Senasica

La Serologa aplicada a ladeteccin de bacterias

Biol. Brbara Hernndez MacasLaboratorio de Bacterias

CNRF DGSV

2009

Serologa

La ciencia que estudia las reacciones, preparaciones y uso del suero sanguneo.

Usos dentro de la fitopatologa: Estudios ecolgicos para determinar el origen, diseminacin y

supervivencia de diferentes patgenos. Identificacin rpida de los fitopatgenos. Deteccin e identificacin de fitopatgenos que se transmiten

por semilla y suelo.

Las inmunoglobulinas son proteinas que se sintetizan en clulas del tejido linftico de los mamferos.

Los anticuerpos son un grupo de inmunoglobulinas quetienen propiedades y funciones especficasson producidos por antgenos o sustancias extraas al organismo animaly slo reconocen al antgeno que les di orgen.

Clases de Anticuerpos

80% del total de Ig. Se encuentran en la sangre y pueden atravesar las paredes de los vasos conductores. Protegen contra bacterias, virus y toxinas

10-15% del total de Ig en la sangre. Mas abundantes en secreciones mucosas como saliva, lgrimas,etc

5-10% de Ig en la sangre. No pasa libremente en los tejidos. Aparece temprano en las infecciones. Inicia la cascada de complemento

0.2% del Ig en la sangre. Se halla en las clulas B inmaduras. Probablemente juega un rol en la regulacin

0.002% en la sangre normalmente.Se incrementa en respuestas alrgicas. Su Fc se adhiere a la mayoria de clulas y causa degradacin

Los Inmunoensayos se basan en anticuerpos.

Los mamferos producen anticuerpos que especficamente se unen a los sitios de reconocimiento ( epitopes o determinante antignico) de las macromolculas como lo son: proteinas, glicoproteinas, lipopolisacaridos, constituyentes de un fitopatgeno (Antgenos)

Cada determinante antignico lo constituyen 8 aminocidos.

Inmunizacin con el antgeno

Estructura de la Gamma globulina IgG

COOH

Sitio de unin del Anticuerpo

PARATOPE

Fragmento FabFragmento

Fab

Fragmento Fc

COOH COOH

CH2

CH2

CH3

CH3

carbohidrato

Sitio de unindelAntgeno

EPITOPE

Antgenos

Anticuerpo Policlonal

Antgeno Colecta de la sangre;se separa el suero

Purificacin delantisuero

Inmunoensayo

Caractersticas que debemos recordar

1. Los anticuerpos son bivalentes (slo dos lugares de unin con el antgeno) y altamente especficos (regularmente slo reconocen al antgeno que les dio origen)

2. La mayora de los antgenos son multivalentes o polivalentes (varios determinantes antignicos, iguales o diferentes, en su estructura)

La inmunoprecipitacin es la tcnica que permiti el desarrollo de nuevas tcnicas

inmunolgicas o mtodos que ahora conocemos

Aadir anticuerpo especfico

Incubar (37C) 1 hr

Inmunoprecipitacin

PRECIPITADO

antgeno

Precipitacin

Aglutinacin

inmunoaislamiento

Inmunoadsorcin con enzimas conjugadas ( ELISA )

Tiras de flujo lateral (Immunostrip)

Inmunoimpresin

Inmunoflourescencia

Inmunocaptura - Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Tcnicas serolgicasunin de Ag - Ac

Doble Difusin en gel

Propiedades de las tcnicas Inmunolgicas

Rpidas Sensibles Especficas Diagnstico de enfermedades Deteccin de patgenos

ELISA

Tcnica serolgica de inmunoadsorcin con enzimas

conjugadas

Enzyme

Linked

Immuno

Sorbent

Assay

Tcnica de inmunoadsorcin con enzimas conjugadas

Materiales

Equipo: micropipetas,potencimetro,lector de placas,incubadora

Muestra vegetal Juego de antisueros Soluciones

amortiguadoras Sustrato Placas de microtitulacin

ELISA

Indirecta / Directa Directa = el antgeno es detectado directamente por el

conjugado (enzima + anticuerpo) Indirecta = la enzima conjugada detecta primero a un

anticuerpo y no directamente al antgeno.

DAS ELISA (doble anticuerpo) El antgeno queda atrapado entre dos anticuerpos (el de

deteccin y el conjugado)

La reaccin Positiva se observa mediante una reaccin enzimtica con un sustrato cromognico

= cambio de color

Directa, Doble Ac Sandwich ELISA = DAS

TAS ELISA - Indirecta(triple antibody sandwich)

Sustratosegundo anticuerpo + Enzima conjugada (tercer Ac)

Antgeno = Fitopatgeno

Sensibilizar - Primer anticuerpo

Reaccin de color

ELISA indirectaMuestra

Antgeno- BacteriaPrimer anticuerpo

Enzima conjugada Reaccin de color

LECTURA DE LA PLACA

Reaccin de la placaLector de placas de

microtitulacin

ControlPositivo

Controlnegativo MUESTRA A MUESTRA B MUESTRAS C Blanco

1.689 0. 030 O.055 0. 099 1.999 0.0002

Reaccin positiva: si el valor de la densidad ptica de la muestra es mayor o igual a tres veces la media del testigo negativo

Propiedades y ventajas

La sensibilidad de esta tcnica es superior a otras pruebas serolgicas, por lo que ha sido extensamente utilizada para la deteccin de patgenos en humanos, animales y plantas.

Es un mtodo confiable y rpido para la deteccin de virus y bacterias fitopatgenos.

Se pueden procesar varias muestras a la vez. Se obtienen resultados cualitativos y cuantitativos.

Desventajas

Sensibilidad Relativa puede ser menor que otros metodos. Se trabaja con protenas.

La especificidad vara de acuerdo a los productos empleados riesgo de falsos + o falsos

Costo

Resultados negativos Resultados positivos

Lnea control

Positiva

Muestra A Muestra B

antgeno

Anticuerpos

especficos

Segundo anticuerpo

Deteccin por tiras de flujo lateral

Vista Seccional de una tira de flujo lateralResultado Positivo

Almohadilla para la muestra

Conjugado -anticuerpo especifico

Membrana de Nitrocellulosa

Complejo Antigeno conjugado-anticuerpo

Formacin del complejo anticuerpo antgeno-enzima

No hay unin del conjugado-con anticuerpo inespecfico

Almohadilla para manejo de la tira

Almohadilla con el Conjugado

Linea de prueba

Linea de control

Muestra vegetal ANTGENO

(patgeno)

Material del envs de la tira

Environlogix, Inc.

Vista Seccional de una tira de flujo lateralResultado Negativo

Almohadilla de muestra

Conjugado con anticuerpos especificos

Membrana de Nitrocellulosa

conjugado-anticuerpo sin antgeno

No hay formacin del complejo

Almohadilla para manejo de la tira

Almohadilla con el Anticuerpo -

Conjugado

Linea de

prueba

Linea de Control

Muestra vegetal Sana,

sin

antgeno

Backing Material

Environlogix, Inc.

No hay unin del conjugado-con anticuerpo inespecfico

ELISA vs. Tira de flujo LateralCmm

00.20.40.60.8

11.21.41.61.8

0 1 2 3

Immunostrip Result

BID

- Abs

orba

nce

650

nm

0 = negativo; 1 = deteccin positiva ligera; 2 = positivo

NCM-ELISA

Inmunofluorescencia (IF)

Generalmente usada para la identificacin de bacterias y esporas de hongos

El marcador es Fluorescente Los reactivos y pasos a seguir son similares a

los de ELISA Se emplea microscopio epifluorescente

Ensayo para Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus

1 Anticuerpo en PBS-Tween

2 Anticuerpo (Alexa Fluor 488, 1:500) en PBS-Tween

Incuba 2 hr, 22C

Lavar 6X, PBS-Tween

Incubar 1 hr, 22 C en obscuridad

Lavar 6X, PBS-Tween

Microscopa Epifluorescente

Phakopsora pachyrhizi

IF = especificidad

P. pachyrhizi

Puccinia graminis

Inmunocaptura - PCR

Las tcnicas basadas en la deteccin del DNA, son altamente sensibles y la variante immunocaptura PCR (IC-PCR) es todava ms sensible al combinar anticuerpos y PCR.

Bao mara

ELISA: Ac captura + Antgeno