afinidad corresponda a

receptores µ o κ a los que se ha unido el radioligando por falta de selectividad, puede

ser descartada si tenemos en cuenta los valores de afinidad y de densidades

receptoriales obtenidos. Además esta suposición no explica el hecho de que este sitio

de alta afinidad tan solo sea detectable en la cepa de animales SDU.

La segunda posibilidad es que, al igual que ocurre con los propios agonistas

δ, en la cepa SDU el agonista κ U50488H reconozca una población de receptores δ

con alta afinidad que correspondan a receptores acoplados a la proteína G, mientras

que a los no acoplados los reconozca con baja afinidad. Esta posibilidad se puede

descartar inicialmente por el hecho de que los sitios de fijación de alta afinidad de

U50488H son un 13% del total, mientras que los reconocidos por los agonistas

selectivos δ empleados suponen un 60%. De todas formas es posible que el

U50488H reconozca con alta afinidad sólo una subpoblación de receptores δ.

Por otro lado, considerando la tercera hipótesis, el sitio de alta afinidad de

U50488H podría corresponder a receptores κ2, ya que se ha sugerido la existencia de

múltiples receptores opioides κ (Attali y cols., 1982; Morre y cols., 1983; Ver

Wollemann y cols., 1993), estando el valor de Ki de alta afinidad de U50488H

desplazando [3H]naltrindol en las ratas SDU en el rango de los valores descritos por

otros autores para el receptor κ2 (Tiberi y Magnan, 1990; Butelman y cols., 1998).

Recientemente, se ha sugerido que el receptor κ2 podría corresponder en realidad con

un dímero κ-δ, debido a la similitud de la farmacología de este dímero con la descrita

para el receptor κ2 (Jordan y Devi, 1999). En cualquier caso, se precisan más

experimentos para esclarecer a qué corresponde el sitio de alta afinidad de U50488H

encontrado en SDU pero no en W, y que implicación tiene en las peculiaridades

observadas in vivo.

192


c) Ligandos µ.

El DAMGO desplazó de manera dosis dependiente la unión específica de

[3H]naltrindol, inhibiendo completamente la fijación específica del mismo a

concentraciones en el rango de 100µM. De forma semejante a lo observado en el

apartado anterior, los resultados de los experimentos de inhibición con DAMGO en

membranas de cerebro obtenidas de ratas de la cepa W se ajustaron mejor a un

modelo de un solo sitio de unión, mientras que en el caso de las membranas

obtenidas de animales de la cepa SDU los datos experimentales se ajustaron mejor a

un modelo de dos sitios de unión (p<0.01) (figura 43 y tabla XII).

193


00

20

40

60

80

100

-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3log[DAMGO]

% U

nión

esp

ecífi

ca

00

20

40

60

80

100

-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3log[DAMGO]

% U

nión

esp

ecífi

ca

Figura 43. Inhibición de la unión específica de [3H]naltrindol (0.1nM) por DAMGO en membranas de cerebro de ratas de ambas cepas. Los círculos negros corresponden a SDU y los blancos a W. Los puntos representan valores promedio de experimentos realizados por duplicado en tres lotes de membranas diferentes.

194


El valor de Ki obtenido en el caso de W es de un rango similar al descrito

previamente por otros autores en cerebro de rata y en el receptor δ clonado de este

animal expresado en células COS y células NG 108-15 (Kieffer y cols., 1992;

Contreras y cols., 1993). Así mismo, en las membranas de cerebro de SDU el valor

de Ki2 obtenido también se encuentra en este rango. De manera semejante a lo

ocurrido en el caso de U50488H, en las membranas de cerebro de los animales SDU

el DAMGO además de reconocer un sitio con similar afinidad al reconocido en W,

reconoce otro sitio diferente con alta afinidad. En la literatura encontramos casos en

los que, en roedores, un ligando µ desplaza a un radioligando δ con un coeficiente de

Hill no diferente de la unidad o ajustándo a un modelo de un solo sitio de unión y

casos en los que el desplazamiento ajusta a un modelo de dos sitios de unión. (Cotton

y cols., 1985; Traynor y cols., 1990; Knapp y cols., 1991; Yammamura y cols., 1992;

Contreras y cols., 1993; Fang y cols., 1994; Fraser y cols., 1999).

De igual manera y por los mismos motivos que en el apartado anterior, puede

descartarse la posibilidad de que el sitio de alta afinidad encontrado en SDU se deba

a la unión inespecífica del radioligando.

Así mismo, la diferencia en la proporción de receptores en alta afinidad

reconocidos por DAMGO y por los agonistas δ, se opone a la posibilidad de que

estos resultados se deban a que el DAMGO reconozca con diferente afinidad los

receptores δ acoplados y desacoplados de la proteína G. No obstante es posible que

el DAMGO esté reconociendo con alta afinidad una subpoblación de receptores δ.

Por otro lado, considerando que la interacción entre los receptores δ y µ ha

sido extensamente documentada (Rothman y cols., 1989 y 1992; Cha y cols., 1995;

para revisión ver Traynor y Elliott, 1993), una tercera posibilidad sería que el sitio de

alta afinidad podría ser causa de una interacción entre los receptores δ y µ, como han

sugerido previamente otros autores (Cotton y cols., 1985; Traynor y cols., 1990). En

esta línea, recientemente se ha descrito la interacción física entre los receptores µ y δ

formando dímeros que, al ser coexpresados en células COS presentan un perfil

farmacológico nuevo (George y cols., 2000; Gomes y cols., 2000). En este trabajo, al

desplazar el [3H]naltrindol con DAMGO encontramos, en las membranas de las ratas

195


SDU, una Ki para el sitio de alta afinidad similar a la descrita para los dímeros µ-δ

(George y cols., 2000; Martin y Prather, 2001). Por lo tanto, una posible explicación

a la aparición de este sitio de alta afinidad en las membranas de los animales SDU y

no en las de las ratas W podría ser que en SDU existe un mayor porcentaje de

receptores δ formando dímeros con los receptores µ que en W, permitiendo su

detección por estos procedimientos. No obstante, se precisan más experimentos para

demostrar si realmente este sitio corresponde a dímeros µ-δ, y el papel que juegan en

las diferencias observadas in vivo.

4.4.- ANÁLISIS DE LA FUNCIONALIDAD DE LOS RECEPTORES

OPIOIDES MEDIANTE ESTUDIOS DE UNIÓN DE GTP-γ-[35S].

La medida de unión de radioligandos a los receptores opioides no se

correlaciona necesariamente con el acoplamiento funcional a los sistemas de

transducción intracelulares (Nijssen y cols., 1992; Maher y cols., 2000). Por ello, los

resultados obtenidos en los estudios de unión de radioligandos no dan cuenta de lo

que ocurre en los estadíos transduccionales. Por lo tanto, a pesar de que las dos cepas

de ratas en estudio no presentan diferencias en la afinidad de los distintos ligandos

opioides por sus correspondientes receptores ni en la densidad de los mismos, las

diferencias observadas in vivo podrían ser consecuencia de diferencias en la

activación receptorial.

En los estudios de unión de radioligando se analizó superficialmente la

interacción del receptor con las proteínas G, midiendo el desplazamiento de los

receptores hacia los estados de alta y baja afinidad, es decir acoplados o

desacoplados de la proteína G. Sin embargo, esta aproximación unicamente permite

determinar diferencias grandes en la activación de las proteínas G, por lo que se

realizó una aproximación más fina con ensayos de unión de GTP-γ-[35S], que

permiten determinar el nivel de activación de la proteína G tras la ocupación por

agonistas de los receptores opioides (Harrison y Traynor, 2003).

196


4.4.1.- ACTIVACIÓN DE LOS RECEPTORES POR DISTINTOS

AGONISTAS: CURVAS DE ESTIMULACIÓN DE LA UNIÓN DE GTP-γ-

[35S].

Los estudios de fijación de GTP-γ-[35S] permiten cuantificar la activación de

receptores acoplados a proteína G, habiendo sido utilizados para estudiar la

activación de receptores opioides (Traynor y Nahorski, 1995). Estos ensayos

permiten la obtención de curvas concentración – efecto y, por consiguiente, la

medida de la potencia (CE50) y la eficacia relativa (Emax) (Harrison y Traynor,

2003). Por ello, han sido utilizados por distintos autores para la detección de

diferencias en la activación de proteínas G por agonistas opioides entre distintas

cepas de roedores (Selley y cols., 2003; Narita y cols., 2003).

En el presente trabajo, se utilizó esta técnica para estudiar la activación

receptorial opioide por distintos agonistas en ambas cepas de ratas, con el fin de

determinar si las diferencias observadas in vivo son debidas a diferencias en la

capacidad de activación receptorial opioide.

Por otro lado, a pesar de que los resultados del estudio in vivo del efecto

antinociceptivo de morfina con distintos tests nociceptivos no sugieren una

localización restringida a nivel espinal o supraespinal de las diferencias intercepa

(apartados 4.1.1.1. y 4.1.1.2.), se estudió la activación receptorial por este agonista µ

también en membranas de médula con el fin de estudiar la posibilidad de que existan

diferencias en la activación receptorial a este nivel.

4.4.1.1.- AGONISTAS µ (MORFINA Y DAMGO).

Cuando se incubaron concentraciones crecientes de morfina o de DAMGO

con GTP-γ-[35S] se originó un incremento de la fijación del mismo a membranas de

cerebro de ambas cepas de ratas, que alcanzó un máximo a la concentración de 10-5M

(figura 44). Al analizar las curvas de estimulación obtenidas, se obtuvieron valores

de potencia de morfina y DAMGO similares en ambas cepas, así como una similar

eficacia de estos dos fármacos (tabla XIII).

197


Tabla XIII. Valores de CE50 y Emax para morfina, DAMGO, SNC-80, deltorfina II y pCl-DPDPE estimados de las curvas concentración – fijación de GTP-γ-[35S], en membranas de cerebro y de médula de ratas SDU y W.

Fármaco Memb. Cepa CE50 o CE50(1)/(2) (nM) Emax o Emax(1)/(2) (%)

MorfinaCerebro SDU 387.6±136.0 135.2±2.2

W 276.4±69.6 130.4±1.5

Médula SDU 310.6±71.9 115.2±7.4W 472.4±171.6 117.6±2.5

DAMGO Cerebro SDU 120.0±23.4 139.3±2.5W 109.2±28.8 136.6±3.6

SNC-80 Cerebro SDU 54.5±26.8 113.8±1.1W 82.0±45.6 114.6±1.3

Deltorfina II

Cerebro SDU 474.1±105.9 114.6±1.0W 862.4±393.0 113.8±1.8

pCl-DPDPE

Cerebro SDU (1)12.4±6.0/(2)1260±266 (1)110.0±1.8/(2)140.7±0.8W (1)15.3±5.5/(2)1269±326 (1)113.1±2.4/(2)138.7±1.3

198


0100

110

120

130

140

-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3

SDUW

log[Morfina]

%U

nión

de

GTP

- γ-[

35S]

0100

110

120

130

140

-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5

SDUW

log[DAMGO]

%U

nión

GTP

- γ-[

35S]

Figura 44. Curvas concentración – respuesta de morfina y DAMGO sobre la estimulación de la unión de GTP-γ-[35S] en membranas de cerebro de ambas cepas de ratas. Los datos representan la media ± error estándar de distintos experimentos por duplicado en 3-5 lotes de membranas distintos.

199


La potencia de la morfina en membranas de médula fue similar en ambas

cepas y semejante a la obtenida en membranas de cerebro, siendo la eficacia menor

que en membranas de cerebro, aunque no se detectaron diferencias entre ambas cepas

(tabla 45 y tabla XIII).

090

100

110

120

130SDUW

-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3log[Morfina]

% U

nión

GTP

- γ-[

35S]

Figura 45. Curvas concentración – respuesta de morfina y DAMGO sobre la estimulación de la unión de GTP-γ-[35S] en membranas de médula espinal de ambas cepas de ratas. Los datos representan la media ± error estándar de distintos experimentos por duplicado en 2 lotes de membranas distintos.

Los valores de CE50 obtenidos en este estudio para DAMGO y para morfina

están en el rango de los previamente descritos por otros autores para membranas de

cerebro entero y de distintos núcleos cerebrales de rata (Selley y cols., 1996; Márki y

cols., 1999; Selley y cols., 2003). Sin embargo, en el presente trabajo la eficacia de

morfina es ligeramente inferior a la encontrada en estos estudios (Márki y cols.,

1999; Selley y cols., 2003), pudiendo deberse al diferente método de obtención de

200


membranas y a que este parámetro depende del área cerebral utilizada (Tsuji y cols.,

1999; Maher y cols., 2000).

4.4.1.2.- AGONISTAS δ (SNC-80, DELTORFINA II Y pCl-DPDPE).

Tanto el SNC-80, como la deltorfina II y el pCl-DPDPE produjeron de forma

concentración dependiente la estimulación de la unión de GTP-γ-[35S], no

observándose diferencias entre las dos cepas de ratas en estudio, en la potencia o en

la eficacia de estos fármacos (figura 46, tabla XIII).

En el caso de pCl-DPDPE la curva concentración - respuesta fue bifásica,

ajustando significativamente mejor a un modelo de dos sitios de unión en las

membranas de cerebro de ambas cepas (p<0.001). Los valores de CE50 para ambos

sitios fueron similares en las dos cepas de ratas estudiadas. No se observaron

tampoco diferencias entre cepas en los valores de unión máxima en cada una de las

fases (figura 46, tabla XIII).

201


0

100

105

110

115

120

WSDU

-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[SNC-80]

%U

nión

GTP

- γ-[35

S]

0

100

105

110

115

120

-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log [II-Deltorfina]

% U

nión

GTP

- γ-[

35S]

0

100

110

120

130

140

150

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log [p-Cl-DPDPE]

% U

nión

de

GTP

- γ-[

35S]

Figura 46. Curvas concentración – respuesta de SNC-80, deltorfina II y pCl-DPDPE sobre la estimulación de la unión de GTP-γ-[35S] en membranas de cerebro de ambas cepas de ratas. Los datos representan la media ± error estándar de distintos experimentos por duplicado en 3 - 6 lotes de membranas distintos.

202


Los valores obtenidos de CE50 para SNC-80 y deltorfina II en este estudio

están en el rango de los descritos por otros autores en membranas de células

trasfectadas con cDNA del receptor δ de rata, en membranas de cerebro de ratón y en

membranas de corteza cerebral de mono (Clark y cols., 1997; Hosohata y cols., 2000;

Ko y cols., 2003). La eficacia encontrada en el caso de deltorfina II fue similar a la

descrita en membranas de médula espinal de ratón y en membranas de corteza

cerebral de mono (Wang y cols., 2001; Ko y cols., 2003), aunque Hosohata y cols.

(2000) describen una eficacia unas tres veces superior a la determinada en el presente

estudio en membranas de cerebro de ratón, fenómeno que puede deberse al distinto

origen de las membranas empleadas.

Por otro lado, la curva bifásica de pCl-DPDPE obtenida en este estudio puede

ser debida a una menor selectividad de éste, uniéndose a concentraciones bajas al

receptor δ y a concentraciones elevadas al µ (Hosohata y cols., 2000). Por este

motivo, en el presente estudio se procedió al análisis de los receptores implicados en

cada una de las fases mediante la utilización de antagonistas selectivos. Así, en

membranas de ambas cepas, la unión de GTP-γ-[35S] inducida por una concentración

de 10-7M de pCl-DPDPE, que corresponde a la fase de alta potencia, es antagonizada

totalmente por naltrindol 10-8M (figura 47), confirmando que la primera fase se

produce por la estimulación de receptores δ. Además, el antagonista µ CTAP, a una

concentración 0.2µM revierte parcialmente el efecto de una concentración 10-5M de

pCl-DPDPE, quedando la unión de GTP-γ-[35S] en los niveles correspondientes a la

fase de alta afinidad (figura 47), sugiriendo por tanto que la segunda fase

corresponde a la activación de receptores µ. Estos resultados demuestran que la

segunda fase de estimulación de la unión GTP-γ-[35S] por pCl-DPDPE es debida a

una pérdida de selectividad, probablemente por la unión de este agonista a receptores

µ, lo que había sido sugerido anteriormente por Hosohata y cols. (2000).

203


SDU 10-5W 10-5SDU 10-5 + CTAPW 10-5 + CTAPSDU 10-7W 10-7SDU 10-7 +NTIW 10-7 + NTI

100

110

120

130

140

150

****

*** **

SDU W SDU W SDU W SDU W

% U

nión

GTP

-γ-[

35S]

- 2·10-7 - - CTAP (µM) - - - 10-8 NTI (M) 10-5 10-5 10-7 10-7 pCl-DPDPE

Figura 47. Efecto de CTAP (2·10-7M) sobre la estimulación de la unión de GTP-γ-[35S] por pCl-DPDPE (10-5M) y de naltrindol (10-8M) sobre la estimulación de la unión de GTP-γ-[35S] por pCl-DPDPE (10-7M). Los datos representan los valores medios ± error estándar de distintos experimentos por duplicado en 3 lotes de membranas distintos. Los valores de % de unión se compararon con el test de la t de Student, y los resultados se expresan como: ** p<0.01 y *** p<0.001 vs el correspondiente control sin antagonista.

4.4.1.3.- AGONISTAS κ (U69593).

En el caso de la activación de los receptores κ, el U69593 produjo un

incremento de la unión de GTP-γ-[35S] a concentraciones en el rango de µM en las

membranas de cerebro de ambas cepas de ratas, no apreciándose diferencias entre

ellas en los valores de estimulación obtenidos (figura 48). No fue posible determinar

el valor de CE50 ni del efecto máximo, debido a que a la máxima concentración

estudiada (10µM) no se alcanzó la saturación.

204


095

100

105

110

115

120SDUW

-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4log[U69593]

%U

nión

GTP

- γ-[

35S]

Figura 48. Curvas concentración – respuesta de U69593 sobre la estimulación de la unión de GTP-γ-[35S] en membranas de cerebro de ambas cepas de ratas. Los datos representan la media ± error estándar de distintos experimentos por duplicado en 2 lotes de membranas distintos.

La estimulación obtenida con la concentración máxima utilizada (10µM), fue

del mismo rango a la descrita en membranas de médula espinal y de determinadas

regiones cerebrales de ratón, si bien es ligeramente inferior a la encontrada en las de

otras (Wang y cols., 2001; Mizoguchi y cols., 2004), pudiendo deberse a que la

activación por agonistas κ depende de la región del sistema nervioso considerada

(Mizoguchi y cols., 2004), y a que se trata de dos especies distintas.

En cuanto a la potencia, al contrario que con los agonistas µ y δ, en el caso de

U69593 la activación receptorial aparece a rangos elevados de concentración, tal

como se ha descrito por otros autores (Wang y cols., 2001; Mizoguchi y cols., 2004).

Sin embargo, otros estudios describen esta activación a concentraciones inferiores,

en membranas de células que expresan el receptor κ clonado de rata o el humano, y

en membranas de corteza cerebral y tálamo de mono (Remmers y cols., 1999; Kohno

y cols., 2000; Ko y cols., 2003). Teniendo en cuenta que la estimulación de proteínas

205


G por los agonistas es proporcional a la densidad de receptores (Selley y cols., 1998;

Ko y cols., 2003), una posible explicación de lo observado en estos experimentos es

que debido a la baja densidad de receptores κ en estas membranas (apartado

4.3.1.2.), la fijación observada a concentraciones elevadas de U69593 sea debida a la

activación de receptores µ o δ.

En resumen, se puede afirmar que en este estudio no aparecen diferencias en

la potencia o eficacia de los agonistas utilizados para activar los receptores µ, δ o κ

que permitan explicar las diferencias observadas entre las cepas SDU y W en los

experimentos in vivo. Esta técnica ha sido empleada previamente por otros autores

que sí han encontrado una correlación entre el efecto in vivo de los opioides y la

capacidad de estimular la fijación de GTP-γ-[35S] (Matthes y cols., 1998; Hosohata y

cols., 2000; Narita y cols., 2003; Ozaki y cols., 2003; Selley y cols., 2003). Así, se ha

utilizado para correlacionar la activación receptorial con las diferencias observadas

in vivo entre cepas de roedores, habiéndose encontrado en algunos casos diferencias

al utilizar membranas de cerebro entero, mientras que en otros casos éstas han

aparecido al utilizar membranas de determinadas áreas cerebrales (Narita y cols.,

2003; Selley y cols., 2003). Por consiguiente, puesto que en el presente estudio los

experimentos han sido realizados en membranas de cerebro entero o de médula

espinal, cabe la posibilidad de que las diferencias en la activación receptorial entre

estas cepas esté restringida a zonas más concretas, imposibilitando su observación

mediante esta aproximación.

Otra posibilidad es que la cantidad de la proteínas G que se activan no sea

diferente entre cepas, sino que lo sea la proporción de los distintos tipos de proteína

G. Se ha sugerido que los dímeros µ-δ, al contrario que ambos receptores por

separado, se acoplan a una proteína G insensible a la toxina pertusis (George y cols.,

2000). En el presente estudio cabría la posibilidad de que en la cepa SDU estos

dímeros sean más abundantes que en las ratas W (apartado 4.3.3.2.c), lo que estaría

en concordancia con esta hipótesis.

206


Por otro lado, también podría darse el caso de que las diferencias entre cepas

observadas in vivo, tengan su origen en los pasos de la transducción posteriores a la

activación de la proteína G.

4.4.2.- ESTUDIO DE LA POSIBLE SINERGIA INTERRECEPTORIAL

OPIOIDE: ACTIVACIÓN CONJUNTA DE LOS DISTINTOS RECEPTORES

OPIOIDES.

Los resultados del efecto de naltrindol y nor-BNI sobre la antinocicepción de

morfina y U50488H en estas cepas de ratas, sugieren que las diferencias observadas

in vivo son debidas a la activación de distintos receptores opioides más que a la

activación de alguno de ellos (apartados 4.2.2.1.3, 4.2.2.1.4 y 4.2.2.2). Por ello, dado

que se ha descrito que el efecto conjunto de ligandos opioides selectivos de distintos

tipos de receptores origina una sinergia en la fijación de GTP-γ-[35S] (Childers y

cols., 1998; Gomes y cols., 2004), cabe la posibilidad de que las diferencias

observadas entre ambas cepas se deban al sinergismo derivado de la coactivación de

distintos receptores opioides. Para estudiar este aspecto, se procedió al análisis de las

posibles diferencias entre cepas en la fijación de GTP-γ-[35S] tras la coactivación

interreceptorial.

Estos experimentos revelaron que la incubación de membranas de cerebro

con combinaciones de agonistas selectivos de los distintos receptores opioides,

originó en ambas cepas incrementos similares en la fijación de GTP-γ-[35S] (figura

49).

207


W SDU W SDU W SDU100

110

120

130

100 - 100 p-Cl-DPDPE (nM) 10 10 - U69593 (µM) - 100 100 DAMGO (nM)

% U

nión

GTP

-γ-[

35S]

Figura 49. Efecto de la acción conjunta de la combinación de un agonista δ y uno κ, un agonista κ y uno µ, y un agonista δ y uno µ, sobre la estimulación de la unión de GTP-γ-[35S] en membranas de cerebro de ambas cepas de ratas. Los datos representan los valores medios ± error estándar de distintos experimentos por triplicado en 3 - 7 lotes de membranas distintos.

Por consiguiente, en el presente estudio no aparecen diferencias en la

activación receptorial por combinaciones de agonistas opioides en las membranas de

cerebro de ratas SDU y W, que expliquen los resultados de los experimentos in vivo.

De manera similar a lo expuesto en el apartado anterior, cabe la posibilidad de que

estas diferencias estén restringidas a zonas más concretas del sistema nervioso, o que

difiera la proporción de los distintos tipos de proteínas G activadas en lugar de su

cantidad, impidiendo en ambos casos su observación mediante esta aproximación.

Se ha descrito que la presencia de dímeros µ-δ en la médula espinal de ratón,

está correlacionada con la sinergia de ligandos µ y δ para estimular la fijación de

208


GTP-γ-[35S], y con la potenciación de la analgesia de morfina i.t. por la

coadministración i.t. del antagonista δ TIPPψ (Gomes y cols., 2004). En el presente

trabajo, en el desplazamiento de [3H]naltrindol con DAMGO y con U50488H en

membranas de cerebro de la cepa SDU se observaba un sitio de alta afinidad, que

podría corresponder a dímeros µ-δ y κ-δ. Sin embargo este sitio no se correlaciona

funcionalmente con la fijación de GTP-γ-[35S]. Ello puede deberse al distinto origen

de las membranas estudiadas, los distintos fármacos y vías empleadas o a que la

mayor potencia antinociceptiva de morfina en SDU no ocurre a nivel molecular. En

el presente estudio, a diferencia de Gomes y cols., (2004), la coadministración de un

antagonista δ vía sistémica revierte la mayor potencia antinociceptiva de morfina s.c.

en las ratas SDU, en lugar de potenciarla, lo que sugiere que la mayor potencia de

morfina sería debida a interacciones más complejas a nivel de sistemas.

Conjuntamente, los resultados obtenidos en este estudio, sugieren que en los

animales de la cepa SDU existe una mayor actividad endógena de los receptores δ,

originando una mayor AIE, una menor sensibilidad nociceptiva a la formalina y una

mayor potencia antinociceptiva de morfina. Así, en la cepa SDU, además de la

analgesia debida al efecto directo sobre el receptor µ, común con la cepa W, existe

también una cooperación de los receptores κ y δ, que potencia el efecto directo de µ.

Este “sistema complementario” estaría organizado en serie, de manera que el

bloqueo a nivel de κ antagonizaría el efecto de µ en este “sistema”, y el bloqueo de δ

antagonizaría en este “sistema” tanto el efecto de la activación µ como κ (figura 50).

Para conocer el origen concreto de esta modulación se precisaría seguir

profundizando tanto en procesos prerreceptoriales como transduccionales.

209


µ Morfina

Nor-BNI

κ U50488H

Naltrindol

δ SNC-80

ANALGESIA

Figura 50. Diagrama simplificado de las diferencias entre las cepas de ratas SDU y W, en la cooperación interreceptorial opioide involucrada en el efecto antinociceptivo de estos fármacos. Las flechas en color negro se darían en ambas cepas, mientras que las cepas en color azul se darían sólo en la cepa SDU. Las flechas rojas continuas representan activación, y las discontinuas inhibición.

210

5.- CONCLUSIONES

CONCLUSIONES

1.- En los test nociceptivos utilizados, tanto térmicos como químicos, a excepción de

en la fase de respuesta aguda a formalina, la morfina presenta una mayor potencia en

SDU que en W. Ello sugiere la existencia de diferencias en el mecanismo de acción o

en la modulación del efecto de morfina.

2.- La mayor potencia antinociceptiva de morfina en SDU se correlaciona con una

mayor sensibilidad, de esta cepa, a los efectos recompensantes del fármaco, pero no

con el desarrollo de tolerancia y dependencia física. Por consiguiente, ello apunta a

que los mecanismos subyacentes a las diferencias entre cepas afecten la nocicepción

y la recompensa, pero no la tolerancia y dependencia física.

3.- Otros agonistas selectivos µ y κ también originan un mayor efecto

antinociceptivo en esta cepa. La mayor potencia de morfina es revertida por

antagonistas κ y δ. Todo ello sugiere que en la mayor sensibilidad de las SDU al

efecto antinociceptivo participan los sistemas µ, κ y δ.

4.- Las ratas SDU son menos sensibles al efecto nociceptivo de formalina en ambas

fases de este test, estando implicados los receptores δ en la respuesta tónica de la

segunda fase.

5.- El estrés induce un mayor efecto antinociceptivo en las ratas SDU que en las W.

Estas diferencias encontradas entre ambas cepas de ratas en la AIE son de naturaleza

opioide, participando en ellas el sistema δ.

6.- El comportamiento detectado en la cepa SDU no se debe a modificaciones en el

número de receptores µ, κ o δ, ni en la afinidad de diferentes radioligandos por los

mismos en membranas de cerebro.

7.- En membranas de cerebro de ratas SDU, pero no en W, los agonistas κ y µ se

unen a un sitio de alta afinidad al desplazar el radioligando selectivo δ. Esto sugiere

que interacciones µ-δ y κ-δ pueden estar participando en las respuestas observadas

in vivo.

200

CONCLUSIONES

8.- La activación de las proteínas G por distintos agonistas opioides o combinaciones

de estos en cerebro entero no parecen estar participando en las diferencias en las

respuestas observadas in vivo entre ambas cepas de ratas.

9.- Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral demuestran en su conjunto que la

variabilidad en las respuestas a opioides puede deberse a diferencias en la

cooperación interreceptorial opioide.

201

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