SEMINARIO PRÁCTICAS

Colinesterasa del suero un ejemplo de determinación de actividad

enzimática y cálculos cinéticos

Javier Sáez Valero

1. Colinesterasas: acetilcolinesterasa y butirilcolinesterasa1.1. El Sistema colinérgico y el papel de acetilcolinesterasa (AChE)1.2. Butirilcolinesterasa (BuChE), potencial papel fisiológico

2. Determinación de la actividad colinesterasa por el método de Ellman2.1 El uso de inhibidores y sustratos específicos

3. La práctica3.1. Los Objetivos3.2. El Protocolo3.3. Los cálculos enzimáticos

4. La seguridad en el laboratorio de investigación

Colinesterasas

Enzimas que hidrolizan preferentemente los ésteres de colina. Serin-esterasas(y por ser inhibidos pro fisostigmina, eserina, 10-5M) Inh irreversible por organosfosforados

Acetilcolinesterasa: AChE Butirilcolinesterasa: BuChEEC 3.1.1.7 EC 3.1.1.8(gen cromosoma 7) (gen cromosoma 3)

Según la (IUBMB) Unión internacional de Bioquímica y Biología Molecular, los estractos enzimáticos pueden nombrarse por un número de identificación consistente en las letrasEC seguidas de 4 digitos (separados por puntos), que corresponderían por orden: el primero a la clase (de las 6 existentes), el segundo a la subclase, el tercero a la sub-subclase y el cuarto número identificaría al enzima concreto.

Clasificación y nomenclatura de enzimas

Normalmente se añade el sufijo -asa al nombre del sustrato o biena una palabra que describe la reacción

Glucosa-6-PIsomerasa

óHexosa-PIsomerasa

Todas las enzima nombres del E.C. y además nombres sencillos

1. Óxido-reductasasReacciones de oxido-reducción

2. TransferasasTransferencia de grupos

funcionales

3. HidrolasasReacciones de hidrólisis(rotura de enlaces por

adición de H2O)

4. LiasasAdición de grupos a los dobles

enlaces o eliminación grupos para formar dobles enlaces

5. IsomerasasReacciones de isomerización

(reordenamientos moleculares)6. Ligasas

Formación de enlaces entre 2 sustratos, con aporte de ATP

grupos aldehidos gupos acilos grupos glucosilos grupos fosfatos (kinasas)

Transforman polímeros en monómeros.Actuan sobre: enlace éster enlace glucosídico enlace peptídico enlace C-N

Entre C y C Entre C y O Entre C y N

Entre C y O Entre C y S Entre C y N Entre C y C

-Deshidrogenasas.-Oxidasas.-Reductasas.-Peroxidasas-Catalasas.-Oxigenasas.-Hidroxilasas.

Transaldolasas, Transcetolasa.Acil-, metil-, glucosil-, fosforiltransferasas.Quinasas.Fosfomutasas.Esterasas.Glucosidasas.Peptidasas.Fosfatasas.Tiolasas.Fosfolipasas.Amidasas.Desaminasas.Ribonucleasas

Descarboxilasas.Aldolasas.Hidratasas.Deshidratasas.Sintasas.Liasas.

Racemasas.Epimerasas.Isomerasas.Mutasas (no todas).

Sintetasas.Carboxilasas

Si una molécula se reduce, tiene que haber otra que se oxide

Cada una de las 6 clases se subdivide en varias subclases y cada subclase en sub-subclase:

Ej: Acetilcolinesterasa (AChE) EC 3 - HidrolasaEC 3.1 – Actúa sobre enlace esterEC 3.1.1 – Hidrolasa de ester carboxílicoEC 3.1.1.7 – Acetilcholinesterasa

(Esterasa de acetilcolina)Reacción:

acetilcolina + H2O = colina + acetato

Sistema colinérgico

La función de la acetilcolinesterasa (AChE)es la inactivación rápida del neurotransmisor acetilcolina después de su liberación en las sinápsis colinérgicas

Además se localiza en tejidos desprovistos de colina, por lo que se le atribuyen otras funciones

EC 3.1.1.7

AChE

La enzima colinacetiltransferasa (ChAT) acetila la colina (Ch) utilizando acetil-coenzimaA (Acetil-CoA) para formar el neurotransmisor acetilcolina (ACh).

La ACh, que se libera mediante vesículas sinápticas y la participación del transportador vesicular de ACh (VAChT).

La ACh liberada al espacio sináptico puede interactuar con receptores colinérgicos muscarínicos o nicotínicos.

Finalmente, ACh es hidrolizada por acetilcolinesterasa (AChE) para producir acetato (A) y Ch.

La Ch es recaptada por la neurona presináptica por un transportador de Ch de alta afinidad (ChT).

La Sinápsis Colinérgica

ChAT

AChE en PATOLOGÍA

La miastenia gravis (debilidad muscular) Enfermedad neuromuscular autoinmune (se generan anticuerpos contra receptores de ACh) y Crónica: debilidad de los músculos esqueléticos causada por un defecto en la transmisión de los impulsos nerviosos a los músculos (tratamiento con Inhib AChE)No confundir con miastenia congénita sináptica, EAD (Endplate acetylcholinesterase deficiency) o síndrome miasténico congénito de Engel: déficit de Col Q(NUNCA administrar Inhib AChE!!!)

La Enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa:deterioro cognitivo y trastornos conductuales.El sistema colinérgico es el más afectado por la patología (papel de ACh en memoria)

BuChE o colinesterasa del suero

La función fisiológica de la Butirilcolinesterasa (BuChE) se desconoce

Puede hidrolizar acetilcolina, aunque sin potencial papel en la sinápsis colinérgica (condiciones normales)

Presente en casi todos los tejidosEspecialmente abundante en suero

EC 3.1.1.8

BuChE en PATOLOGÍA BuChE puede hidrolizar algunos ésteres de colina, los cuales pueden ser drogas como Procaína*, tetracaína*, aspirina, heroína y cocaína

También se ha propuesto que puede servir de “barrera” ante el envenenamiento por organosfosforados

La actividad BuChE puede estar completamente ausente en individuos con mutaciones genéticas: fenotipo silente

Individuos SIN patología pero NO pueden hidrolizar algunos compuestos de uso en medicina (*): anestésico suxametonium

BuChE es especialmente abundante en el suero siendo sintetizada en el hígado por lo que la disfunción hepática cursa con niveles bajos de actividad BuChE

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD COLINESTERASA POR EL MÉTODO DE ELLMAN

+

(CH3)3N-CH2-CH2-S -CO-CH3+

acetiltiocolina

AChE

+

tiocolina(CH3)3N-CH2-CH2-S

-+

acetato+ 2H +3CH -COO-

butiriltiocolina

BuChE(CH3)3N-CH2-CH2-S -CO -CH3

+-CH2-CH2

tiocolina

+(CH3)3N-CH2-CH2-S

-+

butirato2H +

3CH -COO-CH2-CH2-

BW

Iso-OMPA

Basado en la oxidación de grupos tioles libres por un compuesto cromogénico un tioanálogo del sustrato preferente (ATCh/BuTCh)

BuChE

AChEX

X

5-tio-2-nitrobenzoato

COO

NO2S

-

-

conjugado

COO

(CH3)3N-CH2-CH2-S-S NO2+

-

+

Cromóforo412 nm

COO

NO2S

-

-

DTNB

-

S

COO

NO2

S

COO

NO2

-

+tiocolina

(CH3)3N-CH2-CH2-S-+

La tiocolina reacciona rápidamente con el DTNB (5-tio-2-nitrobenzoato)muestra un color amarillo intenso y un máximo de absorbancia a 412 nm

Análisis de actividad enzimática: espectrofotómetros

Un espectrofotómetro tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Permite al operador realizar dos funciones:1. Da información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra (ej AN Abs 260 nm)2. Indica indirectamente que cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en la muestra

Lector de placa permite adaptar los métodos y evaluar simultáneamente gran número de muestras (placas de 96 pocillos)

Objetivos (El alumno habrá de ser capaz de):

Medir actividades enzimáticas por técnicas colorimétricas.

Representar gráficamente el curso temporal de la reacción y valorar la linealidad del proceso.

Calcular actividades enzimáticas, expresando el resultado en unidades de actividad enzimática.

Observar una cinética michaeliana y representar la curva de velocidad frente a concentración de sustrato.

Determinar las constantes cinéticas por la representación de Lineweaver-Burk.

La práctica…

Ensayo de actividad enzimática1) La formación de producto con el tiempo. 2) El efecto de la concentración de sustrato.

Procedimiento: Preparar la tanda de 6 tubos (más un tubo para al ‘autocero’) según el protocolo 1º disolución de DTNB (breve incubación)2º el volumen de sustrato (butiril-tiocolina) + el volumen de agua para completar.Antes de la primera medida de actividad, preparar una cubeta sólo con 2 ml de agua y 1 ml de DTNB (volumen total 3 ml), y usarla para hacer el ‘autocero’ del colorímetro3º ‘Disparar’ la reacción con la enzima.

La práctica…

3º ‘Disparar’ la reacción con la enzima.(tubo a tubo NO todos de golpe…)

Anotar cada 20 sg (durante 3 min)el valor de absorbancia (a 410 nm)

* Es preferible iniciar la reacción añadiendo el sustrato, pero en esta práctica conviene dispararla con la enzima. Ello nos lleva a ‘despreciar’ el valor de hidrólisis espontánea: los grupo tioles libres presentes en proteínas de la muestra, los cuales al reaccionar también con el DTNB pueden alterar la medida enzimática. Se evita, en parte, incubando las muestras con el DTNB, antes de añadir el sustrato.*La adición de inhibidores es necesaria si la muestra puede contener AChE y BuChE; si sólo una de ellas está presente, como es el caso, se pueden omitir.

La práctica…

dtPd

dtSdvVelocidad

Reacción: S P

Perfil de Velocidad o Curva de Progreso

Curva de progreso:Determina vo experimentalmente (para cada [S])[S] ajustable por el investigador

Cinética Enzimática: Velocidad de transformación de reactivos en productosMétodo de estudio del mecanismo de una reacción: estudio de la velocidad de la reacción(y su variación en respuesta a cambios en los parámetros experimentales)Las enzimas modifican las velocidades de las reaccionesLa velocidad se expresa como cambio en [S] (o aparición de P, cambio en [P]) por unidad de t

P

Tiempo

S

S

vo

vo

Representación de la Ecuación de Michaelis-Menten

*

Para conocer la concentración de sustrato final en cada uno de los tubos, aplicar:Vi × Si = Vf × Sf

Por ejemplo, para el tubo 1: 0.05ml ×6mM = 3ml × S1 (S1 = 0.1 mM)

CÁLCULOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICAUnidad Internacional (U): Cantidad de enzima que transforma 1 micromol de sustrato por min.

1 UNIDAD = 1 U = 1 μmol / min

La relación absorbancia - concentración sigue la Ley de Lambert-Beer:Absorbancia = ε C L C = Abs / ε L(espesor)

siendo ε= coeficiente de extinción molar del cromóforo (1,36×104 litro/ mol cm).C = concentración molar de producto formado (moles / litro).L = longitud del paso óptico de la cubeta (1 cm).

En la práctica (para nuestra reacción colorimétrica): C = Abs /1,36×104 (moles / litro)

Cálculos

Promediar Incremento absorbancia (∆Abs) frente a tiempo (min), ∆Abs /min,comprobando linealidad gráficamente,

Dividiendo este valor por ε y por L nos dará el valor de ∆C/min (∆C es el incremento de producto).

A continuación, calculad la actividad enzimática, sabiendo el coeficiente de extinción del cromóforo, empleando la expresión:

Actividad en U/ml (µmol.min-1.ml-1) = [(∆Abs/min)×103×Vt] / [1.36×104 × Vm]Donde Vt es el volumen total en la cubeta, y Vm el volumen de muestra (enzima). 103 es una factor de conversión.

Para simplificar los cálculos, conviene calcular un factor “f” tal que: Actividad en U/ml (µmol.min-1.ml-1) = (∆Abs/min)×f

Calcular dicho factor f para nuestros ensayos

Cálculos

Representar gráficamente la absorbancia frente al tiempo para cada uno de los tubos y obtener la recta que mejor se ajusta a los puntos:calcular el ∆Abs/min

Calcular la actividad enzimática en U/ml suero (μmol/min /ml suero)- Valores ∆Abs/min, v, 1/v, [S], 1/ [S] - Gráfica de v frente a S y 1/v frente a 1/S.

- Valor obtenido de KM y Vmáx .

Resultados

Representación de la Ecuación de Michaelis-Menten

*

A partir de 6-8 puntos experimentales, puede considerarse fiable ladeterminación gráfica de KM y Vmax por este método

En la práctica no suelen calcularse la Vmax ni la KM a partir de la curva de saturación, es poco preciso

1

21

kkkKM

Si k2<<k-1:a

M KkkK 1

1

1

-Significado de KM :su valor es próximo a la [S] que suelen darse en condiciones fisiológicas. Esto permite la regulación de la actividad del enzima en respuesta a pequeñas variaciones de pH, Tª, fuerza iónica, ….-Sería la [S] a la cual el enzima trabaja a la mitad de suvelocidad máxima. Tiene unidades de concentración (M)

Km

Vmax

Vmax

2

S

Vel

ocid

ad in

icia

l v0

Gráfica Michaelis-Menten

La KM puede ser un indicador de la afinidad de unión del enzima por el sustrato

La KM y la Vmax son únicas para cada actividad enzimática en unas condiciones de pH y Tª determinadas

-Es un proceso bifásico:KM: da información sobre la fase de fijación del sustrato E+SES.Vmax: da información sobre la fase catalítica (cinética de paso de SP).

-Significado de vmax :La vmax revela el número de recambio de la enzima

-(La Constante catalítica ó) El Número de recambio (turnover):Número de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo y porcada molécula de enzima, en condiciones de saturación(U/mol de enzima ó mol de Sustrato X min.-1 X mol de enzima-1)

Si hay S >>>> E, todo E está como ES y la kcat ~ k2

1.- ¿Por qué es mejor usar butiriltiocolina que acetiltiocolina para medir la actividad de butirilcolinesterasa?

¿Y por qué butiriltiocolina y no butirilcolina? ¿Por qué prescindimos de inhibidores de colinesterasas?

2.- ¿La enzima ensayada da una respuesta lineal de formación de producto con el tiempo?¿La enzima ensayada, cumple la ecuación de Michaelis - Menten?

3.- En hojas aparte deberá presentar un informe, que contenga los cálculos ya comentados:

- La tabla de Resultados.- Gráfica de absorbancia frente a tiempo. - Tabla con valores de Abs/min, v, 1/v, [S], 1/ [S] - Gráfica de v frente a S y 1/v frente a 1/S.- Valor obtenido de KM y Vmáx .

Cuestionario - Informe

Directrices para laboratorios básicos – niveles de bioseguridad 1 y 2

Protección personal

En el laboratorio SIEMPRE ATENTOS!!

Directrices para laboratorios básicos – niveles de bioseguridad 1 y 2Procedimientos1. Estará estrictamente prohibido pipetear con la boca.2. No se colocará ningún material en la boca ni se pasará la lengua por las etiquetas.3. Todos los procedimientos técnicos se practicarán de manera que se reduzca al mínimo la formación de aerosoles y gotículas.4. Se limitará el uso de jeringuillas y agujas hipodérmicas, que no se utilizarán en lugar de dispositivos de pipeteo ni con ningún fin distinto de las inyecciones por vía parenteral o la aspiración de líquidos de los animales de laboratorio.5. Todos los derrames, accidentes y exposiciones reales o potenciales a materiales infecciosos se comunicarán al supervisor del laboratorio. Se mantendrá un registro escrito de esos accidentes e incidentes.6. Se elaborará y seguirá un procedimiento escrito para la limpieza de todos los derrames.7. Los líquidos contaminados deberán descontaminarse (por medios químicos o físicos) antes de eliminarlos por el colector de saneamiento. Puede ser necesario un sistema de tratamiento de efluentes, según lo que indique la evaluación de riesgos del agente con el que se esté trabajando.8. Los documentos escritos que hayan de salir del laboratorio se protegerán de la contaminación mientras se encuentren en éste.

Directrices para laboratorios básicos – niveles de bioseguridad 1 y 2Procedimientos

Directrices para laboratorios básicos – niveles de bioseguridad 1 y 2

Zonas de trabajo del laboratorio1. El laboratorio se mantendrá ordenado, limpio y libre de materiales no relacionados con el trabajo.2. Las superficies de trabajo se descontaminarán después de todo derrame de material potencialmente peligroso y al final de cada jornada de trabajo.3. Todos los materiales, muestras y cultivos contaminados deberán ser descontaminados antes de eliminarlos o de limpiarlos para volverlos a utilizar.4. El embalaje y el transporte de material deberán seguir la reglamentación nacional o internacional aplicable.5. Las ventanas que puedan abrirse estarán equipadas con rejillas que impidan el paso de artrópodos.

Seamos Profesionales!!(=responsables)

Los cuadernillos de practicas deben entregarse al profesor responsable de la práctica al concluir la misma, con

el nombre del alumnos, así del compañero