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Carbamato de Etilo en vinos.Carbamato de Etilo en vinos.

Su determinacinSu determinacinSu determinacin Su determinacin y exigencias internacionalesy exigencias internacionales

Instituto Nacional de VitiviniculturaInstituto Nacional de Vitivinicultura

CARBAMATO DE ETILOCARBAMATO DE ETILOCARBAMATO DE ETILOCARBAMATO DE ETILO

NombresNombres EtiluretanoEtiluretano

EtilcarbamatoEtilcarbamato

UretanoUretano (CE)(CE)

FrmulaFrmula molecularmolecular CC33HH77NONO22

MasaMasa molecularmolecular 8989,,0909 g/molg/molMasaMasa molecularmolecular 8989,,0909 g/molg/mol

AparienciaApariencia slidoslido incoloroincoloro

NmeroNmero CASCAS [[5151 7979 66]]NmeroNmero CASCAS [[5151--7979--66]]

Qu es el Carbamato de Etilo?Qu es el Carbamato de Etilo?El carbamato de etilo se forma normalmente durante el proceso de El carbamato de etilo se forma normalmente durante el proceso de

fermentacinfermentacin aparece nat ralmente en alg nos alimentos como elaparece nat ralmente en alg nos alimentos como elfermentacin, fermentacin, aparece naturalmente en algunos alimentos como el aparece naturalmente en algunos alimentos como el

pan, bebidas fermentadas y licores destiladospan, bebidas fermentadas y licores destilados..

Es una sustancia considerada por el Organizacin Mundial de la Salud Es una sustancia considerada por el Organizacin Mundial de la Salud como agente cancergeno y genotxico.como agente cancergeno y genotxico.g g y gg g y g

Se han establecido lmites de concentracin del carbamato de etilo en Se han establecido lmites de concentracin del carbamato de etilo en b bid l hlib bid l hlibebidas alcohlicas. bebidas alcohlicas.

Canad, EEUU y la UE han establecido lmites legales.Canad, EEUU y la UE han establecido lmites legales.Canad, EEUU y la UE han establecido lmites legales. Canad, EEUU y la UE han establecido lmites legales.

Qu es el Carbamato de Etilo?Qu es el Carbamato de Etilo?

ndice DL50 en el conejo de 2 g/Kg.ndice DL50 en el conejo de 2 g/Kg.

En ratones ha demostrado capacidad de inducir la aparicin de En ratones ha demostrado capacidad de inducir la aparicin de tumores pulmonarestumores pulmonarestumores pulmonares.tumores pulmonares.

Dosis diaria estimada para el hombre sin efectos 0.3 ppb/kg de peso Dosis diaria estimada para el hombre sin efectos 0.3 ppb/kg de peso

corporalcorporal

Los problemas de salud:Los problemas de salud:

Depende de factores como la ingesta, la susceptibilidad del individuo y Depende de factores como la ingesta, la susceptibilidad del individuo y

la toxicidad intrnseca.la toxicidad intrnseca.

Cmo se forma el carbamato de etilo?Cmo se forma el carbamato de etilo?

El carbamato de etilo, es el producto de la reaccin de urea con etanol. El carbamato de etilo, es el producto de la reaccin de urea con etanol.

Las levaduras liberan urea al medio, producto de su propio Las levaduras liberan urea al medio, producto de su propio metabolismo. metabolismo.

La urea y el etanol reaccionan en el medio, formando carbamato de La urea y el etanol reaccionan en el medio, formando carbamato de etilo una reaccin que depende de la temperaturaetilo una reaccin que depende de la temperaturaetilo, una reaccin que depende de la temperatura. etilo, una reaccin que depende de la temperatura.

Los niveles de carbamato de etilo, aunque pueden ser bajos Los niveles de carbamato de etilo, aunque pueden ser bajos inmediatamente despus de la fermentacin, aumentan en el tiempo y inmediatamente despus de la fermentacin, aumentan en el tiempo y

con la temperatura. con la temperatura.

Cmo se forma el carbamato de etilo?Cmo se forma el carbamato de etilo?

Etanol Uretano UreaEtanol Uretano Urea

Cmo se forma el carbamato de etilo?Cmo se forma el carbamato de etilo?

El envejecimiento de vinos, sobre todo en los tintos, a El envejecimiento de vinos, sobre todo en los tintos, a partir de la etanlisis de la urea procedente del partir de la etanlisis de la urea procedente del

metabolismo nitrogenado de levaduras y/o de compuestos metabolismo nitrogenado de levaduras y/o de compuestos derivados de bacterias lcticas. derivados de bacterias lcticas.

La presencia de azcares residuales.La presencia de azcares residuales.

La tendencia de no practicar la filtracin en tintos de La tendencia de no practicar la filtracin en tintos de calidadcalidadcalidad. calidad.

PrincipioPrincipio

Se basa en la extraccin del CE por solvente y posterior Se basa en la extraccin del CE por solvente y posterior anlisis mediante cromatografa gaseosa con detectoranlisis mediante cromatografa gaseosa con detectoranlisis mediante cromatografa gaseosa con detector anlisis mediante cromatografa gaseosa con detector selectivo de masas (GCMS). selectivo de masas (GCMS).

El contenido desconocido de CE en la muestra de vino se El contenido desconocido de CE en la muestra de vino se calcula sobre la base de la altura del pico cromatogrfico calcula sobre la base de la altura del pico cromatogrfico p gp g(o de rea), utilizando la metodologa del estndar externo.(o de rea), utilizando la metodologa del estndar externo.

Materiales y ReactivosMateriales y ReactivosSolventes y reactivos de trabajoSolventes y reactivos de trabajo

Dicloro metano (CH2Cl2) grado HPLC (Cas N 75Dicloro metano (CH2Cl2) grado HPLC (Cas N 75--0909--2)2)Carbamato de etilo (CE) (Cas N 51Carbamato de etilo (CE) (Cas N 51--7979--6)6)Acetona (C3H6O) grado HPLC (Cas N 67Acetona (C3H6O) grado HPLC (Cas N 67--6464--1)1)ceto a (C3 6O) g ado C (Cas 6ceto a (C3 6O) g ado C (Cas 6 66 ))

Soluciones de referencia y materialesSoluciones de referencia y materiales

Solucin de Carbamato de etilo de 0,1 mg/ml disuelto en acetona.Solucin de Carbamato de etilo de 0,1 mg/ml disuelto en acetona.Sulfato de sodio anhidro (Cas N 7757Sulfato de sodio anhidro (Cas N 7757--8282--6)6)Frasco para extraccin de 500 ml de capacidad del tipo SchottFrasco para extraccin de 500 ml de capacidad del tipo SchottFrasco para extraccin de 500 ml de capacidad del tipo Schott.Frasco para extraccin de 500 ml de capacidad del tipo Schott.Frasco para extraccin de 250 ml de capacidad del tipo Schott.Frasco para extraccin de 250 ml de capacidad del tipo Schott.Agitador magntico.Agitador magntico.Equipo de concentracin al vaco.Equipo de concentracin al vaco...

Tcnicas de extraccinTcnicas de extraccinTcnicas de extraccinTcnicas de extraccin

Columna con Resina Celite AK4

Cartuchos de extraccin de tierra deCartuchos de extraccin de tierra de diatomeas Varian Chem de 5 ml

Frasco tipo Schott.

Agitador magntico

Cromatgrafo Gaseoso con Detector Selectivo de Masa Cromatgrafo Gaseoso con Detector Selectivo de Masa con inyector automticocon inyector automticocon inyector automticocon inyector automtico

Condiciones cromatogrficas operativasCondiciones cromatogrficas operativas

Columna: DBColumna: DB--Wax de 60 m y 320 um.Wax de 60 m y 320 um.Carrier Helio: 1ml/minCarrier Helio: 1ml/minSplit: 1/50Split: 1/50Temperatura del Inyector: 180 CTemperatura del Inyector: 180 CTemperatura de la lnea de transferencia: 200 CTemperatura de la lnea de transferencia: 200 CTemperatura de la fuente de iones: 220 CTemperatura de la fuente de iones: 220 C

Scan m/zScan m/z 50 a 10050 a 100SIR masa 62 Dwell 0,1 y masa 74 con Dwell 0,1SIR masa 62 Dwell 0,1 y masa 74 con Dwell 0,1yySolvent delay de 10 minutos.Solvent delay de 10 minutos.Tiempo de retencin promedio del Carbamato de etilo: Tiempo de retencin promedio del Carbamato de etilo: p pp p40,30 minutos.40,30 minutos.Condiciones de temperatura del hornoCondiciones de temperatura del hornoPrograma de temperatura: 40Programa de temperatura: 40 -- 1 min 1 min 1010/min /min 6060 --2 2 /min /min 150 150 -- 0 min 0 min 10 10 /min /min 220220 -- 5 min5 minTiempo de corrida 60 minTiempo de corrida 60 min

Anlisis CG/SMAnlisis CG/SM

Verificacin absolutaVerificacin absolutaVerificacin absolutaVerificacin absoluta. .

fragmentos inicosfragmentos inicosfragmentos inicos fragmentos inicos

89 amu (M. ion molecular).89 amu (M. ion molecular).62 amu (M62 amu (M--C2H3.)+ y abundancia relativa 100%,: ((89.09C2H3.)+ y abundancia relativa 100%,: ((89.09--(24+3))(24+3))74 amu (M74 amu (M--CH3.)+ y 13% de abundancia relativa : ((89.09CH3.)+ y 13% de abundancia relativa : ((89.09--(12+3))(12+3))44 amu (M44 amu (M OC2H5 )+ y 90% de abundancia; ((89 09OC2H5 )+ y 90% de abundancia; ((89 09 (16+24+5))(16+24+5))44 amu (M44 amu (M--OC2H5.)+ y 90% de abundancia; ((89.09OC2H5.)+ y 90% de abundancia; ((89.09--(16+24+5))(16+24+5))

Energa Cintica del ion m v2 e V = m v2

F t fFuerza centrfugam v2 /r

Fuerza magntica centrpetaH e V H e V = m v2 /r

Operando m/e H2 r2 / 2 Vm/e = H2 r2 / 2 V

Entonces m/e , depende solamente de r, porque B (H) y E (V)Entonces m/e , depende solamente de r, porque B (H) y E (V) son constante.

li d bi l ili d bi l iLas muestras analizadas, mostraron tambin los mismos Las muestras analizadas, mostraron tambin los mismos

picos que los estndares con los m/z antes definidos. picos que los estndares con los m/z antes definidos.

Tambin coincidieron los tiempos de retencin obtenidos Tambin coincidieron los tiempos de retencin obtenidos

entre el estndar y el CE presente en las muestrasentre el estndar y el CE presente en las muestrasentre el estndar y