Purificación de DNADra. Esther Z Vega

Universidad de Puerto Rico Humacao

ResumenDNA total

DNA de plasmidio

DNA de fagos

Aislamiento de DNA de bacteria

Las bacterias se cultivan en medio favorable a temperatura óptima

Se lisan las células y se libera el contenido

Tratamiento del extracto celular para remover todos los componentes excepto el DNA

Se concentra la solución de DNA

DNA Purification > Total Cell

Crecimiento de la bacteria

Crecimiento de medio líquido Medio definido Medio complejo

Crecimiento en medio sólido

Growth can be monitored by optical density

Monitoreo del crecimiento

Growth can be monitored by optical density

Monitoreo del crecimiento

Separación de célulasColecta de células

Centrifugación

Monitoreo del crecimiento

Preparación del extracto celular Las células deben lisarse para liberar el DNA

Métodos Físicos Fuerza mecánica es aplicada para romper la

pared y la membrana Mortero, sonicación

Métodos Químicos Ataque químico a la pared y membrana celular Pared- lisozima, EDTA o ambos Membrana- detergente (SDS)

Lisis celular

Rompimiento de la pared

La lisozima digiere los polisacáridos, componentes estructurales de la pared

EDTA (tetraacetato de etilenediamina) enlaza iones de magnesio esenciales en preservar la estructura de la célula e inhibe las enzimas que pueden degradar el DNA

Rompimiento de la membrana

SDS es un detergente que remueve las moléculas de lípidos

DNA Purification > Total Cell > Breaking Cell

Centrifuge removes insoluble cell debris

DNA Purification > Total Cell

Purificación del DNAAdemás del DNA, todavía se encuentran una

gran cantidad de proteínas y de RNA

La remoción de éstas es importante para evitar interferencia en el análisis

Remoción de proteínas y RNA

Extracción orgánica Adición de fenol ó fenol/cloroformo Se precipitan las proteínas; formación de una

capa blanca en la interfase entre la capa orgánica y la acuosa

Se remueve la solución acuosa

Organic Extraction

DNA Purification > Total Cell > Purification

Extracción orgánica¿Qué tal si hay un exceso de proteínas?

Se repiten las extracciones con fenolNo favorable; destrucción del DNA con el

movimiento Rompimiento con proteasa antes de la extracción

Pronasa o proteinasa K

Extracción orgánicaParte del mRNA es removido con el tratamiento

a fenol.

El remanente del RNA puede ser digerido con ribonucleasas (si es necesario).

Concentration of DNA

DNA Purification > Total Cell

Extracción por SilicaGuanidium thiocyanate

Desnaturaliza el material que no es DNA Hace que el DNA se enlace a las partículas de

silica

Se añade silica directamente o la muestra se pasa por una columna de silica

Remoción de DNA al añadir agua

Purificación de DNA con partículas de silica

DNA Purification > Total Cell > Purification

Extracción de DNA de otros tipos de células

Células vegetales: alto contenido de carbohidratos Lisozima no tienen efecto Se añade CTAB (cetylmethylammonium); se une

a los ácidos nucléicos y los precipita Se centrifuga y se remueve el sobrenadante

Células animales: no tienen pared, lisan con SDS

Purification of Plant DNA

DNA Purification > Total Cell

DNA de plasmidioSe crece la bacteria y se colecta

Se rompen las células y se libera el contenido

Se trata el extracto celular para remover todos los componentes excepto el DNA de plasmidio

Se concentra la solución de DNA

DNA de plasmidioSeparación basada en diferencias entre el

plasmidio y el DNA bacterial tamaño- plasmidios son mucho más pequeños

Separación por tamañoEn orden de maximar las diferencias,

rompimiento mínimo del DNA bacterial

Cuando el rompimiento es mínimo, el DNA formará parte del debris celular

Rompimiento mínimo se logra utilizando técnicas de rompimiento suave

Rompimiento suave de la célula

Tratamiento con lisozima y EDTA en presencia de sucrosa evita el rompimiento inmediato

Al formar esferoplastos, la célula puede lizarse con la adición de detergentes no-íonicos

DNA Purification > Plasmid DNA

Separación basado en conformación

Separación por el ¨superenrollamiento¨de pequeños plasmidios circulares

Separación basada en conformación

Rango de pH más estrecho cuando el DNA ¨superenrrollado¨es desnaturalizado y el DNA regular no.

Se usa un lisado claro Al añadir base; DNA regular es desnaturalizado Al añadir ácido; DNA regular es una masa

¨enredada¨ El DNA ¨enredado¨es ¨pellet¨

DNA Purification > Plasmid DNA

Separación basado en conformación

DNA ¨superenrrollado¨ también puede ser separado del DNA regular utilizando bromuro de etidio en asociación con un gradiente de densidad con cloruro de cesio (CsCl)

Separación basado en conformación

Bromuro de etidio se enlaza a DNA normal, pero sólo en cantidad limitada a DNA ¨superenrrollado¨

Este enlazamiento causa un movimiento en la banda de DNA ¨normal¨

DNA Purification > Plasmid DNA

DNA Purification > Plasmid DNA

DNA de fagosEl DNA de fagos puede estar fuera de la célula;

no hay que comenzar con un extracto celular

Al centrifugar el cultivo, la bacteria estará en el pellet y el fago en suspensión

La dificultad es obtener una concentración grande de fagos por ml de cultivo

Para obtener títulos altosEl fago debe estar en fase lítica

Los fagos deben infectar la baceria al m omento justo en el ciclo de crecimiento

Purificación de DNA fagos

Los fagos pueden ser precipitados con glicol de polietileno (PEG)

Centrifugar. Descartar el sobrenadante. Redisolver.

Purificar por gradiente de densidad de CsCl.

www.dpo.uab.edu/~jglinvil/JS572web S572,FL06,MPurifyDNA.pdf