Som el que expresem Cicle de conferències Actualització de continguts de Biologia
description
Transcript of Som el que expresem Cicle de conferències Actualització de continguts de Biologia
Som el que expresem
Cicle de conferènciesActualització de continguts de Biologia
Dr. Josep ClotetUniversitat internacional de Catalunya
Institut de Ciències de l'Educació Josep Pallach (ICE)
5 Octubre 2012
Les cèl.lules funcionen gràcies a les proteïnes
Transport de substàncies
Estructuració
Enzims
Regulació
...
Defensa
3. Pàgines Gens
Un gen - una proteïna – una funció
Flux de la informació genètica
DNA
Trànscrit primari
RNA missatger
AAAAAAA
Proteïna
Estructura bàsica de un gen
tata atg taa ttatt
Zona codificantPromotor Terminador
attatagtcaaatgggcatgttaaaggcagcttaggtaccccgaggacaccaaggaaaaacttattctggatttcggatttcgggggatttaggaactaaaggattattattaggcaa
Les cèl.lules són el que transcriuen els seus gens
Les mutacions gèniques també afecten a l’expressió de les proteínes
atgtcaactggatttcggatttcgggatttcgggatttagggctttagatcctaggaggc
atgtcaactggatttcggatttcgggatttcgggatttagggctttagatcctaggaggc
atgtcaactgatttcggatttcgggatttcgggatttagggctttaggatcctaggaggc
Transcription factor
Els factors de transcripció regulen l’expresió de gens
El genoma accepta suggerènciesde l’ambient
atg tgc gcc ccg cct gca agc atc ccc
ccc gta acg cgt atc cga aaa aat aac
aag tca tta cca ggt ccct gga ttc gct
cctt gcc atg tgc gcc ccg cct gca agc
atc ccc ccc gta acg cgt atc cga aaa
aag tca tta cca ggt ccct gga ttc gct
cctt gcc atg tgc gcc ccg cct gca agc
ccc gta acg cgt atc cga aaa aat aac
aag tca tta cca ggt ccct gga ttc gct
Ambient
Exemples de regulació de la transcripció (I)
Exemples de regulació de la transcripció (II)
Exemples de regulació de la transcripció (II)
Els promotors integren la informació ambiental
Estímul 1
Estímul 2
Nivell nutrients
Altres cél.lules
• Durant el desenvolupament es generen diferents combinacions de factors transcripcionals específics que indiquen els camins diversos de diferenciació per a cada cèl·lula
• Aquest model simple assumeix que la posició en cada divisió activa (o fa aparèixer) uns factors transcripcionals específics diferents
• Si continuéssim amb l’esquema proposat tindríem més de 10000 tipus cel·lulars diferents amb només 25 factors transcripcionals específics
Flux de la informació genètica
DNA
Trànscrit primari
RNA missatger
AAAAAAA
Proteïna
1. Poliadenilació
2. Mecanisme de splicing
Exemple de Splicing (I)
Exemple d’Splicing alternatiu (II)
DNA genòmic humà
El 25 % de tot el Genoma Humà està constituit per uns 30000gens,molts dels quals encara no es coneix la seva funció
Només l’1 % de tot el Genoma Humà és DNA codificant, és a dir, exons
En canvi,el PROTEOMA HUMÀ está format
Per unes 50.000-60.000 proteïnes
L’origen d’aquesta discrepància és el fenomen de splicingo talls alternatius dels mRNA que pateixen probablement el 60% dels gens.
The Scientist 15[20]:1, Oct. 15, 2001Human Genes: How Many? Consolidation of transcript and protein databases suggests humans may have more than 70,000 genesBy Tom Hollon
Dscam, un gen con 38,000 isoformas potenciales
12 48 33 2
Dscam (Down Syndrome Cell Adhesion Molecule).Axon guidance Schmucker et al. (2000) Cell 101, 671Antibody-like molecules Watson et al (2005) Science 309, 1874
Exemples d’Splicing alternatiu (III)
Ponta et al. NATURE REVIEWS MOLECULAR CELL BIOLOGY (2003) vol 4: 33-45
Exemples d’Splicing alternatiu (IV)
DNA
RNA Protein
Refinant el Dogma Central
DNA
RNA Protein 2
Protein 3
Protein 1
Refinant el Dogma Central
La diferent localització dels mRNAs en la cèl·lula pot restringir localment l’expressió d’una
proteïna a nivell traduccional
3. Transport i localització dels mRNAs
Masking and Cytoplasmic polyadenylation
Control dels mRNAs durant la meiosi
4. Enmascarament citoplasmàtic
5. Edició del mRNA
6. Degradació dels mRNAs
7. Les proteïnes també accepten suggerències de l’ambient
atg tgc gcc ccg cct gca agc atc ccc
ccc gta acg cgt atc cga aaa aat aac
aag tca tta cca ggt ccct gga ttc gct
cctt gcc atg tgc gcc ccg cct gca agc
atc ccc ccc gta acg cgt atc cga aaa
aag tca tta cca ggt ccct gga ttc gct
cctt gcc atg tgc gcc ccg cct gca agc
ccc gta acg cgt atc cga aaa aat aac
aag tca tta cca ggt ccct gga ttc gct
Ambient
P
Exemples de modificacions postraduccionals de les proteínes
Flux de la informació genètica
DNA
Trànscrit primari
RNA missatger
AAAAAAA
Proteïna
8. Les proteïnes també moren
20 S 11 S19 S
Proteasoma 26S
Digestió intracel.lular lisosomal
PeroxisomaMitocòndria
Membrana Lisosoma
8.1 Paper fisiològic celular de la degradació proteosomal
Proteasoma 26S
8.1.1 Digestió de proteïnes en condicionsde manca de nutrients
Proteïnes amb seqüencies KFERQ:- RNAsa
- etc
8.1.2 Digestió de partícules víriques
Complexe MHC-I
Resposta citotóxicadels linfòcits-T
8.1.3 Digestió de proteïnes mal plegades al RE
8.1.4 Un excés de proteïnes engega la‘resposta general de proteïnes mal
plegades’ (UPR)
Proteïnes mal plegades
Ire1 actiu
Splicing mRNA HAC1
HAC1 vida mitja llarga
Activació transcripciógens de ‘refolding’
8.1.5. El cicle cel.lular és controlatper l’activitat del proteosoma
G1
S
G2
M
Els proteosomes són estructures altament conservades
8.2. ¿Com sap el proteasoma a qui ha de destruir?
8.2 Les proteïnes condemnades al proteosoma estan marcades
¿Com sap la ubiquitina a qui s’ha d’unir?
Ub
Ubiquitina
8.2. El sistema d’ubiquitinació decideix qui tindrà la marca
¿Com sap el sistema d’ubiquitanació a qui s’hi ha d’unir ubiquitina?
Proteinasubstrat
E3
Ub
?
-
8.2.1 Reconeixement de substrats prèviament fosforilats
E3++
Proteinasubstrat
-
ProtQuinasa
E3++-
8.2.1 Reconeixement de substrats prèviament fosforilats
Proteinasubstrat
-
Ub Ub
ProtQuinasa
¿Com sap ...?
Ub
8.2.2 Reconeixement de l’extrem n-terminal
E3
Proteïnes que compleixen ‘end rule’:Aminoàcid carregat positivament o hidrofòbic
Proteinasubstrat
Ub Ub
Ub
8.2.3 Reconeixement de determinades seqüencies
E3
Exemples:- ‘Caixes de destrucció’ de les ciclines mitòtiques
Proteinasubstrat
Ub Ub
Ub
8.2.4 Associació amb proteïnes ‘motllo’
Proteinasubstrat
Proteinasubstrat
Ub Ub
Ub
8.2.4 Associació amb proteïnes ‘motllo’
8.3 Patologies associades a errors en elsistema degradació proteosómica
8.3.1. Tumors: degradació de p53 per infeccions de papiloma virus
P53
Hsc70
AP-E6E6
Ub Ub
Ub
P53
AP-E6E6
P53
Ub Ub
Ub
8.3 Patologies associades a errors en elsistema degradació proteosómica
8.3.2. Parkinson: acumulació en cervell d’alfa sinucleina agregada.
Mutacions en Ubiquitina carboxi-terminal hidrolasa (gen UCH-L)
8.3 Patologies associades a errors en elsistema degradació proteosómica
9.3.4. Infeccions virals. - Proteïnes víriques s’uneixen a 20S o 19S del proteasoma.- Proteïnes interfereixen presentació de l’antigen (citomegalovirus humans HCMV)
8.3.3. Desordres neurològics.- Acumulació d’agregats de proteïnes en Alzaimer, Huntington’s, etc.- Mutació en subunitats E3 en sindrome d’Angelman.
Premi Nobel de Medecina 2006:la ciència mai no deixarà de
sorprendre'ns.
Institut de Ciències de l'Educació Josep Pallach (ICE)
5 Octubre 2012
La genètica molecular no sempre funciona:el cas de les petúnies tossudes
Extracòpies delgen de la antocianina sintasa
Napoli and Jorgensen:1990
Detecció de Mex3 en embrió de C- elegans
-C +C
RNA antisentit RNA doble cadena del gen Mex3
Fire at al, Nature V391 pp 806-811 (1998)
La genètica molecular no sempre funciona:
el cas del becari equivocat.
processing the dsRNA into 21-23 nt fragments
34
27212016
short-interfering RNA
QuickTime™ and aGIF decompressor
are needed to see this p icture.
step one:
siRNAs have a defined structure
19 nt duplex
2 nt 3’ overhangs
Tuschl, Cell 2002
the antisense strand of the siRNA guides cleavagestep two:
El sistema RISC elimina selectivament els fragments de doble cadena de RNA
two Dicer-related pathways
1. ¿Quin sentit biològic té?
3. ¿Quines aplicacions clíniques pot tenir?
2. ¿Quines aplicacions en la recerca té i pot tenir?
Virus RNA doble cadena cèl.lula
1.¿Quin sentit biològic té?I. Sistema inmunitari anti viral
1. Transcripció
2. Sortida del Hairpin del nucli
3. Processament del complex
4. Separació de cadenes pel RISC
5. Impediment de la síntesi de proteïnes
1.¿Quin sentit biològic té?II. Tenim gens que codifiquen RNA
d ’interferència
La fabricació de RNA es pot regular
El genoma accepta suggerències de l’ambient
I el transcriptoma també!
C.briggsae Drosophila H. sapiens
conservation of microRNAs
C.elegans
miR-1
Lau et al 2001
Basal
Ganglia
Caudatenucleus
Lentiformnucleus
Putamen
Globuspallidus
Sub
stan
tia n
igra
Bas
al G
angl
ia
Cau
date
Nuc
leus
Put
amen
Tem
pora
l
Cer
ebel
lum
Hip
poca
mpu
s
Occ
ipita
l
miRNA Expression in the Brain
Calin, G.A., et al., 2004. PNAS 101:2999-3004microRNAs are located in “fragile regions” microRNAs are located in “fragile regions”
associated with various cancersassociated with various cancers
If miRNAs are developmental regulated,
could they also be involved in disease?
Predicting onco-miR TargetsRestrict search to 3’-UTRs of known oncogenes
miRNA Predicted Gene Target
miR-21 mutS homolog2 (MSH2)
miR-21 v-ski sarcoma viral oncogene (SKI)
miR-143 breakpoint cluster region (BCR)
miR-143 MCF.2 derived transforming sequence (MCF2)
miR-143 von Hippel-Lindau tumor suppressor (VHL)
miR-143 v-Ki-ras2 sarcoma oncogene (KRAS2)
miR-143 Cas-Br-M retroviral transforming sequence (CBL)
miR-145 Cas-Br-M retroviral transforming sequence (CBL)
miR-188 v-myc viral oncogene (MYCL1)
miR-200b cadherin 13 (CDH13)
miR-219 v-myc myelocytomatosis viral oncogene (MYCL1)
miR-219 B-cell CLL/lymphoma (BCL2)
miR-219 cadherin1 (CDH1)
let-7 nRAS, kRAS, nRAS (multiple binding sites)
let-7 MYC (multiple binding sites)
Confirmation of let-7 Target Genes
MYC protein
expression
RAS protein
expression
Neg Control let-7 pre-mIR
HepG2 cells (low let7)
Precursor miRNAs
Block target mRNA translation
Measure target protein
Introduce let-7 miRNA
miRNA Addition Experiment
Confirmation of let-7 Target Genes
Block miRNA and induce target
mRNA translation
Measure target protein
Introduce let-7 inhibitors
miRNA Subtraction Experiment HeLa cells (high let-7)
Negative Control let-7 anti mIR
RAS protein
expression
MYC protein
expression
Let-7 and RAS Expression in Lung Samples
NAT NAT TT
Pair 1 Pair 2
NAT T
Pair 3
GAPDH protein
Ras protein
let-7 miRNA
U6 snRNA
• Good correlation between
let–7 miRNA and RAS protein expression levels
0
400
800
1200
Actin mRNA Ras mRNA
Real timePCR
• Limited correlation between
mRNA and protein expression
levels
Lung squamous cell carcinoma
NAT=normal adjacent tissue; T=tumor
Model for miRNA Involvement in Lung Cancer
miRNAs as Therapeutics?
Decreased let-7 expression
Increased oncogene expression (MYC, RAS)
Induce cell proliferation
Cancer cell
1. ¿Quin sentit biològic té?
3. ¿Quines aplicacions clíniques pot tenir?
2. ¿Quines aplicacions en la recerca té i pot tenir?
3. Quines aplicacions clíniques pot tenir?
• Hematology (blood)
• Oncology (cancer)
• Stem cell biology
• Infectious diseases
Propietats farmacològiques dels RNA interferència
1)Totes les cèl.lules tenen la maquinària per fer RNAi2) Tots els gens són susceptibles de ser interferits.3) Facilitat de síntesi (anticossos, prot recombinants, etc.)4) Baix cost de producció.5) Químicament estable (liofilitzat es pot guardar atemperatura ambient).6) Rang de temps de l’efecte de silenciament: de 5 dies a vàries semanes.7)1000 vegades més actiu que els tractamentsamb RNA antisentit.8) Alta especificitat: baixa toxicitat.9) Alta especificitat: alta aparició de resistències, però…
Propietats farmacològiques dels RNA interferència
10) Al ser doble cadena de RNA pot despertarresposta d’interferons.11) No pot atravessar les cèl.lules.
http://www.hhmi.org/biointeractive/rna/rnai/index.html
http://www.pbs.org/wgbh/nova/sciencenow/3210/02-expl-flash.html
Som el que expresem
Cicle de conferènciesActualització de continguts de Biologia
Dr. Josep ClotetUniversitat internacional de Catalunya
Institut de Ciències de l'Educació Josep Pallach (ICE)
5 Octubre 2012
Fig 13.18 MCB Darnell 4th ed.
Societat Catalana de
Biologia
Exemple 4: La sortida d’anafase està regulada per l’activitat del proteosoma
Mecanisme transició ana/telofase
Cohesinas Separinas Securinas
Activacióproteosoma
Societat Catalana de
Biologia
Els cromosomes no se separen fins que tots i cada un d’ells no està unit al fus
MAD2
AnaphasetransitionKinetochore Checpoint
MAD2
Proteosoma
Societat Catalana de
Biologia
Els cromosomes no se separen fins que tots i cada un d’ells no està unit al fus