• Crilerio de separación: T ,os coeficientes de variación de la resolución dan la

posibiliclad de ordellar los cquipos desde d más eslahle hasla el de menor estahilidad, así: '

HP-1050, HP-1090 757AO, HP-I090 DAD, KNK-WATERS, PE-Le75,

KNK-757AD, PE-757A\).

Ya para finalizar lo que hace relación a la comparación de eql\ipos, se pllede conclllir

qlle en cllanto a los deleclores se refiere se pnede establecer una clasificación en télminos de

Sil sensibilidad, así:

E L \Vaters 440 ( de A fija) ~'S más sensible 'lile el 757 AD (de A variable). El 757 AD (A variable) es más sensible qlIe el DAD (matriz de diodos). EI757,\D (A variable) es más sensible qne el LC-75 (A variable). Esto puede sen1l1

indicio del lIlaI eslado de la úpl ica y/o de la lámpara d(:1 dekdor J.C -7) .

r,a tabla reSllIlIen conliclIe también valores de reprodncibilidad para los solutos de la

mezcla de pmeba, oblellidos en el crcllnalógrafo Iíqllidu 1I1'-1050; eslosval )rcs resn\t;m de

aplicar la mezcla de prueba en jomadas de trabajo diferentes y calcnlar los coeficientes de

variaciún para los parálIlclros de lodos los picus. Se nota qlle e l Antraceno es eL sollllo quc

presenta valores mayores de coeficientes de variación y que, a Sil vez, la altura y el área de

pico son los parámetros que mH~stran nna mayor variación, como se ohserva también en las

cartas de control ya comentadas.

2,(" Dis~ño f¡e1 t~s( ¡Hira cnlumllas de ITl'LC ( fase in"ersa),

El objetivo principal es discllar \In test para evaluar colmnnas de TIPLe de fase inversa,

COH Hila solución q\le cllntenga sollllos neutros, ácidos y h;\sicos, y 'lile perrnita dasifil:ar y

comparar I;L<;¡ cohmlIl<ls y adermis hacerle 111\ segnimiento a cada collllllna durante s\l vida útil;

cabe <tI1ad ir tambil:ll lI"e dicho lest dd)(~ proporcionar illfonnación para ayudar a decidir qlle

tipo de colum1Ia es 1l1<lS conveniente para dl'1enninados análisis. ESlo lleva a la nec.esidad de

fijar linos parámctros qlle plled;U\ ser reproducidos de forma precisa.

37

I ,(¡ primero, por lo tauto, es dt:.krminar los so lutos que ccmfollllan d test; se parte de la

base dc que la rnezc.!a de PllIcba dC'be contener liBa sustancia como marcador de tiempo

rr1l1c110 (lo) Y sollltos de carácter neutro, ácido y básico, y que posean también características

estlll(~t\J1'al('s q\le p()sibilitcn S\I detección por IN,

En consecllencia, se decide, después de probar con vanos compuestos, que el test

quede estlllc11Iraclo así:

Marcador de t o: Acetona = 10,00 mi

Nelltro: Ftalato de dimetilo = 0,50 mi

Ácido débil: ¡J-Nanol = 300 rng Hasl': o:-Naftilamill<\ 150 mg

Estas cantidades se disuelven en 1no mi ele Acetonitrilo (solución madre PI),

En ocasIOnes es conveniente preparar una solución madre alternativa para aquellas

columnas que presentan solapallliento de picos cuando se aplica una dilución de PI; esta otra

solución madre contiene sólo d sol\110 marcador del tiempo mue110 y el compuesto básico, es

decir:

Acetona: 10,00 m1

o:-Naftilamina: 150 mg

tamhiélnlislleltos en 100 mi de Acetonitrilo (solución madre P'I),

A pal1 ir de las dos solllciolles anteriores se prepara el palTún de Pllleha que se inyecta

eH la colllmna; para ello se prl)c('(k~ así:

1',,\: \ 0,00 1111 de l' 1 disIH:llos en lOO mi de IIIl'zcla ('Il -,eN:1 1, (40:60 v/v),

P\I: 10,00 mi de (>\ dislle!tos en lOO mi de lIlez.c1a CHjCN:l'alllpón Fosfato (40:60

V/V),

1",,: lO/lO IJII de 1"1 dislldlos eH IOOml de mezcla CH3CN:Il/) (40:60 v/v).

[>'13: 10,()() mi de VI dislldtos ell 100 mI de m ezcla CH3CN:Tampón Fosfato (40:óO

v/v),

Como se menciona antes . el test queda fOlmado por sustancias orgánicas detectables

por (TV y con IIHas cOllccntraállles que asegman que se está trahajando en ]a región \in >al

de la ley de Beer.

Sc detenniua además , qllc las condiciones cromatográficas a las cuales se aplica el test

semI las siguientes:

-Las aplicaciones Sl' realizall en el crornalógrafo líquido IU>-1050; las razones para

usar este eqllipe. son las mislllas que ~e cxpllslcron al aplicar el test de equipos.

- Se trahaja con ,1111 bucle de inyección de 20 .aL para garantizar buena eficacia cromatográlica y se inyecta con jerillga de vidrio para HPLC de lOO .aL.

- Se detectan los picos a lllla A de 254 nm.

- La temperatura de colllmna es de 35°C para evitar las oscilaciones propias de la

temperatllra ambiente.

- Se IIsan dos fases móviles que son las siglliellles:

fase móvil 1: Acetonitrilo:Aglla (40:60 v/v).

Fase llIúvil 2: l\n.'I()lIilrilo :TalllpúlI rosfato (40:(iO v/v).

r ',llampÓII I:osfalo L'S O,02'i M ('11 K[[ l PO .1 Yo,mo M en Trielilarnina, es decir, que

Si.' ¡k'Sall :\ J :lOIII.t! dl' I;llsfalo 1111l110POI;)sico y ]4')0 IIIg de Trietilalllilla, se llevan a 1,0 lilro

COI1 :l¡1l1a 'MilliQ y se ajllsla d pll a J ,OO con ácido Fosfúrico (85%. <:'11 peso). Esta fase móvil

puede ~lIardars(' í..'1I né'Vi:ra. P(:1'1l (k'he tiltrarsL' siempre anlL's dI,;' Sil liS\) eDil filtj'() (/e O,-t'. J.1111 .

El Ac.etonitrilo es grado tII)Le y el agua es de calidad MilliQ (cambiada cada día), y

tanto ellos dos como el tampón Fosfato deben estar desgasificados.

• El flujo de la fase móvil es de 1,00 ml/min.

• La presión a estas condiciones depende de la columna que se está examinando.

• El sistema de tratamiento de datos que se utiliza para procesar los datos

cromatográficos es el Gynkosoft, ya descrito en la sección 2.1.

En la figma G se observa el perfil tanto del cromatograma correspondiente al test con

la fase móvil 1, COl1l0 el que corresponde al test aplicado en la fase móvil 2, ambos con la

colunma Lichrospher.

2.7. Aplicación del Cest de columnas de HPLC de fase inversa.

Lo que se persIgue aquí es aplicar el test de colmnllas a uIIa amplia diversidad de

columnas de la sección de cromatografia del IQS (como se describe en el anexo n03), con el

objetivo de caracterizar su estado actual; . como ya se dijo, el test permite caracterizar,

clasificar y comparar columnas, hacer un seguinliento de la vida útil de las mismas y decidir

sobre la conveniencia o no de usar una columna para un ensayo detelminado. A efectos de

lograr lo anterior, es necesario obtener valores de variables que permitan determinar en que

estado se hallan las colunillas; de esas variables, se incluyen en este trabajo el tiempo de

retención de los solutos (t R ), la ,U1chura de pico a la mitad de la altura (w In ), el número de

platos teóricos (N) por columna y por metro, la asÍ!ndría de pico (s), el factor de capacidad

(k'), la selectividad (a), y la altllra de plato reducida (h).

Para obtener eslos dal.:}s, eS necesario hacer dos inyecciones replicadas en cada

collffiilla de la mezcla de prueba PA en la fase móvil 1; en el caso de que haya solapamiento

de picos en la inyecciones an1eriores, clllonces se precisa efechlar dos lluevas inyecciones del

patrúlI de prueba P',\ (y rase múvil 1).

40

I

400 mV . AD-5

254 nm

300 , .

I

200 I

I I

100

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O 0.0 1. O 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0

FIGURA G: (a). Cromatograma del test de columnas en la fase móvil 1: CH3CN:~O

y columna Licbruspher.

..450

400

300

200

100

O 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0

mV

/'>. \j

I

AD-5 254 nm

\j ~ min

FIGURA G: (b). CroIDatograrna del test de columnas en la fase móvil 2:

CH3CN:Tampón Fosfato y columna Lichrospber.

Si se dct.ecta una cola por adsorción demasiado pronunciada para el pico de la ,unina,

entonces se hace indispensable camhiar el agua de la fase móvil por el t,uupón Fosfato y

realizar dos nuevas inyecciones replicadas del patrón de pnteba P n; para aquellas coltmmas

que muestren solapamiento de picos en este caso, se procede nuevamente a inyectar dos

veces e! patrón de pnteba P'B (con e! tampón Fosfato en la fase móvil),

El infonne incluye el perfil del cromatograma y valores para t R' k', W 112' N, s, y a

partir de ellos se calculan o: y h.

El factor de capacidad (k') es una medida de que tanto se retiene la molécula de

muestra en la columna durante lUla separación isocrática, y es función de la naturaleza de!

material de relleno de la colunma; k' debe tener 1m valor entre 1,0 Y 5,0 para alcanzar 1m

compromiso razonable entre retención y tiempo reqllerido para el análisis.

Los valores de asimetría de piCO deben estar entre 1,0 y 1,2 para solutos que se

comportan adecuadamente; valores mayores conducen a resultados cuantitativos inexactos.

La selectividad ( 0:) es HIla medida de la retención relativa de dos componentes en una

mezcla; la selectividad de la columna es función del relleno de la colunllla y de las

condiciones de elllción; para que ocurra una separación, a debe ser mayor que la lUlidad;

sin elllhargo, valores mayores que :2 dan tiempos de análisis que son demasiado largos para

usos prácticos.

La altura de plato reducida (h) se expresa corno h = H/d p Y para una buena columna h

debe estar en el rango de 2-10.

La tabla IV muesh'a las columnas examinadas en el presente trahajo, junto con SIlS

características más determinantes,

41

Tahla IV: CllhlllllUlS IIIrLC d~ ras~ ill\'crsn.

~OLU1\-tNA

lJltrabast: 125

~jchrospher

RP-Select B

Dim('nsi(m (mm)

150 x 4.6

125x·'¡'.O

125 x 4.0

Tam. Pu."t. (um)

5

5

5

% Carbono

16,2

21,5

12

Desactivación

SI

SI ,

Spherisorb .4

lKromasil

Novapak

AccQ.Tag

Sphet1s0rb .39

ISO x 4.0

150 x 4.0

150x.1 .9

150x1.9

150x3.9

5

5

4

4

5

12

19

7

12

SI

SI

SI

Todas las columnas de la tabla IV utilizan rellenos esféricos de Silica modificada con

grupos Octadecilo (RP-l R) con excepción de la columna Select B que está moditicada con

grupos Octilo (RP-8).

2.M. Resultados y cliscusiún dl'l t~st de columnas.

A las columnas listadas en la tabla IV se les aplica, en primer lugar el test de

verilicaeión de equipos y, en segundo lugar, el test para columnas de fase inversa. Los

resultados obtenidos al aplicar el test de equipos a estas cohurmas pemliten clasificarlas

fundamentalmente desde el punto de vista de sus características de retención separación y

eticacia, teniendo en cuenta que diclto test está formado por solutos neutros no polares; las

características mencionadas están relacionadas básicamente con la longitud de la colunma, el

talll:ul0 de partícula del relleno y el porcentaje de ~~u'hollo del relleno.

42

]'.11 las gr:ilicas 11" 117 a 11" 1)0 (figma 11), se r~pn:sclllall algllnos rl.~sl\lladús obtenidos

al aplicar la mezcla dc pl1leba del test de verificaciólI de eqllipos a las COhUl\11aS de la labia

IV ~ollsid('radas todas como dl: fase ¡"versa; estos resllltados corrcspl)ndcn a las variables de

ticmp) de rttellciún del Antracellu. lIúmero de platos/metro para el Antra.l:eno, resulución

entre Fcnantnmo y AlltracellO y altura de plato reducida para el Antraceno. Las columnas

examinadas se compcII1all de manera diferente: En Cllanto a la resolución, hay colllIfLnas qlle

no alcanzan a separar el último par de picos dd test (Selecl D, Novapak y Spherisorb .39) y,

de otro lado, la columna lJ Itrabase-125 tiene ulla mlly buena resolución, pero tiempos de

retención IIl1ly largos (9.1X mili para el Antraceno, rnielltras la Lichrospher tiene 5.66 mm

COII \lila hucna resolución); la colmnna AccQ.lag es quizás la mejor columna para aplicar el

test debido a que con un tiempo de retención cOl10 para el último pico (4.38 min) posee una

hllcna resolución para el último par de picos (1. 71) Y cllenta con una alta eficacia (636RO

platos/metro para el Antraceno).

A partir de los valores de h, obtenidos con la aplicación de la mezcla de pmeba dd test

de verificación de equipos, se puede estahlecer lUla clasificación de las cohmmas (gráfica n°

130) debido a que este parámetro es independiente de la longitud de la cohlIlUla y del tamaño

de partícula del relleno de la columna, q\le son alglllla~ de las variables que más diferencian a

las columnas de HPLC fase inversa.

EH la gráfica meIlcionacla, se obs ~rva que lus valores de h para todas las C'olmnnas

están entre]. y 1n, a excepción de la ('olulllna Núvapak (,\Iyo valor exageradamente alto de h

concuerda con las allth:edentes de esta columna; para el estudio siguiente del test de

whmmas, se reemplaza esta cI)lumoa Novapak 1 por una nueva del mismo relleno, la

. Novapak 2.

43

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Por otra palie, al aplicar a estas mismas coluumas el test diseñado para colmIlnas de

fase inversa, se obtienen los resultados que se discuten a continuación. La discusión se

limita al so luto con carácter básico «('(- Naflilamina) del test debido a que es el compuesto

más activo de la mezcla en las C(llldiciolles de aplicación de la misma, y por ello presenta

l\Iayores inconveniellll's 'lile el soluto lIeutro (Halato de dimetilo) que interactúa con el

relleno de la colmllna sin presentar fencnneIlos de adsorcit'll1, y qlte el compuesto ácido (f3

-Nano\) que por sus caracteristicas de ácido débil 110 está disociado a las condiciones de pI I

de aplicación del test.

Los resultados de la aplicación del test de columnas se consignan en la figura 1

(gráficas n') lJI a n° 04) y en la figura J (gráficas nOOS a n0138).

Inicialmente se representan los factores de capacidad (gráficas n° 131 y n0132)

obtenidos para la amina en todas las columnas probadas. Primero (nOI31) en la fase móvil 1

(CH/:N :II l )) que nlllestra valoJ"l:s para k' demasiado altos pm·a las columnas Spherisorb .4

y Spherisorb .39, probablemente debidos a fenómenos de adsorción. En la otra gráfica

(n° 13 2) se ven los valores de k' que se obt ienen al aplicar el test a las colwIlI1as en la fase

móvil 2 (CH/::N:Tampón Fosfato); es de Jlotm· que las columnas tienen valores más

parecidos de k', lo que indica que con esta fase móvil se equiparan los mecanismos de

retención para la amina en todas las cohmmas. Tarnbién se podria anotm· que el valor de k'

para la amina en la columna TJ Itrabasc con la fase móvil 2 es ligeramente superior al resto de

las colmnnas en esta misma fase móvil; es decir, que hasta ahora se puede deducir que esta

cohmma es la que da rnejores resllltados con la desventaja de que tiene tiempos de retención

un poco lm·gas pm·a estos solutns.

A contillllaciólI ~e presentan los resultados que están relacionados con el hecho de qlle

la mnina se adsorba en PllTltos activos de los rell ':l1os de al 'Ullas columnas; aqui se observa

qlle algunas columllas que CSI;111 especi.alrnentc preparadas para este tipo de solutos, se

comportan bien CDn esta lllezcla de prueba como es el caso de las columnas Ultrabase y

Kromasil que ftmciollan biell con una fase rnóvil de Acelonitrilo-A )lIa.

44

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8

En las gráficas 11°133 y n"134 están representadas las asimetrías de pico de la amina

para todas las columnas exanlÍnadas. Primero (nOI33) en la fase móvil l (CH/_~N:HP)

donde se ve que en todas las co!tIIIIII:lS l~sle sohtto presenta colas con es la fase móvil, excepto

con la Ullrabase y la Kromasil; hay que notar además, que este pico aparece con una cola

muy pronunciada en las dos columnas Spherisorb probadas. En la gráfica n0134, se puede

observar que todas las collll11nas preSelll¡m valores de asimetría de pico aceptables para el

pico de la amina, a excepción de las dos columnas Spherisorb, en las cuales este pico sigue

con algo de cola, a pesar de que esta vez se usa la fase móvil 2 (CHFN:Tampón Fosfato);

de nuevo es la colmllna Ultrabase la qlle da mejores resul1ados.

En las gráficas 11°135 y In36 se representa la eficacia de las cohm1Jlas expresada como

número ele platos/ml'lro para el solllto básico del test (n:-NaHilamina). En la primera de ellas

(n0135) aparecen las eficacias resultantes de aplicar el test en la fase móvil 1 (CH3CN:HP) y

COIIIO se puede ver, existen dikrcncÍas significativas entre las coltinmas: Tres de ellas

cuentan con eficacias inadecuadas (Spherisorb .39, Spherisorb .4, y AccQ.Tag), mientras que

tres poseen eficacias aceptables y equivalentes (Novapak, Kromasil, y RP-Select B) y con

mucho, la de mayor eficacia es la Ultra base, quedando la Lichrospher con una valor regular.

En la otra gráfica (n013ó) se observan las eficacias que se obtieuen cuando se aplica el test en

la fase móvil 2 (CH¡CN:Tampón fosfato) y se nota un aumento en su valor para todas, las

cohnlUlas hasta el pUJlto de lIue (siete) 7 de ellas tienen ya eticacias casi equivalentes y

accptnbles, mientras que sigue siendo la Ultrabase la que posee un resultado más alto.

Finabnente, las gráficas It 137 Y n° 138 muestran los valores de h para las collmmas

examinadas, cuando se aplica el test para columnas de fase inversa. Inicialmente en la fase

móvil 1 (n° 1:\ 7) se ohservan valores demasiado altos de h para todas las cohmmas COIl

excepción de las columnas lJHrabase, RP-SeleclB, K.J·olllasil y Novapak. Al pasar a la bse

múvil 2, todas las cohunnas Gxperimentan \lna mejoría d¡mdo valores de h entre 2,5 y 7,0

(que son valores dentro del rango considerado como aceptable para la altura de plat r)

reducida); nlIevamellte, la columna l.lltrabase es la que da los mejores resultados.

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Es posible entonces cOIK'hlir en este momento que al pasar de la fase móvil 1, donde la

amilla se adsorbe porque interactúa con los Sihmul ácidos libres de los rellenos de las

collUllnas (mostrando cola de pico), a la tase móvil 1, donde la amina se protona y además la

Trietilamina compite con elJa por los pUlItoS activos del relleno, se pone de manifiesto lIna

pérdida de la cola del pico y un aumento considerable de la eficacia de la columna, que trae

como resultado \lna notable mejoría en los valores de h.

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L.as conclusiones qlle se derivan de este trahajo son las siguientes:

l. Se diseñó un test de verificación de equipos de HPLC; este diseño incluye la

preparación de la mczcla dc pnleha, la sc.-l('(·ciún de las condiciones crnmatográficas para la

aplicnción de la misma, la e1ecciólI de las variables de pico más importantes para evaluar, y

finalmente, la selcl·.ción del sistema de tratamiento de los datos cromatográficos.

2. Se hizo un estudio de la sensibilidad del test de verificación; este estudio de

sensibilidad consiste en observar las variaciones que experimentan algunas v,-uiables de pico

ante pequeños L:ambios <.'11 las ('olldicio\1es crornatográficas de aplic~\ción del test. Entre las

variahles de pico evaluadas se ellClll'lllran el tiempo ele retención, el área y la altura de pico,

la efil;acia y la resoluciún. Las c\)lIdicinn(~s lTomatográficas en las cuales se introdujeron

cambios SOIl la composición de la fase 11Iúvil, el /lujo de la fase m{)vit. la temperatma de la

columna, el volurnell de inyección y la longitud ele onda de detección de los picos.

3. A partir del esftldio allterior se desprende que la variable cualitativa (t R) se ve muy

afec.tada por los camhios CH la composición de la fase móvil, mientras que en lo referente a

las variables cu<1\1titativas se puede <lec.ir quc el án:a de pico es muy estable y la altura tk~

pic(J varía notablemente cuando cambia la composidóll de la fase móvil. De otro lado, en

cuanto a las variables de separación, eficacia y resolución, están amhas muy U1fluicLas (como

es obvio) por los cambios en el volllmen de inyección; además, la resolución varía mucho

cllando camhia la composición de la Jase móvil. Finalmente, los cambios en la longirud de

fl\l!la de detección de los picos afedall indistintarllente a los sollltos del test, siendo el

Antracl'I10 el Slllllto más afectado.

4. Se aplicó el lesl de v,:~rificacióll a siele (7) configuraciones de cromatógrafos de­

f-1 PLC de la sección de cromatllgralla del IQS; estas ci'lnfiguraciones resultan de combinar

cllafro sistemas de bombas distilltllS y cinco detectores LN diferentes.

5. Las distilltas aplil~aciones permitieroll dcteclar algllllils problemas en h)s equipos

evalllados, corno por ejemplo, haja eficacia en lino de ellos (algo inesperado) , demasiado

llIido e inestabilidad qll tilIa de las hO\llbas, el deterioro de la óptica de lino de los detectores

(CSlos doS últimos casos ya l'()IIOl~idos de anlentano) y la recllperación de uu delector que

estaba sin IItilizar.

(l. Por otra parte, los resultados del test pemlitclI dasificar a los dekctores de mayor a

menor sensibilidad, de la siguiellle rnalll'ra:

Waters 440; Af3 757 AD; I040 A DAD.

7. Se diseJlo IIn tesl para columnas de HPL< (fase inversa); el disei'ío incluye la

preparación de la mezcla de pJ1\cba que comprende sotlltoS neutros , ácidos y básicos, la

sl'1ecciúlI de las cOlldiciolles lTolllat0¡2r;'tIicas para la aplic;lciólI de diclla mezcla y la elección

de las variables de pit o 111;'¡S illlptll1anlcs qlle se deben medir; se decidió que el sistema de

tratamiento de datos fuer;, el lIIislllO que se IlSÓ e ll la aplicación del test de verificación de

iust n tn Il'l IIClS.

8. Se aplicó e.1 test (k cohllllTlas a ocho (R) columnas diferentes de la sección de

('J'omatografia del 1QS. l,as lifercncias en las columnas rati icall flllldarnentalmellte en el

porcentaje de Carbono de su relleno y en el llecho de que algunas cohunnas están

especialmente discí'iadas para trabajar COH sollltos básicos. De otro lado, las columnas

evaluadas son muy semejantes en cuanto a SIIS dimensiones y al tarnañ de pal1ícula.

c). l ,os factores de <.:apa(~ idad, k', para el sollllo básico del test (n-Naftilamina), v<.uían

según el tipo de coltlllllla, desde valores pequeí'ios para el caso de la colllmna Se\ect B (que

es ulla C-8 a difi.::I\'l\cia del resto que S01l C-18) hasta valores altos paJa las columnas

Spherisorh, ell las que además de1mecanisll1o de pm1ición, se dan fe"ómenos de adsorción.

10. El estudio dl: la asillletría de pICO pcnllile l:oniprohar que columnas (como la

Kromasil y la lJltTabase) qlle esr:ín disc¡"ladas para trahajar con sollltos básicos, se comportan

adecuadamente sin necesidad de lItili";lr r,l<;CS móviles modiricadas. Sin embargo, la adición

de Trietilamina al elu~'ente, da la posihilidad de. que el resto de columnas examinadas

también produzcan picos cromatográficos sin cola.