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Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016)

4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación

Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016


Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016 Memorias

Separación y semi-síntesis de compuestos con posible actividad

biológica.

Gervacio Javier Marcelino (Becario) Universidad Autónoma de Guerrero (UAGro)

Unidad Académica de Ciencias Naturales Programa de Verano UAGro [email protected]

Área en la que participa: II Biología y Química

Dra. Laura Patricia Álvarez Berber (Asesor) Profesor-Investigador del Centro de Investigaciones Químicas-IICBA

Universidad Autónoma del Estado de Morelos (UAEM) [email protected]

Resumen

El ácido ursólico (ácido 3b-hidroxiurs-12-en-28-oico) es un triterpeno ampliamente conocido por

su variada gama de actividades biológicas. Este ácido fue aislado de su fuente natural, la planta

medicinal Astianthus viminalis (Bignoneasea). Se realizaron modificaciones a la estructura base

del ácido ursólico por medio de reacciones de oxidación y esterificación, lo que permitió la

obtención de los compuestos 3 y 5. Estos compuestos se purificaron mediante cromatografía en

columna y se utilizó la cromatografía en capa fina para el monitoreo de las fracciones obtenidas.

Los compuestos semi-síntetizados se identificaron por medio de resonancia magnética nuclear de 1H y 13C. Se sugiere que los compuestos obtenidos con las transformaciones realizadas puedan

presentar una buena actividad biológica.

Palabras Clave: Triterpenos, Ácido Ursólico, Derivados Semisintéticos.



Introducción

Actualmente la búsqueda de compuestos con un posible efecto farmacológico es constante.

Las plantas por su parte, son conocidas por producir una variedad de metabolitos biactivos que se

utilizan en el tratamiento de diversas enfermedades. Un ejemplo de estos compuestos son los

metabolitos secundarios, estos tienen un papel importante en la regulación de las interacciones de

la planta con el ambiente que la rodea. Se estima que más del 40% de los medicamentos tienen sus

orígenes en productos naturales. Es importante mencionar que el mecanismo de acción de estas

moléculas bioactivas, puede abrir nuevas vías para el desarrollo o mejoramiento de nuevos

enfoques terapéuticos. (Kashyap, Tuli & Sharma, 2016; Babalola & Shode, 2013)

Un grupo de productos naturales que ha tenido una destacada importancia biológica son los

triterpenos pentaciclicos. Algunos ejemplos de estos compuestos con actividad reportada son, el

ácido betulínico (AB), ácido oleanólico (AO) y ácido ursólico (AU) que se encuentra

abundantemente en plantas, especialmente en hortalizas. Se caracterizan por tener propiedades

como anti-inflamatorio, tripanocida, antirreumático, antiviral, antioxidante, antitumoral y muchas

otras actividades. Estos compuestos farmacológicamente activos han ganado la atención debido a

su índice terapéutico prometedor. (Sandeep y Rajesh, 2015)

Mencionado anteriormente, el ácido ursólico (AU) es un producto natural que representa

uno de los componentes principales de algunas hierbas, utilizadas en la medicina tradicional. El

AU exhibe una amplia gama de actividades biológicas dentro de las que se destacan su potencial

como antiinflamatorio, antiproliferativo, proapoptótico, antimetastásico y antiangiogénico. (Wang,

Jiang, Xiang, Li, Ou, Yang, Shao, Lu, Lin, Chen, Dai y Jia, (2014); Shanmugam, Dai, Prem, Tan,

Sethi y Bishayee (2013)

Estos antecedentes sugieren que el ácido ursólico podría tener un enorme potencial en el

desarrollo de un compuesto bioactivo, que pueda ser candidato para el desarrollo de un fármaco.

Kow, Lee, Chung, Kim y Lee (2009), proponen la realización de modificaciones en la estructura

base de este triterpeno, para la mejora de su actividad biológica, en este caso antiinflamatoria.

Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016)

Figura 1. Modificaciones realizadas por Kow, T. y colaboradores (2009) a la estructura base del triterpeno ácido ursólico, para mejorar la actividad antiinflamatoria. Fuente: Elaboración propia.

Materiales y Métodos

En general todos los reactivos utilizados, fueron obtenidos por proveedores comerciales

y se utilizaron sin purificación adicional. La evolución de las reacciones se observó mediante

cromatografía en capa fina (CCF) utilizando cromatofolios de aluminio de silicagel 60 F254 marca

Merck dotados con indicador UV a 254 nm. La purificación de cada crudo de reacción, realizó

mediante el uso de cromatografía en columna (CC).

Los metabolitos y crudos de reacción obtenidos a partir del presente trabajo, se encontraban

en mezcla por lo que fue necesaria su separación, la separación se realizó por medio de

cromatografía en columna (CC) utilizando gel de sílice, específicamente Sílica Flash (Merck grado

9385, 230-400) como fase estacionaria, los disolventes orgánicos empleados como fase móvil en

la purificación fueron previamente destilados y utilizados en mezclas según el caso. La

cromatografía en capa fina (CCF) de gel de sílice se utilizó como herramienta para el monitoreo

del fraccionamiento realizado en cromatografía en columna (CC), utilizando como revelador

sulfato cérico al 1% en ácido sulfúrico 2N y lámpara UV (Figura 2).



Figura 2. Metodología descrita mediante imágenes, que muestran los pasos a grandes rasgos del trabajo realizado después de cada reacción, para obtener un producto puro. Fuente: Elaboración

Propia.

Metodología de reacciones

Oxidación de la mezcla natural de ácido ursólico y ácido oleanólico.

La mezcla natural de ácido ursólico y oleanólico fue obtenida de la planta astianthus

viminallis, se partió de un gramo de la mezcla natural de estos triterpenos utilizando la siguiente

metodología: En un matraz redondo de 100 mL provisto de agitación se colocaron 0.5 g (1.15e-3

mol) de la mezcla ácido ursólico- ácido oleanólico y se adicionaron 15 mL de CH2Cl2, la solución

se colocó en un baño de hielo y se añadió gota a gota una disolución que contenía 1.5 eq (0.2833

g) de AMCPB en 15 mL de diclorometano. Finalizada la adición, la mezcla resultante se mantuvo

en agitación a temperatura ambiente durante 24 horas. El crudo de reacción fue neutralizado por

medio de una solución concentrada de Na2CO3 y extraído por triplicado con 30 mL de CH2Cl2, el

crudo de reacción fue purificado por medio de cromatografía en columna hexano:acetato de etilo

(85:15).

Oxidación del ácido ursólico (1) y compuesto 4

Preparación del reactivo de Jones:


En un matraz redondo de 100 mL provisto de agitación magnética, se adicionaron 0.22g de

CrO3, a continuación el matraz fue colocado en un baño de hielo y se agregaron gota a gota 0.2

ml de H2SO4 concentrado, la mezcla resultante se diluyo con 2 ml de H2O y se mantuvo a esta

temperatura por 30 minutos.

Se preparó una solución de compuesto (1 o 4) con 7 ml de Acetona, la mezcla se colocó en

un baño de hielo y gota a gota se realizó la adición del reactivo de Jones hasta que se mantuvo el

color anaranjado-café, posteriormente se agregó metanol gota a gota hasta la desaparición del color

y se adicionaron 10 ml de una solución de NaOH. La mezcla se transfirió a un embudo de

separación y se extrajo con 30 ml de Diclorometano por Triplicado, el disolvente se eliminó a

presión reducida en un rotavapor obteniéndose el derivado correspondiente, el crudo de reacción

se purifico en cromatografía en columna Hexano:Acetato de Etilo (95:5).

Lactonizacion del Anillo A para los compuestos 2

A partir del compuesto 2

En un matraz de 100 mL provisto de agitación magnética, se agregó 0.0713 g del

compuesto 2 y se disolvió con 5 mL de CHCL3, la mezcla se colocó en agitación en baño de

hielo. Por otra parte se pesó la cantidad de 0.0814g de AMCPB y se solubilizo en 2 mL de CHCl3.

Posteriormente se añadió gota a gota al matraz anterior y se mantuvo durante 30 min a esa

temperatura, transcurrido este tiempo la mezcla de reacción se agito a temperatura ambiente

durante 72 hora. El crudo de la reacción se neutralizo con Na2CO3, realizando extracciones por

triplicado con 30 mL de CHCL3, el crudo de reacción se purifico por medio de cromatografía en

columna en Hexano:Acetato de Etilo (85:15).

Esterificación con yoduro de metilo del compuesto 1

En un matraz bola con agitador magnético se colocaron 0.1028 g de ácido ursólico y

0.03732 g (1.2 eq) de K2CO3 la mezcla se solubilizo con 6 mL de CHCl3 en un baño de hielo con

agitación 15 minutos, después se adiciono gota a gota 2 mL de DMF y pasados 10 min se

adicionaron 0.029 mL de yuduro de metilo. El matraz se mantuvo a temperatura de reflujo durante

2 horas. El crudo de reacción se purifico en cromatografía en columna en Hexano:Acetato de etilo

(99:1).



Técnicas de caracterización de los compuestos obtenidos

Los espectros de resonancia magnética nuclear de protón (RMN 1H), carbono 13 (13C), se

determinaron en el equipo Varian UNITY de 400 MHz, empleando como disolvente principal

cloroformo deuterado (CDCl3), los desplazamientos químicos (δ) están reportados en partes por

millón (ppm), las constantes de acoplamiento (J) en Hz y la multiplicidad de las señales está

indicada por medio de las siguientes abreviaturas: (s) singulete, (d) doble o doblete, (t) triple, (c)

cuarteto, (dd) doble de doble y (m) múltiple.

Resultados

Los resultados de las reacciones realizadas fueron los siguientes:

Tabla 1. Transformaciones realizadas y rendimientos obtenidos en cada una.

Reacción Rendimiento Compuesto obtenido

Oxidación 1 57.21% Compuesto 1

Oxidación 2 70% Compuesto 2

Reacción de Baeyer-Villiger 3 31% Compuesto 3

Esterificación 4 78.4% Compuesto 4

Oxidación 5 84% Compuesto 5

Figura 3. Compuestos semisíntetizados e identificados por medio de RMN 1H y 13C. Fuente: Autoría Propia


Datos espectroscópicos compuesto 3 y 5

Tabla 2. Datos obtenidos de los espectros de RMN 1H y 13C, para el compuesto 3.

RMN 1H (CDCl3, 400 MHz):ᵟ (ppm) 5.20 (pseudo-t,J=3.6,3.6, H-12); 2.53 (m, H-2); 2.14

(d,J=11.2 Hz, H-18); 1.40 (s, H-23); 1.34 (s, H-24); 1.07 (s, H-25); 1.01 (s, H-27); 0.89 (d,J= 6

Hz, H-29); 0.79 (d,J= 6.4 Hz, H-30); 0.76 (s, H-26).

RMN 13C (CDCl3, 100 MHz): ᵟ (ppm) 182.80(C, C28); 175.60 (C, C3); 138.08 (C, C13); 125.84

(CH, C12); 86.53 (C, C4); 54.86 (CH, C5); 52.81 (CH, C18); 48.23(C, C17); 47.63 (CH, C9);

42.46(C, C14); 40.01 (CH2, C1); 39.77(C, C8); 39.27 (CH, C19); 39.00 (CH, C20); 38.43 (C, C10);

36.85 (CH2, C22); 32.53 (CH2, C2); 32.30 (CH2, C7); 30.81(CH2, C21); 28.08 (CH2, C15); 26.00

(CH3, C23); 24.26 (CH2, C16); 23.84 (CH2, C11); 23.55 (CH3, C27); 23.14 (CH3, C24); 21.34(CH3,

C30); 21.34 (CH2, C6); 17.32 (CH3, C29); 17.18 (CH3, C26); 16.55 (CH3, C25).

Tabla 3. Datos obtenidos de los espectros de RMN 1H y 13C, para el compuesto 3.

Polvo amorfo blanco

FM= C30H46O4

Masa calculada 470.34

Cristales incoloros

FM= C31H48O3

Masa calculada 468.72



MN 1H (CDCl3, 700 MHz):ᵟ (ppm) 5.26 (pseudo-t,J=3.5,J=6.8, H-12); 3.60 (s,3H-1´); 2.53 (ddd,

Jgem=16.8 Hz, Jaa=9.8Hz, Jae=4.9Hz); 2.37 (ddd, Jgem=16.1 Hz, Jea=7 Hz, Jee=3.5 Hz); 2.24

(d,J=11.2 Hz, H-18); 1.81 (s,3H-24); 1.81 (s,3H-23); 1.04 (s,3H-25); 1.03 (s,3H-27); 0.94 (d, 3H-

29, J=6.3 Hz, H-19); 0.86 (d,J=6.8, 3H-30, J=6.3 Hz, H-20); 0.79 (s,3H-26).

RMN 13C (CDCl3, 100 MHz): ᵟ (ppm) 177.85 (C, C28); 138.39 (C, C13); 125.75 (CH, C12); 66.01

(CH, C1’); 55.41 (CH, C5); 51.07 (CH, C18); 48.27 (C, C17); 47.76 (CH, C9); 42.25 (C, C14);

39.75 (C, C8); 39.30 (C, C4); 38.09 (CH2, C1); 38.94(C, C10); 38.83(CH2, C22); 37.17(CH, C19);

36.95(CH, C20); 33.26(CH2, C7); 30.92 (CH2, C21); 28.35 (CH2, C15); 28.19 (CH3, C23); 27.42

(CH2, C2); 24.41 (CH2, C16); 23.75 (CH3, C27); 23.50 (CH3, C30); 21.41 (CH2, C11); 18.52 (CH3,

C29); 17.29 (CH2, C6); 17.24 (CH3, C26); 15.83 (CH3, C24); 15.67 (CH3, C25).

Discusión y conclusiones

El ácido ursólico fue obtenido de su fuente natural, donde se sabe se encuentra con su

isómero el ácido oleanólico, por ello, la obtención de este compuesto no se puede realizar mediante

métodos de separación convencionales. Debido a una pequeña diferencia en la estructura de estos

dos isómeros en los metilos de la posición 29 y 30 presentes en el ácido ursólico y juntos en el

carbono 30 del ácido oleanólico, se observa que el ácido oleanolico presenta menor impedimento

estérico en el doble enlace de su estructura, esto hace que pueda reaccionar con mayor facilidad al

formar un epóxido con su doble enlace, lo que se logra mediante una reacción de epoxidación,

donde el agente oxidante encargado de la trasformación es el ácido metacloroperbenzoico

(AMCPB), debido a la reactividad del epóxido formado la reacción culmina con la formación de

una lactona con el carbono de la posición 28 del ácido oleanólico (Figura 5).


Figura 4. Epoxidación del doble enlace del ácido oleanólico, con lo que se observa una cambió en

la polaridad de los compuestos. Fuente: Autoría Propia

Por medio un monitoreo a la reacción se puede observar una diferencia en la polaridad del

nuevo compuesto, la placa se realizó en una sistema de elución 70:30 Hexano:Acetato de Etilo, el

ácido sigue teniendo la misma polaridad, pero en la lactona generada se observa un incremento de

la polaridad (Figura 6), seguido de esto se realizó la separación en cromatografía en columna para

la obtención de ácido ursólico puro.

Figura 5. Diferencia de polaridad después de la epoxidación del doble enlace del ácido oleanólico. Fuente: Autoría Propia.

Por otro lado las reacciones realizadas se monitorearon mediante CCF y se observaron las

trasformaciones realizadas al compuesto de partida (Figura 7).



Figura 6. Esquema de reacciones realizadas. Fuente: Autoría propia

Mediante las transformaciones se obtuvieron los compuestos 3 y 5, se tiene la hipótesis de

que estos compuestos puedan tener una buena actividad biológica, con lo que es de suma

importancia verificar su identidad, esto fue realizado mediante RMN 1H y 13C (Anexo 1 espectros).

Los datos espectroscópicos fueron comparados con las referencias que se tienen en el laboratorio,

en la tabla 2 y 3 se muestran los resultados de los desplazamientos químicos que confirman las

estructuras de los compuestos.

Por último se debe mencionar que se logró la purificación del ácido ursólico, a partir de la

mezcla de estos isómeros que se encuentra naturalmente en las plantas el ácido ursólico y el ácido

oleanólico. Tomando como materia prima al ácido ursolico se semi-síntetizaron 2 compuestos

finales 3 y 5 que se sugiere puedan tener actividad biológica.

Agradecimientos

Por medio de esta estancia, obtuve nuevos conocimientos, los cuales me serán de gran

utilidad para mi formación académica, por lo que agradezco:

En primer lugar al programa Verano UAGro, por permitirme participar como joven

investigador en el 4° Encuentro estatal de jóvenes investigadores-CONACyT.


También a la Universidad Autónoma de Guerrero por apoyarme con los trámites

correspondientes para obtener este logro. Así mismo al investigador, Dra. Laura Patricia Álvarez

Berber, por aceptar ser asesor del proyecto de investigación que desarrollé durante esta estancia.

De igual manera a la Autora M.C. Maritza Leonor Maldonado Santiago por estar conmigo

en el Proyecto “Separación y semi-sintesis de compuestos con posible actividad biológica” que

lleve a cabo durante este periodo, quien mostró disponibilidad e interés para obtener un trabajo

adecuado.

También quiero darle gracias a Dios, hermanos y Padres Marcelino Gervacio Pineda y

Francisca Javier Villalva por tener su apoyo incondicional para seguir adelante en mi formación

educativa.

Referencias

Babalola, I. T. & Shode, F. O. Ubiquitous Ursolic Acid : Ursolic Acid : A Potential Pentacyclic

Triterpene Natural Product. J. Pharmacogn. Phytochem. 2013, 2, 214–222.

Kashyap, D., Tuli, H. S. & Sharma, A. K. Ursolic acid (UA): A metabolite with promising

therapeutic potential. Life Sci. 2016, 146, 201–213. doi: 10.1016/j.lfs.2016.01.017

Kow, T., Lee, B., Chung, S., Kim, D-H. & Lee, Y. Synthesis and NO Production Inhinitory

Activities of Ursolic Acid and Oleanolic Acid Derivatives. Bull. Korean Chem. Soc. 2009, 30, 119-

123.

Product. J. Pharmacogn. Phytochem. 2013, 2, 214–222.

Jichuang Wang, Zhou Jiang, Liping Xiang, Yuanfang Li Minrui Ou, Xiang Yang, Jingwei Shao,

Yusheng Lu, Lifeng Lin, Jianzhong Chen, Yun Dai & Lee Jia. Synergism of ursolic acid derivative

US597 with 2-deoxy-D-glucose to preferentially induce tumor cell death by dual-targeting of

apoptosis and glycolysis. Sci. Rep. 2014, 4, 5006.

Sandeep R. & Rajesh K; Variations in Pentacyclic Triterpenoids in Different Parts of Four

Ocimum Species Using Reverse Phase-High Performance Liquid Chromatography. The National

Academy of Sciences. 2015, 1, 1-6.

Shanmugam MK, Dai X, Prem A, Tan BKH, Sethi G, Bishayee A. Ursolic acid in cancer

prevention and treatment : Molecular targets, pharmacokinetics and clinical studies. Biochem

Pharmacol. 2013; 85(11):1579-1587. doi:10.1016/j.bcp.2013.03.006.

Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016)



Anexo 1

Espectro 1. RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) compuesto 3.


Espectro2. RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) compuesto 3.



Espectro 3. RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) del compuesto 5.


Espectro 4. RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) del compuesto 5.

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