Las Caspasas: Un enemigo en nosotros

La existencia de la maquinaria apoptótica fue predicha a partir de la observación de la estereotípica morfología de las células a punto de morir, bajo condiciones fisiológicas, como resultantes de injurias leves. Estos cambios reflejan complejos eventos bioquímicos llevados a cabo por una familia de proteasas denominadas caspasas. En función de que es poco conocido el mecanismo de regulación de las caspasas, resulta importante primero revisar la proteólisis, que a diferencia de la mayoría de las modificaciones postranslacionales, es irreversible. Esto implica que la única forma de controlar una proteasa es limitando su actividad ya que una vez que se ha producido el clivaje de una proteína, la única corrección posible es sintetizarla nuevamente. Considerando esta característica general de la proteólisis, no debe sorprendernos encontrar estas enzimas en procesos tan irreversibles como el desarrollo, el ciclo celular y el más irreversible de todos: la muerte celular.

La mayoría de las proteasas son sintetizadas como precursores de muy baja actividad catalítica. En general, el precursor es convertido a la forma activa por procesamiento proteolítico, lo que se produce por otra proteasa o por autocatálisis, disparada por la unión a un cofactor o por la remoción de un inhibidor. El precursor puede acumularse en grandes cantidades y activarse en función de la demanda.

Las proteasas pueden regular su propia activación. Esto puede realizarse a través de retroalimentación positiva o negativa, generando un lazo de amplificación en el que la proteasa activa puede directa o indirectamente activar al precursor, resultando en una tasa de activación exponencial y asegurando que la proteasa cumpla su objetivo rápidamente.

Donde existe una proteasa existe un inhibidor. El inhibidor puede establecer un umbral que regula la concentración de la proteasa activa en la célula. Este umbral previene de las consecuencias de la activación espontánea, un evento no deseado si la enzima activa puede matar la célula.

Las reacciones proteolíticas pueden ser específicas. La especificidad de las proteasas es a menudo determinada por una combinación de las estructuras primaria, secundaria o terciaria de las proteínas que actúan como substrato. La proteólisis que gobierna procesos biológicos críticos (por ejemplo el ciclo celular o la muerte celular) es altamente específica e involucra un restringido conjunto de substratos.

¿Que son las caspasas?

Las caspasas fueron implicadas en la apoptosis a partir del descubrimiento que el producto génico CED-3, requerido para la muerte celular en el nemato de Caenorhabditis elegans, está relacionado con la enzima convertidora de interleucina-1b de mamíferos (ICE-1 o caspasa-1). la caspasa-1 , fue el primer miembro identificado de una gran familia de proteasas cuyos miembros tienen distintos roles en los procesos de inflamación y apoptosis (Fig. 1A). En apoptosis las caspasas funcionan tanto en el desensamble (efectores) como iniciando los procesos que conducen al desensamble celular (iniciadoras).

Las caspasas comparten similitudes en la secuencia de aminoácidos, estructura y especificidad por el substrato. Todas ellas son expresadas como proenzimas que contienen tres dominios: un dominio terminal-NH2, una subunidad grande y una pequeña. La activación involucra el procesamiento proteolítico entre los dominios, seguido por la asociación de las subunidades grande y pequeña para

formar un heterodímero. La estructura cristalina de dos de las caspasas activas (caspasas-1 y -3) muestra que, en ambos casos, dos heterodímeros se asocian para formar un tetrámero, con dos sitios catalíticos que parecen funcionar independientemente. Dentro de cada dominio catalítico las unidades grande y pequeña están íntimamente asociadas, contribuyendo ambas con los residuos necesarios para la unión al substrato y la catálisis.

Dos características de la estructura de las proenzimas, son centrales para el mecanismo de activación de estas proteasas. Primero, el dominio amino-terminal, que es altamente variable en secuencia y longitud, está involucrado en la regulación de la activación de estas enzimas. Segundo, todos los dominios derivan de la proenzima por clivaje en el sitio de consenso de las caspasas, implicando que estas enzimas pueden ser activadas tanto autocatalíticamente como por una cascada de enzimas con especificidad similar.

Las caspasas están entre las proteasas más específicas, con un inusual y absoluto requerimiento para el clivaje en la posición posterior al ác. aspártico. El reconocimiento de al menos cuatro aác. amino-terminales en el sitio de clivaje es también un requerimiento para una catálisis eficiente. El tetrapéptido de reconocimiento preferencial difiere significativamente entre las caspasas, explicando la diversidad de sus funciones biológicas.

Su especificidad es aún más estricta: no todas las proteínas que contienen la secuencia óptima de tetrapéptidos son clivados, implicando que la estructura terciaria puede influenciar el reconocimiento del substrato. El clivaje de proteínas por caspasas es no solo específico sino altamente eficiente (kact / Km > 106 M-1 s-1). La estricta especificidad de las caspasas es consistente con la observación que la apoptosis no va acompañada de una indiscriminada digestión proteica, sino que un selecto conjunto de proteínas es clivado de forma coordinada, usualmente en un solo sitio, resultando en su pérdida o cambio de función.

Cómo las caspasas matan a una célula

Los eventos apoptóticos incluyen fragmentación del DNA, condensación de cromatina, vesiculacion de la membrana, encogimiento celular, y desensamble de las células en vesículas rodeadas de membrana (cuerpos apoptóticos). In vivo, este proceso culmina con el encierre de estos cuerpos por las células vecinas, previniendo las complicaciones que podrían resultar de la liberación del contenido intracelular.

Estos cambios ocurren en una secuencia predecible y reproducible, que puede completarse entre los 30 y 60 minutos.

El cómo las caspasas contribuyen a este proceso no está completamente comprendido, principalmente debido a que la mayoría de los substratos conocidos han sido hallazgos fortuitos. Como resultado de los 40 o algo así de los que han sido identificados, la relación de su clivaje con la muerte celular es bien conocida solo para un poco. Sin embargo esos pocos ejemplos sugieren que un subconjunto de caspasas (efectoras) es responsable de los cambios celulares que ocurren durante la apoptosis y proveen una idea del mecanismo empleado

Uno de los roles de las caspasas es inactivar proteínas que protegen células vivas de la apoptosis. Un ejemplo claro es el clivaje de ICAD/ DFF45, un inhibidor de la nucleasa responsable de la fragmentación del DNA, CAD (caspase-activated deoxyribonuclease). En células no-apoptóticas, las CAD están presentes como un complejo inactivo: ICAD. Durante la apoptosis, el complejo ICAD es inactivado por caspasas liberando CAD que funciona como una nucleasa. Sin embargo, este sistema no es tan

simple como aparenta: las CAD sintetizadas en ausencia de ICADno son activas, implicando que el complejo CAD- ICADse forma co-translacionalmente, y que ICAD es requerido tanto para la activación como para la inhibición de esta nucleasa.

Otros reguladores negativos de apoptosis son las proteínas Bcl-2. Aparentemente cuando son clivadas, no solo se eliminan sus propiedades antiapoptóticas, sino que algunos de los fragmentos resultantes promueven apoptosis. Que tales feedbacks positivos estén involucrados en el control de apoptosis no debe sorprender, dada su importancia en la regulación de otros sistemas proteolíticos.

Las caspasas contribuyen a la apoptosis a través del desensamble de la estructura celular, como lo ilustra la destrucción de la lámina nuclear, una estructura rígida que tapiza internamente la membrana nuclear y está implicada en la organización de la cromatina. La lámina está formada por polímeros de proteínas filamentosas intermedias. Durante la apoptosis estas son clivadas en un sitio único por las caspasas causando el colapso de la lamina y contribuyendo a la condensación de la cromatina. Las caspasas indirectamente también reorganizan estructuras por el clivaje de proteínas involucradas en la regulación del citoesqueleto, incluyendo la gelsolina, la quinasa de adhesión focal y la quinasa 2 activada por p21. El clivaje de estas proteínas resulta en la desregulación de su actividad. Por ejemplo en el caso de la gelsolina (una proteína que rompe los filamentos de actina en una vía regulada, uniéndose a su extremo + y previniendo el intercambio de los filamentos) su clivaje por una caspasa genera fragmentos constitutivamente activos.

La disociación de dominios regulatorios y efectores es un carácter distintivo de la función de las caspasas. Por ejemplo las caspasas desactivan o desrregulan las proteínas involucradas en la reparación de DNA (tales como la DNA-PKCs), del empalme del mRNA (tal como U1-70K) y de la replicación del DNA (como el Factor de Replicación C). Aunque la relación de estos clivajes con la muerte celular no han sido completamente clarificados, resulta muy probable que el desensamblaje de funciones reparativas y homeostáticas críticas facilitan el desensamblaje celular.

Las caspasas participan en apoptosis en una forma planeada y ejecutada . Las caspasas cortan el contacto con las células vecinas reorganizan el citoesqueleto, y apagan la replicación y reparación del DNA, interrumpen el empalme, destruyen el DNA, rompen la estructura nuclear, inducen a la célula exhibir señales que las marcan para ser fagocitadas y desintegran las células en cuerpos apoptóticos. Conforme se desarrollen mejores técnicas para encontrar nuevos substratos para las caspasas, mejor se comprenderán los mecanismos usados para que estos cambios se produzcan.

La consideración de estrategias terapéuticas potenciales para inducir selectivamente apoptosis en las células (por ejemplo cancerosas) origina varias preguntas acerca de los substratos, por ejemplo, ¿Cuál es el mínimo conjunto de substratos que pueden ser clivados para eliminar inocuamente una célula? Claramente el clivaje de ICADparece resultar en la muerte celular, pero es poco probable que promueva la fagocitosis de las células. Desde otro punto de vista, quizás disparar la "engullida" de una célula, podría ser suficiente para "sepultarla" viva.

El descubrimiento que muchas proteínas claves poseen sitios de clivaje para caspasas desafía la comprensión de la vida y su evolución. En efecto, ¿Qué pudo ocurrir, para que las células evolucionasen de tal manera que puedan ser tan rápidamente desensambladas? ¿Por qué en los componentes celulares coexisten dos funciones opuestas: el soporte de la vida y también los mecanismos que conducen a su muerte?

¿Cómo son reguladas las caspasas?

La observación que los precursores de las caspasas son constitutivamente expresados (aún en neuronas) pero que las células vivas pueden ser inducidas a sufrir apoptosis rápidamente, indica que la regulación de las caspasas es "sofisticada" y efectiva. Los complejos sistemas proteolíticos, que a menudo involucran una combinación de proteasas regulatorias, cofactores, retroalimentaciones y umbrales, que convergen para controlar la actividad de una proteasa efectora, que lleva adelante la función de todo el proceso. Esta intrincada regulación da cuenta de una característica espectacular de estos sistemas: mantienen la proteasa efectora inactiva pero, en respuesta de cantidades mínimas de un inductor apropiado, son capaces de activar grandes cantidades de ésta rápidamente.

Dada la función de las caspasas como mediadores de muerte celular, la complejidad de su regulación podría rivalizar con la de los sistemas de complemento y de coagulación.

Activación de caspasas efectoras: Numerosas evidencias genéticas y bioquímicas soportan que el modelo de activación de caspasas efectoras: una señal proapoptótica culmina en la activación de un iniciador de caspasas que activa las caspasas efectoras, resultando en el desensamble celular. Diferentes iniciadores de caspasas actúan mediando distintos conjuntos de señales. Por ejemplo la caspasa-8 está asociada con apoptosis por receptores de muerte celular. En contraste la caspasa-9 esta involucrada en la muerte celular inducida por agentes citotóxicos. Este modelo explica porqué distintas señales apoptóticas inducen los mismos cambios bioquímicos y morfológicos.

Activación de caspasas iniciador: Las evidencias disponibles indican que la activación de caspasas iniciadoras requiere la unión de cofactores específicos, un mecanismo que es comúnmente observado en proteasas. Esta unión es disparada por la unión de una señal proapoptótica y mediada a través de, por lo menos, uno de los dos diferentes motivos estructurales que residen tanto en el prodominio de la caspasa como en el del co-factor correspondiente. Por ejemplo la activación de la procaspasa-8 requiere de la asociación con su co-factor FADD (Fas-associated protein with death domain) con el DED (death effector domain), mientras que la procaspasa-9 involucra un complejo con el cofactor Apaf-1 a través del CARD (caspase recruitment domain) La activación de la caspasa-9 también requiere citocromo c y desoxiadenosina trifosfato, indicando que la activación de caspasas puede requerir de múltiples cofactores.

¿Cómo la unión de cofactores puede llevar a la activación?

Ya que no existe una estructura cristalina de un precursor de caspasas, los modelos propuestos se basan en evidencias indirectas. El modelo de inducción por proximidad o de oligomerización, está basado en tres observaciones: las procaspasas tienen actividad baja, pero detectable, requieren de dimerización para su activación y las procaspasas sobreexpresadas en las células y entrecruzadas artificialmente se tornan activas. El modelo argumenta que las caspasas están en estado de latencia en las células debido a que se encuentran en estado monomérico a bajas concentraciones. Los cofactores actúan llevando a dos o más precursores de caspasas a un estado de estrecha proximidad, permitiéndole realizar una activación autoproteolítica intermolecular. Sin embargo existen unas cuantas cuestiones que este elegante modelo debería clarificar. Por ejemplo no está probado que el iniciador de precursores de caspasas sea realmente monomérico en las células vivas.

Muy poco es lo que se conoce de la regulación de la interacción entre procaspasas y sus cofactores. Un ejemplo fue provisto por el descubrimiento del FADD-like ICE innhibitory proteins (FLIPs). Estas proteínas son similares en secuencia a la procaspasa-8 excepto por que carecen del residuo catalítico esencial. Estas proteínas probablemente compiten con la procaspasa-8 para unir su cofactor FADD,

previniendo así la activación de la caspasa. Parece ser que la caspasa-8 no es la única que posee un señuelo, como ha sido sugerido por los descubrimientos del CARD , ARC (apoptosis repressor with caspase recruitment domain) Los factores que determinan cómo los cofactores eligen entre las procaspasas y sus señuelos aún no han sido dilucidados.

La compartimentalización de las caspasas y sus cofactores podría ser otra manera de regular la activación de las caspasas. Esta noción está soportada por el descubrimiento que los extractos de algunas células vivas pueden activar caspasas espontáneamente, sugiriendo que todos los componentes para la activación de las caspasas están presentes pero secuestrados en las células vivas. Esta observación llevó al descubrimiento que el citocromo c es requerido para la activación de caspasa-9 in vitro y la subsecuente hipótesis que la apoptosis puede ser disparada por inducción de cambios mitocondriales que resultan en la liberación de este cofactor. Otro ejemplo es provisto por el descubrimiento que la caspasa-8 es activada cuando es reclutada por el complejo receptor FAS. La determinación de la ubicación subcelular de las caspasas y sus cofactores es un área de intensa investigación en la actualidad, ya que permitiría contribuir a una mejor comprensión de la regulación de las caspasas.

¿Pueden las Caspasas ser el blanco de tratamientos de enfermedades?

Hay dos tipos opuestos de enfermedades que involucran una desrregulación de la apoptosis. Están aquellas en las que la apoptosis es excesiva, causando daño a los tejidos normales y aquellas en las que la apoptosis es prevenida permitiendo el crecimiento de los tejidos malignos. En concordancia con esto, las dos estrategias a seguir serán: inhibición de las caspasas o inducción de la apoptosis vía activación de las caspasas, respectivamente.

Inhibición de las caspasas. La apoptosis excesiva ha sido responsabilizada en varias patologías serias para las que usualmente existen limitadas opciones terapéuticas. Por ejemplo podemos incluir en este grupo a las enfermedades neurodegenerativas, la injuria por reperfusión isquémica, enfermedades de respuesta a injertos, y enfermedades autoinmunitarias. Las caspasas constituyen atractivos blancos potenciales de estas condiciones dado el indispensable rol de estas moléculas en la apoptosis y las perspectivas de las terapias basadas en inhibidores de pequeñas moléculas. Adicionalmente existen un cúmulo de evidencias que estas metodologías pueden resultar exitosas en el tratamiento de estas patologías. Por ejemplo el tratamiento con p35 previene la disminución de los mutantes de Drosophila con degeneración retiniana, indicando que la inhibición de caspasas puede funcionalmente rescatar células de la muerte. En adición, los inhibidores peptidil-caspasas son efectivos en modelos animales de stroke, injuria por isquémia - reperfusión miocárdica, patologías hepáticas e injurias cerebrales traumáticas.

Muchas cuestiones significativas aún deben ser determinadas, particularmente en relación con el tratamiento de desórdenes crónicos. ¿Cuáles son los mejores blancos de las caspasas para la inhibición de la apoptosis? Para responder esta pregunta se requiere un mejor conocimiento de del rol

de caspasas individuales en diferentes tejidos. ¿Pueden las enfermedades crónicas ser tratadas con seguridad sin riesgo de desarrollar enfermedades autoinmunes o progresiones tumorales? Para este tipo de patologías puede requerirse la liberación de inhibidores selectivos. Es probable que al menos inicialmente, resulte más realista considerar el tratamiento de desórdenes agudos.

Desde una perspectiva pragmática, ¿Podrá ser identificado un inhibidor de caspasas con propiedades

apropiadas para su uso in vivo?. A la fecha, se han usado dos clases mayores de drogas inhibidoras de proteasas: los inhibidores de la enzima conversora de angiotensina (ACE) y los inhibidores de las proteasas del virus de inmunodeficiencia adquirida. Existen actualmente otros pocos ejemplos, pero no

muy extendidos en la práctica clínica. Esto refleja en parte, las dificultades prácticas de generar pequeñas moléculas, inhibidores no-peptídicos de las enzimas proteolíticas, que sean selectivos, estables y con capacidad de penetrar la membrana efectivamente.

Existen elegantes trabajos experimentales sobre inhibición de cisteína - proteasas que han significado un punto de partida, en la identificación de varias clases de potentes inhibidores de caspasas reversibles e irreversibles. Estudios con estos componentes proveerán sin dudas respuestas a muchas de las cuestiones relacionadas con el potencial terapéutico de la inhibición de las caspasas.

Tratamiento del Cáncer. Dos problemas principales de las quimioterapias convencionales son: la toxicidad para las células normales y las fallas en la capacidad de matar las células cancerígenas. Ambos problemas se originan del mecanismo indirecto por el cual, tanto las drogas quimioterapéuticas como la irradiación, matan a las células. El daño se produce tanto sobre las células normales como sobre las cancerosas y este daño es trasladado a través de múltiples pasos hacia la muerte celular, de forma similar a lo que ocurre con la activación de las caspasas que conduce a la apoptosis. Cuando estos pasos son comprometidos la terapia falla.

Una estrategia alternativa es diseñar un tratamiento que active las caspasas directamente. Una posibilidad involucra la activación de complejos de receptores que estén directamente unidos a caspasas iniciadoras.) Debido que los receptores de muerte son también expresados en células normales, el principal desafío de esta estrategia es activar estos receptores selectivamente en las células cancerosas.

Otro método puede provenir de la observación que las oncoproteínas que desrregulan el ciclo celular pueden activar caspasas e inducir apoptosis. Asimismo, la transformación oncogénica puede ser pensada como una señal proapoptótica, que está presente solo en células transformadas. Cuando esta señal esta desacoplada de la activación de la caspasa, la célula sobrevive. La comprensión de cómo esta señal puede ser re- acoplada a la activación de la caspasa puede proveer una oportunidad para selectivamente destruir a las células transformadas.Si éste u otros métodos pueden resultar beneficiosos, no está aún claro. Es de esperar que en el futuro las células tumorales puedan analizarse por sus defectos en la activación de caspasas, como se hace actualmente con las proteasas de la coagulación, y los tratamientos puedan basarse en esta información más que en una compilación de reglas empíricas como es la base de la quimioterapia clásica.

En suma, se ha producido un progreso substancial en relación con la comprensión de las propiedades catalíticas y estructurales de las caspasas activas, y su contribución a la apoptosis. El objetivo de

futuras investigaciones será comprender la regulación de estas enzimas. Esto debería facilitar los esfuerzos por manipular la maquinaria apoptótica con fines terapéuticos.

Jorge Juica Navea

Tania Ledezma Maluenda

Sebastián López Acosta

Nicolás Olivares Mondaca