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PRÁCTICA 1.Determinación De Proteínas Por Los Métodos De Lowry Y Bradford

OBJETIVOS.

y Conocer y comprender el principio y la metodología en la que se basan los métodos de determinación

proteína de Lowry y Bradford.

y Realizar un análisis estadístico básico y aplicar las pruebas: t de Student y F de Fisher; para determinar si exis

no diferencia significativa en la precisión y exactitud entre el método de Lowry y el método de Bradford.

y Determinar si sustancias no proteínicas producen una interferencia en la determinación de proteínas p

ambos métodos.

y Establecer ventajas y desventajas entre el método de Lowry y el método de Bradford.

DATOS EXPERIMENTALES E INFORME.

a) Método de Lowry

y Curva de Calibración.

Tabla 1.1 - Curva de calibración de hemoglobina.Método de Lowry

Tubo No.Cantidad deProteína (g)

A590

Serie a Serie b

1 25 0.051 0.050

2 50 0.124 0.102

3 75 0.156 0.162

4 100 0.197 0.187

5 125 0.236 0.259

y = 0.0019x + 0.0105

R² = 0.9779

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 20 40 60 80 100 120 140

A b s o r b a n c

i a ( 5 9 0 n m )

Cantidad de Proteína (g)

G1.1 - Curva de calibración de hemoglobina.

Método de Lowry



Fórmulas usadas:

×

×

À

De la ecuación obtenida, interpretamos al valor 0.0105 (ordenada al origen) como la absorbancia

nuestro blanco con una cantidad de proteína igual a 0g, al valor 0.0019 (valor de la pendiente) com

razón de cambio entre la cantidad de proteína y la absorbancia, es decir, el factor de calibración d

curva.

Así también podemos decir que la ecuación y = 0.0019x + 0.0105 cumple la Ley de Bouger y Beer

.d.c)1 en el intervalo [25, 125], teniendo un factor de calibración de la curva =526.32 que en siste

fotométricos estables permanece constante y permite realizar un cálculo sencillo para determina

concentración de la muestra multiplicando el factor de calibración () por la absorbancia (A)

y Análisis estadístico.

Tabla 1. 2 Réplicas para el Análisis Estadístico

Tubo No. A590Cantidad deProteína (g)

1 0.131 63.42

2 0.119 57.113 0.128 61.84

4 0.082 37.63

5 0.092 42.896 0.142 69.217 0.145 70.798 0.105 49.74

9 0.109 51.84

10 0.122 58.68 = 56.3

S= 10.83

CV= 19.23%

%Er = -24.91

S2= 117.28

L.C.M. = 7.7

La cantidad de la proteína se obtuvo de la ecuación de la curva de calibración:

Despejando x, se tiene:

Por ejemplo, para la absorbancia 0.131 se calcula:

1 Donde A = la absorbancia de la muestra, c = concentración, d = el espesor recorrido por la radiación y = el factor d

calibración.



y Interferencias en el desarrollo del método de Lowry

Tabla 1.3 Efecto de algunas sustancias no proteínicas en el Método de Lowry

TuboNo.

Sustancia A590Cantidad deProteína (g)

Tipo deInterferencia

Generada

1 TRIS 1M pH. 7.0 0.124 59.74 No Interferencia

2 Glicerol al 1% (v/v) 0.163 80.26 Positiva

3 Detergente comercial al 1% 0.157 77.11 Positiva

4 Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1.0% 0.141 68.68 Positiva

5 Ácido tricloro acético (TCA) al 5% 0.154 75.53 Positiva

L.C.I. = 48.6

L.C.S.= 64.1

El método de Lowry se da en condiciones alcalinas pues el Cu2+ se reduce a Cu+ formando complejos

los enlaces peptídicos, siendo sustancias acidulantes, quelantes o reductores de Cu+ algu

interferentes de este método. Por lo que de la Tabla 1.3 comparando los L.M.C. Inferior (L.C.

Superior (L.C.S.) con la cantidad de proteína se determina si la interferencia se debe a la sustan

siendo positiva si el valor es mayor al L.C.S. y negativa si es menor a L.C.I.

b) Método de Bradford.

y Curva de Calibración.

Tabla 1.4 Curva de calibración de hemoglobina.Método de Bradford

Tubo No.Cantidad deProteína (g)

A590

Serie a Serie b

1 25 0.167 0.22

2 50 0.33 0.35

3 75 0.345 0.37

4 100 0.375 0.381

5 125 0.383 0.405

y = 0.0018x + 0.2009

R² = 0.7153

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 20 40 60 80 100 120 140

A b s o r b a n c i a ( 5 9 0 n m )

Cantidad de Proteína (g)

Curva de calibración de

hemoglobina. Método de Bradford



Para Bradford se obtiene el valor de 0.2009 (ordenada al origen), el valor 0.0018 (pendiente), ademá

ecuación y = 0.0018x + 0.2009 cumple la Ley de Bouger y Beer en el intervalo [50, 125] y tiene un fac

de calibración de la curva =555.55.

y Análisis Estadístico.

Tabla 1. 5 Réplicas para el Análisis EstadísticoTubo No. A590

Cantidad deProteína (g)

1 0.319 65.612 0.277 42.28

3 0.342 78.39

4 0.329 71.175 0.289 48.94

6 0.329 71.17

7 0.293 51.17

8 0.319 65.619 0.308 59.50

10 0.321 66.72 = 62.1

S= 11.39

CV= 18.36%%Er = -17.26

S2= 129.78

L.C.M. = 8.1

y Interferencias en el desarrollo del método de Bradford

Tabla 1.6 Efecto de algunas sustancias no proteínicas en el Método de Bradford

TuboNo.

Sustancia A590Cantidad deProteína (g)

Tipo deInterferencia

Generada

1 TRIS 1M pH. 7.0 0.510 171.72 Positiva

2 Glicerol al 1% (v/v) 0.434 129.50 Positiva

3 Detergente comercial al 1% 0.524 179.50 Positiva

4 Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1.0% 0.354 85.06 Positiva

5 Ácido tricloro acético (TCA) al 5% 0.460 143.94 Positiva

L.C.I. = 53.9

L.C.S.= 70.2

Del método de Bradford se espera que carbohidratos, detergentes y álcalis interfieran en

determinación de proteínas, de los datos obtenidos y los L.M.C. se estableció que todas las sustan

son interferentes para Bradford.



c) Comparación de Bradford Vs Lowry de precisión y exactit ud.

Tabla 1.7 Comparación Bradford Vs Lowry

Tubo No.A590

DiBradford Lowry

1 0.319 0.131 0.188

2 0.277 0.119 0.1583 0.342 0.128 0.214

4 0.329 0.082 0.247

5 0.289 0.092 0.1976 0.329 0.142 0.187

7 0.293 0.145 0.148

8 0.319 0.105 0.214

9 0.308 0.109 0.19910 0.321 0.122 0.199

D= 0.20

SD= 0.03

t cal= 21.885

F cal= 1.11t tab= 2.262F tab= 4.03

Tabla 1.8 Prueba F y t de StudentValor Calculado Tablas Interpretación

F 1.11 < 4.03 N.D.S.

t 21.885 > 2.262El método de Lowry

es más inexacto

DISCUSIÓN.

El método de Lowry es un método para determinar la cantidad de proteínas por desarrollo de color a 590

relativamente simple, repetible y sensible (25-100g), sin embargo, toma más tiempo al tener que incubar en

ocasiones para que el reactivo desarrolle color. En éste método la curva de calibración siguió con más fidelidad la ley

Bouguer y Beer teniendo una R2 = 0.9779, en el análisis estadístico básico la media fue baja comparada con el v

esperado de 75g y finalmente en cuanto a las sustancias interferentes, el método de Lowry es poco selectivo puelas 5 sustancias interferentes, únicamente para TRIS 1M, pH 7.0 no provocó una interferencia; aunque esto puede

cuestionado debido a que los analistas que elaboraron las experiencias fueron diferentes, por lo que los L.C.M.

difícilmente aplicables para esta práctica.

En cuanto al método de Bradford, también es un método simple, repetible, sensible (1-15g) y además rápido

desarrollo de color es en la longitud de onda de 595nm. Su curva tipo presentó una zona no linean [25,50] y pres

una R2 = 0.7153, el análisis estadístico básico fue mejor desarrollado, sin embargo, las muestras de interferen

presentaron una cantidad muy elevada de proteína, dando interferencias positivas que bien podrían ser debido a

sustancias interferentes o más probablemente al analista que las realizó.



Comparando Bradford contra Lowry, tenemos que Bradford es más rápido y sensible, sin embargo presenta m

interferencia con las sustancias utilizadas por éste equipo, por lo que si se tuviera que escoger uno de éstos para rea

una determinación en la presencia de los interferentes usados Lowry sería el más indicado, a pesar de ser más tarda

así también Lowry presentó una linealidad más definida y próxima a la ecuación de Bouguer y Beer y una R2 mu

mejor y en el análisis estadístico básico nuestro analista es más exacto con Bradford que con Lowry, esto se demue

estadísticamente, pues entre ambos métodos no existe diferencia significativa en la precisión (Prueba F) pero si ex

en la inexactitud (Prueba t de Student) siendo Lowry el más inexacto.

La determinación de proteínas por medio de análisis fotométricos, son métodos destructivos, pues las muestras una

desarrollado el color no pueden ser usadas nuevamente, sin embargo, son las pruebas más sensibles para éste objet

algunos métodos son, en orden descendente de sensibilidad: Ácido Bicinconínico, Bradford, Lowry y Biu

Los métodos fotométricos siguen la ley de Bouguer y Beer, por lo que es fácil determinar su factor de calibración d

curva, y debido a su comportamiento lineal y la relación pareada de las muestras es de fácil análisis estadístico.

CONCLUSIONES.

y Los métodos de determinación de proteína de Lowry y Bradford son métodos fotométricos, que obedecen la

de Bouguer y Beer, en ambos casos los reactivos provocaron un desarrollo de color debido a comple

formados con las proteínas, la característica medida fue la absorbancia utilizando un espectrofotómetr590nm (Lowry) y 595nm (Bradford) al 100% de transmitancia, a través de la cual se pudo realizar la curva

calibración para la cuantificación de proteínas.

y Para ambos métodos se realizó un análisis estadístico básico, obteniendo su media (x), desviación estándar

coeficiente de variación (C.V.), porcentaje de error (%Er), varianza (S2) y el límite de confianza media (L.C.

con éstas herramientas estadísticas y al realizar las pruebas F y t de Student determinamos que ambos méto

fueron igual de precisos, sin embargo, el método de Bradford fue más exacto.

y Tanto Lowry como Bradford presentaron interferencia debido a sustancias no proteínicas, sin embargo,

obtenidas en ésta práctica no son las esperadas, esto es probablemente al diferente trabajo realizado e

analistas.

y El método de Bradford estadísticamente es mejor, debido a que ambos son igual de precisos y sensibles, p

Bradfoº1d es más exacto

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