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n factor limitante para la obten-ción de mayores rendimientos enel cultivo de girasol es un eficien-te control de malezas, con espe-

cial énfasis en aquellas de hoja ancha. Losherbicidas del grupo de las imidazolino-nas controlan efectivamente un amplioespectro de malezas. Si bien el girasol essensible a todos los herbicidas de estegrupo, recientemente se encontró resis-tencia en plantas de girasol silvestre la cualfue incorporada al girasol cultivado. Laselección de genotipos resistentes se rea-liza actualmente a campo por lo que dis-poner de una metodología de laborato-rio para la identificación de fenotipos queporten los genes de resistencia se tradu-ciría en un ahorro de tiempo y recursosdentro de los programas de mejoramien-to. El objetivo del trabajo fue evaluar laexpresión de la resistencia a imidazoli-nonas durante la germinación y el desa-rrollo de plántulas de girasol. Se utiliza-ron como material vegetal las líneas en-docriadas HA89B, 1058-1 y HA425B degenotipos susceptible (S), intermedio (I)y resistente (R) respectivamente. Se eva-luaron dos metodologías: a) germinaciónin vitro en medio de cultivo solidificadocon agar y germinación en multimacetascon perlita. El herbicida utilizado fue elClearsol® cuyo ingrediente activo es el ima-zapir (ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il) nicotínico). Las dosisevaluadas para este agente selectivo fue-ron: 1,25-2,5-5-7,5-10 µM. En el casode la metodología in vitro el herbicida se

Breccia, G.*; Vega, T.; Nestares, G.; Zorzoli, R.1; Picardi, L.1

Selección por resistencia a imazapir enetapas tempranas del desarrollo

incorporó al medio de cultivo previa este-rilización mediante microfiltración (Nal-gene, Milipore 0,2 µm). En el caso de lametodología de multimacetas con perlitael herbicida se agregó a la solución nutri-tiva de riego (MS 25 % - Murashige ySkoog, 1962). Las multimacetas se acon-dicionaron sobre bandejas y el riego seefectuó por capilaridad. Como control seutilizaron el medio basal y la solución nu-tritiva sin agregado de herbicida en cadacaso. En ambas metodologías el diseñoexperimental fue un completamente alea-torizado con 2 repeticiones de 30 aque-nios cada una para cada combinación degenotipo y dosis. La incubación se realizóen cámara de ambiente regulado a 25 ± 2 ºCcon un fotoperíodo de 12 horas durante8 días. Cumplido ese período se evaluó:longitud de raíz principal (LR), longitudde hipocótilo (LH), peso fresco aéreo(PFA), peso fresco radical (PFR), pesoseco aéreo (PSA) y peso seco radical(PSR). Se efectuaron las pruebas de nor-malidad para todas las variables y los da-tos se analizaron a través de la variancia(ANOVA). Los valores promedio se com-pararon a través de la prueba de Tukey(Sokal & Rolhf, 1969). Con el objetode comparar las metodologías de cultivoin vitro y la germinación en multimace-tas se efectuó el análisis de correlaciónde Pearson entre los valores promedio delas variables estudiadas. En los dos ensa-yos los embriones germinaron a los 2-3días para todas las combinaciones de tra-tamientos. Para el genotipo S indepen-

U

Cátedra de Genética, Fac. Cs. Agrarias, 1CIUNR, Universidad Nacional de Rosario. CC14(S2125ZAA) Zavalla, Santa Fe. *gabrielabreccia@yahoo.com

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dientemente de la dosis de herbicida apli-cada se observó un menor desarrollo debiomasa aérea y radicular. Las plántulasdel genotipo S obtenidas en presencia deherbicida mostraron raíces principales noelongadas y necrosadas, y manchas violá-ceas en hipocótilos. Por el contrario, ge-notipos R e I germinados en presencia deherbicida no mostraron valores prome-dio significativamente diferentes con res-pecto a su control para todas las variables.La raíz principal de la línea I elongó perose observó un escaso desarrollo de raícessecundarias para las dosis de 7,5 y 10 µMde imazapir. El desarrollo radicular para elgenotipo R fue similar en las distintas dosisrespecto a su control. Las correlacionesentre las variables evaluadas en las condi-ciones in vitro y en multimacetas fueronaltas, positivas y significativas en todoslos casos:

Se concluye que ambas metodologías pre-sentan potencial para ser utilizadas como mé-todo de selección temprana a imidazolino-nas en girasol, ya que los tres grados de resis-tencia pueden ser identificados en forma rá-pida y sencilla a través de la observación deldesarrollo radicular. A su vez, de acuerdo a laalta correlación observada entre las variablesestudiadas bajo las dos condiciones, se con-cluye que las dos metodologías son igual-mente eficientes. Sin embargo, la metodolo-gía de multimacetas presentaría las ventajasde tener menor costo, requerir menor equi-pamiento y ser más sencillo de implementar.

Bibliografía:

• Murashige T. & Skoog F. (1962) Physiol.Plant 15: 473-497.• Sokal RR & Rolhf FS (1969) Biometry.San Francisco, WH, Freeman & Co.

VariableLH LR PFA PSA PFR PSR

Coeficiente 0,97 0,93 0,86 0,56 0,60 0,63correlación p<0,0001 p<0,0001 p<0,0001 p<0,0152 p<0,0080 p<0,0054

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lgunos destacados avances en lamejora del girasol provienen deespecies silvestres del géneroHelianthus. Tal es el caso de la re-

sistencia a Puccinia helianthi (Putt y Sac-kston Can. J. Plant Sci. 37:1957), el CMSPET1 (Leclercq Ann. Amelior. Plantes19:1969), tolerancia a herbicidasde la familia de las imidazolinonas(Al-Khatib et al. Weed Sci 46:1998). Seinforma sobre la búsqueda de caracteresde interés agronómico en poblaciones deH. annuus (ANN) y H. petiolaris (PET)naturalizadas en Argentina (Poverene etal. RIA 31:2002). a) Ninguna de lascruzas con plantas de 7 poblaciones deANN puras, F1 y F2 de cruzas con líneasendocriadas adroestériles (ME) ni F1 y

Cantamutto, M.1,2; Presotto, A.1,3; Poverene, M.1,3; Alvarez, D.4;Rodríguez, R.5; Lenardón, S.6; Giolitti, F.6 y Martín Sánchez, J.2

Valoración agronómica de poblacionesargentinas de Helianthus annuus y H. petiolaris

F2 de cruzas con PET restauraron la ferti-lidad en la F1 de cruzas con la líneaME CMS RES1 HA 89 de citoplasmaH. resinosus. b) Plantas ME de una po-blación ANN Argentina (LM) fueronpolinizadas por hermanas, líneas mante-nedoras (B) y restauradoras (R) del CMSPET1. Una planta actuó como restaura-dora (R) en forma parcial. Las líneas R432(con germoplasma de H. niveus) y R307produjeron sólo descendientes ME mien-tras que B10, B09, HA89B y R049 res-tauraron en forma total o parcial la ferti-lidad masculina de la F1. Plantas ME deuna población de EE.UU. (NEV) halla-das en el jardín de la UNS respondieronde un modo diferente (T(T(T(T(Tabla 1)abla 1)abla 1)abla 1)abla 1). Enalgunas plantas ME se observaron gra-

A

1Dpto. Agronomía UNS 2Centro UdL-IRTA, Lleida, España 3CERZOS-CONICET 4EEAManfredi (INTA) 5EEA Balcarce (INTA) 6IFFIVE-INTA

Tabla 1 Plantas androestériles (ME) de dos posibles nuevas fuentes de H. annuus silvestre deArgentina (LM) y EEUU (NEV) encontradas en el Departamento de Agronomía (UNS) polinizadas porhermanas y líneas endocriadas mantenedoras (B) y restauradoras (R) del citoplasma PET1

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nos de polen pero la ausencia de autofe-cundación se constató fenotípicamente enlos descendientes de cruzas con dos líneasendocriadas monocéfalas. c) Utilizandoun índice de crecimiento y desarrollo seinfiere la existencia de tolerancia a bajastemperaturas en poblaciones de ANN na-turalizadas que mostraron diferencias sig-nificativas (Tukey p<0,05) cuando fue-ron cultivadas 20 días a 15 ºC/ 5 ºC, díaneutro. d) Mediante inoculación mecá-nica se detectaron posibles fuentes de re-sistencia al Sunflower chlorotic mottle virus(SuCMoV) en poblaciones de ANN. LaF1 del cruzamiento de plantas resistentesde dos poblaciones (resistente x resisten-

te) produjo 45 % de individuos sin sín-tomas visibles de la enfermedad (T (T (T (T (Tabla 2)abla 2)abla 2)abla 2)abla 2).Esta fuente de resistencia superaría a lainformada por Lenardón et al. (Crop Sci.45:2005). e) Nueve poblaciones deANN fueron cruzadas con las líneas MEHA89, A09, A10. Se realizó la evalua-ción fenotípica de las F1, F2 y BC1 bus-cando material de interés para el mejora-miento del cultivo. El fenotipo cultiva-do se recuperó notoriamente en BC1.Estos resultados permitirían inferir quelas poblaciones argentinas de ANN po-seen rasgos de interés para la mejora del cul-tivo y animan que se continúe la transferen-cia de sus genes al germoplasma cultivado.

Tabla 2 Efecto de la inoculación mecánica con SuCMoV sobre la F1 de plantas silvestres resistentes(R) y la línea A10. A los 27 días los individuos inoculados (N) se clasificaron en; susceptibles;síntomas severos (S); tolerantes, síntomas atenuados (T); inmunes, sin síntomas (I)

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as especies silvestres de girasol cons-tituyen una fuente muy rica devariabilidad genética para ser uti-lizada en el mejoramiento genéti-

co del girasol cultivado. Dado que el fe-nómeno de erosión génica está presenteen forma permanente, se considera nece-sario y estratégico que la Argentina con-serve recursos genéticos del girasol silves-tre como un seguro para poder afrontaren el futuro situaciones no predecibles ycon ello poder lograr nuevos avances ge-néticos en los cultivares que se vayan pro-duciendo. El objetivo general de este pro-yecto es la creación de un banco activode especies silvestres naturalizadas e in-troducidas de girasol y evaluar el germo-plasma disponible. Se han realizado via-jes de colección durante los años 2005 al2007 y se han obtenido muestras desemillas de diferentes poblaciones deHelianthus petiolaris y H. annuus silvestreque crecen en forma natural en las provin-cias de Buenos Aires, Córdoba, Entre Ríos,La Pampa, San Juan, San Luis y Mendoza.También se han colectado plantas clasifica-das como H. x laetiflorus del sur bonaeren-se. Se han introducido de otros paísesdiferentes especies anuales de girasol:H. anomalus, H. annuus, H. argophyllus,H. bolanderi, H. debilis, H. deserticola,H. neglectus, H. praecox y H. petiolaris, lamayoría de las cuales se han multiplicadoen forma controlada. Se introdujeronmás de 30 diferentes citoplasmas que

Grupo Responsable: Castaño, F.D.1; Poverene, M.M.2 y Rodríguez, R.H3.Participantes: Cantamutto, M.A.2; Carrera, A.D.2; Clausen, A.M.3; Echeverría, M.M.1;Ridao, A.C.1; Salaberry, M.T.1; Cáceres, C.4; Diuorno, R.S.5; Ureta, M.S.6

Proyecto PICTO-ASAGIR 08-13169Conservación y evaluación de especies silvestres de

girasol de importancia para el mejoramiento genético

condicionan androesterilidad (CMS) yhan sido multiplicados mediante cruzamien-tos con una línea endocriada. Se multiplica-ron asexual y sexualmente diferentes entra-das correspondientes a las especies perennesH. d e cap e ta lu s , H. x l a e t i f l o ru s ,H. maximiliani, H. resinosus, H. rigidus yH. uberosus. Se han realizado estudios re-lacionados con la evaluación del germo-plasma silvestre de manera especial con elnaturalizado en la Argentina. Respecto aH. annuus silvestre, se identificaron dosprobables nuevas fuentes CMS y sus co-rrespondientes fuentes restauradores dela fertilidad del polen, se han seleccio-nado plantas tolerantes a bajas tempe-raturas y al virus SUCMoV.

Por otro lado, se han realizado un análisisde la variabilidad molecular en varias po-blaciones argentinas de H. annuus silves-tre mediante el uso de marcadores ISSRy se ha determinado que los mismos permi-ten: 1) estimar la variabilidad genéticaen H. annuus cultivado y silvestre y dife-renciar las líneas endocriadas. 2) Las po-blaciones marginales de H. annuus silves-tres mantienen considerables niveles devariabilidad, que puede atribuirse a múl-tiples introducciones y que descartaría unefecto fundador marcado durante el pro-ceso de dispersión. 3) La similitud entrepoblaciones silvestres colectadas en sitiosde cultivo y líneas puras de uso frecuen-te, pone en evidencia el efecto del flujo

L

1 Facultad de Ciencias Agrarias, UNMdP., 2 Departamento de Agronomía, UNS., 3 EEA INTA Balcarce4 Becaria proyecto PICTO ASAGIR 08:13169. 5 Becaria (UNMdP)., 6 Becaria doctoral CONICET, UNS

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de genes desde el cultivo. 4) Los geno-mas silvestres y cultivados han conserva-do para los marcadores analizados, unaalta homología durante el proceso de do-mesticación. Se está estudiando la trans-ferencia del carácter resistencia a imaza-pyr a H. annuus silvestre y evaluando suefecto sobre la supervivencia y la fecundi-dad. Se encontró tolerancia natural en unbajo número de individuos de las pobla-ciones silvestres y la misma aumentó sig-nificativamente en la F1 (silvestre x IMI).La tolerancia a imidazolinonas fue fácil-mente transferida en las poblacionesde H. annuus silvestre. Se evaluaron va-rias poblaciones de H. petiolaris naturali-zadas en la Argentina por su comporta-miento frente a las infecciones en hoja ytallos con Sclerotinia sclerotiorum. Se hancaracterizado desde el punto de vis-ta fenotípico algunas poblaciones deH. petiolaris y los híbridos (F1 y retrocru-zas) entre esta especie y el girasol. Medianteel uso de marcadores RAPDs se ha con-cluido que los híbridos interespecíficosH .petiolaris x H. annuus cultivado pue-den ser identificados mediante marcado-res moleculares. De especial interés resul-tan los marcadores de H. annuus, dado

que permiten cuantificar el flujo génicodesde el cultivo hacia las poblaciones sil-vestres, receptoras de genes con poten-cial impacto ambiental. Los marcadoresdescriptos pueden aplicarse al estudio deprocesos de hibridación e introgresión,ya que en sucesivas retrocruzas con la es-pecie silvestre los caracteres morfológicosintermedios no son evidentes. Se hanevaluado poblaciones de H. x laetifloruspor su comportamiento a las infeccionesen tallo y hojas de S. sclerotiorum y seestán realizando estudios de reproduc-ción y variabilidad genética en las pobla-ciones argentinas. Algunos de los resul-tados de los estudios descritos anterior-mente se presentan en varias comunica-ciones del Congreso ASAGIR 2007.

Respecto a la formación de recursos hu-manos, las Ing. Agr. Ureta y Cáceres con-tinúan de manera normal sus estudios deposgrado. Cáceres, ha completado el cur-sado de asignaturas y el trabajo experi-mental por lo cual se estima que en el año2007 obtendrá la Maestría. A su vez, laIng. Diuorno obtuvo la Maestría en el2006. La Lic. Echeverría obtuvo su Doc-torado a fines del 2005.

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elianthus petiolaris (2n=2x=34),especie que se ha naturalizado enla Argentina, constituye una va-liosa fuente de variabilidad gené-

tica para el mejoramiento genético delgirasol. La caracterización morfológica yreproductiva de los híbridos que se pro-ducen entre ambas especies debe brindarinformación en cuanto a si es posible quealgunos caracteres de interés agronómicopuedan ser transferidos de H. petiolaris aH. annuus (2n=2x=34). Por otro lado,no se han detectado estudios en la pro-genie producida por el retrocruza-miento del híbrido interespecífico conH. petiolaris, el cual podría darse en la re-gión donde ambas especies son simpáti-cas. El desarrollo de plantas transgénicasha aumentado la preocupación sobre elposible escape de genes del girasol culti-vado a especies silvestres relacionadas. Espor ello que se considera necesario obte-ner información acerca de la hibridacióne introgresión en forma recíproca, entreambas especies. El objetivo del trabajofue caracterizar las progenies híbridas,F1 y retrocruzas, provenientes del cruza-miento entre H. annuus y H. petiolaris,desde el punto de vista fenotípico en losestadios vegetativo y reproductivo. Serealizaron cruzamientos recíprocos entreplantas de un híbrido simple de girasol yde H. petiolaris, provenientes de semillascolectadas en la Argentina. Luego, estasdos progenies híbridas (F1) fueron cru-zadas con ambas especies progenitoras,de lo cual resultaron cuatro progenies

Diuorno, R.S.; Salaberry, M.T.; Echeverría, M.M.; Alonso, S.I. y Rodríguez, R.H.

Caracterización de híbridos provenientes deHelianthus petiolaris y el girasol cultivado (H. annuus)

(RC1F1). En el campo, se tomaron datosde distintos caracteres morfológicos a tra-vés del ciclo biológico de 98 plantas deH. petiolaris, 28 de H. annuus y 338 delas seis progenies híbridas. Además, se es-tudió la meiosis de los híbridos interes-pecíficos.

Luego, se realizó un análisis de compo-nentes principales, con el fin de detectargradientes de variabilidad de los caracte-res y visualizar las relaciones entre las es-pecies y sus progenies. Los dos prime-ros componentes principales explicanun 67,5 % de la variabilidad y estable-cen el agrupamiento de las plantas deH. petiolaris y las de las progenies F1 yRC1F1, cuyo progenitor recurrente es estaespecie, que no se detecten diferenciasentre progenies de cruzamientos recípro-cos, que se produzca una gran dispersiónde las plantas de la progenie RC1F1, cuyopadre recurrente es el girasol cultivado yque las plantas de esta especie se diferen-cien del resto. Los caracteres de mayorinfluencia en el ordenamiento dado porel componente 1 son aquellos relaciona-dos con los tamaños del capítulo (el diá-metro del capítulo, el diámetro del discoy el ancho de filaria) y de la hoja (el largoy el ancho) y el tipo de ramificación. Seconsidera que los genes que determinanel tipo de ramificación tienen un rol de-cisivo en la distribución de las plantasevaluadas. El componente 2 separa a lasprogenies de las especies progenitoras porlos caracteres que resultaron transgresi-

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Unidad Integrada de Balcarce (UIB, Estación Experimental INTA-Facultad deCiencias Agrarias, UNMdP). C.C. 276 (7620) Balcarce, BA.

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vos, la altura de la planta y el largo delpecíolo. De lo anterior se deduce que lascaracterísticas de las plantas de las pobla-ciones de H. petiolaris y de las RC1F1, quetiene a esta especie como progenitor re-currente, hace que sea difícil detectar asimple vista, diferencias entre ellas. Porotro lado, se deduce también que existeuna gran variabilidad en las plantas RC1F1,que tienen a H. annuus como progenitorrecurrente, debida probablemente por unlado, a genes que gobiernan el tipo deramificación y que están segregando y porel otro, a genes de ambas especies que encombinación, codifican caracteres trans-gresivos. En las progenies F1, que tienenun alto grado de esterilidad (más de 95 %),se observó un mínimo de 10 bivalentesen la diacinesis de la meiosis, lo cual indi-caría que al menos siete cromosomas es-

tán involucrados en las translocacionescromosómicas que diferencian las pobla-ciones argentinas de H. petiolaris y el gira-sol cultivado. Un decavalente es la máxi-ma configuración cromosómica observa-da en estas progenies. En las anafases ytelofases I y II se observaron puentes yfragmentos cromosómicos y micronú-cleos. Un dodecavalente fue la máximaconfiguración cromosómica y once bi-valentes fue el mínimo número de biva-lentes observados en una planta RC1F1.Ello explica el grado elevado de esterili-dad del polen que se detecta en algunasplantas RC1F1 (entre 30 y 90 % de gra-nos de polen abortados) y da indicios deque aún en estas progenies existen barre-ras reproductivas importantes que dificul-tan el flujo génico entre ambas especies.

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elianthus petiolaris se encuentraprincipalmente al este de La Pam-pa, al oeste de Buenos Aires y alsur de San Luis y Córdoba. Las

plantas crecen en caminos vecinales y ban-quinas, ocasionalmente invadiendo lotessin cultivar (Poverene et al., 2002). Estaespecie silvestre constituye una valiosafuente de variabilidad genética para la in-corporación de caracteres de importanciapara el mejoramiento genético del girasolcultivado como son: la resistencia a diver-sos tipos de estrés, tanto bióticos comoabióticos y la eficiencia en la utilizacióndel agua. Además, es una fuente de cito-plasmas que producen androesterilidad ygenes restauradores de la androfertilidad(Seiler, 1992). Hasta el momento, no secuenta con la información necesaria parasaber si hay mayor variabilidad de caracte-res morfológicos entre o dentro de las po-blaciones de H. petiolaris que se encuen-tran en la Argentina.

La evaluación de dicha variabilidad conrespecto a algunos caracteres permite porun lado, determinar dónde se encuentrala principal fuente de variabilidad y por elotro, identificar genotipos valiosos con elfin de que sean utilizados en planes demejoramiento genético del girasol. Porotro lado, Heiser (1961) determinó queexisten tres grupos citológicos en las po-blaciones de H. petiolaris que se encuen-tran en Estados Unidos. Los tres gruposdifieren en una o más translocaciones cro-mosómicas, de tal modo que las F1 prove-

Diuorno, R.S.; Salaberry, M.T.; Echeverría, M.M.; Monterubbianesi, M.G. yRodríguez, R.H.

Evaluación de la variabilidad de algunos caracteres entre y dentrode algunas poblaciones argentinas de Helianthus petiolaris

nientes de individuos de distintos gruposson semiestériles por presentar transloca-ciones heterocigóticas. Una evaluación dela fertilidad de algunas poblaciones argen-tinas de H. petiolaris contribuirían con in-formación para detectar la presencia demás de un grupo citológico en nuestropaís y para explicar la variabilidad existen-te. Se planteó como hipótesis que haymayor variabilidad dentro de estas pobla-ciones que entre ellas.

El objetivo del trabajo fue determinar lavariabilidad de algunos caracteres, en losestadios vegetativos y reproductivos, en-tre y dentro de algunas poblaciones ar-gentinas de esta especie. En el Banco deGermoplasma del género Helianthus de laEstación Experimental Agropecuaria delINTA de Balcarce se conservan coleccio-nes de especies silvestres con la finalidadde detectar genes de interés agronómicopara el cultivo de girasol. De acuerdo a losestudios realizados en las poblaciones co-leccionadas y a lo observado en los viajesde colección por el país, se considera quelas poblaciones que se encuentran en la Ar-gentina pertenecen a la subespecie petiolaris.Se realizó un ensayo en el campo cuyodiseño fue el de bloques completos alea-torizados en dos fechas de siembra, cadauna con dos repeticiones, y en el que seincluyeron siete poblaciones argentinasde H. petiolaris. Cada parcela constó detres surcos de 5 m de largo, distanciadosentre sí a 1,50 m.

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Unidad Integrada de Balcarce (UIB, Estación Experimental INTA-Facultad de CienciasAgrarias, UNMdP). C.C. 276 (7620) Balcarce, BA.

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Las semillas se habían colectado en pobla-ciones que se encontraban distantes entresí, en la provincia de La Pampa. Se toma-ron datos por planta de distintos caracte-res, la mayoría de tipo cuantitativo, a tra-vés del ciclo biológico, ya sea durante elestadio vegetativo como el reproductivo.Además, con el fin de determinar si existenmás de un grupo citológico en las pobla-ciones, se analizó el nivel de viabilidad delpolen de las plantas, mediante la técnica detinción de Alexander (1980).Debido a que todas las plantas presenta-ron un alto grado de viabilidad del polen,se deduce que no se encuentran diferentesgrupos citológicos en las poblaciones mues-treadas. Los caracteres evaluados presen-tan una gran variabilidad entre plantas den-tro de cada una de las poblaciones argenti-nas evaluadas. Se detectaron mínimas di-ferencias entre poblaciones. Estas mínimasdiferencias podrían ser debidas a diferen-cias en las frecuencias génicas. El númerode capítulos por planta y por lo tanto, el

de ramificaciones es el carácter más varia-ble entre plantas. Dado que solamente seencuentran plantas de H. petiolaris de lasubespecie petiolaris, de un solo grupo ci-tológico y que prácticamente no hay dife-rencias en los caracteres entre poblaciones,se concluye que las poblaciones argenti-nas de esta especie deben haber tenido unorigen común y que por lo tanto, al me-nos en la región evaluada, no es necesariobuscar variabilidad genética en diversas po-blaciones.

Bibliografía:

• Alexander, M.P. 1980. Stain Technology.55:13-18.• Heiser, C.B. Jr. 1961. Evolution. 15:247-258.• Poverene, M.M.; Cantamuto, M.A.; Ca-rrera, A.D.; Ureta, M.S.; Salaberry, M.T.; Eche-verría, M.M. y Rodríguez, R.H. 2002. Revistade Investigación Agropecuaria. 31:97-116.• Seiler, G.J. 1992. Field Crops Research.30:195-230.

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Echeverría, M.M; Salaberry, M.T; Castaño, F.D y Rodríguez, R.H.

Caracterización genética y agronómica de laandroesterilidad citoplásmica RES1

en el girasol cultivado (Helianthus annuus L.)

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UIB: FCA, UNMdP - EEA Balcarce, INTA C.C. 276 (7620) Balcarce, BA.

ctualmente, más del 90 % de laproducción mundial de girasolproviene de híbridos que poseenla fuente de androesterilidad cito-

plásmica (CMS) PET1, lo que determi-na que el cultivo presente vulnerabilidadgenética. En la UIB se identificó la fuen-te CMS RES1 proveniente de la especiesilvestre H. resinosus. Se planteó la hipó-tesis de que esta fuente presenta caracte-rísticas agronómicas y genéticas favora-bles para ser utilizada en la producciónde híbridos.

Los objetivos del trabajo fueron:1) co-nocer la expresión fenotípica y la estabili-dad de CMS RES1, 2) conocer en quéestadio de la microgametogénesis seproducen los sucesos que llevan a la an-droesterilidad de las plantas CMSRES1, 3) identificar genotipos con ca-pacidad de restaurar la fertilidad masculi-na de las plantas CMS RES1 y en el casode identificarlos, estudiar el modo deherencia del o los genes restauradores dela fertilidad (Rf), 4) caracterizar el cito-plasma RES1 por sus efectos sobre de-terminados caracteres agronómicos en lí-neas endocriadas y sobre la aptitud com-binatoria de los mismos caracteres y 5)determinar si existen cambios molecula-res en la región atp6-coxIII del ADNmtde las plantas CMS RES1. El citoplasmaRES1 se incorporó a las líneas endocria-das HA89, RHA271, RHA274 yRHA801. Las plantas CMS RES1 pre-sentaron escasa producción de granos de

polen inviables y anteras deformadas, máscortas que las anteras de las plantas férti-les y que generalmente permanecieronretenidas dentro de la corola. El procesomeiótico fue normal en las líneas endo-criadas CMS RES1. La androesterilidadse mantuvo en las diferentes generacio-nes de retrocruzas y ambientes. Se con-firmó que el origen de esta fuente de an-droesterilidad es citoplásmico, que suexpresión fenotípica es completa y esta-ble en distintos ambientes y que las alte-raciones se producen en estadios post-meióticos. Para identificar genes Rf se eva-luaron: a) genotipos diploides: 19 líneasendocriadas de girasol cultivado, 19 po-blaciones originadas a partir de germo-plasma de origen interespecífico (siendoH. annuus uno de los progenitores) ydos especies silvestres (H. petiolaris yH. argophyllus) y b) genotipos hexaploi-des: las especies silvestres perennesH. resinosus, H. x laetiflorus, H. tuberosus yH. pauciflorus. Todos los genotipos diploi-des evaluados se comportan como man-tenedores de la androesterilidad de lasplantas CMS RES1, mientras que las es-pecies hexaploides como restauradores.Uno o dos genes Rf, con dominancia,estarían localizados en los cromosomasde H. resinosus, homólogos con los deH. annuus, por lo cual sería factible latransferencia al girasol cultivado. Se eva-luaron las líneas endocriadas HA89,RHA271, RHA274 y RHA801, en susversiones androfértil y androestéril, a finde caracterizar el citoplasma RES1 por

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sus efectos sobre algunos caracteres de re-levancia agronómica. Además se evaluóla línea endocriada HA89 en ocho ver-siones isoplásmicas, B, RES1, PET1,PET2, PEF1, RIG1, MAX1 y GIG1, ylos híbridos producidos entre estas sietelíneas HA89 androestériles y otras tantaslíneas endocriadas probadoras, HA338,HA369, HA821, HA850, RHA271,RHA274 y LB598, para determinar siCMS RES1 produce algún efecto dife-rente al de otros citoplasmas sobre la apti-tud combinatoria, con respecto a algunoscaracteres agronómicos, incluyendo el com-portamiento frente a Sclerotinia sclerotiorum.

Los resultados indican que las plantasandroestériles con el citoplasma RES1sólo se diferencian de las plantas CMSPET1 en el menor tamaño del capítulo.La producción de semillas y, por lo tanto,la fertilidad femenina no se afectan en lasplantas portadoras del citoplasma RES1.Se realizó el análisis molecular de la re-

gión atp6-coxIII del ADNmt de las líneasendocriadas HA89, RHA271 yRHA801 con los citoplasmas B, RES1,PET1 y MAX1, mediante la amplifica-ción con cebadores universales y especí-ficos y la hibridación tipo Southern. Sedeterminó que el citoplasma RES1 sediferencia de los citoplasmas PET1 yMAX1 por la ausencia del orfH522 y pre-senta diferencias estructurales con respec-to al citoplasma B, en las áreas circundan-tes a los genes atp9 y coxIII.

El citoplasma RES1 es apropiado paraser utilizado en programas de produc-ción de híbridos de girasol si se logra trans-ferir el o los genes responsables de la res-tauración de la fertilidad del polen en elgirasol cultivado (H. annuus). De todasmaneras, dicho citoplasma puede ser usa-do con éxito en programas de mejora-miento genético de girasoles ornamenta-les en los que la finalidad no es la pro-ducción de semilla.

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Errazu, P.J.1; Presotto, A.D.1,2 y Cantamutto, M.A.1,3

Interferencia del girasol silvestre sobre unhíbrido Clearfield® de girasol cultivado

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1Dpto. Agronomía UNS; 2 CERZOS-CONICET; 3Centro UdL-IRTA, Lleida, España.

l girasol silvestre ha mostrado altacapacidad de interferencia en culti-vos de trigo (Triticum aestivum L.)(Rosales-Robles et al., Cereal Res.

Com. 30:2002); en soja (Glicine max Merr.)(Geier et al., Weed Technol.10:1996),en remolacha (Beta vulgaris L.) (Schwei-zer y Bridge Weed Sci. 30:1982), sorgo(Sorghum bicolor L.)(Rosales-Robles et al.,Agrociencia (Méx.). 39:2005), maíz(Zea mays L.) (Deines et al., Weed Sci.52:2004). La nueva tecnología para elcontrol de malezas en girasol se basa en laincorporación de genes de tolerancia aherbicidas de la familia de las imidazoli-nonas, hallados en una población deKansas (USA) sometida a siete años deaplicación con esos herbicidas. La tecno-logía ha sido liberada en nuestro país bajola denominación CL®. Esta nueva tecno-logía no serviría para el control de girasolsilvestre en cultivos de girasol, pues existenriesgos que las poblaciones contengan enbaja frecuencia los genes de tolerancia o quesean incorporados por flujo génico desdelos cultivos CL.El objetivo del trabajo fue evaluarla interferencia del girasol silvestreHelianthus annuus L. sobre plantas del culti-vo (Helianthus annuus var. macrocarpus)empleando un híbrido tolerante al her-bicida imazapir. El ensayo se realizó en laUniversidad Nacional del Sur, Bahía Blan-ca Latitud 38º41’46.18’’S longitud62º14’55.18’’W, utilizando el híbridoDK 3880CL. Se sembró a chorrillo a prin-cipios de diciembre y se raleó poste-

riormente para ajustar la densidad a 5,5 pl/m2.Plantas de H. annuus silvestres de Colo-nia Barón (La Pampa) se obtuvieron eninvernáculo utilizando bandejas paraplantines. Ocho días después de la siem-bra, en simultáneo con el raleo, se dispu-sieron esas plantas como maleza, en unestado de desarrollo similar al del híbridocomercial, en la posición correspondien-te a una planta del cultivo. Se realizó elseguimiento del desarrollo del cultivo yla maleza, incluyendo altura de planta(cm), número de hojas, área foliar (cm2),diámetro de tallo (cm), número y diáme-tro de capítulos (cm), peso de 1.000 (g),peso de granos por capítulo (g). Los pa-rámetros medidos sobre las malezas fueroncontrastados con los de plantas de la mismapoblación (Colonia Barón) cultivada a bajadensidad (1,66 pl/m2) en el mismo cam-po experimental. El diseño empleado fuecompletamente al azar, con cinco repeti-ciones.Se realizó un ANOVA y comparación demedias considerando grupos de plantasdispuestas en círculos concéntricos des-de las malezas, con el paquete estadísticoInfostat. No se encontraron diferenciasen el número de hojas entre la maleza y elhíbrido comercial, mientras que la alturafue significativamente mayor en la prime-ra. Ambos parámetros fueron superiorescuando la maleza creció a baja densidad.El número de ramificaciones y capítulosfue menor en las plantas silvestres dentrodel cultivo, mientras que no se encontra-ron diferencias en el diámetro de discoentre ambos grupos de plantas silvestres

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(T(T(T(T(Tabla 1)abla 1)abla 1)abla 1)abla 1). Las variables evaluadas indi-caron un crecimiento indeterminado enlas plantas silvestres, a diferencia del híbrido,observándose un aumento en la altura aúnluego de iniciada la floración (F(F(F(F(Figura 1)igura 1)igura 1)igura 1)igura 1).Las plantas del cultivo inmediatamentevecinas a las malezas y las ubicadas a dis-tancias crecientes no mostraron diferen-cias significativas en ninguno de los pará-metros considerados. Estos resultadosindicarían que las plantas de girasol silvestreejercerían una interferencia similar a las delhíbrido cultivado. En situaciones similaresa la evaluada podría esperarse que la mermaen el rendimiento del cultivo sea propor-cional a las plantas de cultivo que hayansido reemplazadas por la de la maleza.

Tabla 1 Efecto de la competencia sobre el crecimiento y desarrollo de Helianthus annuus spp. annuus(ANN CBAR) y del híbrido comercial Dekalb 3880CL. Medias seguidas de la misma letra no difieren segúnTukey para p<0,05. AD: cultivo y maleza a alta densidad (5,5 pl/m2); BD: maleza a baja densidad (1,66 pl/m2)

Figura 1 Crecimiento de la maleza Helianthusannuus spp. annuus (ANN CBAR) y del híbridocomercial Dekalb 3880 CL en una densidad de5,5 pl/m2

1 Hoja sobre el tallo principal.

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Fernández, P.1*; Di Rienzo, J.2; Fernández, L.1; Hopp, H.E.1; Paniego, N.1 y Heinz, R.A.1

Respuesta a estreses abióticoscaracterizada mediante chip de ADNc

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1 Unidad Integrada de Investigación y Docencia FCEyN-UBA-CNIA-INTA, Instituto deBiotecnología, CC 25 (B1712WAA) Villa Udaondo, Pcia. de Buenos Aires, Argentina 2

Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina.*pfernandez@cnia.inta.gov.ar

iferentes herramientas molecularesfueron desarrolladas localmentecon anterioridad para abordar elanálisis genómico del girasol cul-

tivado, las cuales incluyen 550 micro-satélites altamente polimórficos (SSR)(Paniego y col., 2002), 64 unigenes de-rivados de secuencias relacionadas conanálogos a genes de resistencia (RGAs) y319 unigenes provenientes de etiquetasde secuencias que se expresan (ESTs)(Fernández y col., 2003). Consideran-do la importancia del cultivo de girasolpara el país y atendiendo al progresivodesplazamiento del área de cultivo haciaregiones marginales en los últimos años,surgen como factores limitantes crecien-tes los estreses ambientales como sequía,frío y salinidad

El objetivo general de este trabajo es laidentificación de genes candidatos rela-cionados con tolerancia a frío y salinidadsiendo el objetivo específico la utilizaciónde micromatrices de ADNc generadas apartir del banco local de ESTs debida-mente anotados según vocabulario nor-malizado (GOA: Camon y col., 2003),y su posterior validación mediante la téc-nica de qRT-PCR. Para la impresión demicromatrices de ADNc sobre soportede vidrio, se amplificaron por PCR losfragmentos representativos de los unige-nes anotados en las bibliotecas previa-

mente caracterizadas, mediante el servi-cio ofrecido por Gentron Genomic Ser-vices (Gentron, Suc Argentina), utili-zando el equipo VersArray Chip Writer(BioRad). Se evaluaron los ARNs extraí-dos de 3 muestras biológicas tanto parael tratamiento control, frío (tratamientode 24 hs. a 10 oC) y salinidad (tratamien-to de riego con 150 mM NaCl durante3 días). Se utilizó el sistema «SuperScriptIndirect RNA Amplification System»(Invitrogen, L1016-02) para amplificarel ARN partiendo de 800 ng RNA ex-traído de cada muestra basado en el mé-todo de síntesis de ADN complementa-rio in situ y amplificación del ARN(Eberwine y col., 1992).

El ARN amplificado fue marcado fluo-rescentemente con Cy3 o Cy5 por incu-bación en medio alcalino con ésteres deCy3 o Cy5 respectivamente. Los vidriosimpresos fueron escaneados usando ellector de fluorescencia VersArray ChipReader (BioRad) y las imágenes obteni-das fueron analizadas utilizando softwareSpotfinder (www.tm4.org/spotfinder.html).La normalización se realizó a través deprogramas generados bajo el Paquete R(University of Auckland, USA), mien-tras que el análisis de expresión globalse realizó utilizando Infostat 2006®(Grupo Infostat 2006, FCA, Córdoba,Argentina). A partir del análisis de la

Palabras clave: Helianthus annuus; girasol; EST; micromatrices de ADNc; estrés por frío, estrés salino.

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matriz de expresión mediante la integra-ción de métodos estadísticos basados enanálisis de varianza y componentes prin-cipales se identificaron 80 genes candida-tos para respuesta a frío y/o salinidad.

Del análisis de perfiles individuales de los80 genes candidatos, se detectaron 50sobre o sub expresados frente a uno uotro estrés, indicando la implicancia demecanismos regulatorios comunes a am-bos estreses. Asimismo, se detectaron 15y 12 genes sobre o sub expresados res-pectiva y específicamente frente a un es-trés y no frente al otro, mientras que los 3restantes presentaron un perfil transcrip-cional contrastante siendo inducidos enun estrés y reprimidos en otro. Para cadauno de los 80 genes seleccionados comogenes candidatos se graficó el perfil de ex-presión según su comportamiento en cadatratamiento y se construyó el gráfico decolores («heatmap») asociado a ese patróndiferencial de modo de analizar cualitati-vamente el gradiente diferencial por trata-miento y por gen (Romero y col., 2005).

De estos resultados surgieron genescandidatos de interés para su análisisde expresión diferencial, de los cuales15 fueron seleccionados para validarmediante la técnica de PCR cuantitati-va (qRT-PCR). Se confirmó el perfiltranscripcional de 10 genes candidatos.De los restantes cinco genes, tres no am-plificaron y los otros dos presentaron unperfil transcripcional contrastante con losresultados obtenidos en la micromatrizde ADNc analizada.De acuerdo al análisis funcional predichopor comparación de secuencias con basespúblicas, los genes candidatos específi-

camente regulados en situaciones deestrés formarían parte de mecanismosde regulación involucrando factoresde transcripción y traducción, pro-teínas relacionadas con procesos dedegradación/plegado o interacción entreproteínas y enzimas asociadas a la síntesisde metabolitos secundarios y generacióny procesamiento de especies reactivas deoxígeno. Como conclusión, se generó laprimera micromatriz de ADNc para gira-sol a partir de la base de ESTs local conun diseño de tres réplicas biológicas parala evaluación de respuestas a dos estresesabióticos relevantes para el cultivo de gi-rasol. Este es el primer trabajo reporta-do para estudios de expresión concerta-dos en respuesta a salinidad en girasol,existiendo en la actualidad un solo tra-bajo publicado en girasol sobre respuestaa frío en condiciones de ensayo diferen-tes a las descriptas en este trabajo(Hewezi y col., 2006).

Bibliografía:::::

• Camon y col. Comp. and Funct. Genom.2003, 4:71-74.• Di Rienzo y col. Infostat 2006®(www.infostat.com.ar).• Eberwine y col. Methods Enzymol. 1992,216:80-100• Fernández y col. BMC Genomics 2003,4:40.• Hewezi y col. Journal of ExperimentalBotany 2006, doi:10.1093/jxb/erl080• Paniego y col. Genome 2002, 45: 34-43.• R-Project, [http://www.r-project.org]. Ver-sion 1.9.0(University of Auckland).• Romero y col. Análisis de perfiles genéti-cos: elección de atributos. IV Congreso La-tinoamericano de Biología Matemática, Tan-dil, Bs. As., Noviembre 2005.

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Lia, V.V.; Peluffo, L.; Hopp, E.; Vázquez Rovere, C.; Paniego, N. y Heinz, R.A.

Caracterización de genes candidatos pararesistencia a la podredumbre húmeda

del capítulo de girasol

LInstituto de Biotecnología (IB), INTA, Castelar.

a podredumbre húmeda del capí-tulo de girasol (PHC) es la formamás devastadora de la enfermedadcausada por el hongo fitopatóge-

no necrotrófico Sclerotinia sclerotiorum,con una incidencia anual sobre la produc-ción de la pampa húmeda del 10-20 %.Debido a la complejidad de la base gené-tica de la resistencia a este patógeno, hancobrado relevancia estrategias centradasen el estudio de los factores determinan-tes de la patogénesis y de las respuestas dedefensa del hospedante. Las germinas(GP) y proteínas de tipo germinas (GLPs)han sido frecuentemente vinculadas conel funcionamiento de la pared celular ycon los mecanismos de defensa frente apatógenos. En el caso de la podredum-bre de tallo (PHT), la expresión consti-tutiva de una germina, el gen de oxalatooxidasa de trigo, en plantas de girasoltransgénicas fue utilizada con éxito comoaproximación para conferir resistencia ala invasión del hongo (Hu y col. 2003).

Por otro lado, se ha descripto que la res-puesta a PHT también estaría relaciona-da con la inducción de la síntesis de pro-teínas de transferencia de lípidos (LTPs),proteínas inhibidoras de poligalacturona-sas (PGIPs) y defensinas (Regente y col.1997; Urdangarín y col. 2000; Regentey de la Canal, 2000 y 2003; Hu y col.2003). A partir del análisis de las colec-ciones, de ESTs desarrolladas en el IB(Fernandez y col. 2003) se identificaronsecuencias con similitud a genes de otras

especies cuya función ha sido asociadacon respuestas a estreses bióticos y/o abió-ticos. Entre estos candidatos se seleccio-naron los transcriptos correspondientesa un gen de una proteína de tipo germi-na (HaGLP1) y a un inhibidor de poli-galaturonasa (HaPGIP1) para validar ex-perimentalmente su función biológica yevaluar su contribución a la tolerancia aPHC. En un estudio previo se detecta-ron diferencias en los niveles basales deexpresión de HaGLP1 en capítulos deplantas susceptibles y resistentes inocula-das con el patógeno, siendo además lainducción de este gen más tardía en lasprimeras (Peluffo y col. 2004).

Como primera etapa en la caracteriza-ción estructural de los genes HaGLP1y HaPGIP1 se utilizaron técnicas deRACE con el objeto de obtener la se-cuencia completa de los transcriptos co-rrespondientes a líneas tolerantes(RHA801) y susceptibles (HA89) aPHC. La comparación de los datos desecuencia reveló la ausencia de sustitu-ciones aminoacídicas entre líneas paraHaGLP1 (220 aa) y una divergencia del0,6 % para HaPGIP1 (331 aa). Ambosgenes candidatos presentaron un intrónal ser amplificados a partir de ADN ge-nómico y exhibieron una población detranscriptos de longitud variable (Ha-GLP1: 712-886 pb; HaPGIP1: 1116-1157pb), estando la totalidad de las di-ferencias de tamaño restringidas a la re-gión 3´ no codificante. El análisis de la

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secuencia de aminoácidos correspondien-te a HaGLP1 permitió verificar la presen-cia de los motivos conservados caracterís-ticos de las GPs y GLPs. A fin de estable-cer la posición filogenética de la secuenciaobtenida dentro de la familia de las GLPsse realizó un análisis de parsimonia inclu-yendo 98 representantes del grupo pro-venientes de diversas especies vegetales.

La topología resultante confirmó la asig-nación de HaGLP1 como GLP y dio lu-gar a la identificación de tres nuevosmiembros de esta familia en girasol. Lascuatro GLPs de girasol presentan una si-militud nucleotídica promedio del 51,6 %para la región codificante, mientras que alconsiderar la secuencia de aminoácidosesta cifra desciende a 44 %. En concor-dancia con lo esperado para proteínas desecreción al apoplasto, las predicciones insilico indican la existencia de un péptidoseñal en todas ellas.

El estudio de la abundancia de transcrip-tos mediante la técnica de Northern Blot

reveló la existencia de diferencias tempo-rales y finales en los niveles de expresiónde materiales resistentes (RHA801,RHA275, HA853) y susceptibles(HA89). Actualmente se están realizan-do construcciones en vectores de trans-formación para evaluar la funcionalidadde estos genes candidatos en respuesta aSclerotiia sclerotiorum en plantas modelocomo parte de la estrategia para explorarlas bases de la resistencia al patógeno en elgermoplasma de girasol.

Bibliografía:::::

• Fernández y col. (2003). BMC Genomics4: 40.• Hu y col. (2003) Plant Physiol. 133:170-81.• Peluffo y col (2004). Congreso Argentinode Girasol. ASAGIR 2005. 31de mayo y 1ºde Junio de 2005, Buenos Aires Argentina.• Regente y col. (1997). Physiol. Planta-rum 100: 178-182.• Regente y col. Physiol. Plantarum 110:158-163. 6-Urdangarin y col. (2000). PlantPhysio. Biochem. 38: 253-258.

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Mancuso, N. y González, J.

Variabilidad en líneas degirasol de EEA Pergamino

L

INTA - EEA Pergamino. pergira@pergamino.inta.gov.ar

a variabilidad del germoplasma esuna condición necesaria para eldesarrollo de un programa de me-joramiento, y la evaluación de las

líneas obtenidas permite estimar la orien-tación del mismo y hacer la re-orienta-ción en caso necesario. La utilización delmétodo de componentes principales per-mite determinar la contribución de loscaracteres y su importancia relativa paraser usado como criterio de selección. Elobjetivo del presente trabajo fue estimarla variabilidad y/o divergencia de las lí-neas a través del método de componen-tes principales. Se sembraron 126 líneas(93 mantenedoras y 33 restauradoras defertilidad) en la EEA Pergamino en lascampañas 2001/2002, 2003/2004 y2004/2005.

Los caracteres evaluados, utilizados parala descripción morfológica de las líneas,fueron: número de hojas, ancho, largo yrelación ancho /largo de la lámina, largodel pecíolo, días a floración, diámetro deltallo y capítulo, días a floración, posi-ción y forma de capítulo, largo de brác-teas, relación largo brácteas/diámetro decapítulo, espesor del receptáculo, núme-ro de flores liguladas, largo y ancho delígula, peso, ancho y largo de aquenio,porcentaje de aceite y pepita. Las obser-vaciones se realizaron sobre 4 plantas encompetencia completa. La ecuación decomponentes principales para todas laslíneas incluyendo altura, días a floración,

peso y número de aquenio, porcentajede aceite y pepita explican el 40 % paraCP 1 y el 24,6 % para CP 2. No observópatrón de agrupamiento en las líneas delprograma de diferentes orígenes; excep-to para las líneas Alto Oleico que se con-centran alrededor de los caracteres por-centaje de aceite y pepita.

Cuando la ecuación restringe a los carac-teres del aquenio (número, largo y an-cho) y porcentaje de aceite y pepita, hayuna mayor explicación de la CP 1 llegan-do al 53,4 % y CP 2 a 17,5 %, concen-trando aún más las líneas de Alto Oleicoen el cuadrante con los caracteres de aque-nio. Se explicaría este comportamientopor el origen común de estas líneas sien-do necesario la recurrencia a germoplas-ma de origen diferente para incrementarla variabilidad de las mismas.

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Maranesi, D.1 y Mancuso, N.2

Aptitud combinatoria de 4 líneasde girasol a Verticillium dahliae

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1UNR; 2INTA EEA Pergamino

n girasol, el secado anticipado yquebrado del tallo provocado porVe r t i c i l l i u m d a h l i a e K l e b(Verticillium Wilt) es la enferme-

dad más importante en Argentina. Fue re-conocida por primera vez en nuestro país en1965 y causa pérdidas de rendimiento dehasta 73 % en campos altamente infesta-dos. Los microesclerocios sobreviven variosaños en el suelo. Se estimó los efectos deAptitud Combinatoria General y Especificaentre cuatro líneas endocriadas de girasol(Helianthus annuus L.) para conocer su po-tencial utilización en la síntesis de híbridos ycomo progenitoras en programas de mejo-ramiento en relación al carácter en estudio.Se realizó un cruzamiento dialélico entre lascuatro líneas de girasol seleccionadas porsu comportamiento a V. dahliae : 2 lí-neas resistentes de diferente origen:KLM-214-b (4) KLM-214-b (4) KLM-214-b (4) KLM-214-b (4) KLM-214-b (4) seleccionada del com-puesto KLM (variedad Klein y locales Man-fredi) desarrollada en la EEA Pergamino; yVVVVV-112/E-1-1-2-1-1-3 (5)-112/E-1-1-2-1-1-3 (5)-112/E-1-1-2-1-1-3 (5)-112/E-1-1-2-1-1-3 (5)-112/E-1-1-2-1-1-3 (5): provientedel cruzamiento entre la línea VVVVV-112-112-112-112-112 (de-rivada de cruzas intraespecíficas) con unalínea de INIA La Estanzuela (Uruguay); y2 líneas susceptibles derivadas del compues-to PGRK (pozo genético Ruso x Klein)desarrolladas en la EEA Pergamino:RKRKRKRKRK-416/RK-416/RK-416/RK-416/RK-416/RK-456-1-5 -2 (1)-456-1-5 -2 (1)-456-1-5 -2 (1)-456-1-5 -2 (1)-456-1-5 -2 (1) yRKRKRKRKRK-426-11-b (2)-426-11-b (2)-426-11-b (2)-426-11-b (2)-426-11-b (2). L L L L Las evaluaciones fue-ron realizadas a los estados fenológicos R4 yR6. Las líneas y los híbridos testigos mos-traron similar comportamiento en los ensa-yos realizados en el infectario natural de laChacra Experimental Bellocq y en el ensayoen condiciones de invernáculo e inocula-

ción artificial siguiendo el método de inyec-ción de hipocótilo a la altura del primer en-trenudo con una suspensión de conidios.No se identificó la raza del inoculo utiliza-do; se infiere que el inoculo presente en elinfectario natural y el utilizado en la inocu-lación artificial pertenecen a la misma razapor el similar comportamiento de las líneas ehíbridos testigos; asumiendo que pertenecea la raza Varg 1, la más abundante en Argen-tina. Se llevó a cabo un ensayo con tres repe-ticiones sembrado el 11 de Octubre de 2000en el infectario natural de la Chacra Experi-mental Bellocq (partido de Carlos Casares),usando como testigos resistentes VDH-96y P-64A41 y como susceptibles TRITONy MG2. La elección de las líneas se basó enevaluaciones previas. La escala utilizada paraevaluar grado de severidad fue de 0 a 4. Elcruzamiento entre líneas susceptibles se com-portó como susceptible y entre líneas resis-tentes como resistente. Los cruzamientos en-tre progenitores resistentes y susceptibles secomportaron como susceptibles con excep-ción del cruzamiento 4x1 que se comportócomo resistente. Este cruzamiento con unvalor en su ACE negativo e importante queratifica este comportamiento y corrobora elaporte de la línea 4 a la resistencia. Los efec-tos principales para Aptitud CombinatoriaGeneral (ACG) y Aptitud CombinatoriaEspecífica (ACE) resultaron significativa-mente diferentes para los distintos genoti-pos. Dentro de las líneas susceptibles, la lí-nea 2 muestra un efecto mayor de ACGque la línea 1, y dentro de las resistentes lalínea 4 muestra un efecto de ACG mayorque la línea 5.

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Maringolo, C.1-2*; Troglia, C.1; Nishinakamasu, V.3; Quiroz, F.1;Cervigni, G.4; Heinz, R.3; Paniego, N.3 y Escande, A.1

Podredumbre del capítulo de girasol.Identificación de QTL asociados a la resistencia

a Sclerotinia sclerotiorum

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1Unidad Integrada Balcarce INTA-UNMDP, Ruta 226, Km 73,5. 7620. Balcarce.2PICTO Asagir-Agencia, 3INTA-Castelar, 4UNS. *cmaringolo@balcarce.inta.gov.ar

a Podredumbre Húmeda del Ca-pítulo del Girasol (PHC) causadapor Sclerotinia sclerotiorum es la se-gunda enfermedad más importan-

te del cultivo en la Argentina. Debido aque las formas de control químico, me-diante agentes biológicos y rotaciones noes eficaz, es necesario intensificar la bús-queda de nuevas fuentes de resistencia aPHC a través del uso de herramientas mo-leculares, ya que además presenta una basegenética compleja y una alta interaccióncon factores ambientales. Los objetivos deeste trabajo fueron caracterizar fenotípica-mente la resistencia de una población degirasol y detectar regiones cromosómicasasociados a PHC en girasol (QTL) em-pleando marcadores moleculares microsa-télites (SSRs) informativos. Se evaluó enensayos de campo la incidencia y la inten-sidad de la enfermedad, en las líneas pa-rentales con moderada resistencia (MR) ysusceptibilidad (S), los híbridos F1 y lasfamilias F2:3, mediante la inoculación decapítulos en estadio R 5.2 con una sus-pensión de ascosporas de S. sclerotiorum.Se trabajó en dos ambientes (secano-ta-pado post-inoculación y riego-sin tapar)con un diseño en Bloques IncompletosAleatorizados con tres repeticiones. Enuna primera etapa de la caracterización ge-notípica se analizó la existencia de poli-morfismos en las líneas parentales para unconjunto de 365 SSRs (Tang y col.,2003; Yu y col., 2003; Paniego y col.,2002; Poormohammad y col., 2006;2007; Talia y col., comunicación perso-

nal). El 78 % de los pares de oligonu-cleótidos evaluados fue funcional en lascondiciones ensayadas; de estos el 86 %amplificó un único producto de tamañomolecular esperado (283 SSRs). El 46 %fueron monomórficos para las líneas pa-rentales analizadas y un 55 % fueron po-limórficos; de estos el 6 % fue polimórfi-co dominante, detectándose un 48 % deSSRs codominantes informativos de loscuales 87 están confirmados y se genoti-pificaron en 96 individuos F2 (T(T(T(T(Tabla 1)abla 1)abla 1)abla 1)abla 1).A partir de estos resultados se prosiguióel análisis con 63 SSRs. Los resultadosindican que el nivel de polimorfismo ob-servado es alto, si se compara con los ni-veles esperados dentro del germoplasmacultivado de girasol, que es de aproxima-damente 30 %. Del conjunto de 63 mar-cadores informativos identificados, lamayoría de los cuales estaban previamen-te localizados en un mapa público de gi-rasol (Tang y col., 2003; Yu y col., 2003),segregaron en los mismos grupos de li-gamiento, permitiendo estandarizar la no-menclatura a partir de los SSRs comunesa ambos mapas y están representados 16de los 17 grupos de ligamiento descrip-tos para girasol. En la segunda etapa delanálisis genotípico se generó un mapagenético parcial utilizando sólo los SSRsque se ajustaron a la segregación mende-liana esperada (24 SSRs). Este mapa cons-ta de seis grupos de ligamiento (GL) quepueden ser asociados al mapa consensorecientemente reportado (Poormoham-mad K S y col., 2007). La asociación de

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estos marcadores con la caracterización fe-notípica en el campo (Troglia y col., 2005,Maringolo y col., 2005) permitió la iden-tificación de tres QTL inéditos de resisten-cia, con valores altamente significativos(LOD de 2,56; 3,4 y 4,4), los cuales sehallan asociados al GL 10 del mapa con-senso. Estos resultados profundizan el co-nocimiento sobre la variabilidad de la re-sistencia a la podredumbre del capítulo enlos materiales de cultivo, identifican marca-dores moleculares neutros para las distintasfuentes de resistencia al patógeno y generanasí herramientas que (junto con los estu-dios desarrollados por este grupo interdis-ciplinario) permitirán en el futuro desarro-llar estrategias moleculares para asistir en laselección por este caracter.

Financiamiento: ANPCyT/PICTO ASAGIR-Agencia 13165,INTA y UNMdP

Bibliografía:

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y evaluación de poblaciones para el mapeode QTLs. III Congreso Argentino de Gira-sol, Buenos Aires, Junio de 2005.www.asagir.org.ar• Paniego N, Echaide M, Muñoz M, Fernán-dez L, Torales S, Faccio P, Fuxan I, CarreraM, Zandomeni R, Suárez E Y, and Hopp HE. 2002. Microsatellite isolation and charac-terization in sunflower (Helianthus annuus L.)Genome 45: 34–43.• Poormohammad Kiani S, Grieu P, MauryP, Hewezi T, Gentzbittel L, Sarrafi A. 2007.Genetic variability for physiological traits un-der drought conditions and differential ex-pression of water stress-associated genes insunflower (Helianthus annuus L.). TheorAppl Genet 114:193–207.• Tang, S., Kishore, V. K. and Knapp S. J.2003. PCR-multiplexes for a genome-wideframework of simple sequence repeat mar-ker loci in cultivated sunflower. Theor ApplGenet 107:6–19.• Troglia C, Maringolo C (ex-aequo) y Es-cande A. 2005. Caracterización fenotípicade podredumbre húmeda del capitulo porSclerotinia sclerotiorum en dos poblacionesde girasol. XIII Congreso Latinoamericanode Fitopatología. III Taller de la AsociaciónArgentina de Fitopatólogos. 19-22 de Abrilde 2005. Villa Carlos Paz, Córdoba, Argen-tina. Pág. 328.• Yu J, Tang S, Slabaugh, M, Heesacker, A,Cole G, Herring, M, Soper, J, Han, F, Webb,D Thompson, L, Edwards, K, Berry, S, Leon,A, Grondona, M, Olungu, G, Maes, N andKnapp, S. 2003. Towards a Saturated Mole-cular Genetic Linkage Map for CultivatedSunflower. Crop Sci.: 43:367–387.

Tabla 1 Número total y porcentajes de SSR correspondientes a cada una de las categorías identificadas

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Nestares, G.*; Vega, T.; Breccia, G.; Cravero, V.; Zorzoli, R.1 y Picardi, L.1

Metodologías no convencionales para laselección por resistencia a imidazolinas

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Cátedra de Genética, Fac. Cs. Agrarias, 1CIUNR, Universidad Nacional de Rosario.CC14 (S2125ZAA) Zavalla, Santa Fe. * gnestare@fcagr.unr.edu.ar

Proyecto financiado por: ANPCyT-ASA-GIR. PICTO 08-13163: «Selección de ge-notipos de girasol (Helianthus annuus L.)resistentes a imidazolinonas por metodolo-gías no convencionales» Director: Dra. Li-liana Picardi.

as imidazolinonas son un grupode herbicidas que permiten el con-trol de un amplio espectro demalezas y son efectivos a bajas

dosis de aplicación dada su alta potenciabiológica. Esta familia de herbicidas ac-túa interrumpiendo la biosíntesis de untipo de aminoácidos que producen sólolas plantas, los animales deben obtener-los de la dieta. A su vez, como esta vía nose encuentra en mamíferos, estos herbici-das son de baja toxicidad para el hom-bre. El girasol es sensible a imidazolino-nas. Sin embargo, en el año 1998, enKansas (EE.UU.) se descubrieron plan-tas de girasol resistentes a estos herbici-das. Se trataba de plantas silvestres queconvivían como malezas en lotes de otroscultivos. La resistencia a imidazolinonasproviene de una fuente que existe en lanaturaleza, es decir no transgénica, ya quelos genes de resistencia de estas plantasfueron transferidos por cruzamientosconvencionales a la especie cultivada. Es-tos nuevos materiales con resistencia seencuentran disponibles para el desarro-llo de cultivares híbridos. Para lograr unhíbrido resistente se deben incorporar losgenes de resistencia a las dos líneas proge-

nitoras de este híbrido, lo cual demandauna gran cantidad de esfuerzos en lo quese refiere a identificación y selección deindividuos. El objetivo del presente pro-yecto es el desarrollo de bioensayos parala selección de materiales élite de girasolresistente a imidazolinonas que comple-menten los programas de mejoramientoconvencional. Se dispone de líneas condistinto grado de resistencia (resistente,intermedio y sensible) las cuales se eva-lúan bajo distintos sistemas in vitro enpresencia del herbicida. Acerca de la me-todología implementada, cabe aclararque el término «in vitro» significa en con-diciones de ambiente controlado. Se hanpuesto a punto dos tipos de test germi-nativos, que implican la incubación delas semillas por un lapso de ocho días,utilizando como soporte medio de culti-vo solidificado con agar o germinadoresmultimaceta con perlita. Se estableció ladosis de herbicida que permite discrimi-nar entre plantas resistentes, intermediasy sensibles por simple inspección visualde las raíces durante la primera semana deincubación. Por otra parte se están estu-diando otros sistemas de selección in vitroen los que se utilizan pequeñas muestrasde tejidos vegetales. Estas metodologíaspermitirían seleccionar en forma rápida ysencilla un gran número de plantas enetapas tempranas del desarrollo, lo cualreduciría el tiempo y la cantidad de mate-rial a evaluar en los programas de mejora-miento.

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Radonic, L.M.; Zimmermann, J.M.; Zavallo, D.; López, N. y López-Bilbao, M*

Transformación genética degirasol con genes antifúngicos

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Instituto de Biotecnología, INTA Castelar. *mlopezbilbao@cnia.inta.gov.ar.Los autores Radonic y Zimmermann colaboraron por igual en este trabajo.

rgentina es el primer exportadormundial de aceite de girasol y sesiembran en promedio2.400.000 ha produciendo un

total de 4.000.000 t de grano y1.600.000 t de aceites. Una importantelimitación en este cultivo son las enferme-dades provocadas por hongos, funda-mentalmente la podredumbre del capítu-lo y la verticilosis, causadas por lospatógenos Sclerotinia sclerotiorum yVerticillium dahliae, respectivamente, lasque además de disminuir el rendimiento,afectan la calidad de los productos.

El mejoramiento genético convencionalno ha sido eficiente para incorporar resis-tencia a estas enfermedades, en parte porlas limitadas fuentes efectivas de resisten-cia genética a los principales patógenos yademás por el carácter poligénico de la re-sistencia frente a patógenos. Existe desdehace más de una década, la sólida eviden-cia de que la sobre-expresión de transge-nes codificantes para proteínas antifúngi-cas pueden conferir protección frente alataque de patógenos y que esta protecciónse ve aumentada debido al efecto sinérgi-co de la expresión de dos o más genes(Broglie y col., 1991; Melchers y col., 1993).El objetivo final de este trabajo es obtenerplantas de girasol que expresen al menosdos genes antifúngicos y luego evaluar elcomportamiento de las líneas obtenidas.Se utilizó el método de transformacióndesarrollado en el Instituto de Biotecno-logía (Radonic y col., 2006) y se trans-

formaron explantos del genotipo públi-co HA89.

Los genes utilizados codifican para dosenzimas que degradan la pared fúngica(glucanasa y quitinasa), una osmotina yuna proteína inhibidora del ensambladode los ribosomas del patógeno. Se utiliza-ron dos estrategias diferentes basadas en lautilización de distintos vectores de trans-formación para la introducción de los ge-nes antifúngicos. En el primer esquema elvector posee dos cassettes de expresión delos genes de interés, que por lo tanto seexpresan de a pares, además de expresar elgen marcador nptII, esta estrategia ya fueutilizada con éxito en otras especies vege-tales (Vellicce y col., 2005) En la segundaestrategia, el vector se basa en la capacidadde la proteasa codificada por el gen NIade un potyvirus de autoclivarse y recono-cer secuencias específicas de clivado.En este sistema los cuatro genes de interésse traducen en una única poliproteína bajola regulación de un único promotor flan-queado por la secuencia de reconocimien-to de dicha proteasa, esperando obtenerniveles de expresión equimolares de losmismos (Ceriani y col., 1998).

En este trabajo se observó una alta depen-dencia con el ADN que se quiere intro-ducir y una considerable inestabilidad gé-nica, donde plantas T1 que expresan eltransgen lo pierden en la siguiente genera-ción (características ya descriptas no sóloen la especie girasol sino también dentro

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del grupo taxonómico de las Compuestasal que pertenece esta especie).El volumen del trabajo realizado corro-boró la eficiencia del método de transfor-mación y selección en presencia de kana-micina donde no se obtuvieron escapes,ya que todos los brotes capaces de enrai-zar in vitro en presencia del antibiótico re-sultaron portadores del transgen. La cons-trucción doble capaz de expresar los genesde glucanasa y quitinasa mostró una efi-ciencia del 1,05% en la producción debrotes transgénicos. La T1 y T2 de estaslíneas están siendo caracterizadas molecu-larmente y permitirán analizar la respuestafrente a patógenos en ensayos de desafíoen condiciones controladas.

Bibliografía:

• Broglie K, Chet I, Holliday M, CressmanR, Biddle P, Knowlton S, Mauvais CJ andBroglie R (1991) Rhizoctonia Solani Sci 254:1194–1997.• Ceriani MF, Marcos JF, Hopp HE, BeachyRN. (1998). Plant Mol Biol 6[2]:239-48• Melchers LS, Sela-Buurlage MB, VloemansSA, Woloshuk CP, Van Roekel JSC, Pen J, vanden Elzen PJM and Cornelissen BJC (1993)Plant Mol Biol 21: 583–593.• Radonic LM, Zimmermann JM, ZavalloD, López N, López Bilbao MG. (2006) Elec-tronic J. of Biotechnology , Vol 9 (3): 315-319.• Vellicce G, Dýaz Ricci J, Hernández L,Castagnaro A. (2006) Transgenic Research15:57–68.

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Talia, P.1; Díaz Quijano, C.2; Nishinakamasu, V.1; Montenegro, A1; Hopp, H.E.1;Greizertein, E.2; Heinz, R.1; Poggio, L.2 y Paniego, N.1

Desarrollo de un mapa genético y físico de girasolintegrando marcadores neutros y funcionales

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1Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Castelar, CICVyA, Instituto deBiotecnología, CC 25 (B1712WAA) Villa Udaondo. Pcia. de Buenos Aires, Argentina.2Laboratorio de Citogenética y Evolución, Dep. de Ecología, Genética y Evolución.

n este trabajo se presenta la bús-queda de marcadores funcionales,la construcción de un mapa gené-tico de referencia sobre una po-

blación de líneas recombinantes endocria-das de girasol cultivado y el establecimien-to de técnicas de citogenética molecularpara definir la correlación cromosómicade los grupos de ligamiento de interésmediante la localización física de regio-nes codificantes y no codificantes pormedio de técnicas de hibridación in situcomo FISH (Fluorescente in situ hybri-dization) y/o Prins (Primed in situ labe-lling). Para la construcción del mapa ge-nético se trabajo sobre el mapa públicodescrito por Al-Chaarani et al. (2004) so-bre una población de 123 RILs obtenidasdel cruzamiento de RHA266 x PAC2sobre el cual se incorporaron 157 SSRsse obtuvo un mapa de AFLPs-SSRs(S. P. Kiani et al., 2007) que sirve demarco para el mapeo progresivo de marca-dores codominantes (SSRs funda-mentalmente), y la incorporaciónde marcadores funcionales comoEST-SSRs, INDELS y SNPs.

La identificación de marcadores funcio-nales de tipo EST-SSRs se llevó a cabomediante el análisis de 36.741 genestentativos (TC) definidos en el Indice deGenes de girasol cultivado (HAGI;www.dana farber) utilizando los programasde distribución pública «SSR Discovery»(La Trobe, University, Victoria, Austra-

lia) y CUGI-SSR. Sobre un total de1134 SSR identificados se seleccionaron127 para los que se diseñaron inicadorespara su amplificación por la técnica dePCR. Un 18 % de los EST-SSRs analiza-dos resultaron funcionales e informati-vos para los parentales de la poblaciónen estudio. Los datos de genotipifica-ción de 14 SSR-EST y 3 InDels sobre94 RILs fueron incluidos en una ma-triz de datos general que contiene410 AFLPs y 234 SSRs, obteniéndoseun mapa que integra 511 marcadores(197 SSRs, 9 EST/SSR, 1 InDel y 304 AFLPs)en 17 grupos de ligamiento. A partir deestos datos se estimó una densidad pro-medio de 3.7 cM por locus cubriendo1824.6 cM del genoma de girasol. Estevalor representa una cobertura de 96 %del genóma de girasol estimado según elmétodo de Chakravarti et al. (1991).

La mayoría de los marcadores previamentelocalizados en el mapa público de girasolde Tang et al. (2002) segregaron en losmismos grupos de ligamiento permitien-do estandarizar la nomenclatura a partirde los SSRs comunes a ambos mapas.Con el fin de establecer la correlación delmapa genético con el mapa físico de gira-sol se seleccionaron un conjunto de 32microsatélites distribuidos en 3 gruposde ligamiento para ser mapeados con latécnica de BAC-FISH en los cromoso-mas de girasol. La secuencia genómica deestos marcadores fue analizada con el

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programa «overgo 1.021 program» (http://www.mouse-genome.bcm.tmc.edu) para di-señar sondas de tipo overgo («overlap-ping oligonucleotide»). Las mismas fue-ron marcadas con nucleótidos radiacti-vos y combinadas en grupos de hastadoce sondas para la búsqueda de clonesde BACs usando una genoteca comercial(HA_HBa; CUGI BAC/EST ResourceCenter) que consta de 11 filtros y repre-senta 8,3 veces el tamaño del genoma degirasol. Se identificaron seis clones deBAC que contienen cinco marcadoresmicrosatélites respectivamente y que re-presentan a los 3 grupos de ligamientoseleccionados inicialmente. De manerapreliminar en el Laboratorio de Citoge-nética y Evolución, Facultad de CienciasExactas y Naturales de la UBA se realizóla técnica de BAC-FISH para uno de es-tos clones dando como resultado una

señal en la región satélite de un cromoso-ma submetacéntrico.

Bibliografía:

• S.P. Kiani et al., Genetic analysis of plantwater status and osmotic adjustment in re-combinanat inbred lines of sunflower undertwo water treatments, Plant Sci (2007),doi:10.1016/j.plantsci.2006.12.007.• Tang et al., Simple sequence repeat mapof the sunflower genome. Theor Appl Ge-net (2002), 105:1124–1136.• Chakravarti et al., A maximum likelihoodmethod for estimating genome length usingenetic linkage data. Genetics (1991),128:183-193.• G. Rachid Al-Chaarani et al., Genotypicvariation and identification of QTLs for agro-nomic traits, using AFLP and SSR markersin RILs of sunflower (Helianthus annuus L.).Theor Appl Genet (2004), 109: 1353-1360.

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Ureta, M.S.1,2; Presotto, A.1,2; Cantamutto, M.1,3; Carrera, A. D.1,2 y Poverene, M.1,2

Aptitud de plantas de girasol silvestre yde sus híbridos con girasol cultivado IMI resistente

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1Dpto. Agronomía UNS 2CERZOS-CONICET 3Centro UdL-IRTA, Lleida, España

a tecnología Clearfield®, que otor-ga tolerancia a principios activosde la familia imidazolinonas, pro-veniente de una mutación natural

en plantas de girasol silvestre, ha sido in-corporada recientemente en el cultivocomercial de girasol. Helianthus annuussilvestre es una invasora naturalizada ennuestro país que comparte grandes ex-tensiones y el ciclo de floración con elcultivo. Se aplicó el herbicida imazapiren el estadio de cuatro hojas en una dosisde 160g p.a./ha a plantas de cinco po-blaciones naturalizadas de H. annuus y adescendientes F1 de plantas de las mis-mas poblaciones polinizadas manual-mente con un híbrido comercial tole-rante.En las poblaciones silvestres se registróun 2 % de sobrevivientes sobre un totalde 307 plantas, mientras que la supervi-vencia de la F1 aumentó al 38 % en 350plantas (Ureta et al. BAG 17, 2006).

El objetivo de este estudio fue compararla aptitud biológica de plantas silvestres ysus descendientes F1 y R1. En 2005-06se realizaron en el campo experimentaldel Depto. Agronomía UNS retrocruzasentre plantas F1 IMI-resistentes y su pa-rental cultivado, DK3880CL (R1). En2006-07 se evaluaron conjuntamente enel campo experimental, plantas F1, R1 yplantas silvestres de las respectivas pobla-ciones naturales, en un ensayo completa-

mente aleatorizado sin competencia. Lasvariables registradas fueron: número ydiámetro de capítulos, número de semi-llas llenas y vanas. Las plantas silvestres delas cinco poblaciones se diferenciaron delas F1 por tener mayor número de capí-tulos, pero las F1 tuvieron en general unmayor tamaño de capítulo.

Se encontraron diferencias altamente sig-nificativas entre las poblaciones y las F1con respecto al número de semillas lle-nas. Las poblaciones puras no difirieronen el porcentaje de semillas cuajadas, quefue significativamente mayor que en cua-tro de las cinco F1.

La comparación de cada una de las po-blaciones silvestres y sus correspondien-tes F1 mostró diferencias altamente sig-nificativas en el número de capítulos, nú-mero de semillas llenas y porcentaje desemilla cuajada, tres importantes compo-nentes de la aptitud en estadio reproduc-tivo (T(T(T(T(Tabla 1abla 1abla 1abla 1abla 1).

La regresión del número de semillas lle-nas respecto al diámetro de capítulo agru-pando las poblaciones y sus híbridosmostró que la relación fue mucho mayoren las poblaciones puras.

En las F1 el aumento en diámetro delcapítulo no fue acompañado de mayornúmero de semillas llenas (F(F(F(F(Figura 1)igura 1)igura 1)igura 1)igura 1).

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Tabla 1 Comparación de caracteres reproductivos entre poblaciones de H. annuus silvestre y susrespectivas F1 por cruzamiento con un híbrido comercial IMI resistente. Medias seguidas de distinta letraindican diferencias altamente significativas luego de la prueba de Kruskal-Wallis

Figura 1 Regresión del número de semillas y eldiametro del capítulo en plantas silvestres (símbolosgrises) y F1 del cruzamiento con un híbridocomercial IMI resistente (símbolos anaranjados)

La retrocruza con el parental cultivadoIMI aumentó el número de semillas lle-nas con respecto a la F1, encontrándosediferencias altamente significativas entrelas plantas silvestres, las F1 y las R1, entanto no afectó el número ni el tamañode los capítulos. El carácter IMI difundi-ría rápidamente en la población silvestrey las plantas F1 tendrían menor aptitudbiológica aunque resta comprobar si estase recupera en las siguientes generacionescomo lo indicaría la R1.

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Zavallo, D.; Peluffo, L.; Hopp, H.E.; López Bilbao, M. y Heinz. R.*

Búsqueda y caracterización de genesque se expresen en semilla de girasol

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Instituto de Biotecnología CNIA INTA CC25 Castelar, Buenos Aires, Argentina.* rheinz@cnia.inta.gov.ar

a identificación de promotores, quedefinan un patrón de expresión es-pacio-temporal específico es fun-damental para la generación de plan-

tas transgénicas en la producción de com-puestos farmacéuticos (Molecular Farming)y alimentos nutracéuticos, siendo las se-millas un «embalaje» muy conveniente paraeste fin. Se propuso como objetivo de tra-bajo buscar regiones promotoras capacesde dirigir la expresión de transgenes en se-millas de girasol. Los genes candidatos ele-gidos son el gen Ha-LTP5, que codificapara una proteína de transferencia de lípi-dos (Regente y de la Canal, 2003), el genFAD2-1 que codifica para una oleato des-aturasa (Martínez-Rivas y col., 2001) degirasol, y un gen correspondiente a una se-cuencia expresada parcial o «EST»(BU6711910) (Fernández y col., 2003) quepor análisis comparativo de secuencias pre-senta similitud con una nsLTP. El cDNAcompleto de la nsLTP fue clonado por latécnica de 5´RACE. Se realizó un perfil deabundancia de transcriptos basado en latécnica de RT-PCR con oligonucleótidosiniciadores específicos para amplificar cadasecuencia candidato. Los perfiles de expre-sión fueron confirmados mediante experi-mentos de Northen blot, utilizando son-das radioactivas especificas de cada gen.

Para determinar la especificidad de la ex-presión de estos genes candidatos se anali-zaron distintos órganos de la línea HA89:hoja (H) y tallo (T) de planta adulta (3meses de edad), botón floral en estadio

(R1), (R2) y (R3) y semilla seca (S). En losensayos de RT-PCR y Northern blot no seobservó amplificación o señal radioactiva,en los órganos vegetativos para ninguno delos tres genes. El gen Ha-LTP5 solo pre-senta expresión en semilla seca (S) mien-tras que los genes FAD2-1 y nsLTP tam-bién lo hacen en los estadios de botón flo-ral. La expresión específica en semilla seca(S) del gen Ha-LTP5 lo posiciona comocandidato para los objetivos del trabajo.

Sin embargo los otros genes, al expresarsedurante el desarrollo floral y en semilla re-sultan interesantes para el aislamiento ycaracterización de su región promotora yaque podrían estar involucrados en el pe-riodo de llenado de grano.

Para determinar tanto el momento del de-sarrollo como la extensión de la etapa deexpresión de estos genes y así poder esta-blecer una asociación con el periodo de lle-nado de grano, es necesario evaluar un nú-mero mayor de estadíos de desarrollo. Unavez determinados estos genes candidatosse relevará una genoteca de girasol cons-truída en BACs (Gentzbittel y col., 2002;CUGI, Clemson University, USA http://www.genome.clemson.edu/).

Los clones BAC positivos se caracteriza-rán, subclonarán y secuenciarán para laidentificación de las regiones promotoras,trabajo que se está realizando en paralelocon esta caracterización de genes. Luegode su obtención, se generará una serie de

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deleciones por digestión con endonuclea-sas y se realizarán construcciones utilizan-do distintos fragmentos de la región pro-motora fusionados a genes indicadores conel fin de caracterizar cajas de regulacióntemporal/espacial en dichas regiones pro-motoras.

Bibliografía:

• Fernández P, Paniego N, Lew S, Hopp HE,Heinz R Differential representation of sunflo-wer ESTs in enriched organ-specific cDNA li-braries in a small scale sequencing project.BMC Genomics 2003, 4:40 (2003).

• Gentzbittel L, Abbott A, Galaud J.P, GeorgiL, A bacterial artificial chromosome (BAC) li-brary for sunflower, and identification of clo-nes containing genes for putative transmem-brane receptors. Mol. Genet. Genomics 266:979-987 (2002).-Regente M, de la Canal L, AcDNA encoding a putative lipid transfer pro-tein expressed in sunflower seeds. J. Plant Phy-siol. 160. 201–203 (2003).• Martínez-Rivas J, Sperling P, Lühs F andHeinz E, Spatial and temporal regulation ofthree different microsomal oleate desaturasegenes (FAD2) from normal-type and high-oleicvarieties of sunflower (Helianthus annuus L.).Molecular Breeding 8: 159–168, (2001).

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