Rojas Julio Otoniel Universidad de Los Andes-Facultad de ...
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Rojas Julio Otoniel Solubilización en agua de crudo pesado tipo cerro negro por cepas bacterianas aisladas de ambientes contaminados con petróleo Universidad de Los Andes-Facultad de Ciencias-Postgrado en Biología Molecular. 1992. p. 107 Venezuela Disponible en: http://bdigital.ula.ve/RediCiencia/busquedas/DocumentoRedi.jsp?file=33812&type=ArchivoDocumento &view=pdf&docu=27007&col=5 ¿Cómo citar?
Transcript of Rojas Julio Otoniel Universidad de Los Andes-Facultad de ...
Rojas Julio Otoniel
Solubilización en agua de crudo pesado tipo cerro negro por cepas bacterianas aisladas de
ambientes contaminados con petróleo
Universidad de Los Andes-Facultad de Ciencias-Postgrado en Biología Molecular. 1992. p. 107
Venezuela
Disponible en:
http://bdigital.ula.ve/RediCiencia/busquedas/DocumentoRedi.jsp?file=33812&type=ArchivoDocumento
&view=pdf&docu=27007&col=5
¿Cómo citar?
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS
LABORATORIO DE FERMENTACIONES POSTGRADO EN BIOLOGIA MOLECULAR
OPCION FERMENTACIONES.
SOLUBILIZACION EN AGUA DE CRUDO
PESADO TIPO CERRO NEGRO POR CEPAS BACTERIANAS
DE CON
PETI:;:Cli....EO.
PF~I:::si::::N·rADD f..) NTE L.. A
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES POR EL LICENCIADO
JULIO OTONIEL ROJAS COMO REQUISITO PARA OPTAR
AL TITULO DE HAGISTER SCIEHTIE EN LA OPCION
FE::p¡v¡¡:;::NT{iC I ONE!::; DI:::L POSTGF~ADO DE BIOI .... DGIA
IVIOI....ECUI .... AR •
El presente trabajo fue realizado en el Laboratorio de Fermentaciones bajo la tutcria
del Profesor JOSE ANTONIO SANCHEZ CRISPIN.
~_;_-:pr:y,-¡¡<.oC1a,r,
MERIDA~ MAYD DE 1992. ¡9~l
El Presente trabajo fue realizado en el Laboratorio de Fermentaciones. Departamento de Biologia. Facultad de Ciencias de La Universidad de Los Andes y fue subvencionado con fondos del subsidio otorgado por el CDCHT de la ULA.
El mundo es mi patria y la c1enc1a mi religión
Christiaan Huygens.
Que vastitud la de esos orbes y que poco
considerable es conparada con ellos la tierra~
el teatro sobre el cual se juegan todos
nuestros designios~ todas nuestras navegaciones
y todas nuestras guerras. Una consideración muy
pertinente y materia de reflexión para los
reyes y prfncipes que sacrifican las vidas de
tantas personas solo para halagar su ambición y
convertirse en due~os de alg0n lamentable
rincón de este peque~o Jugar.
Chistiaan Huygens.
AGRADECIMIENTO.
Al Dr. SANCHEZ CRISPIN por brindarme la
oportunidad de mejorar y aumentar mi 1' o nna e: i 6n
profesional y por su orientación y ayuda, tanto
pei'""SC:lrl e:\ 1 como profesional, en
del presente trabajo.
Lbpez ..
A todos mis campaNeros y amigos del
Laboratorio de Fermentaciones.
INDICE
CAPITULO I. INTRODUCCION
1.- Biosurfactantes. 2.- Quimica del petróleo. 3.- Biodegradación del petróleo.
CAPITULO II. OBJETIVOS.
CAPITULO III. METODOLOGIA.
1.- Cultivos de enriquecimiento.
2.- Selección de los cultivos con capacidad para crecer y emulsionar el petróleo en medios salinos.
3.- Determinación de la viscosidad aparente en los crudos emulsionados por la acción microbiana.
4.- Determinación del biodegradación.
porcentaje de
5.- Estudio de la fracción de maitenes y asfaltenos en petróleo sometido a tratamiento microbiológico.
6.- Aislamiento de las cepas microbianas, a partir de los cultivos mixtos, con capacidad para emulsionar y crecer en petróleo.
7.- Estudio de las condiciones de cultivo.
8.- Detección del sistema nitrato reductasa en las cepas seleccionadas.
9.- Estudio surfactante seleccionadas.
de la en
producción de las cepas
10.- Caracterización e identificación de las cepas aisladas.
1
8 17 30
41
43
43
45
4·7
49
50
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53
55
57
CAPITULO IV. RESULTADOS Y DISCUSION.
1.- Cultivos de en~iquecimiento.
2.- Seleccibn de los mic~oo~ganismos
con capacidad pa~a c~ece~ y produci~
biosu~factantes que emulsionan el c~udo
en medios salinos.
3.- Estudio de la viscosidad aparente en los c~udos emulsionados por acción microbiana.
4.- Determinación del biodegradaci6n.
po~centaje de
5.- Estudio de la f~acci6n de maitenes y asfaltenos en petróleo sometido a t~atamiento microbiológico.
6.- Aislamiento de las cepas microbianas, a partir de los cultivos mixtos~ con capacidad pa~a emulsiona~ y crece~ en pet~óleo.
7.- Estudio de las condiciones de cultivo.
8.- Estudio de la producción de surfactante en las cepas seleccionadas.
9.- Caracterización e identificación de las cepas aisladas.
CAPITULO V. CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFIA.
60
60
65
65
67
70
70
76
78
90
91
CAP#TULO #
#NTRODUCC#ON
INTRODUCCION
El petr6leo sigue siendo en la actualidad la principal fuen-
te de energia para la human1dad. Es de vital importancia para las
naciones técnicamente más avanzadas que necesitan y consumen la
mayor parte de la energia y para las estructuras económicas y
monoproductoras de algunos paises en via de desarrollo.
El petróleo además de ser una fuente de energ!a constituye
la materia prima para la industria petroquimica que elabora
sustancias tales como abonos artificiales, fibras sintéticas~
plhsticos y otros productos.
Los yacimientos de petr6leo son explotados mediante la
perforación de pozos para que el crudo mane desde los confines de
los yacimientos hasta la superficie de la tierra. Durante las
primeras etapas de producción el petróleo es extraido mediante la
pres16n natural del gas en el yacimiento. De la magnitud de la
presibn depende si el petróleo fluye naturalmente o, si por el
contrario, la presión es solo suficiente para que el petróleo
llegue hasta cierto nivel.
Cuando se da el primer caso se habla de una recuperación
primaria y en el segundo caso se recurre a la extracc16n por
medios mecánicos y se habla de una recuperación secundaria. La
recuperación secundaria se hace necesaria porque a medida que el
pozo produce hay un decaimiento de presión natural del
yacimiento. Para forzar el crudo hacia los pozos de producci6n y
hasta la superficie generalmente se hacen perforaciones
adicionales de pozos por los que·se inyecta agua o vapor para
incrementar la presión (Lagoven, 1985; Petrcleum, 1987; Shah,
1981).
Los procesos mencionados anteriormente continuan durante la
vida de un pozo hasta llegar a un limite económico de
productividad. En esta etapa las técnicas de recuperación
secundaria se hacen inefectivas e insuficientes para recuperar el
remanente de petróleo que queda en los reservorios del
yacimiento.
Debido a la demanda energética mundial y al hecho de que el
petróleo exista en cantidades limitadas y también a que casi el
65 70 % del petróleo original queda atrapado en los
reservorios, después de la aplicación de métodos convencionales
de recuperación, se hace necesario estudiar nuevas técnicas que
permitan recuperar esta significativa cantidad de petróleo
remanente (Schwartz, R. D. y Leathen, W. W. 1976; Shah, 1981).
Las técnicas o procesos creados para tal fin han sido
llamados proceses de recuperación terciaria o recuperación
mejorada de crudos. Tales métodos pueden ser divididos en dos
grandes grupos: Procesos térmicos y procesos de flujos quimicos.
La combustión en sitio, inyección de vapor, combustión húmeda
etc, pertenecen al primer grupo mientras que el flujo caustico,
flujo con surfactantes, flujo micelar etc, pertenecen a la
segunda categoria de procesos (Shah, 1981; Petroleum, 1987).
La principal desventaja de estos procesos es que por ser
altamente tecnificados resultan muy costosos. Por estar aún en
estudio no se ha logrado obtener una gran eficiencia y aparte de
presentar problemas operacionales, generalmente originan también
problemas secundarios en los sistemas de recuperacibn mejorada
(Petroleum, 1987).
Se ha sugerido la utilización de microorganismos viables que
podrian ayudar en los procesos de recuperación mejorada del petró
leo. Esta idea est~ basada en el hecho de que los hidrocarburos
que permanecen después de las extracciones primarias y
secundarias suelen ser asfaltenos y otras fracciones condensadas
de petróleo y también por haberse encontrado microorganismos
capaces de metabolizar hidrocarburos y producir metabolitos
útiles a la industria petrolera (Schwartz, R. D. y Leathen, W. W.
1976; Shennan, J. y Vanee, I. 1987).
Las estrategias planteadas para utilizar microorganismos en
la recuperación mejorada son (Schwartz, R. D. y Leathen, W. W.
1976; Shennan, J. y Vanee, I. 1987):
a) Microorganismos productores de gas. Una producción de gas
en sitio aumentarla la presión de los yacimientos facilitando la
emanación del petróleo.
b) Microorganismos productores de alcoholes. Los alcoholes
influyen fuertemente en la cinética de las micelas durante una
recuperación de flujo micelar.
4
e) Microorganismos productores de ~cido. Serian capaces de
disolver, en algunos yacimientos, las rocas calizas y facilitar
el desplazamiento del petróleo.
d) Microorganismos productores de surfactantes. Estos
metabolitos sen capaces de disminuir la tensión interfacial del
crudo, disminuyendo asi su viscosidad.
e) Microorganismos capaces de metabclizar parte del crudo
permitiendo su desplazamiento desde los poros de las rocas. El
metabolismo de las partes asfalténicas y resinosas producirla
crudos mas livianos que podrlan fluir con m~s facilidad.
f) Taponamiento intencional con biomasa o metabolitos en las
zonas de alta permeabilidad de algunos reservorios.
Debido que los yacimientos presentan ciertas
caracteristicas especiales, los microorganismos que van a ser
utilizados en estos procesos deben reunir unas caracteristicas
adecuadas y poseer una maquinaria metabólica capaz de producir
crudos livianos a partir de crudos pesados o extrapesados
mediante su degradación.
Estos microorganismos deben ser aerobios o anaerobios
facultativos, ser capaces de soportar altas presiones y
concentraciones de sal (halófilos) y temperaturas moderadamente
altas (term6filos). También deben poder crecer en medios
econOmices y de f~cil mantenimiento y transporte, mostrar
estabilidad genética y ser inocuos a la salud de humanos,
animales y plantas (Shennan, J. L. y Vanee, I. 1987).
Estos microorganismos podr!an ser aislados del medio
ambiente en general, por ejemplo del agua, suelo, aire o del mar
etc. Podrian buscarse en zonas contaminadas con hidrocarburos en
los pozos petroleros o entre los ya clasificados en los cultivos
de colección.
Venezuela es un pais monoproductor cuya economia está
sustentada por la exportación petrolera. Por tanto, resulta de
vital importancia abocarse al estudio de procesos y técnicas que
puedan desarrollarse con el fin de mejorar y aumentar la
producción. En Venezuela los métodos de recuperación adicional
tienen muchas perspectivas para su aplicación puesto que las
reservas probadas son de 295.000 millones de barriles de
petróleo de los cuales solo ha producido 40.000 millone,
estimándose en 225.000 millones los no recuperables. Porción esta
que debe ser el objetivo para una recuperación mejorada.
(Petroleum, 1987).
Venezuela posee, adem~s, un gran yacimiento de petróleo
pesado y extrapesado, llamado Faja Bituminosa del Orinoco y para
poder ser explotado se hace necesaria la aplicación de métodos de
recuperación terciaria. La Faja Petrolifera del Orinoco tiene
unos 700 kilómetros de largo. Arranca desde Tucupita, Estado
Delta Amacuro, atraviesa los Estados Monagas y Anzoátegui y
6
cubre parte del Estado Guhrico. Su área abarca cerca de 53.700
kilómetros cuadrados. Se estima que existen 12 billones de
barriles de petrOleo con un factor de recuperación primaria de
petrOleo de 12,4 % y un factor secundario de 23,3 %. Asi,
aproximadamente el 65 % de las reservas quedarian in situ sin ser
recuperadas con las tecnologias actualmente disponibles.
(Lagoven, 1985).
Se pone en evidencia la importancia de desarrollar una serie
de procesos, dentro de los cuales estarian los biotecnológicos,
con miras a utilizar microoganismos que puedan ayudar a la
recuperación terciaria del petróleo. Tales procesos serian más
económicos por ser desarrollados en el pais y brindarían una
cierta independecia tecnológica a los proyectos de la industria
petrolera nacional.
7
1. BIOSURFACTANTES
Los biosurfactantes son sustancias que a bajas
concentraciones tienen la propiedad de adsorberse en
superficie o interfase del sistema y alterar marcadamente
energia libre superficial o de la interfase.
La energia libre de la interfase es la minima cantidad
la
la
de
trabajo requerida para crear dicha interfase. Esta energia por
unidad de ~rea es la que medimos cuando se determina la tensión
interfacial existente entre las dos fases. Los surfactantes
generalmente actuan para disminuir esa energia libre. (Mil ton,
1978).
Los agentes tensoactivos o surfactantes poseen una
estructura molecular caracteristica. Consiste de un grupo
estructural que tiene muy poca atracción para el solvente acuoso,
conocido como grupo hidrofóbico, junto con un grupo que tiene una
fuerte atracción, llamado grupo hidrofilico.
En una solución acuosa el surfactante se concentra en la
superficie con los grupos hidrofóbicos orientados hacia el aire y
los grupos hidrofilicos orientados hac1a el agua. Esta
configuración provoca una disminución de la tensión superficial
del sistema debido a que la interacción de las móleculas del agua
con los grupos hidrofilicos del surfactante es mayor que la
existente entre el agua y las moléculas del aire (Figura 1).
8
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FIGURA .l. DISMINUCION DE LA 'l'fi:NSION SIJPEHFICIAL.
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9
1
A concentraciones bajas el surfactacte existe en forma de
mcnómeros en la solución acuosa. A medida que se incrementa la
concentracibn este tiende a formar estructuras tridimencicnales
llamadas micelas (figura 2).
La formacibn de micelas es un fenómeno muy importante en los
estudios de solubilizaci6n por surfactantes. Debido a sus
propiedades los surfactantes son utilizados en la industria
petrolera para disminuir la tensibn interfacial de los sistemas
de crudo en agua en los yacimientos y facilitar su desplazamiento
hasta los pozos de producción durante el procese de flujo
micelar.
Otra de las aplicaciones de los surfactantes es la
produccibn de emulsiones de crudo pesado en agua con el objetivo
de disminuir las altas viscosidades de estos crudos para hacer
posible su transporte por oleoductos y facilitar su
almacenamiento.
Los microorganismos que crecen sobre petróleo e
hidrocarburos de petrbleo producen metabolitos con propiedades
tensoactivas llamados biosurfactantes. Entre ellos se encuestran
los lipidos de trealosa, lipopéptidcs, ácidos corimicólicos,
ramanollpidcs, y lipopolisacáridos (figura 3) (Ito y col.
Neu y
Pines V . col. 1990; Kretschmer y col. 1982; Cooper y col.
Gutnick 1984; Pines y Gutnick 1986; Rosenberg
1982;
1979;
y col.
1979; Romero y Brenner 1966; Casida, L. E. jr. 1968; Duvnjak, D.
10
1
\ \ '\ o
FIGURA
-o
2. FORMACION DE 1'1 J CELM-;.
6
4
3
•
• •• •
5
1 •
1: Película de surfactante en la superficie del agua. 2; Moléculas de surfactantes en la fase acuosa. 3: Formación de las micelas. Las cabezas polares se orientan hacia afuera y las colas hidrofóbicas en la matriz. 4: Solubilización del crudo en el interior de las micelas. 5: Crudo en la superficie del agua. 6: Fase acuosa.
11
li'IGUHA 3. ES'l'HUC'l'UHi\ (JU IM 1 CA PJ•: 1\LlJUNO~i Bl O:.iUHFI\C'l'ANTJm.
a
b
CH3 l . o-CH
1
(e H2l,s .
OH
COOH
H OH H e ~~ ----~------- (e H 2) ----
H n
12
OH j C=O
y Kosaric, N. 1985; Apostol, J. 1991).
Los biosurfactantes son necesarios para el metabolismo de
los hidrocarburos por los microorganismos. Su asimilación puede
i . . "L . l d ·ac:!.. :~.·:.a· a
·f'Drmación
por hidrofobización de la pared celular,
sur·factant<'::"! pOI'""
solubilización o dispersión del hidrocarburo en la fase acuosa.
E;-:isten meta bc:l 1 .i. t.: o~; qU€·?
la
la
tensoact:i.vc:\5, aunque su producción no está relacionada con el
metabolismo de los hidrocarburos. Entre ellos se encuentra la
subtilisina o surfactina, un biosurfactante producido por la
bacteria Bacillus subtilis que tiene la propiedad de lisar los
eritrocitos y disminuir la tensión superficial del agua hasta 27
milinewtons por metro (figura 4). (Neu y col. 1990; l"lu 11 iqan y
col. 1984; Cooper y col. 1981; Bernheimer y Avigad 1970).
Este biosurfactante es producido en cultivos de B. 5Ubt.r..l.r..s·
con carbohidratos como fuente de carbono y energia. Su producción
se ve inhibida completamente con la adición de hidrocarburos al
medio (Cooper y col. 1981).
la surfactina posee propiedades comunes con otros agentes
cataliticos de origen bacteriano tales como la s-toxina de
estafilococo o la streptolisina S. (Bernheimer y Avigad 1970).
Otro producto microbiano que ha sido objeto de estudio en la
0-L----L
14
FIGURA b. m3'['HfJCTI.JJ\A QUlMl CA DEL XAN'l'J\NO.
o"-
( To!ltéid() d~ :-)u tltr.n' J.é:trtd y kit~ r·u 1 f, 19R?) .
15
industria petrolera es el heteropolisacárido llamado Xantano
(figura 5). Este bicpollmero e~ producido por la bacteria
Xanthomonas campestris. Se ha utilizado en la formulación de
lodos de perforaci6n y en la recuperación secundaria y mejorada
de crudos. La producci6n del exopolisacárido ha sido relacionada
con la patog~nesis de la bacteria. (Schwartz y Leathen 1976;
Whitfield y col. 1981; Cadmus y col. 1978; Vuyst y col.
Kenedy y col. 1982).
16
1987;
2. QUIMICA DEL PETROLEO
El petr6leo es un concentrado selectivo de compuestos
parcialmente derivados de ciertos constituyentes menores de
plantas y animales preexistentes. (Meinschein y Huang, 1979).
A estas conclusiones se llega luego de estudiar las
relaciones estructurales y las disparidades en las
concentraciones entre los esteroles en organismos, los estanoles
y estenoles en los sedimentos recientes y los esteranos en el
petróleo ya formado.
Los esteroles son sometidos a procesos de reducción en las
rocas sedimentarias para originar los estenoles y estanoles que
son moléculas muy abundantes en los sedimentos recientes. Los
procesos de reducción continuan durante largos periodos de tiempo
para producir los esteranos. Estos esteranos son al canos
tetraciclicos que poseen un esqueleto carbonado indéntico al de
los esteroles. (Meinschein y Huang, 1979).
Similares procesos de reducción operan en la conversión de
triterpenos a alcanos de serie hopano, gammacerano etc, asi como
también de otros isoprenoides a al canos. Estos son
estructuralmente equivalentes en muchos detalles a los compuestos
biológicos que son sus precursores aparentes. Algunos esteranos
rearreglan el esqueleto carbonado y se racemizan en las rocas
sedimentarias (figura 6) (Meinschein y Huang, 1979).
17
Jt' T r;r lHA f) . F:~)THI JCTTJ !<A T l 1-' J C/\ fi E /\ !/ ;1_11~' J:) F.STERANO~:).
a
nl EntfH'rtno, l.Jl L':r)t.F!rnn•.) d'' .l.l1 Cl-'r1.t> Gammacernno. (Sugún Meinr;chnin y Huung, 1)-.l'/!}).
18
Asi, se puede considerar a los esteroles como marcadores
biológicos que permiten establecer la fuente y distribución
ecológica de la materia orgánica que origina un determinado
yacimiento.
Los hidrocarburos del petróleo se han clasificado de acuerdo
con la estructura, en diferentes componentes~
Los Alcanos, también conocidos como parafinas tienen la
fórmula molecular CnH2n+2 ( figura 7a). Esta serie esta presente
précticamente en todos los petróleos pero es preponderante en los
de base paraflnica. Los componentes mas livianos de la serie
(gases y liquido&) estan generalmente asociados con petróleo de
base asf~ltica.
Las olefinas y polimetilenos también llamados naftenos con
relativamente poca saturación constituyen las llamadas cadenas de
anillos abiertos. Incluyen varias series independientes,
diferentes en caracteristicas fisicas y quimicas aunque son
id~nticos en cuanto a su composición porcentual. Son raros en el
petróleo pero aparecen en muchos productos refinados como
consecuencia del proceso de cracking (figura 7b). Los acetilenos
de f6mula molecular CnH2n-2 de rango superior son caracteristicos
de muchos crudos (figura 7c).
Los arom~ticos son compuestos de fórmula molecular CnH2n-6
se encuentran en pequeNas cantidades en todos los petróleos,
entre ellos tenemos el benceno, fenantreno, antraceno, fluoreno,
19
[c'lUUHA 7. E::)'l'l<UC'J'UW\ \JUJMlCl\ Lll~ 1\Ll~UNU::i 1\Lll•'/\'l'lCUS.
H H H H H H 1 1 1 1 1 1
H- c-e-c-e-c-e -H 1 1 1 1 1 1
H H H H H H
a
b
H-e= e-H
e
éi) Alcé.lno, b) Oleiilla, c.:) Ac.-~tilu1u. ('J'ouwdt> de LJ\UC>VEN, l98b).
2tzl
etc (figura 8). La enorme cantidad de compuestos que hay en el
petróleo se incrementa por el aumento en el número de las cadenas
carbonadas, por las variaciones en las ramificaciones de las
cadenas, por las condensaciones de los anillos y por las
combinaciones entre diferentes clases de hidrocarburos. Varios
autores e investigadores estiman que mas de 3.000 compuestos de
hidrógeno y carbono pueden existir en el petróleo. Por tanto, la
qulmica petrolera representa todavia un extenso campo de estudio
e investigacibn (Lagoven,1985; Bartha, 1986).
Aparte de la serie de compuestos descrita anteriormente
podemos encontrar las llamadas resinas que son estructuras
hidrocarbonadas que poseen moléculas de oxigeno, nitrógeno, o
azufre. Las que contienen nitrbgeno se clasifican en: derivados
de piridina (quinolinas, fenantridinas etc), derivados del indol
(pirroles, carbazoles, benzocarbazoles etc) y las amidas
arom~ticas. Entre las que contienen azufre estan: alquiltioles,
tiofenos, benzotiofenos, etc~ Y entre los que contienen oxigeno
se encuentran los fenoles y los ~cidos nafténicos (figura 9).
(Lagoven, 1985; Bartha, 1986).
Por último se encuentran las fracciones asf~lticas altamente
condensadas presentes en gran proporción en los crudos pesados y
extrapesados. Es tan formadas por los asfaltenos y las
petroporfirinas.
Los asfaltenos presentan estructuras moleculares que han
sido objeto de muchos estudios debido a que es muy dificil
21
lf!GUHA 8. ES'l'RUC'l'lJIU\ t)tllM[C/\ f>l< I,IJ;; JIJI,J<II('/\I<HIII<II;-~ /\l\1Jt11\'i'l''il;;_
a
b
e
~) B~nceno, b) Fen~ntreno, e) Antraceno, d) Fluoreno. (Tom•do d~ Bartha, 1986).
22
FIGURA~). 1~;-;'J'WJC'l'Ul<i\ QIJlMICA VI~ LA::) H.E~-ilNI\:).
a
S d
OH 1
e
b
e
N H
a.) Quinolinéi, b) Ctu·b;..J..:::ol, ,;) F•:r,ol. d) Bt:n::::ot.lof.:r¡.-~_, t~) Di ben::.:o L i of<:::r¡;:¡. (Según B.t.H'ti¡;..J., 1\Hll:)) .
23
formular una estructura promedio. Acevedo y col en 1982
trabaj aren con asfal ten os de crudos del Pao, de la Faja
Petrolifera del Orinoco. Estos autores mediante estudios llegaron
a la conclusi6n de que los asfaltenos son de naturaleza
polim~rica. Su peso molecular dependeria de la polaridad del
solvente. Las asociaciones moleculares más importantes para la
fcrmaci6n de agregados en los asfaltenos serian los puentes de
hidr6geno. La estructura molecular promedio propuesta para los
asfaltenos se ilustra en la figura 10.
Además de los asfaltenos existen otras moléculas condensadas
presentes en los crudos pesados y extrapesados: las
petroporfirinas. Presentan estructuras cicliclas que tienen
insaturaciones conjugadas altamente resonantes de geometria plana
compuestas por 20 átomos de carbono. La porfirina básica consiste
en cuatro anillos de tipo pirrol unidos por cuatro puentes de
tipo metino para formar un macrociclo.
Las porfirinas se encuentran en el petróleo y sedimentos en
forma libre o como complejos con iones de metales pesados. Los
pigmentos mas abundantes que se han aislado son los complejos de
vanadio deoxofiloeritro-etioporfirina (D.P.E.P)(Figura 11),
tambi~n se ha encontrado otros cuatro tipos de porfirinas que
Etio, Di- D.P.E.P, Rodo-Etio, y Rodo-D.P.E.P.(Márquez, S.
1988).
Con base en su diferente polaridad, los compuestos del
petr6leo, pueden ser separados por medio de cromatografia de
24
OH
S"
25
FIGUHA 11. E:·)'l'J\lJCTUl<l\ (¡lJlMlC'/\ J:¡.; I.JN.t\ I'F:'J'Iit)Pill\l•'!l<INA.
Df~ o x o f i 1 () '~ r i t. r-· o-- f~ t i n T ·•' r · f i r· i n rt ( D P 1•: P ) . ('J'UIIIii(J(¡ dt: M,il''Jilt;:-; ;;,¡¡;,;;, 1~11111).
26
adSOI' .. C.i6n !1 en columnas de vidrio, sobre silica o alómina. El
método más utilizado es el llamado S.A.R.A y, dependiendo del
proceso de separac.i6n, pueden existir variaciones de este método.
Mediante esta cromatograf1a pueden separarse del CF""LidO l i:\ S
fracciones de saturados, ar·om.~ t :i. c:o~; !1 r··e~:; :.i. n<::\~s y ;as fa 1 temo~;.
(Figura 12).(Herbes y col. 1977; Herbes y Schwall,1978~ Oudot y
c:ol. 1987¡ Pendrys 1989¡ Lopez y Pasquali,1988; Carrion y c:ol.
1986; Márquez,1988).
Entre las propiedades más importantes del petróleo están la
densidad y la viscosidad.
La densidad, gravedad especifica o los grados API denotan la
·fluidez c.h:? los crudos. La industria petrolera internacional
adoptó hace aNos la entonces nueva escala propuesta por el
Instituto Americano de Petróleo. Consiste en una modificación de
las dos escalas de Baumé usadas para comparar, con la utilización
de un hidrómetro, la densidad de liquides más livianos que el
agua de gravedad especifica = 140/ 130 + n, o para liquides más
pesados de gravedad especifica = 145/ 145 n. B<~? tomó como
factor de relación para la gravedad especifica el valor de 141.5.
La ecuación matemática que relaciona los grados API con la
gravedad especifica de los crudos es:
API - (141.5 1 gravedad especifica) - 131.5.
La c:lasific:ac:ión de crudos por rango API que utiliza el
Ministerio de Energla y Minas de Venezuela es la siguente:
27
CRUDO a
, filtracion
MAL TE NOS
b e¡ . AROtv1ATlCOS
d SATURADOS
,
RESINAS
u) Prt::;~ii-Iit,éH.::ión c:on n IH~r:d;t.~.no, b) [Cillt:ifHl <:c!ll hP.):c"iri<J, C') f(Juc:ion con toluuno. d) I•:Ju,:it¡n t:r,~n tl;iUt;III>/ Htt~L·'!rtul.
( Su~ún Ló~.•t.::?. y Prt:i·JIJ,¡ l i, 1 ~JHH).
28
$ElPJ\#~Cm~ Bi!aUi)liEtCAii\liji]g ¡¡;ruHif.\IUEG \') "TULlO FEBRES CORDi:IW"' 1
UNIVIR')If)ll,D Ot, LOí /JNDES ¡, M'éF<tDA · V["\it!iJLLA
E:-: tr,::~ pf..~sado!c.; ~~" ((.j 9 .9 q_ ?iF' I
Pfo!~:;ad o .1.0 2.1. . <":{ q
1'1ed :L.::~ nos; l"'tl'""¡ • 1:: •• .,::. 29.9 P .
11
Livianos :;::0 -· m~:~ E-:; q 11
1 .... ,::~ visco~:;id;:i\d es una medida que permite apreciar la
resistencia que opone el crudo al flujo interno .. Se obtiene por
varios métodos y valores de medición. E!::; tos son poisE!!::. o
centipoises que equivalen a dinas por segundo sobre centimetro
cuadJ'"ado (din. -~
seg/ cmL) .. En estos términos, la viscosidad
la fuerza por unidad de superficie, por·
centimetros cuadrados, necesaria para mantener una diferencia de
velocidad de un centimetro por segundo entre dos capas teóricas
el(~ que estan separadas por un Ct:?nt.imf:?.tro ( l .... afJoVE!n,
.1.985; Pérez Dumet, 7 ,{ •• n l9B:.?) •
3. BIODEGRADACION DEL PETROLEO
Muchos microorganismos han sido aislados del petrOleo n de
hidrocarburos del petrOleo. En la tabla 1. se recejen una serie
de microorganismos reportados que utilizan petrOleo o hidrocarbu-
ros del petrOleo para su crecimiento. Los compuestos utilizados
van desde simples hidrocarburos alif~ticos (Metano, n-alcanos,
isoalcanos, olefinas, cicloalcanos, fenilalcanos etc.) hasta
hidrocarburos aromáticos (Benceno, tolueno, naftaleno, antraceno,
fenantreno, etc). No todos estos compuestos son oxidados hasta
dióxido de carbono o agua.
En condiciones aerobias, el ataque primario sobre los
hidrocarburos intactos requieren siempre de la acción de
oxigenasas, y por ende de la presencia de oxigeno libre.
Ex1sten dos categorias mayores de oxigenasas. Las
monooxigenasas, que incorporan un ~tomo de oxigeno en el sustrato
y el otro es reducido hasta formar agua, y las dioxigenasas que
catal1zan
sustrato.
oxidaciones
la incorporación de ambos átomos de oxigéno
Generalmente las monooxigenasas operan en
de estructuras parafinicas, mientras que
al
las
las
dioxigenasas lo hacen en compuestos arom~ticos (Schwartz, R. D. y
Leathen, W. W. 1976; Connan 1987; Bartha 1986).
Los sistemas de oxigenasas encontrados en microorganismos
que oxidan hidrocarburos son complejos y variados. Son
estructuras multiproteinicas que usualmente requieren cadenas de
30
TABLA 1. ALGUNOS GENEROS DE MICROORGANISMOS CON PARA CRECER EN PETROLEO O PRODUCTOS DERIVADOS.
CAPACIDAD
HONGOS FILAMENTOSOS.
Co rynE> bact"e r.i u m Abs.id.ia Cand.ida,
Acremon.ium e rv pto <.:o ce u:.:::
N.icromonospor·a A.:::: pe l'q i .l .lus En<.iomvces
Stn:~ptomvce.-::: Nansenu.la
Nocarci.ia Cepha.lospor.ium Nvcotoru.la
NE.' t ha nomo na;;:: Chaetom.ium Pichi a
Psueo'omona.:::: Ch.lor.id.ium f<hodotoru.la
.A e .in~? to bacte r C.l ado.~.~ por ium Toru.lops-.is
Co.l.letotr.ichum Tr.icho;;::poron
r-· .la~~ o ba e ter Cu.nni nqhamrd .la Sac:cha romvce.i' »
Dr.~mat .i um
B<E~ci.l.lus Epicoccum
Arthrobactf..'l'
Achr·omobacte r N Glioclad.ium
Ciraphiu.m
fl,<? 1 .i e o:::: t v.l u. m
Ne.lm.inthospor.ium
Noni.lia
Nucor
O.i deod redum ....
Tomado de Schwartz y Leathen, 1976.
::::;.1.
transporte de electrones y cofactores enzim~ticos especi~icos.
Los alcanos atacados por las oxigenasafi dan como resultado
""lcohol<~s .. Muchos microorganismos atacan lc>E
ter··mi na J. m en tt:~ (por- un solD E-.>:-:tr·t:?mo)~ algunos
pr .. ef :l. eren
un;;~. o>: idac::ión por los dos extremos de la cadena c.::\rbon,;;\di:!\.
.:;1lcohol producido es oxidado posteriormente a un .~~ 1 cl<-::~h.'i.c:lo y
finalmente a un ~ciclo graso que por último es degradado por ~-
(figura 13)
Las ramificaciones metilicas interfieren con el proceso ele
¡-oxidación y se necesita un ataque cliterminal u otro mecanismo o
via matabólica .. Por esta razón los n-alcanos son degradados más
f~cilmente que los iso-alcanos.
Los cicloalcanos son transformados por un !::;istf.?mC:\
no t<::>talmt:?nt<~ c,::~r,.·ac:t<;?l~ .1. :<~aclo, has; t.:,:~ E-.' 1 <lld<~hido
c:iclico correspondiente el cual es deshidrogenado a una cetona.
F'os; t.E?r iclr'-men tf:':! un sistema de monooxigenasa, di fer~f.':!nte del
anterior, lactoniza al anillo y este es subsecuentemente abierto
por una hidrolasa lac::tona.
El hecho de que los sistemas de oxigenasas mencionados
anteriormente nunca son encontrados todos juntos en un
impidE· e~ 1 aislamiento de cultivos puros que
sobre cicloalcanos. Sin embargo, la ac::ci6n sinérgica de
comunidades microbianas hacen posible dt?.Q r·,:"dc:~c:::i.ón
FIGURA 13. BIODEGRADACJON DE Hll,lf<OCARBliHU:~ ALJit'/\'l'T(~(J::
al cano
CH 3 - (CH 2 )n-CH 2 0H
alcohol
l aldehído
áciclo graso
33
eficiente de los clcloalcanos.
Los hidrocarburos arom~ticos son transformados por los
Procariotas, mediante el ataque inicial con dioxigenasas, hasta
trans-dihidrodioles y posteriormente oxidados hasta productos
dihidroxilados como el catecol.
Los microoganismos Eucariotas utilizan monooxigenasas
produciendo 1,2 dioxi-benceno del benceno. Esta acción es seguida
por una adición de agua para producir dihidroxi-dihidrobenceno
que es oxidado hasta catecol. El catecol es un intermediario en
la biodegradación de los arom~ticos. El anillo se abre por un
rompimiento tipo orto o meta, produciéndose ~cido mucónico o 2-
hidroxisemialdehido mucónico. Ambos productos son metabolizados
hasta intermediarios del ciclo de los ~cidos tricarboxilicos
(figura 14).
Los arom~ticos policiclicos condensados son degradados, un
anillo a la vez, por un mecanismo similar al anterior, pero la
biodegradabilidad tiende a declinar con el número de anillos y el
grado de condensación. La biodegradación tiende también a
disminuir con los sustituyentes alquilicos sobre los anillos
arom~ticos.
Algunos hidrocarburos de petróleo como los alcanos de cadena
a si como los compuestos monociclicos ciclopentano,
ciclohexano, y cicloheptano, son tóxicos para la mayoria de los
microorganismos. Estos compuestos debido a que son solventes
34
ll'IGUHA '14. BlOlJEGHADAC lON DE /\HOMAT 1 CU::;.
a
OH OH
b
d OH e OH OH COOH
f g e
h
V';y"OH -~~OH ~ ~
. COOH/ · OH
HOC / r{ 1('0 ~O.y
O ..y
u) Ft:nontrt;HO, b) Di.hldroxiferwntc~no, e) 1 hldcuxi--ucldu naftoico; d) Dihidroxi-naftl.dtno, eJ Acido dihidroxicinámicu, !') Acido salicílico, g) C<~11:ecol, y h) Sf.:llliuldehido hid:r·ox·iruucórücu. ('l'on.!ado dt Schwü.ctz y LeLILert, l~r/11¡.
35
org~nicos tienden a destruir las capas lipidicas de la membrana
celular.
La mayoria de los microoganismos utiliza para su crecimiento
compuestos parafinicos. Otros utilizan tanto compuestos
parafinicos como arom~ticos y aromáticos condensados. Sin
embargo, existen microorganismos que degradan preferencial mente
los compuestos aromáticos condensados, las resinas o los
asfaltenos. (Oudot y col. 1897; Wyndham y Casterton 1981; Wyndham
1987; Bumpus 1989; Weissenfels.1990).
Oudot en 1987 reporta una degradación preferencial de
resinas y asfaltenos en petróleo por la bacteria filamentosa
Nocardia y por el hongo Fusarium oxisporum. Foght en 1989 reporta
una especie de Pseudomonas que es capaz de degradar los
aromáticos de bajo y alto peso molecular incluyendo el fenantreno
y el antraceno, pero no degrada los compuestos saturados.
En condiciones anaer6bicas los microorganismos pueden
degradar compuestos aromáticos utilizando en vez de oxigéno otro
aceptar final de electrones. En estas condiciones se ut1!1za
nitrato, sulfato o mon6xido de carbono como aceptar final de
electrones. los mecanismos metabólicos que permiten ut1l1zar
aromáticos en condiciones anaer6bicas son~ el fotometabolismo,
respiración del nitrato o sulfato y la fermentación metanogénica.
(Evans 1977; Aftring y taylor 1981; Bakker, 1977;
Sahm y col 1986).
36
Sleat, 1984;
Los principales factores que afectan la biodegradación de
h .i. dt'··Dca r·I:Juro~=~ de petrbleD en el med.i.o ,7:\mbi<~?nte
composicibn de los hidrDcarburos, el estado fisico en que se
encuf?.ntr·a f?l petrbleo, la meteorización, la disponibilidad de
la temperatura y el pH del medio. Las disponibilidades de
oxigeno, nitratos, sulfatos, nitrógeno, hierro y fósforo también
son limitantes para el crecimiento. (Bartha, 1986).
La salinidad es un factor importante en la biodegradación
del petróleo. Los trabajos realizados indican que a medida que
aumc'?nta la salinidad en el medio disminuye la emulsión y l él
biodegradación del petróleo (Bartha, 1986; Ajisebutu, O. S. 1988;
Ward, M. D. y Brock, T. D. 1978).
Ajisebutu en 1988 reporta un óptimo de salinidad de ~.5 %
para la I:Jiodegradación del petróleo por las bacterias del género
f~e romo nas. Sin embargo existen otros reportes donde se logra
detectar una biodegradación de saturados y aromáticos del
petróleo a una salinidad del 20 %. (Ward y Brock, 1978).
Las temperaturas reportadas en los ambientes donde se
registra biodegradación del petróleo van desde 4 Q hasta 66 Q r
Bazyliski y col en 1989, en su trabajo en el Golfo de California,
logran aislar microorganismos de una submuestra a 2.0~~ metros
Este
microorganismo al igual que los del resto de la submuestra
degradaron hidrocarburos provenientes de la alteración t~rmica de
materia orgánica de origen planctónico y t.E!t'··rE"2&t.t'··e.
-::-··7 ..... 1
registrado bicdegradacibn en reservcrics con temperaturas entre
20 y 75 qC. (Ccmnan, ,J. JC.?B7).
De les precedentes que venimos de exponer se infiere que, en
<;Jf.~ne¡···.:.:\ 1 V 1 para que los microorganismos puedan
reunir una serie de
a) Disponer de microorganismos adecuados.
b) Presencia de flujo de agua meteórica.
1 Cl!:5
c::ir·c::uns tan cia~:;
e) Contacto efectivo entre la fase del crudo y del agua. Ya
que los microorganismos solo prosperan en presencia de agua.
d) elE? o:·ligenc::r, cuando ¡···ec¡u:iel~e
microorganismos aeróbicos.
E!) Fuente adecuada de nutrientes salines (1\litr·.:\tc¡~:; y
fosfatos entre otros).
f) Temperatura adecuada para el crecimiento y actividad del
mi Cl'"·oor·gan i smo.
Con base en los conocimientos que se tienen en la actualidad
la microbiología del petróleo, descritos anteriormente se
planteó como hipótesis para el presente trabajo la posibilidad de
que existan en el medio ambiente relacionado con la explotación,
3!3
transporte y almacenamientos de hidrocaburos microoorqanismos
capaces de disminuir la viscosidad de los crudos pesados. Seqón
nuestra hip6tesis esta disminución se producirla por la
degradación de estruc~uras asfalténicas y resinosas presentes en
el crudo pesado o por la producción de metabolitos que disminuyen
la tensión superficial.
La importancia de aislar microorganismos que degraden
preferencial mente los asfaltenos y las resinas es debida a que
son precisamente estas estructuras las que le confieren las altas
viscosidades a los petróleos pesados. Como se saNa lb
anteriormente existen microorganismos con capacidad de degradar
estructuras condensadas de hidrocarburos pero no a los compuestos
saturados.
Es probable, también, que estos microorganismos puedan
producir biosurfactantes que ayuden a disminuir la tensión
interfacial de los sistemas crudo-agua en los yacimientos.
La idea principal para lograr la recuperación de petróleo
pesado es inyectar microorganismos adecuados en los reservorios.
Estos microorganismos degradarian los asfaltenos para rendir
crudos livianos o producirían surfactantes que disminuirian las
tensiones interfaciales.
39
CAIP#TUILO ## OBJET! \VOS
OBJETIVOS.
1) Obtener muestras de hidrocarburos de zonas adyacentes a
los pozos petroleros y realizar cultivos de enriquecimiento para
obtener microorganismos capaces de crecer en medio
petróleo pesado como ~nica fuente de carbono.
idóneo con
2) Seleccionar cultivos puros y mixtos de los
microorganismos aislados que muestren mejor crecimiento y mayor
capacidad emulsionante del petróleo pesado en sistemas acuosos.
3) Identificar y caracterizar a los microorganisamos
seleccionados mediante pruebas bioquimicas y fisiológica.
4) Determinar las capacidades óptimas de los microorganismos
para biodegradar el crudo estudiando las caracteristicas de las
fracciones de asfaltenos y maitenes antes y después
biotratamiento.
5) Estudiar las condiciones de producción de
biosurfactantes que permiten solubilizar y emulsionar el
pesado en agua.
41
del
los
crudo
CAPITULO 111 METODOLOG!A
METODOLOGIA.
1) CULTIVOS DE ENRIQUECIMIENTO:
Las muestras sometidas a cultivos de enriquecimiento fueron
tomadas de pozos existentes en las ciudades de Cabimas 9 Ciudad
Ojeda, Lagunillas y Tia Juana situados en la Costa Oriental del
Lago de Maracaibo.
Las muestras sólidas estaban formadas por suelos conteniendo
crudos enbebidos y por hidrocarburos emanados de los balancines.
Estos suelos presentaban un color oscuro, olor fuerte a
hidrocarburos y consistencia arenosa.
Las muestras liquidas de hidrocarburos fueron tomados del
área de extracción de los balancines y se caracter1zaban por
tener una consistencia pastosa, un olor fuerte a gasoil y a
sulfuros V '
poseian un color negro brillante. Estas muestras
fueron trasladadas al laboratorio en pequeNas bolsas de plástico.
Otras muestras estaban constituidas por arena y agua de la costa
del Lago de Maracaibo.
Con el objeto de estimular el crecimiento de los
microorganismos que pudiesen estar presentes en las muestras, se
procedió a cultivarlos en medios salinos con petrOleo pesado como
única fuente de carbono y energia. El petróleo utilizado fué del
tipo Cerro Negro enviado gentilmente por LAGOVEN al Laboratorio
de Fermentaciones.
43
Se prepararon una serie de frascos de 500 mililitros de
capacidad que contenian 200 mililitros de medio salino con c:l 1?.
petróleo Cerro Negro como fuente de carbono. Los medios fueron
sin pn:?!5ión, durc:\n t<e :?0
minutos.
En una serie de frascos se colocaron aproximadamente r.:: ,_1
gramos de muestra proveniente de cada región.
frascos fueron inoculados con los filtrados de estas muestras a
'll'··avé:~:;; ele pi::lpf::!l de f.i.J.t.I'"O i1Jat.tman :J:J: .:t..' F'a1r·.:;\ filt1r·¿"'r las mu<::?stl"·as,
se agitó cada porción en tampón fosfato a pH 6.8 y se recuperó el
liquido por decantación para ser filtrado. Los cultivos fueron
Los procedimientos con medios de enriquecimiento, al .i.qual
que la formulación de los medios salinos utilizados fueron
tomados de la literatura. (Ward y Brock, 1978; (-'\j .i. Sf:? bu tu .:l. 9B8;
Austin y col 1977; Weinssenfels y col 1990; Oudot y col 1<:;>B7;
Pendrys 1989; Fedorack y Westlake 1984; Foght y col 1989)
La fórmula de los medios salinos, pa1"·a los c:u 1 tivo::~
realizados en esta primera etapa, fué la siqu.i.ente~
I<H2PD4 0 .. 6B ql"·amos ..
Na:.zi-IPD 4 1 .. 79
1"1<:;,1 804 {(.) .. ::::: ~) 11
ND ::~;N J ... ¡ L~ .1. . ~~~;~ 11
Fe 804 0.4 mi 1 :i.ql' .. amo!::; ..
44
El medio utilizado en cada experiencia fué ajustado a pH 7
con una solución de NaOH 0.1 normal y se le agregó en cada
ocasi6n 5 % de crudo pesado tipo Cerro Negro.
Los cultivos mixtos, aislados a partir de les cultivos de
enriquecimiento, fueron repicados cada 15 ellas en el medio salino
anterior conteniendo 5 % de crudo pesado tipo Cerro Negro.
fue el sustrato utilizado en todas las experiencias del PI'"E~sen te
t¡~,"'ba.:i o.
2) SELECCION DE LOS CULTIVOS CON CAPACIDAD PARA CRECER Y
EMULSIONAR EL PETROLEO PESADO EN LOS MEDIOS SALINOS:
Se prepararen una serie de fiolas de 250 mililitros de
capacidad con 100 mililitros de medio salino que cont.en1a 10 % de
pet.J'"óle-?o p<~?sc-1do.
D<~?·spués ele~ e~:;;tf::~¡r·il.izar·· r:-:d mat.er·.i.al .::~ H%~ r;~.C con v.::1por
durante 30 minutos, fueron inoculadas las fiolas con 5 % de cada
sobrenadante proveniente de los cultivos de enriquecimiento
realizados anteriormente y se procedió a incubar, sin agitación,
a :::;.0 p_C dur·.::mt.e.~ :::;;¡;!) dj.ar::;.
Se tomó nota de la apar1enc1a de las fases inmiscibles
formadas por el crudo y el agua asi como del grado de turbidez
df.? la fasf::? ac:t.tosa. Se determinó el número inic::i.al
microorganismos, por mililitro de medio, presentes en cada fiola.
45
Transcurrido el tiempo de incubación se seleccionaron
aquellas fiolas donde el petróleo pudo ser emulsionado o
dispersado en la fase acuosa. También se tomaron en cuenta
aquellas fiolas que presentaban turbidez y donde el número de
microorganismos habia aumentado.
Para determinar el número de microorganismos, tanto al
inicio como al final de la incubación, se procedió a realizar
diluciones seriadas de cada muestra con medio salino desde 10-l
- ··-6 .. . . . . hasta 10 . Se sembró 0.1 m1l1l1tro de cada dilución sobre placas
de agar nutritivo y los cultivos se incubaron a 30° C durante 5
dias.
Pasado el tiempo de incubación se determinó el número de
colonias en las placas y al relacionarlo con el factor de
dilución se obtuvo el número de células por mililitro de medio
correspondiente a cada muestra.
A continuación se sembraron en medio salino, con petróleo
como fuente de carbono y de energia, una serie de microorganismos
pertenecientes al cepario del Laboratorio de Fermentaciones.
Estas cepas estaban relacionadas con algunos géneros con
capacidad de degradar hidrocarburos.
Los microorganismos selecionados fueron los siguientes~
Bactérias:
46
Acinetobacter calcoaceticus r-Yrcc .1.117.1
Arthrobacter sp. CNCIC :.t.~:;4
Bacillus megaterium.
Flavobacterium sp.
Corynebacterium qlutamicum. ATCC .:1.:::::0~:':·El
Streptomyses venezuelae. ATCC 2.1. :J.. .1:3
Hongos y levaduras:
Aspergillus niger. ATCC .1.141.4·
Canci.ida ut.i.l.is ..
Saccharomycopsis .lipo.lftica. A'T'CC 8661
Rhyzopus delemar. r~'T'CC 4b86.1
El conjunto de fiolas que contenian los cultivos con las
bacterias y con los hongos fueron cultivados, sin agitacibn,
Se registrb la apariencia inicial del crudo en cada medio V !
la turbidez en la fase acuosa. Al terminar la incubación se dosó
el crecimiento por el grado de turbidez de los medios y se
determinó la capacidad que poseia cada cultivo para emulsionar el
pé~tr .. ólf:~o.
3) DETERMINACION DE LA VISCOSIDAD APARENTE EN LOS CRUDOS
EMULSIONADOS POR LA ACCION MICROBIANA:
La emulsión producida por un microorganismo al crecer sobre
petróleo pesado se debe a un proceso que ocurre en dos fases. En
la primera el microorganismo produce un emulsionante y 1 "''
segunda las macromoléculas son degradadas.
En vista de que no nos fue posible separar netamente las dos
fases tampoco pudimos medir la viscosidad real puesto, que la
producción del surfactante es el evento primario.
En consecuencia medimos lo que denominamos viscosidad
apan:;-nte qUE' define indirectamente la capacidad Clf..? los
microorganismos para emulsionar el crudo.
Fiolas de 250 mililitros de capacidad contE.•niendo .1.(~0
mililitros de medio salino, con .1.5 % de petrbleo pesado c:omo
fuente de carbono, fueron inoculadas con 10 % del sobrenadante de
los cultivos seleccionados anteriormente. Es decir~ con los
cultivos que presentaron mayor capacidad para crecer y emulsionar
Estos cultivos fueron incubados durante 20 dias, sin
-.. :·:r r>l &.~e ·¡· t t l""l ·t· e·· ¡··· (""" rl i::tq.itacibn, "" -•I<:J •••• •. ! ....•• • los controles con medio salino y 15
% de petróleo pero sin inocular-·. Des;pués de J. pE"! r-· .í od o
incubación el petróleo proveniente de los cultivos y de lns
cnntroles fue decantado en viales de 30 mililitros de capacidad y
se determinó la viscosidad aparente de lns c::rudns emulsionadns en
Se utilizó un viscosimetrn Brookfield mndelo RVF. Sf::~
seleccionaron lns ejes más idóneos para lns rangos de viscosidad
4!:3
de los crudos pesados. Estos ejes fueron los TE del dif:;po!:~itivo
HE:d .ipath Vi~=~ C::0~5 J.. mE~ t.I'"O u t. i 1 .i. ~·=a el o quE~ pet"·mi ta• mf?dit•"
comprendidas entre los y
CE?n tipo .i. ce!:' .. ' .. Las lecturas de Vi. S C::OS :Í. el o:\ el ·f'uet'"Dn
La velocidad de deformación o cizalla fue de 10 rpm, el
porcentaje de fase interna de la emulsión fue del 70 •¡ In
aproximadamente con una concentración de biosurfact.ant.e de 10
miligramos por mililitro que corresponde a la m~xima producción
ele los microorganismos en los medios estudiados.
4) DETERMINACION DEL PORCENTAJE DE BIDDEGRADACIDN:
Para determinar los porcentajes de biodegradaci6n en los
cultivos mixtos se utilizaron técnicas gavimétricas publicadas en
varios trabajos sobre biodegradación (López V 1 F'acuali,
Ajisebutu, 1988; Austin y col 1977; Oudot y col 1987).
.1.9B8;
Se prepararon una serie de matraces de 100 mililitros de
capacidad con 40 mililitros de medio y 0.5 % de petróleo pesado.
minutos y se inocularon con los cultivos mixtos seleccionados
anteriormente. Se incubaron, sin agitación, durante 30 ellas a 30
q,C
Los controles consistieron en medio salino con crudo sin
inocular-. Estos controles nos permitir~n corregir la pérdida de
49
masa del crudo por la evaporación o solubilización en el medio
acuoso.
Después de la incubación se determinó la masa del crudo
remanente en cada cultivo. A cada fiola se le agregaron 15
mililitros de cloroformo. La mezcla se agitó durante 10 minutos
para disolver el crudo residual de los cultivos. Para separar en
cada fiola la fase orgánica de la acuosa, se colocaron los medios
en un embudo de separación. Las fases acuosas fueron descartadas
y se recuperaron las fases orgánicas en placas previamente
pesadas.
El solvente fue evaporado por calor y el petróleo remanente
se pesó. El porcentaje de biodegradación se determinó al comparar
los pesos iniciales y finales de los crudos. Estos pesos se
corrigieron
relación~
con el peso del crudo del control mediante la
% B 1 - Peso final 1 peso final del control ) * 100.
5) ESTUDIO DE LAS FRACCIONES DE ASFALTENOS Y MALTENOS EN
PETROLEO SOMETIDO A TRATAMIENTO MICROBIOLOGICO:
Para determinar esas fracciones en el petróleo pesado tipo
Cerro Negro se siguieron las técnicas publicadas sobre la
separación y cuantificación de fracciones de crudos pesados.
Estas técnicas se basan en la utilización de solventes de
diferentes polaridades (Lopez y Paculali, 1988; Acevedo y col,
50
1982; Carribn y col 1986; Márquez, S. 1988).
Se estudiaren un total de 8 muestras. Cada una consiste en
un gramo de crudo contenido en pequeMos matraces • Se le agregó a
cada muestra 40 mililitros de n-heptano, se agit6 hasta disolver
t.otalmentf?. E?l sust1'"·at.o y sse guar-dó E!n "f'r·:lcl (4 r~C)
Las muestras enfriadas se "f'iltraron y se recuperaron los
asfaltenos precipitados. La filtración se realizó a 4
de filtro Wattman # 1, pesado previamente. Los asfaltenos
obtenidos se lavaron varias veces con pequeHas porciones de n
heptano frie y se secaron en la estu"f'a durante toda la noche. Por
la diferencia en peso de les papeles de filtro, se determinó la
cantidad de asfaltenos presentes en
anal.i.~:ad,::l.
cada gramo de muestra
Los filtrados anteriores y los lavados fueron recuperados en
placas previamente pesadas. Se evaporó el solvente de cada pléiC::a
i:!ll colocarlas en la estufa y se determinó, por diferencia de
peso, la cantidad de maltenos presentes en cada muestra.
Se prepararon una serie de matraces de 250 mililitros de
conteniendo 100 mililitros de medio salino c::on 1 % de
c::r··udo. Esto~; mc:\t.l"·acE•!5 ·fuE!r··on t.-::s;t.t-~l'··i 1 i ~~c\dos:; a .1.00 p_C con V<::\por··
el u,, .. an t.~? 30 minutos y luego inoculados con
SI.'.:' l fo' e e i Dn e:\ el o~:;. I...ClS cultives fueron incubados, junto cDn
c::Dntr·oJ.E:'!L:; nD .i.nocul,::~do!!:>!, a ::::.0 q_C dUI'""c:\ntf::! 2Qi d:l.as.
51
Después de incubar se decantó el crudo remanente de cada
cultivo y se tomó 0.5 gramos para cuantificar la concentración de
las fracciones de asfaltenos y maitenes por los métodos decritos
anteriormente. Los resultados se compararon con los controles y
con los datos obtenidos de las cuantificaciones hechas con el
crudo sin tratamiento microbiológico.
6) AISLAMIENTO
CULTIVOS MIXTOS,
PETROLEO:
DE LAS CEPAS MICROBIANAS, A
CON CAPACIDAD PARA CRECER Y
PARTIR DE LOS
EMULSIONAR EL
Se sembraron en matraces con medio salino y petróleo los
cultivos provenientes de las zonas
an tf::~r· i or·mf::~n te. Los cultivos de estas muestras fueron incubados~
~s.in e:1qi tación, P.e c:lt.w.;,,ntE~ 20 d1.as hasta
crecimiento y capacidad para emulsionar el petróleo.
Se realizaron diluciones seriadas, con tampon
las muestras o cultivos incubados anteriormente. Se sembraron 0.1
mililitros de cada dilución en placas de agar nutritivo. Y fueron
incubadas a 30 oC durante 5 dias. Las colonias seleccionadas al
azar se repicaron varias veces sobre placas de agar nutritivo
para asegurar la pureza de cada cepa.
A continuación se prepararon una serie de tubos conteniendo
20 mililitros de medio salino y 5 % de petróleo. Esto~:; tubos
fueron inoculados con las cepas seleccionadas anteriormente y se
incubaron, sin agitación, C:'i 3(7.) Q.C dUI'"ant.f.\·~ 20 cl1~::'1!5.
Pasado el periodo de incubación se seleccionaron los tubos
donde se produjo mayor crecimiento y emulsión del crudo en la
fasf.'~ acuosa .. A partir de estos tubos se reaislaron
sobre placas de agar nutritivo y se guardaron en cuNas de agar
p<?.ptona a 4 pC • Tod.::\!:; 1 as Cf:?pa!:; fuf.'-"l'··on r-f.·?p:l. ce:\das <?.n E? 1
medio cada 2 meses.
7) ESTUDIO DE LAS CONDICIONES DE CULTIVO:
7.1 Temperatura:
pr··epc:~r··ar·on culti\/DS con c:epar:::. sf.'~ J. ecc::ionac:lc.~s
anteriormente y se incubaron a diferentes temperaturas: 4·, :.2(Zl,
durante 20 dias. En c:ada caso se comparó el
crecimiento por el grado de turbidez de la fase acuosa y el grado
de c:l.ispE'I~ción o solubilización del p<;:? t. r-ó J. E? O p.::1r··a e:: a da
prueba se utilizó el medio salino de
crecimiento que contiene 10 % de petróleo pesado.
7.2 Salinidad:
S e r· e C::\ J. i. ~-~ a n:m cultivos a diferentes concentraciones de
cloruro de sodio 0.5 , 3 , 6 y 10 % en el medio anterior y se
:i.ncubaJ""CJn a :37 q_C dur·ant~::: 2(21 dia!::;. Al ·f'inaliz,::\r la inc:ubc:1C::ión !5e
¡~eqistr·ó E:'l crecimiento y capacidad de emulsiont.e
concentración de sal.
7.3 Concentracibn de nitratos:
Se estudiaron los cambios en el crecimiento y emul!::;ión
cepas seleccionadas a concentraciones de 1 , ,.., .. ::. , de
nitrato de sodio. Al igual que en las pruebas anteriores se
utilizó medio salino conteniendo 10 % de petróleo y la incubación
7.4 Aereaci6n:
E::.l \1 !
).,;:¡ pi'"Ddu ce i ón de emu 1 !::d. ón en mf.?dios
cultivados en aerDbiDsis se comparó cDn los cultivadDs en
anaerDbiosis. LDs cultivos en aerobiDsis se hicierDn en fiDlas de
500 mililitros prDvistas de tapDnes atravesados
vidriD por los que se les suministró aire desde un cDmpresor. Se
utilizó un VDlumen de 100 mililitros cDnteniendo 4 % de nitrato
y 5 % de crudo. Los cultivos en anaerDbiosis fuerDn realizados en
fiDlas de 100 mililitros con 50 mililitros del
cerradas herm~ticamente con tapDnes de goma.
7.5 Concentraci6n de sustrato:
Se realizaron estudios sobre la capacidad de las cepas par.:.1.
crecer y emulsionar petróleo en CDncentraciones de 5 .1.0,
2t'.l y 5(2) % !1 en medio salino. La incubación se realizó a 37
!s.i.n aq.it..:"~c:.ión, c:lurc:~nt.E·:! :;,;:((.) d.:las.
8) DETECCION DEL SISTEMA NITRATO REDUCTASA EN LAS CEPAS
SELECCIONADAS:
las cepas seleccionadas eran capaces de
r·G.~duc:::i.l'' se realizaron varias pruebas
metodolgia previamente reportada (Bailey y Scott. 1970,
Crispin, J. A. 1988).
Se sembró cada cepa en caldo peptona. La incubación se hizo
durante 24 horas. Df.'!!Spués de 1 a a :y¡ qC,
inc:ui:J,::~c:ión, 3 mililitros del reactivo de nitritos, se mezclaron
con 0.05 mililitros de cultivo de cada cepa y se esperó el
desarrollo del color c:arac:teristic:o de la reacción. Las muestras
que .::\1 principio no desarrollan el color y después de agregar
Zinc: lo desarrollan, se consideran negativas. Cuando no Sf:?
clesc:\Y"I'"CJlla el cCJlDr ni aún en presencia de Zinc: y se CJI:Jserva
producción de gas en lCJs cultivos se considera que se trata de
cepas pDsitivas para la desnitrific:ac:ión.
9) ESTUDIO DE LA PRODUCCION DE SURFACTANTES EN LAS
CEPAS SELECCIONADAS:
9.1 Obtencibn de los biosurfactantes.
las cepas selec:ciCJnadas se cultivarCJn en medio salino
estéril que contiene 15 % de petróleo Cerro Negro y 0.1 % de
extracto de levadura. Se utilizaron matraces de 500 mililitros de
capacidad con 200 mililitros de medio. Un control estuvo formado
55
por ese medio mas peptona pero sin inocular. Otro consistió en el
mismo medio inoculado pero sin petróleo. Esta prueba se hizo para
detectar la posible producción de biosurfactante en ausencia de
h:i.d¡··oc:aJ'""bur·os n TodCJs los cultivos fueron incube:1dos ~· sin
ar;¡it.::1c::ión, a ::::;-¡ Q.C dur·c:tntE"!.' 2fl.l d.:l.<::\!5.
TerminadCJ el periodo de producción se procedió a extraer los
biosu1~ f actac tf:?r..; de los medios de cultivos.
utilizarDn técnicas de extracción liquido-liquido con la ayuda de
solventes aprDpiados y técnicas de precipitación en
prDpuestas por diversos investigadores (McDonald y col
Cooper y Paddock 1984; Makula y col 19"75; Kretschmer y col
CamE?I'"On y col 1988; Rosenberg y col .19"79a, .1.9"79b;
fr·.io,
.1. <;18.1 ;
1 <J>82;
brenner 1966; CCJoper y col .1.979; Neu y Poralla .1.990, Nue y col •
.1.990; Ito e Inoue .1.982; Apostol, J • .1.991).
9.2 Extracción liquido-liquido con eter dietilico:
Los cultivos fueron filtrados con gasa con la finalidad de
crudo no emulsionado de la fase acuosa. De~; pué s; ~;;e
separó la fracción de crudo emulsionado mediante una filtración
a 1 v,::~c.ío.
Los filtrados fueron centrifugados a 9000 g por 20 minutos
para separar la células. LDs sobrenadantes se filtraron a través
de una membrana Millipor de 0.45 micras para descartar el
de células del sobrenadante.
Se colocaron 25 mililitros de sobrenadante en un embudo de
separación con 25 militros de éter dietilico y se hicieron tres
extracciones sucesivas con igual volumen del solvente. Se separO
la fase acuosa y se recuperó la fase orgánica en envases de
vidrio previamente pesados. Luego el solvente se evaporO con
calor y por diferencia con el peso del envase se determinO, a
temperatura ambiente, el peso (en gramos) de los biosurfactante
producidos por cada cultivo.
9.3 Extracción de los biosuractante por precipitación en frio:
A 5 mililitros del sobrenadante obtenido anteriormente se le
agregó igual cantidad de acetona, se homogeniz6 y se mantuvo a 4
Q.C c:lurr,:;¡ntc:::- 24 hrJrras. ~3f.:~ r-<2C:Uper-ó E~l pi'"E~cipitaclo de c:ac:l.::\ t.tne:\ dE?
las muestras mediante centrifugación a 6000 rpm
Le:'\l:.lofuqe I I) durante 15 minutos. Se descartó el sobrenadante y
los tubos se secaron y pesaron para determinar la cantidad de
biosurfac:tante producido.
Con 1 ¿,¡ 1.. '1 . 1 1 1 ··.:t.na ... :t.ce:¡c: C:Fi! resultados estadisticamente
\/á 1 .i. ciD!::., tDdas las medidas se realizarDn pDr triplicado . T<"'n to
los controles como los cultivos sin petrOleo fueron tratados de
iqual manera que las muestras anteriores.
10) CARACTERIZACION E IDENTIFICACION DE LAS CEPAS
AISLADAS :
Se siguieron los esquemas de indentific:ación propuestos por
57
Bailey y Scott en 1970, y los de identificación bacteriológica de
Bergey (1984).
Las primeras pruebas de caracterización fueron las
siguen tes:
a) Estudio de los cultivos en medios liquides (caldo
nutritivo). Se registraron las caracteristicas de crecimiento en
los tubos, formación de peliculas, producción de gas y formación
de precipitado.
b) Estudios de las colonias de las cepas en medios sólidos
de agar nutritivo. Se estudió la forma de las colonias, su
tamaho, consistencia, elevación, tipos de bordes, color, tipo de
superficie y producción de pigmentos.
e) Estudio de la forma de las células, su agrupación,
presencia de c~psulas, presencia de endosporas, movimiento y
coloración de Gram.
Las pruebas preliminares de identificación fueron las
siguientes~ Reducción de nitratos, oxidasa, catalasa, producción
de pigmentos y tipo de metabolismo para la dextrosa.
58
CAPiTUlO ffV RESUL !fADOS Y D#SCUS#ON
... . •
RESULTADOS Y DISCUSION.
1) CULTIVOS DE ENRIQUECIMIENTO:
Después de 30 dias de incubación algunos cultivos de
enriquecimiento, pertenecientes a las muestras formadas por los
suelos y crudos, presentaron crecimiento microbiano.
Este crecimiento fue registrado al comparar la turbidez de
las fases acuosas de las muestras con los controles y también
mediante observación al microscopio de luz.
Los cultivos de enriquecimiento de las muestras de suelos y
de hidrocarburos presentaron turbidez en la fase acuosa y tomaron
una coloración marrón clara. En los cultivos provenientes de las
muestras de arena y agua del Lago de Maracaibo no se registró
crecimiento microbiano (tabla 2).
Al observar al microscopio la fase acuosa de los cultivos no
filtrados se detectó la presencia de numerosos bacilos móviles y
de protozoarios del tipo Paramecium. En los cultivos inoculados
con las muestras filtradas solo se vieron los bacilos móviles.
Se observó que en los cultivos donde estaban presentes los
protozoarios, el número de bacilos tendia a disminuir con el
tiempo de cultivo, hasta llegar un momento en que predominaban
los protozoos. Los cultivos filtrados no presentaron este
problema y los bacilos llegaron a crecer normalmente.
60
TABLA 2. MUESTRAS RECOLECTADAS PARA REALIZAR LOS CULTIVOS DE ENRIQUECIMIENTO.
¡ ... ¡ i c:l¡r·o <:::c:t r" bu r"C:)S
DniGEN
¡ ... l.i. d r .. o e: a r· tJ u ,~os;. c:~?rc:,::~nos;
a los baJ.¿¡r·,c::inE~s
Su e:.:> J. e;.~:; c::er .. cano!::; a lo!:ñ bdJ.,:Ol.nc.i.nE•s
(]¡·-i.lJ.a clv.:?l l....aqo de l"'l<::lt-,::¡c::a.i. bo
Agua del Lago de 1"1<> r .. ,:;¡ca i bo
CULTIVO ( :ft- )
1 r·, •• , .1::.
::~:
7
Ct=.::Pt-iS f.·iiGLAD(..~G
¡v¡¡;;;:z ..... :;? .t.¡.D .. ·-.1
I"'IE:Z. ..... ~~;
Los balancines menc.i.cnaclos est~n situados en la costa oriental clel Lago de Maracai.bo entre las ciudades de Cabimas y Tia Juana. Las zonas muestreadas de la orilla clel lago est~n situadas en el sector La Rosa (Cabimas) frente a las torres ele perforación costa a fuf:?r"d.
El medio de sales minerales con petróleo como fuente de
carbono, ut1l1zado para los cultivos de enriquecimiento, permitió
el desarrollo de microorganismos. Pero los suelos y crudos
materia orgánica que permitió
desarrollo de los protozoarios.
Los medios salinos no fueron suplementados con vitaminas ni
con otros microelementos necesarios para el
microorganismos fastidiosos. Es por ello que se debió
producir un crecimiento selectivo de solo una porción del tot:.c:1l
de microorganismos presentes en los ambientes de donde se
tomaron las muestras.
Los:. c::ult . .:i.vo~:; Y"E'alizc:1c:lo~:; al pl'"inc:ipio a ~:::0 ~2C ccln .1.::'• 1.. c:lf.7~
crudo y en agitación, permitieron el crecimiento y dominio de una
bacteria filamentosa, probablemente pertenenciente a los géneros
Streptomyces o Nocardiay comunmente encontradas en ambientes con
hidrocarburos. Al variar las condiciones de los cultivos con 20 %
dE? p<-::~t.ról eo,
des,::\paF"!7?Ci f:?F"DI'l
móv.il<7:~s.
2) SELECCION
~:;7 Q.C y ~:;.:t.l'"r c:\!J.:Í.t:<::lc:ión !' la~1; bac::t!er-.:i.as f.i.l,;~ment.os;.:·~!::;
y los cultivos fueron dominados por bacilos muy
DE MICROORGANISMOS CON CAPACIDAD PARA CRECER
Y PRODUCIR BIDSURFACTANTES QUE EMULSIONAN EL PETROLEO EN MEDIOS
SALINOS:
Los cultivos obtenidos en este trabajo provienen de muestras
tome:\ das de diferentes reqiones. De estas muestras fuer .. on
las cepas capaces de crecer y E~mul~>ionaJ'"' el
petróleo pesado en los medios salinos.
tcJm,!:l.I'"Dn como criterios de selección la
crecer y la de prDducir biosurfactantes que permiten emulsionar
el crudD en los medios salinosa, ya que hemDs supuesto que estos
son los dos fenómenos producidos durante la biodegradación de
h.idl~ocal'"bur-os. Como se sehaló anteriormente, los microoganismos
biosurfactantes para facilitar la disponibilidad de
hidrocarburos mediante la formación de emulsiones que solubilizan
los diferentes sustratos en fases acuosas. Estos sustratos pueden
ser metabolizados directamente o ser degradados por exoenzimas
para facilitar su absorción por las células.
L.. os cultivos seleccionados provienen de las muestras de
crudos y suelos cercanos a los bal,::\ncin<;.?s.
presentaron gran t.ur-b.i.d~?Z <?.n El númE~I'"O df.'J
microorganismos al iniciarse la incubación fue del orden de 102
e· ., . .. ... . .. , .. •- '·¡ t"' ,- ·!- .. 11lJ 6 .. '1 e:· .,:. r,, cólula~.;; poi'" mil.ilitro de mc=~clin y ... ><"- J.I\C..I"emf:.dli .. C. le:\_,, .. <::i . a .. o .. ~ .... ••o
dias (figura 15).
ND se logró seleccionar cepas provenientes del cepario del
Laboratorio de Fermentaciones que pertenecian a géneros capaces
el ('.,> b i. cJ el !:'?!] ,, .. a el a ,, .. cruciDs. Esto fue debido a que al<]unas cepas no
crE?c.iei'"DI"l y 1 c:\s; quE~ 1 o h.:t.clel'-c:•n :• probablemente metabDlizarDn
algunos componestes del extractD de levadura. En todo caso no se
produjo ni emulsión ni sDlubilizac:ión del petróleo.
6:::::
FIGURA 15 " sel~eccion de microorganismos en medios : con petroleo a e 1 u 7 1 a 6 a 1 5 m 1
4 a
- 3 1 Q 2 g
a 1 n O --1------b a a 1!11
1 o
inicial (O dias) final (30 días)
Peri~os de cultivo ~
Muestras:
•• suelos ~crudos [<J arenas ~aguas
3) ESTUDIO DE LA VISCOSIDAD APARENTE DE LOS CRUDOS EMULSIONADOS
POR LA ACCION MICROBIANA:
Los resultados obtenidos en estas experiencias representan
la media de 5 medidas para cada muestra. Se encontró que las
emulsiones de crudo en agua formadas con los sobrenadantes de las
muestras de los cultivos con hidrocarburo tenian una viscosidad
aparente de 75.000 cps. Las emulsiones formadas con los
sobrenadantes de los cultivos mixtos de los suelos presentaron
una viscosidad aparente de 85.000 cps (tabla 3).
4) DETERMINACION DEL PORCENTAJE DE BIODEGRADACION:
Los resultados obtenidos de los cultivos con petróleo pesado
muestran que los porcentajes de biodegradación de crudo fue de
alrededor de 4.34 %.
Estos resultados indican que si bien las bacterias pueden
crecer y emulsionar el petróleo en medios salinos, con crudo como
fuente de energia, no poseen una capacidad elevada
biodegradar el hidrocarburo. los datos reportados
literatura son m~s elevados (Oduot y col, 1987; AJisebutu,
Dibble y Bartha 1976).
para
en la
1988;
Las técnicas utilizadas para determinar el porcentaje de
biodegradación no son muy precisas. De hecho se cometen errores
en la recuperación del crudo remanente y durante la determinación
65
TABLA 3. REPORTES DE LAS PRUEBAS DE VISCOSIDAD.
LECTURA DEL DIAL
(cultivos)
l 1 ~.:.:,
1''\ :l ~::\ .1::.
··:" .:1. "7 ._ .... ,.
CCJNTI::;:DL.. ··,·r¡ ... >.,::.
cps~ centipo.ises.
LAS MEDIDAS DE
( C .. !"l e::. O( j ("l'J ::;;; ·) . - ....... 'l· . (.,
7~5
]~j
El~:::~
.1.6(;~
las lectwras del dial se multiplican por el factor de corrección 5 * .:1.0~ (manual del equipo) para obtener los valores de viscosidades en centipo.ises. Todas las medidas fueron realizadas con el eje TE del viscosimetro Brookfield RVF a una temperatura de 30 Q C. Se tomó como tiempo para estabilizar la lectura 15 minutos. los cultivos 1 y 2 provienen de las muestras de crudo y el cultivo 3 de las muestras de suelo.
66
de los peses de los mismos. Es probable, asi, que la técnica
no sea la m~s adecuada para la
biodegradaci6n del petróleo por les cultives seleccionados.
En este sentido algunos autores han reportado que durante
los proceses de extracción del crudo residual de les medios de
cultive, pueden arrastrarse metabolitos y restos de células que
interferirian con las medidas de los pesos en los crudos
estudiados (Oudot y col, 1987).
5) ESTUDIO DE LAS FRACCIONES DE MALTENOS Y ASFALTENOS EN
PETROLEO SOMETIDO A TRATAMIENTO MICROBIOLOGICO:
De las 8 muestras estudiadas, para caracterizar el petróleo
que se utilizarla en este trabajo, se obtuvo un porcentaje
promedie de 19 % (+/- 0.5) de asfaltenos. Este porcentaje es
similar a los reportados por López y Pascuali (1988)~
contenido de asfaltenos para crudos pesados de diferentes pozos
de la región de Zuata, en la Faja Petrolifera del Orinocc, fue de
16 a 18.9 %, dependiendo de las caracteristicas propias d• cada
pozo o yacimiento.
Las técnicas utilizadas para determinar los porcentajes de
biodegradaci6n de los asfaltenos fueron las mismas que las
empleadas para derterminar la actividad en el crudo total.
El porcentaje de asfaltenos recuperados después de la
67
incubaci6n fue de 17.56 % para los cultivos provenientes de las
muestras con suelo y de 11.8 % para los provenientes de las
muestras con hidrocarburo. Comparandolos con la concentracitm
presente en el petróleo tipo Cerro Negro (19 %) esto representó
una disminución de asfaltenos de 7.6 y 38 respectivamente.
(figura 16). Los porcentajes sehalados anteriormente son el
promedio de 4 medidas para cada cultivo y en todo caso la
desviación estandard no superó el valor de 0.5.
La importancia de determinar la capacidad de los cultivos
para degradar asfaltenos, se debe a que esta fracción es la
responsable de las altas viscosidades que presentan los crudos
pesados V 1 extrapesados. alguna cepa microbiana pudiera
metabolizar estas estructuras se producirian crudos livianos a
partir del metabolismo de los pesados.
Los resultados provenientes de las pruebas de biodegradación
de los asfaltenos y los obtenidos para los cambios de viscosidad
en los crudos estudiados, no concuerdan con las explicaciones
teóricas anteriores.
El hecho de que estas cepas disminuyan la viscosidad de los
crudos en un 50 % no puede ser explicado 6nicamente por los
resultados de la disminución, por degradación, de la fraccion de
asfaltenos.
Lo que ocurre, probablemente, es lo siguiente: Las células
inician su crecimiento a expensas de un estimulante como el
68
e FIGURA 16. o n Degrt3.daciorl d~e asfaltenos. e
d 25 . ..---------··----------
'e
;a 20 S f 15 a 1
10 t . · .. ...... - ... _. ..... ...,: :=-=- ...
~e
n 5 iQ
S -·
o ·--r--
inicial (0 dlias) final (30 dia:s)
Periodos de incubacion.
cultivos:
- c~ontrol ~~ suelo.s I::::::J c¡·udo:s
extracto de levadura. Una vez ut1l1zado este sustrato desarrollan
su maquinaria enzim~tica para producir biosurfactantes con los
que solubiliza el petrOleo. Como consecuencia, pueden
metabolizar algunos componestes del crudo a un ritmo y en
cantidades que no pudimos registrar con las técnicas utilizadas
en el presente trabajo.
6) AISLAMIENTO, A PARTIR DE CULTIVOS MIXTOS, DE CEPAS
MICROBIANAS CON CAPACIDAD DE CRECER Y EMULSIONAR EL PETROLEO:
Mediante las técnicas utilizadas se pudieron aislar 3 cepas
bacterianas capaces de disminuir la viscosidad del petrbleo en
medios salinos.
Estas cepas muestran ser bacilos móviles gram negativos y se
designaron inicialmente como 0-1, MEZ-2, y MEZ-3. Todas
provienen de crudos y suelos de las áreas cercanas a los
balancines existentes en las regiones citadas en la metodologia.
Los estudios que siguieron fueron hechos con cada cepa en
particular y no con los cultivos mixtos utilizados en las pruebas
anteriores.
7)ESTUDID DE LAS CONDICIONES DE CULTIVO:
7.1 Temperatura.
70
Los resultados obtenidos indican que las cepas aisladas
pertenecen a organismos mesófilcs con capacidad para crecer muy
bif:n a ::::.7 .\1.c .. L.::\f:5 C::E?pa D·-1. y ¡vlEZ-···2 puc:liE'r-on Cl' .. ec::er- y p!' .. ocluc:il' ..
b.io!sur·f'r.\c::t.::~nte!5 qut.?. f?mul!:~ion;,:¡n el c::r·udo <.:•. 42 P.C:, mi<;;Jntl'-a!s qu<=.~ la
cepa MEZ-3 no creció a esa temperatura y mostró un óptimo a 30
Q.C.. 1'-.lin<;.IL.tn,:~ e:! E~ 1 ,:;,s; C::E·:~p<H:; i'w;;~ cc:!pc:1z dE2 cl' .. f::,>c:er- e:\ :52 9.C (tabla 4).
7.2 Salinidad:
Por- t.?.ncim.::1 dF:~l aumento de salinidad
negativamente en el crecimiento y en la formación de emulsiones
por parte dP los microorganismos estudiados. Las c:epas
capaces de crecer y emulsionar el petróleo hasta una salinidad
entre 3 y 6% (tabla 5).
7.3 Concentracibn de nitratos:
Se registró mayor crecimiento y capacidad para emulsionar el
petróleo a medida que aumentó la concentración de nitratos en el
Cuando las c::onc::entración llegó al 4 % la fase acuosa del
medio de cultivo se tornó más viscosa. Es;t:.cJ
probablemente, a una mayor producción c:le biosurfactante.
7.4 Aereacibn:
Se encontró que las cepas pueden emulsionar el c:rudo tanto
en medios aeróbicos como anaeróbicos. En este último caso,
siempre que se agregen nitratos al medio. Esto es debido a que el
7:1.
TABLA 4. CRECIMIENTO Y EMULSION A DIFERENTES TEMPERATURAS.
CEPAS MICROBIANAS.
.. , .. ,., rn ¡::) "'' ¡r· .. , t 1 ¡¡r· "'¡ \·:: . . 6 e:. <::\ .• •• e: e ...... e)
D ..... J ME:Z ..... :~;
e E e
.. ¡ ..
20 .. ¡ .. + .. ¡ .... ¡ .. + .. ¡ ..
.. ¡ .. ..¡.. .. , .. .. , .... , .. + ..¡ .. + .. ¡ .. .. ¡ .. + .. ¡ ..
::::;~7 ..¡.. .. ¡ .. ..¡.. +·+·+ ..¡ .... ¡ .... ¡ .. ·+·-1··+· + +
42 + .. , .. ..¡.. .. ¡ .. ..¡.. .. ¡ .... ¡ .... ¡ .. ++·+·+ .. ¡ .. ++ .. ¡ ..
r· Crecimiento microbiano. E~ Emulsibn del petrOleo en la fase acuosa. El número de cruces indican el grado relativo de emulsión y de e¡~¡:.;~ e: :i. m.i. 0:~n t. o.
TABLA 5= CRECIMIENTO Y EMULSION A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE CLORURO DE SODIO.
CONCENTRACIDN DE NaCl. ( ~~ )
k"l)
"":!" ····'
6
10
++
··1··+
··1··
CEPAS MICROBIANAS.
D-1
e E e
++ ++ ··1····1··
··1····1·· ++ +··1··
+ + +
E: Emulsión del petróleo en la fase acuosa. e: Crecimiento de las bacterias en la fase acuosa.
e
++ +··1··
+··1·· ··1····1··
+ +
nitrato actúa como aceptar final de electrones reallzando el
mismo papel que el oxigeno en condiciones aeróbicas.
7.5 Concentracibn de sustrato:
cepas estudiadas con
concentraciones crecientes de petróleo desde 5 hasta 50 %. Se
encontró que en los medios salinos con concentraciones del 50 %
d<,::~ c:r-udo las c:epas descritas anteriormente
emulsionarlo totalmente en la fase acuosa.
7.6 Actividad nitratoreductasa:
I....C:l t.::lbla 6. muestra los resultados de la
nitratoreductasa. Sello la cepa MEZ-3 fue capaz de reducir
nitratos hasta compuestos gaseosos del nitrógeno.
Las condiciones de cultive estudiadas anteriormente no
como t in,::\ lid<::lc:l J.(:)~;; df.?
biodegradación o de la producción de biosurfactantes.
razón se estudiaron pocas variables y con valores extremos. La
·finalidad P''-:J .. nc.ipal fue determinar si l<JS
probados pueden soportar algunas de 1 é:l ~;;; condiciones extremas
presentes en los reservorios de petróleo.
La cepa MEZ-3 presenta la ventaja de pod<O!I'" ,, •• f:-? d u e :.i. t-·
nitratos hasta compuestos gaseoso. De ser utilizada en
yacimientos aumentarla la presión y evitarla la acumulación del
74
TABLA 6. REDUCCION DEL NITRATO HASTA NITRITO O FORMAS DEL NITROGENO EN CULTIVOS ANAEROBICOS.
NITRATO A NITRITO
D-.1
1'1EZ--2
1''1E 1. ·····:~;
Se utilizó como medio de prueba de nitrato de potasio. La incubación se realizó a an .::tf:i)I'""CJI:J .i. ClS .i. S.
··1··
+
+
c:;::,Jclo
C' c:lur;::,n te:::,
GASEOSAS
+
nitrito como producto de la respiración. ~1 nitrito podria
convertise en un producto tOxico en los ambientes con espacios
confinados.
8) ESTUDIO DE LA PRODUCCION DE BIOSURFACTANTES EN LAS CEPAS
AISLADAS:
Los resultados indican que las cepas bacterianas D-1 y MEZ-
2 son las mejores productoras de biosurfactantes. Estas cepas
bajo condiciones no optimizadas produjeron un máximo de 10
miligramos de biosurfactantes por cada mililitro de medio
(figura 17).
Debido a que el petrOleo utilizado en el presente trabajo es
de tipo pesado, fue necesario corregir la producción de
biosurfactantes con un control formado por un cultivo no
inoculado. Se tienen, asi, en cuenta los surfactantes naturales
existentes en estos tipos de crudos. Como se seNalO en la
sección de quimica del petrOleo, estos crudos contienen grandes
cantidades de asfaltenos y ácidos nafténicos que podrian actuar
como surfactantes naturales.
Se encontró que tanto la cepa MEZ-2 como la D-1 son capaces
de producir biosurfactantes a partir de una fuente de carbono
diferente a los hidrocarburos. Este hecho permitió evaluar la
producci6n de biosurfactantes sin que las medidas sean afectadas
por la intervención de surfactantes existentes naturalmente en el
petr6leo.
76
S u r f a 12 IC t 10 a n t e
a 6
4
m ~~
~ o 1 m 1
o
FIGURA 17. Produccion de bi~o.surfa.ctantes por
dif1e1rentes microorgani~snnos
---+----+
1 2 T
3 4 !)
·riempo· (dias)
Cepas:
---4'-·-------~
6 7 8
-- D-1 --~ IVJEZ-2 ---41-- MEZ·-3 --Control
En un medio que contiene extracto de levadura y glicerol
estas cepas pueden producir hasta 8 miligramos de biosurfactante
por mililitro de medio (figura 18).
Se encontr6 que en presencia de petróleo la producción es
mayor. Este hecho puede tener una explicaci6n similar a la
reportada por Duvnjak y Kosaric (1985). Estos autores observaron
en Corynebacterium lepus. que la bacteria producia un
biosurfactante~ el ~cido corimicólico, en presencia de glucosa
pero esta producción se vió incrementada cuando se aNadia
hidrocarburos al medio.
Suponen que las bacterias producen biosurfactante hasta que
se satura las superficies de las células por no existir
hidrocarburos que desprendan continuamente estos metabolitos. Al
agregarle el petróleo ocurriria ese desprendimiento aumentando en
consecuencia la producción del biosurfactante en el medio.
9) CARACTERIZACIDN DE LAS CEPAS AISLADAS:
Los resultados de los estudios en los medios liquides y
sólidos se muestran en la tabla 7 • las cepas bacterianas
aisladas se caracterizaron por ser bacilos gram negativos, no
esporulados. Estos bacilos no formaron cápsulas y el tipo de
movimiento sugiere la presencia de flagelos polares. las células
aparecen generalmente aisladas o en pares.
Como se aprecia en la tabla 8. todas las cepas fueron
78
s.·-u~ r f a 10 ~e
t 8 a n 6 t
1e 4
m 2 g
o r 1 o m 1
FIGURA ~18. Prodllccion de biosur·factante.s en
cultivos sin pet:ro~eo
,>/'¿---------+-----+
,.,..;:;?' //
~· ,/
... 6'· .. • ... .~' A:.------*--------t:
~=='-==1-~~//~:_::/ _______ ,_-e.-------~-o r
1 2
¡·------~------~------T-----~
3 4 5
Tiempo (d ias)
Cepas:
6 7 8
--- D-1 -+- MEZ-2 ---*-- MEZ·-~3 ----- Control
TABLA 7. CARACTERISTICAS DE LOS CULTIVOS BACTERIANOS EN LIQUIDOS Y MEDIOS SOLIDOS.
F o f"rrli::\ e .i. ón el E~ Pf."~ 1 .i e: u 1 a •
Pr-oducción el<;? qas.
¡:::-DI'"tné:~c:.i.ón clf.?
p :l.qmc,~n t. os.
A(,JI'"Upac:ión dt:~
lar:; c:élule:'~"··
F o ¡·-m <::t el f.? 1 '"' s:. c:<!21 u 1 e::\ S.
Co 1 or-ación ele Gram.
C/.:1 p~:;u 1 as .•
Enclospot'"C:\S.
1'1ov :i. rn:i. f.?l"l t. o.
DlDir· de 1o~:s
cu 1 t.i \/()~.:;.
CEPAS MICROBIANAS.
D ..... l. 1"1EZ·····::~
.. ¡ .. +
.. ¡ .. +
bac.1.l o~; bac:i..lDS·
..¡ .. .. ¡ ..
\..l\/ 2l a
80
MEDIOS
t~l E Z ..... :::;;
..¡ ..
+
·+·
b,;:~ e :i. 1 or::,; 1<::\F"<JDS.;.
+
TABLA 8. PRUEBAS BIOQUIMICAS REALIZADAS PARA LA IDENTIFICACION DE LAS CEPAS BACTERIANAS.
1'1t-;:. t. i:':\1::¡ cll i sm o d e 1 a de:·: ti'"Cls.:;¡.
C!:-: id asa
CataJ.,:;¡sa
Pr .. oducción dE·~
p.i.Clc.i.an.i.na.
Pr·oducción c:IE~
piovc:.-?r·d in a.
F<es:;p.i.I'"<:!IC:i.ón c:le nitr·ato.
Desnitrifi.c:ac:i.ón.
Jvletr3bol.i.r.";mo f er .. mE?n t. a t.i. vo.
D·· .. ·l
o:·: .i. da t. .i. \/D
+
+·
.. , ..
+·
.. , ..
81
CEPAS MICROBIANAS.
I"IEZ·-.. 2
o:-:.i.dat.i.vo C:lN id,::\ ti VD
.. ¡ .. +
.. , .. .., ..
.. ¡ ..
+ ..¡ ..
.. , .. .., ..
.., ..
oxidasa y catalasa positivas y de metabolismo oxidativo para la
dextrosa en el medio cl~sico para la prueba de oxidación y
fermentación (O.F) de Hugh y Leifson. Como se indicó
anteriormente, todas presentaron capac1dad para reducir los
nitratos y la cepa MEZ-3 lo redujo hasta nitrógeno gaseoso.
De acuerdo con las claves de los manuales de identificación
bacteriológica estas cepas pueden ser ubicadas dentro del género
de las Pseudomonas. La cepa D-1 se caracterizó por producir dos
pigmentos difusibles en el medio de cultivo. Uno de color verde y
el otro fluorescente a la luz ultravioleta. El primero es
conocido como piocianina y ha sido ampliamente estudiado y
caracterizado en estos géneros de bacterias. El segundo se conoce
con el nombre de pioverdina o fluorescefna y fluoresce en
presencia de luz ultravioleta.
La cepa D-1 se caracterizó también por presentar un olor a
uvas en los medios de cultivos probados y sus colonias fueron
tipicas de las Pseudomonas. De acuedo con estas cracteristicas es
probable que esta cepa pertenezca a la especie Pseudomonas
aeruginosa.
La cepa MEZ-2 presentó muchas de las caracteriticas
observadas en la cepa anterior, pero no produjo igual cant1dad
piocianina en los medios de cultivo, aunque si produjo igual
cantidad de pioverdina. Su capacidad de moverse en medios acuosos
tampoco fue igual a la de la cepa probable de Pseudomonas
82
(0-1) por lo que el número de flagelos
esta última cepa debió ser diferente. La cepa MEZ-2 tampoco
presentO el olor caracteristico a uvas de la especie aeruqinosa.
Por·· lo planteado anteriormente se concluye que C(·::!p,::\ I"IEZ·····2
pertenece al género Pseudomonas, pero se necesitan realizar otras
series de pruebas para determinar la especie.
La cepa MEZ-3 no produjo piocianina y se diferenció de las
anteriores por ser capaz de producir nitrógeno gaseoso a partir
de los n.i t¡r·atos n Se pudo observar también que PI'""OciUCE!
piorverclina y muestra caracteristicas tipicas ele las Pseudomonas.
Se necesitan m~s pruebas para caracterizar la especie dentro de
es:;e <Jéner·o.
El crecimiento de las cepas se ve fuertemente influenciado
la temperatura. Es tipico de las Pseudomonas crecer en lo!..::;
rangos observados de temperatura. La proclucciOn de emulsión se ve
incrementada si los cultivos se hacen a temperaturas cercanas a
1 os 4-:;~ p_C. Esto es debido, probablemente, a que se encuentran a
temperatura óptima de crecimiento y hay mas producción de
biosurfactante o a que el petrOleo, a esa temperaturas, es menos
viscoso por lo que se facilita la formación de la emulsión.
La ~;a J. .in .i.dad afecta de dos maneras el crecimiento de
C:: E·~ p (o\ ~!5 • En primer lugar las Pseudomonas~ por lo general, no snn
halófilos estrictos. Por ello un aumento en la concentración de
~sa 1 inhib:i.r.'i.a el crecimiento de estns microorganismos. r~.::~:; t. o
traerla como consecuencia que se produjeran menns biosurfactantes
B:::;.
y por ende menor capacidad de emulsionar y solubilizar los crudos
en el medio.
la salinidad podria no ser factor En segundo lugar,
limitante directo del crecimiento. Pero al producirse el
biosurfactante, este perderla propiedades tensoactivas debido a
la presencia de iones salinos. Ello traerla como consecuencia que
no se produjera emulsión ni solubilización del petróleo (Shah, D.
O. 1981; Milton, J. R. 1978; Ajisebutu, O. S. 1988).
Las especies de Pseudomonas aisladas en el presente trabajo
pueden crecer y producir biosurfactantes en ausencia de oxigeno.
En este 61timo caso pueden utilizar los nitratos como aceptar
final de electrones para respirar. Esta caracteristica es de suma
importancia si se pretende que estos microorganismos actúen en
ambientes anaeróbicos como los reservorios de petróleo.
No resulta extraNo que se hayan encontrado especies de
Pseudomonas en ambientes con hidrocarburos ni tampoco el hecho de
que produzcan biosurfactantes. Estas bacterias poseen gran
capac1dad para asimilar varios tipos de hidrocaburos desde
saturados simples hasta poliaromáticos condensados (Bergey, 1984;
Austin, B. y col, 1977; Bartha, R. 1986; Connan, J. 1987; Evans,
W. C. 1977; Guerra Santos, L. H. y col 1986; Holloay, B. W. 1985;
Neu, R. T. y col 1990; Neu, R. T. y Poralla, K. 1990; Reiling, H.
y col. 1986; Shennan, J. y Vanee, I. 1987; Schwartz, R. D. y
Lethen, W. W. 1976).
84
La capacidad que tienen las Pseudomonas para asimilar una
serie muy amplia de sustratos, entre ellos hidrocarburos, está
relacionada con la presencia de plásmidos que codifican enzimas
para su metabolismo inicial. La asimilaci6n de los productos de
este metabolismo primario es llevada a cabo por enzimas
codificadas en genes cromosomales de la bacteria. (Holloway, B.
w. 1985).
El biosurfactante principal producido por las especies de
Pseudomonas es un lipopolisacárido denominado Ramanolfpido
(figura 19). Recientemente se report6 un nuevo biosurfactante a
partir de una especie de Pseudomonas. Este biosurfactante,
denominado Viscosina, fue considerado hace tiempo como un
antibi6tico y se caracteriza por ser el más poderoso tensoactivo
encontrado hasta el momento. La viscosina es capaz de disminuir
la tensi6n superficial del agua en 26.5 m N 1 m (Cooper, D. G.
y col 1981; Nue, R. T. y col 1990).
Por los expuesto anteriormente se puede concluir que las
especies de Pseudomonas aisladas en el presente trabajo
produjeron un biosurfactante que puede ser el Ramanolipido o la
Viscosina. Se necesitan de todas formas, posteriores trabajos para
caracterizarlo .
Se han reportado varias especies de Pseudomonas con
capacidad de degradar hidrocarburos poliaromáticos, por ejemplo~
fenantreno, antraceno, fluoreno etc. No seria extraNo que las
especies aisladas degradaran parte de las estructuras condensadas
85
F'lGUHA 19. ESTHUC'l'fJHi\ l)IJlHICA VEL RAMANOLIPIDO.
HO
o
HO OH
86
del petróleo utilizadas como sustrato en el presente trabajo.
Hace falta realizar las pruebas de biodegradación con otras
técnicas mas finas para determinar el tipo de estructuras,
presentes en el petróleo, que puedan ser metabolizadas.
El aislamiento de bacterias en pozos petroleros, con
capacidad para crecer y producir emulsiones de los crudos
pesados, confirma nuestra hipótesis inicial en el sentido de que
es posible conseguir microorganismos para ser utilizados en
procesos biotecnológicos de utilidad para la industria petrolera.
Para utilizar un microorganismo en los procesos de
recuperación mejorada es necesario vencer una serie de
dificultades, impuestas por las condiciones extremas para la vida
que se encuentran en los reservorios. Por esta razón las
bacterias aisladas en el presente trabajo deben ser objeto de
numerosos estudios y mejoramientos genéticas para aprovechar al
máximo todas sus cualidades y potencialidades.
La biodegradaci6n de cierta cantidad de la fracción de
asfaltenos del petróleo utilizado en el presente trabajo podria
producir una disminución de la viscosidad la cual no pudo ser
cuantificada en el presente trabajo.
Los microorganismos aislados pueden sere utilizados también
en los procesos de saneamiento ambiental, debido a que producen
biosurfactantes en cantidad suficiente para emulsionar los
hidrocarburos contaminantes de los suelos y aguas.
87
Esta producción de emulsiones facilita la asimilación de los
contaminantes por parte tanto de especies de Pseudomonas como
de la flora microbiana existente en los ambientes a ser tratados.
Lo d1cho anteriormente está basado en experiencias previas
en las que se han utilizado biosurfactantes para disminuir los
tiempos de adaptación de las comunidades bacterianas para
metabolizar los contaminantes (Bartha, P 1986; Oberbremer, R. y
col. 1990).
88
CAPffTUILO \ll CONJCLUSffONJES
CONCLUSIONES
1) Se logr6 aislar, a partir de las muestras tomadas de los
ambientes contaminados con hidrocarburos, microorganismos con
capacidad de crecer en medios de enriquecimiento con petróleo
pesado tipo Cerro Negro como única fuente de carbono.
2) Se logró seleccionar cultivos de microorganismos que
mostraban capacidad para producir emulsiones de petróleo pesado
en agua con una viscosidad aparente de 75.000 cps tanto en
condiciones aeróbicas como anaeróbicas.
3) Se caracterizaron e identificaron 3 cepas bacterianas
a part1r de los cultivos. Una cepa fue identificada como
Pseudomonas aeruginosa y las dos restantes como Pseudomonas spp.
4) Se determinó que estos microorganismos presentan
capacidad para metabolizar la fra~ci6n de asfaltenos presentes en
los crudos pesados. Esta caracteristica de los microorganismos
podria contribuir a la disminución de la viscosidad en los crudos
sometidos a biotratamiento.
5) Se estableció que durante la biodegradación
emulsionaba totalmente el crudo por la producción
biosurfactantes. Su producción contribuiria a disminuir
viscosidad aparente de los crudos emulsionados.
biosurfactantes fueron sintetizados utilizando petróleo
glicerol como fuente de carbono.
90
se
de
la
Los
o
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