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Versión 3 20/09/2012 Página 1 de 34

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Modificación detección de toxina a+b de clostridium difficile

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16/11/2009

Unificacion y actualizacion de los PNTs COPROCULTIVO y PARÁSITOS ENTERICOS

3 20/09/2012

REVISADO: Responsable de Calidad APROBADO: Dirección

FFeecchhaa ddee RReevviissiióónn:: 1144--0099--22001122 FFeecchhaa ddee AApprroobbaacciióónn:: 2200--0099--22001122 Firma: Firma:



COPROCULTIVOS

ÍNDICE: 1. Propósito y alcance 2. Fundamento 3. Indicaciones del coprocultivo 4. Muestras 5. Procesamiento coprocultivo 6. Procedimientos de screening 7. Detección de Toxina a de Clostridium difficile 8. Detección antigénica de Rotavirus y Adenovirus



1. PROPÓSITO Y ALCANCE El propósito de este procedimiento es el de definir las técnicas microbiológicas aplicables al diagnóstico etiológico de las infecciones gastrointestinales causadas por bacterias. Se describe la forma de recoger las muestras y su almacenamiento, así como el procesamiento de las mismas mediante técnicas apropiadas para la detección e identificación del agente bacteriano causal y/o sus antígenos o toxinas a partir de heces. 2. FUNDAMENTO La detección de agentes enteropatógenos bacterianos se basa en la capacidad de crecimiento de los mismos tras el cultivo de las muestras en medios diferenciales y selectivos, con o sin enriquecimiento previo, y con atmósferas y temperaturas de incubación variables. Asimismo, también se pueden detectar sus antígenos o toxinas mediante diversas técnicas. 3. INDICACIONES DEL COPROCULTIVO

- Pacientes con diarrea aguda o crónica, especialmente si se acompaña de fiebre y productos patológicos (sangre, moco, pus).

- Neonatos ante la más mínima sospecha de infección.

- Pacientes con síndrome febril no filiado.

4. MUESTRAS

Recogida y conservación de las muestras de heces para el diagnóstico de infecciones bacterianas y víricas (Rotavirus y Adenovirus) En líneas generales, las muestras de heces deben recogerse durante la fase aguda de la infección, preferentemente durante los 3-5 primeros días de la enfermedad. Las muestras recogidas ocho días o más tras la aparición de los síntomas, pueden contener cantidades insuficientes de antígeno para que puedan detectarse. Las muestras de heces para coprocultivo -incluida la detección de toxinas A y B de Clostridium .difficile y la detección de antígeno de Rotavirus y Adenovirus- deben recogerse y transportarse en un recipiente estéril y seco de boca ancha preferiblemente de plástico, bien cerrado. Es importante indicar al paciente que nunca lo llene a más de la mitad de su capacidad, ya que basta con una pequeña cantidad de heces (la mitad del tamaño de una nuez) para la realización del cultivo y la determinación de antígenos y/o toxinas. Se pueden admitir muestras en torunda o escobillón con medio de transporte habitual (Amies), -aunque no se recomienda-, en aquellos casos en que la recogida de heces puede resultar muy dificultosa (bebes con heces muy líquidas que se quedan absorbidas por el pañal, etc.), excepto en el caso de sospecha de diarrea por Clostridium difficile, que deberán recogerse siempre en recipiente seco. Si no se van a procesar inmediatamente, deben conservarse refrigeradas a 4ºC. Deben desecharse las muestras de heces mezcladas con orina.



Por su puesto, no son adecuadas para cultivo y detección de antígeno y/o toxinas, las heces con líquido conservante para la determinación de parásitos. Por lo que, en caso de que se soliciten simultáneamente al coprocultivo se deberá recoger una muestra específicamente para coprocultivo siguiendo las instrucciones anteriormente citadas, adicionalmente a las muestras recogidas para parásitos. Una vez emitidas, las heces frescas pueden conservarse hasta dos horas a temperatura ambiente, durante dos días refrigeradas a 4ºC y pasado este tiempo deben congelarse a -20º C o preferentemente a -70º C. Una muestra descongelada no debe volver a congelarse, por lo que es recomendable preparar alícuotas. Al contrario que en el caso de la determinación de parásitos no es habitual realizar cultivos seriados. Si llega más de una muestra al laboratorio, del mismo paciente en el día, únicamente se procesará una de ellas (normalmente la que se piense que es más reciente o presente más productos patológicos como moco o pus, sean más líquidas, etc), o, en cualquier caso se hará a criterio facultativo. 5. PROCESAMIENTO DEL COPROCULTIVO Es el método de elección para el diagnóstico de las infecciones bacterianas intestinales.

En primer lugar, con un asa o escobillón se tomará una pequeñísima porción de heces (de 1 a 2 g) y se inocularán los siguientes medios de cultivo:

- Agar sangre

- Agar MaConkey

- Agar Salmonella -Shigella (SS)

- Agar Yersinia

- Caldo de Selenito, para enriquecimiento de Salmonella.

- Agar Campylobacter

Las placas de agar sangre, MacConkey, SS y el caldo de Selenito se incubarán 18-24 horas en la estufa de 37ºC. Transcurrido este periodo de incubación se procederá a la lectura de las placas y al caldo de Selenito se le realizará un pase ciego a SS que se incubará 24 horas más en las mismas condiciones, periodo tras el cual, se procederá así mismo a su lectura.

El agar Yersinia se incubará a tª ambiente y se valorará en una primera lectura a las 18-24 horas y en una segunda a las 48 horas.

Por último el agar Campylobacter se incubará 48 horas en atmósfera microaerofílica (generador Gaspak Campy) en campana en la estufa de 42ºC. Periodo tras el cual se procederá a la lectura de la placa y valoración por el microbiólogo.

Según lo expresado anteriormente el esquema del Coprocultivo quedaría de la siguiente manera:



Día 0: Siembra del coprocultivo

Día 1: Lectura y valoración del agar sangre, agar MacConkey y SS (siembra directa). Primera lectura y valoración del agar Yersinia.

Día 2: Lectura y valoración del SS (pase del Selenito), Agar Campylobacter y segunda lectura del agar Yersinia.

6. PROCEDIMIENTO DE SCREENING

6.1 SALMONELLA

Las colonias de Salmonella se reconocen en medio SS por ser transparentes (no fermentadoras de lactosa) con el centro negro (productoras de H2S). También las colonias de Proteus spp.(microorganismo comensal en las heces) presentan idénticas características, por lo cual habrá que utilizar una batería de pruebas bioquímicas para diferenciar ambos géneros. Se pueden usar medios diferenciales como el UMI (urea-movilidad-indol) y TSI (triple azúcar hierro). Últimamente se está produciendo un aumento de los aislados de Salmonella arizonae, que presentan como características bioquímicas principales que son cepas fermentadoras de lactosa con producción de H2S (en medio SS aparecen de color rosas y con el centro negro), por lo que se prestará especial atención a las cepas de estas características antes de descartarlas como no especies no patógenas patógenas (p.e . Citrobacter spp).

Si la colonia es bioquímicamente compatible con Samonella y/o aglutina con alguno de los antisueros específicos poliva lentes Poly A o Poly B se procederá a su identificación completa y pruebas de sensibilidad mediante los procedimientos estándares del laboratorio. Dado que la gran mayoría de los aislados corresponden a los serotipos Enteritidis y Typhimurium se procederá al serotipado de todas las Salmonellas aisladas siguiendo el siguiente esquema:

Poly A +:

- Antisueros 9, y gm positivos: Salmonella Enteritidis

- Antisueros 4,5, e i positivos: Salmonella Typhimurium

- Antisueros 9, y Vi positivos: Salmonella Typhi

Poly B +:

- Antisuero 7 positivo: Salmonella C1

- Antisuero 8 positivo: Salmonella C2

Los aislados que bioquímicamente sean identificados como Salmonella enterica y/o aglutinen con los antisueros Poly A o Poly B, pero no se respondan a ninguno de los esquemas anteriores serán enviadas también al Centro de Referencia para su serotipado.



6. 2 SHIGELLA

Las colonias sospechosas de Shigella en agar MacConkey son incoloras y transparentes. Estas colonias serán sometidas a un proceso de despistaje mediante una batería de pruebas bioquímicas (UMI,TSI. ONPG). En general las cepas de Shigella spp. son poco reactivas bioquímicamente. La dificulatad principal estriba en la diferenciación con cepas de E.coli no fermentadoras o fermentadoras lentas de lactosa. La prueba de la ONPG, es muy útil para esta diferenciación.

Diferencias y similitudes entre E.coli y Shigella spp

Shigella E.coli

Fermentación de Latosa (o ONPG)

- +

Producción de Indol - +

Producción de gas - +

Movilidad - +

Producción de Urea - -

Los aislamientos con características bioquímicas compatibles deberán identificarse bioquímicamente y realizarse las pruebas de sensibilidad según los procedimientos estándares del laboratorio. Cuando la identificación sea positiva, deberá hacerse la identificación definitiva a nivel de especie mediante aglutinación en porta con antisueros específicos de los grupos A, B , C y D, según el siguiente esquema:

- Grupo A positivo: Shigella dysenteriae

- Grupo B positivo: Shigella flexneri

- Grupo C positivo: Shigella boydii

- Grupo D positivo: Shigella sonneii

Cabe la posibilidad de encontrar aislamientos que bioquímicamente se identifican como Shigella spp., pero que no pueden ser aglutinados por los antisueros disponibles de los grupos A ,B , C y D. Estas cepas deben ser sometidas a 100ºC durante 15-30 minutos en un baño de agua y probadas nuevamente frente a los antisueros específicos. Si aún así no es posible lograr la aglutinación del aislamiento, la cepa debe ser informada presuntivamente como "Shigella spp." y envíada al Centro de Referencia para su confirmación.



6.3 E. COLI

La caracterización microbiológica de las E. coli productoras de diarrea resulta muy complicada debido a que esta especie es un componente abundante de la microflora normal del intestino humano. A diferencia de Salmonella spp. a Shigella spp., las cepas de E. coli productoras de diarrea pueden ser tanto fermentadoras como no fermentadoras de lactosa, por lo que solo puede hacerse mediante antisueros específicos o por ensayos de virulencia, técnicas que no están al alcance de un laboratorio como el nuestro.

Sin embargo, el principal serotipo de E. coli enterohemorrágico, E. coli O157 H7, constituye una excepción a lo anteriormente expuesto. Estas cepas presentan la particularidad de no fermentar el D-sorbitol y además se dispone de técnicas de detección de antígeno. El despistaje de este patógeno se realizará a criterio del microbiólogo teniendo en cuenta el diagnóstico clínico del paciente.

6.4 Campylobacter

Las colonias de Campylobacter spp. son grisáceas, redondas, pequeñas (pero no puntiformes) o aceitosas (que se extienden por la estría como una gota de aceite). La identificación microbiológica de las colonias sospechosas recae principalmente sobre su morfología característica en la tinción de gram (bacilos gram negativos finos con forma típica de gaviota) y el resultado positivo para la pruebas de la oxidasa y la catalasa. A nivel de especie solamente se identificará el C. jejuni (hipurato +), por ser la que con más frecuencia se aísla en el laboratorio (>99% de los casos). Aquellas que resulten hipurato -, se informarán como Campylobacter sp. A los aislamientos que resulten positivos en la identificación de Campylobacter se les realizará un antibiograma con eritromicina y ciprofloxacina siguiendo las normas del CLSI. La placa de antibiograma se incubará a 42ºC durante 24 horas en campana, con atmósfera microaerófila.

6.5 AEROMONAS Y PLESIOMONAS

Las Aeromonas se buscan en el agar Yersinia. A las colonias que fermenten el sorbitol en dicho medio (presentan color rojo ), se les realizará un reaislamiento en agar sangre. A aquellas colonias que sean oxidasa + se les realizará una identificación bioquímica completa y pruebas de sensibilidad según los procedimientos estándares del laboratorio.

Las Plesiomonas, que se caracterizan por no fermentar la lactosa y ser productoras de oxidasa, se buscarán en el agar MacConkey.



6.6 VIBRIO

La mayoría de especies no presentan excesivas dificultades para crecer en los medios poco selectivos utilizados para el aislamiento de enteropatógenos .Sin embargo, debido a la posibilidad de que la flora fecal saprófita dificulte la detección de estos microorganismos y en especial para el aislamiento de V. cholerae, se recomienda el empleo del medio TCBS (tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa) en zonas endémicas. En las zonas no endémicas de cólera, como la nuestra, el empleo rutinario del medio TCBS en todas las muestras fecales no parece rentable y nuestro laboratorio no lo utiliza. A pesar de no buscarse sistemáticamente su aislamiento puede ser un hallazgo casual en la búsqueda de otros patógenos entéricos, principalmente Aeromonas y Plesiomonas ya que son géneros muy relacionados y comparten características comunes como la producción de oxidasa. Para distinguir el género Vibrio de otros relacionados (como Aeromonas) es muy útil la utilización del factor vibriostático 0/129, al cual la mayoría son sensibles.

Cuando se aísle un Vibrio cholerae se aglutinará con los antisueros 01 y 0139 con el fin de comprobar si se trata de una cepa epidémica o no. Así mismo se informará a Medicina Preventiva para la declaración del caso y será preceptivo enviar el aislamiento al Centro de Referencia para la confirmación de la identificación y en su caso serotipado de la misma.

6.7 YERSINIA

En el agar Yersinia las colonias de este microorganismo aparecen (tras 24 horas de incubación a 25-30 ºC) con una morfología peculiar designada en "ojo de buey" y consistente en un centro rojo rodeado de una zona transparente. A estas colonias se les realizará un test de ureasa a tª ambiente y un reaislamiento en agar sangre. Las colonias ureasa +, ONPG o lactosa negativas, con morfología típica puntiforme se identificarán de forma completa y se les hará la prueba de sensibilidad según los procedimientos estándares del laboratorio. A las que resulten identificadas como Y.enterocolitica se les realizará una aglutinación en porta con los antisueros específicos (0:3 y 0:9), con el fin de conocer su serogrupo.

7. DETECCIÓN DE TOXINA A+B DE CLOSTRIDIUM DIFFICILE

7.1 INTRODUCCIÓN

C. difficile es un bacilo gram positivo esporulado que forma parte de la flora saprófita intestinal del ser humano y de algunas especies animales. Constituye la causa principal de diarrea asociada a antibióticos y colitis pseudomembranosa. Es actualmente uno de los patógenos más comúnmente detectados y una causa importante de infecciones nosocomiales. Los síntomas clínicos de la diarrea asociada a C.difficile. varían desde una colonización asintomática hasta la colitis pseudomembranosa y el megacolon tóxico.



El organismo ha sido aislado de diversos habitats naturales como suelos, heno, arena, y excrementos de multitud de mamíferos (incluido el hombre). Clostridium difficile produce por lo menos tres factores de virulencia potenciales de los cuales la Toxina A o enterotoxina y la Toxina B o citotoxina son considerados los más importantes en la patogénesis de la enfermedad asociada al mismo.

Ya que no todas las cepas de C.difficile producen toxinas y aproximadamente el 2% de los adultos y el 50% de los niños menores de 2 años pueden estar colonizados la detección de las toxinas A y B en muestras de heces de pacientes con diarrea es más significativa que el cultivo de la bacteria.

7.2 INDICACIONES

Está indicada la detección de las Toxina A y B de C. difficile en todos aquellos pacientes que presenten una diarrea asociada a tratamiento antibiótico, especialmente si los síntomas son de moderados a severos y/o el paciente se encuentra ingresado.

7.3 FUNDAMENTO

ImmunoCardR Toxina A&B (Meridian) es un inmunoensayo enzimático (EIA) de flujo horizontal para detectar las toxinas Ay B del C.difficile.

7. 4 COMPONENTES DEL KIT (50 pruebas)

1- Tarjetas de Test InmunoCard Toxins A&B en bolsas individuales.

2- Diluente para muestras en viales plásticos con goteros.

3- Control Positivo en vial plástico con gotero.

4- Reactivo de Lavado en gotero plástico.

5- Reactivo de Substrato en vial plástico con gotero.

6- Conjugado Enzimático en vial plástico con gotero.

7- Pipetas plásticas de transferencia con marcas para 25 y 150 microlitros.



7.5 PROCEDIMIENTO

1- Dejar que todos los reactivos se atemperen.

2- Utilizar un tubo de ensayo para cada muestra o control.

3- Añadir 200 microlitros de Diluente para Muestra al tubo de ensayo.

4- Añadir 3 gotas (150 microlitros) del Conjugado Enzimático. Mezclar los reactivos en el tubo.

5- Añadir la materia fecal:

a) Heces líquidas o semisólidas: Con una pipeta de transferencia se aspira 25 microlitros de heces y se dispensa en el tubo de ensayo. Aspirara varias veces para mezclar el contenido del tubo.

b) Heces sólidas: Usando un palillo o un asa, transferir una pequeña porción (aproximadamente de 2 mm de diámetro) y emulsionar bien.

c) Para el control Positivo, añadir una gota a la mezcla del Diluente y del Conjugado, al igual que las muestras de paciente.

Nota: Es muy importante emulsión homogénea de las heces con los reactivos.

6-.Dejar reposar la muestra durante 5+/- 1 minuto a tª ambiente y agitar nuevamente antes de hacer el test.

7-.Sacar la tarjeta de la bolsa metálica y añadir 125 microlitros a cada uno de los puertos de muestra de la tarjeta.

8-.Incubar a tª ambiente durante 5+/- 1 minuto. Al final de la incubación ambos puertos deben verse completamente mojados.

9-.Dispensar 3 gotas de Reactivo de Lavado a cada uno de los puertos de reacción.

10-.Cuando el Reactivo de Lavado se haya absorbido completamente añadir 3 gotas de Reactivo de Substrato.

11-.Incubar la tarjeta durante 5 minutos a tº ambiente y proceder a su lectura.



7.6 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Negativo: Aparece solamente un punto azul en el puerto de la izquierda (Control interno de la prueba).

Positivo: Aparecen dos puntos azules.

Resultado inválido: Si no aparece ningún punto azul o bien aparece solo en el puerto de la derecha. En ese caso hay que repetir la prueba.

8. DETECCIÓN ANTIGÉNICA DE ROTAVIRUS Y ADENOVIRUS

8.1 INTRODUCCIÓN

Rotavirus

Estos agentes fueron los primeros virus asociados a procesos entéricos. Su identificación por Microscopía Electrónica (ME) se realizó en 1973. En la actualidad se considera el agente responsable del 30 al 60% de los casos de diarrea severa en niños.

Son virus desnudos de 70 nm de diámetro con estructura icosaédrica. Debido a la doble cápside que poseen, presentan un aspecto de rueda cuando se observan al ME, lo que les confiere su nombre. Su genoma consiste en una doble cadena de ARN segmentada. Se han reconocido 6 grupos antigénicos. El Grupo A es patógeno humano primano y los grupos restantes, del B al F, se asocian principalmente con animales.

Los Rotavirus del grupo A son la primera causa de gastroenteritis deshidratante en niños, e incluyen al menos 11 serotipos diferentes, de los que solo se han implicado en patología humana del 1 al 4.

El pico de incidencia de la enfermedad se produce entre los 3 y los 18 meses de la vida, con mayor morbilidad alrededor de los dos años.

Los Rotavirus del grupo A no son considerados patógenos de adultos pero pueden causar enfermedad en ciertas circunstancias: contacto íntimo con un niño infectado, exposición a agua contaminada, viajes y de forma epidémica en poblaciones geriátricas.



En el 80% de la población con edad superior a 3 años se detectan anticuerpos anti-rotavirus. Estos anticuerpos no son protectores, aunque pueden aumentar la sintomatotogía.

El período de incubación es de 3 días y la duración de la enfermedad de 5 a 7; en pacientes inmunodeprimidos la duración del proceso puede prolongarse sustancialmente. El cuadro clínico se caracteriza por diarrea acuosa, aguda, no inflamatoria y esporádica. Puede presentarse con hipertermia leve y son comúnes los vómitos de aparición precoz.

Los Rotavirus se transmiten por la ruta fecal-oral y se ha propuesto la transmisión vía aérea. En países templados esta infección se produce de forma estacional, principalmente en los meses frios, mientras que en los países tropicales se produce durante todo el año.

Adenovirus entéricos

Son virus desnudos con ADN de doble cadena y capside icosaédrica, de 70-80 nm de diámetro. Se han descrito 41 serotipos diferentes distribuidos en 6 grupos, de la A a la F. Los serotipos 40 y 41, del grupo F, se asocian con la producción de gastroenteritis. Algunos estudios demuestran que estos agentes son la segunda causa de gastroenteritis viral pediátrica después de los Rotavirus. La enfermedad se produce en niños menores de 2 años, en particular en el primer año de vida, es poco común en adultos y se ha relacionado con brotes nosocomiales.

El patrón de adquisición de anticuerpos se desarrolla durante la niñez. No se conoce si esta inmunidad es protectora. El período de incubación de 8 a 10 días y la duración de la sintomatología clínica de 5 a 12 días con duración superior al resto de las gastroenteritis virales. Los síntomas incluyen diarrea acuosa prominente, seguida de l ó 2 días con vómitos. Los afectados de menor edad presentan fiebre baja durante dos o tres días. La deshidratación severa es poco común.

La infección parece transmitirse de persona a persona y no se presenta de forma estacional.

8.2 FUNDAMENTO

La detección antigénica de Adenovirus y Rotavirus se realiza de forma simultánea mediante un sistema inmunocromatográfico .

8.3 INDICACIONES

Dada su alta prevalencia está indicado siempre, como complemento al coprocultivo.



8.4 COMPONENTES DEL KIT

- Dispositivos de reacción individuales (cassettes)

-Tubos compactos de recolección de muestra y búfer para la recolección de la muestra y su disolución.

8.5 PROCEDIMIENTO

1-Tomar un tubo compacto por muestra. Desenroscar el aplicador (azul o rojo, según el kit disponible) y con la punta tomar una pequeña cantidad de heces (50 mg) y volver a colocarlo en el tubo. Si las heces son líquidas aspirar una pequeña cantidad con la ayuda de una pipeta y transferir 2 gotas (50 microlitros) al tubo líquido y volver a cerrarlo con el aplicador correspondiente.

2- Agitar 15 segundos en el vórtex.

3- Sacar el dispositivo del test de su envase.

4- Romper la punta del tubo de recolección y transferir 4 gotas de la solución a lugar correspondiente del test (S) presionando el tubo.

5- Leer el resultado a los 10 minutos.

8.6 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Negativo: Aparece una única línea rosa en la parte superior de la prueba (C).

Positivo:

- Rotavirus: Además de la línea del control (C) aparece una línea en la zona central (R).

- Adenovirus: Además de la línea de control (C) aparece una línea en la zona inferior (A).

Negativo Rotavirus positivo Adenovirus positivo Rota/Adeno positivo

----- C ---- C ---- C ----- C

R ---- R R ----- R

A A ----- A ----- A

.



Parásitos entéricos

ÍNDICE:

1. Introducción

2. Fundamento

3. Indicaciones del estudio parasitológico

4. Recogida y conservación de las muestras

5. Técnicas de examen

6. Diagnóstico inmunológico

7. Diagnóstico práctico de las parasitosis más frecuentes



1. INTRODUCCIÓN

Las parasitosis humanas representan una causa frecuente de patología entérica. Estos procesos afectan de manera localizada al tubo digestivo, originando cuadros diarreicos y provocando en ocasiones anormalidades en la absorción de alimentos. Existen numerosos parásitos capaces de producir cuadros entéricos. A continuación se expone una clasificación resumida de agentes parasitarios implicados en infecciones gastrointestinales:

1.1 PROTOZOOS

Los protozoos constituyen el grupo de parásitos más a menudo asociado con diarreas.

1.1.1 Amebas

Su ciclo vital es relativamente sencillo y tiene dos fases una de crecimiento con movilidad activa (trofozoito) y la fase inmóvil resistente e infecciosa (quiste). La reproducción se logra mediante fisión binaria (división del trofozoito) o bien mediante el desarrollo de numerosos trofozoitos en el interior del quiste multinucleado maduro. La movilidad se logra a través de la extensión de un seudópodo. Los trofozoitos permanecen móviles de forma activa tanto tiempo como el entorno sea favorable. La forma quística se desarrolla cuando la temperatura ambiental o la humedad descienden.

La mayoría de especies son comensales (Entamoeba coli, Entamoeba hartmani, Entamoeba dispar, Endolimax nana, y Idodmoeba bütschilii). Entamoeba histolytica es el patógeno humano más importante de este grupo aunque Entamoeba polecki también está descrita como causa de enfermedad en humanos (diarrea leve transitoria). Las amebas intestinales no patógenas son importantes porque deben distinguirse de E. histolytica, E.polecki y B. hominis. La identificación exacta exige un cuidadoso examen microscópico. E.histolytica y E.dispar pueden ser diferenciadas únicamente por medio de reactivos inmunológicos específicosa es muy infrecuente.

1.1.1.1Patogenia (Entamoeba histolytica)

Después de ser ingeridos, los quistes pasan a través del estómago, donde la exposición al ác. gástrico estimula la liberación del trofozoito en el duodeno. Los trofozoitos se dividen y provocan una extensa necrosis local en el interstino grueso. No se conoce adecuadamente el fundamento de esta necrosis tisular aunque se atribuye a la producción de citotoxinas. Se observan úlceras en la mucosa intestinal junto con inflamación, hemorragia e infección bacteriana secundaria. Puede presentarse la invasión más profunda de la mucosa con extensión hacia la cavidad peritoneal. Esto puede conllevar la afectación secundaria de otros órganos, principalmente el hígado.

La amebiasis extraintestinal se asocia a la forma de trofozoito y se encuentran únicamente en ambientes donde existe una presión reducida de oxígeno, ya que altas concentraciones del mismo son letales para el mcroorganismo.



1.1.1.2 Enfermedad clínica (Entamoeba histolytica)

Los pacientes aquejados de amebiasis intestinal desarrollan síntomas clínicos relacionados con la destrucción tisular localizada en el intestino grueso. Los síntomas incluyen dolor abdominal, retortijones y colitis con diarrea. Los signos sistémicos de infección (fiebre, leucocitosis, escalofríos) se encuentran presentes en los pacientes con amebiasis extraintestinal. El hígado se encuentra afectado de forma predominante, debido a que los trofozoitos son retirados del torrente sanguíneo a medida que pasan por este órgano.

1.1.2 Blastocystis hominis

Es un protozoario anaerobio estricto, es el centro de una considerable controversia sobre su posición taxonómica y su patogenicidad. Se encuentra en las heces de individuos asintomáticos y también en sujetos con diarrea persistente. Se ha sugerido que la presencia de grandes cantidades de estos parásitos (5 o más por campo microscópico ×1000), en ausencia de otros patógenos intestinales es indicativo de enfermedad.

1.1.3 Flagelados

Entre los flagelados intestinales sólo Giardia lamblia (duodenalis) y Dientamoeba fragilis parecen tener significación patógena. Este último no muestra fase quística y sus trofozoítos se destruyen fácilmente por la acción del jugo gástrico, por ello presenta escasa difusión en humanos. Chilomastix mesnilii puede observarse como comensal.

1.1.3.1 Patogenia (Giardia lamblia)

La infección se inicia mediante la ingestión de quistes. El ác. del estómago estimula la rotura de los mismos con la liberación del trofozoito en el duodeno y el yeyuno donde los organismos se multiplican por fisión binaria. Los trofozoitos pueden unirse a las vellosidades intestinales mediante una prominente ventosa central en forma de disco. Aunque las puntas de las vellosidades pueden aparecer aplanadas y puede haber una inflamación de la mucosa con hiperplasia linfoide, no suele haber necrosis tisular.

1.1.3.2 Enfermedad clínica (Giardia lamblia)

La infección por Giardia puede dar lugar a un estado de portador asintomático (50% de los individuos) o bien una enfermedad sintomática que comprende desde la diarrea leve hasta un síndrome malabsorción grave. El periodo de incubación tiene un promedio de 10 días. El inicio de la enfermedad es súbito y se manifiesta con diarrea líquida y fétida acompañada de espasmos abdominales, flatulencia y esteatorrea. Es frecuente la recuperación espontánea después de 10 o 15 días, aunque puede desarrollarse enfermedad crónica con múltiples reacaídas.



1.1.4 Ciliados

Balantidium coli es el único miembro de este grupo que tiene capacidad patogénica para el ser humano. La enfermedad producida por B. coli es similar a la amebosis.

El ciclo vital es sencillo, implicando la ingestión de los quistes infecciosos, rotura de los mismos e invasión de la mucosa del intestino grueso, ciego e íleon terminal por los trofozoitos.

Puede darse el estado de portador asintomático. La enfermedad se caracteriza por dolor e hipersensibilidad abdominal, tenesmo, nauseas, anorexia y heces líquidas con sangre y pus. Puede observarse úlceras en la mucosa intestinal, al igual que en la amebosis.

1.1.5 Coccidios

Los microorganismos causantes de coccidiosis entéricas incluyen Isospora sp, Sarcocystis sp. y Cryptosporidium sp.

Isospora belli se presenta con relativa frecuencia a sujetos con alteraciones inmunológicas (en especial SIDA). La infección se contrae a través de agua y alimentos contaminados con quistes maduros. Los ooquistes eliminados en heces maduran fuera del tracto intestinal.

Sarcocystis sp. origina una coccidiosis zoonótica que se produce al ingerir carne de cerdo o bovino con bradizoítos, que evolucionan en el intestino delgado a esporoquistes con esporozoítos.

Cryptosporidium parvun y Cyclosphora cayetanensis son una causa muy frecuente de diarrea crónica en enfermos con SIDA. En estos pacientes puede generar un cuadro diarreico severo, caracterizado por gran pérdida hídrica y marcada reducción en peso corporal, que es difícil de tratar.

1.1.6 Microsporidios

Son patógenos intracelulares obligados que se caracterizan por la estructura de sus esporas. Hasta la fecha se han descrito 6 géneros (Enzephalitzoon, Pleistophora, Nosema, Vittaforma, Trachipleistophora y Enterocytozoon)

La infección intestinal por E.bieneusi en los pacientes con SIDA se caractriza por una persistente y debilitante diarrea similar a la observada en casos de coccidiosis.



1.2 HELMINTOS

1.2.1 Nematodos

Son los parásitos intestinales más fáciles de reconocer, debido a su gran tamaño y a su cuerpo cilíndrico no segmentado.

Las parasitaciones intestinales causadas por nematodos incluyen parásitos como Trichuris trichiura, Enterobius vermicularis, Ascaris lumbricoides, Ancylostoma duodenale, Necator americanus y Stron gyloides stercoralis..

Nematodos de importancia médica

Parásito Nombre común Enfermedad

Enterobius vermicularis Oxiuro Enterobiosis

Ascaris lumbricoides Áscari Ascariosis

Toxocara canis Áscari del perro Larva migrans visceral

Toxocara cati Áscari del gato Larva migrans visceral

Trichuris ttrichiura Tricocéfalo Trichuriosis

Ancylostoma duodenale Ancilostoma * Infección por ancilostoma

Necator americanus Ancilostoma ** Infección por ancilostoma

Ancylostoma braziliense Ancilostoma *** Larva migrans cutánea

Strongyloides stercolaris - Estrongiloidosis

Trichinella spirallis Triquina Triquinosis

Wuchereria bancrofti Filaria de Brancoft Filariosis

Brugia Malawi Filaria malaya Filariosis

Loa loa Gusano africano del ojo

Loiosis

Mansonella spp Mansoneliosis Filariosis

Onchocerca volvulus Ceguera del río Oncocercosis

Dirofilaria immitis Gusano del corazón ****

Filariosis

Dracunculus medinensis Gusano de Guinea Dracunculosis



*del Viejo Mundo, ** del Nuevo Mundo, *** del perro o del gato, **** del perro

La anisakiasis es, también, una enfermedad causada por un nematodo (Anisakis) que se contrae por la ingestión de las larvas presentes en pescados crudos y cuya sintomatología se caracteriza por la aparición de dolor abdominal, nauseas, vómitos y diarrea. Este parásito puede enclavarse en la mucosa gástrica y producir gastritis y hemorragias ocultas en heces.

1.2.2 Trematodos

Son gusanos planos carnosos y filiformes, no segmentados. La mayoría son hermafroditas. Los esquistosomas constituyen la única excepción. Todos requieren anfitriones intermedios para completar su ciclo vital y los primeros anfitriones intermedios son moluscos (caracoles y almejas). En esos anfitriones tiene lugar un ciclo de reproducción asexual que representa un tipo de propagación de las células germinales. Algunos trematodos necesitan varios anfitriones intermedios secundarios antes de alcanzar el anfitrión final y transformarse en parásitos adultos.

Los huevos están equipados con una tapadera en la parte superior de la cáscara, llamada opérculo que se abre para permitir la salida de la larva en busca del anfitrión apropiado. Los huevos de los esquistosomas carecen de opérculo.

Trematodos de importancia médica

Trematodo Nombre común

Anfitrión intermedio

Vector biológico

Anfitrión reservorio

Fasciolopsis buski

Duela intestinal gigante

Caracol Plantas acuáticas

Cerdos, perros, conejos, humanos

Fasciloa hepatica

Duela hepática de la oveja

Caracol Plantas acuáticas

Ovejas, vacas, humanos

Opistrochis (C)sinensis

Duela hepática china

Caracol, peces de agua dulce

Pescado crudo

Perros, gatos, humanos

Paragonimus westermani

Duela pulmonar

Caracol, cangrejos, gambas de agua dulce

Cangrejos y gambas crudos

Cerdos, monos, humanos

Género Duela Caracol Ninguno Primates,



Schistosoma sanguínea roedores, animales domésticos, ganado, humanos

1.2.3 Cestodos

Los cestodos o tenias son gusanos planos segmentados en forma de cinta. La cabeza o escólice está dotada de órganos de fijación. Los segmentos individuales reciben el nombre de proglótides y la cadena de proglótides conforma el estróbilo.

Son hermafroditas y poseen órganos reproductores masculinos y femeninos en cada proglótide madura. Los huevos no son operculados y contienen (salvo alguna excepción) un embrión con 6 ganchos.

Carecen de aparato digestivo y el alimento lo absorben desde el intestino del organismo anfitrión a través de su pared.

La mayoría tienen ciclos vitales complejos que implican un anfitrión intermedio y, en algunos casos (cisticercosis, equinococosis, esparganosis) el anfitrión intermedio es el ser humano, que alberga estados larvarios del gusano.

Cestodos de importancia médica

Cestodo Nombre común Reservorio de las larvas

Reservorio de los adultos

Taenia solium Tenia del cerdo cisticercosis

Cerdos Ser humano

Ser humano

Taenia saginata Tenia de la vaca Bóvidos Ser humano

Diphilobotrium latum

Tenia del pescado

Crustáceos y Peces de agua dulce

Ser humano, Perros, Gatos, Osos

Echinococcus granulosus

Quíste hidátidico unilocular

Herbívoros, Ser humano

Cánidos

Echinococcus multilocularis

Quíste hidatídico alveolar

Herbívoros, Ser humano

Zorros, Lobos, Perros, Gatos

Hymenolepis nana

Duela enana Roedores, Ser humano

Roedores, Ser huimano



Hymenolepis diminuta

Duela enana Insectos Roedores, Ser humano

Dipylidium caninum

Tenia de semillas de calabaza

Pulgas Perros, Gatos

2. FUNDAMENTO

En general el diagnóstico de las parasitosis intestinales se sustenta en los estudios coproparasitológicos. Estos estudios permiten detectar tanto la presencia de protozoos (mediante la observación de formas vegetativas y/o quísticas) como de helmintos (investigación de larvas y/o huevos).

Procedimientos diagnósticos en las pararitosis del tubo digestivo e hígado

Microorganismo infeccioso

Tipo de muestra Métodos de recogida

Procedimientos diagnósticos

Entoamoeba histolytica (intestinal)

Heces en fresco Heces conservadas Material de sigmoidoscopia

Suero

Contenedor impermeabilizado

Punción venosa

Examen microscópico (en fresco o tinción permanente) Cultivo Serología

Entamoeba histolytica Echinococcus spp (hepática)

Aspirado, Biopsia, Suero

Muestra estéril Punción venosa

Examen microscópico (en fresco o tinción permanente) Cultivo, Serología

Giardia lamblia Heces en fresco Heces conservadas Contenido duodenal

Contenedor impermeabilizado Entero-Test o aspirado

Examen microscópico (en fresco o tinción permanente) Antígenos, Cultivo

Crytosporidium spp

Heces en fresco Heces conservadas

Contenedor impermeabilizado

Examen microscópico (tinción



Biopsias acidorresistente) Antígenos

Microsporidia Heces en fresco Heces conservadas Contenido duodenal, Biopsias

Contenedor impermeabilizado Aspirado, suero salino

Examen microscópico (Giemsa, Gram, tinción cromotropa)

Oxiuros Frotis de muestras perianales

Tira adhesiva de celofán

Examen macroscópico y microscópico

Helmintos Heces en fresco Heces conservadas Suero

Contenedor impermeabilizado Formol, SAF, MIF, PVA Punción venosa

Examen macroscópico y microscópico Serología Cultivo

Debido a que la mayoría de las identificaciones parasitológicas se basan en el reconocimiento de la morfología característica de los organismos, cualquier circunstancia que pueda ocultar o distorsionar el aspecto morfológico del parásito puede originar una identificación incorrecta o un diagnóstico erróneo.

3. INDICACIONES DEL ESTUDIO PARASITOLÓGICO

- En pacientes con diarrea prolongada (mas de 4 días de duración) en los que no se detecten otros enteropatógenos.

- Brotes de diarrea en colectivos como guarderías.(Giardia lamblia, Cryptosporidium sp.).

- Sujetos inmunocomprometidos. (Cryptosporidium sp., Isospora sp, Enterozitozoon bienusi, Giardia lamblia).

- Personas procedentes de países con parasitosis endémicas. (Entamoeba histolytica, helmintiasis).

- En casos de protozoosis, en familiares y contactos próximos al paciente (Giardia glambia).

- Antecedentes de contacto con animales (Isospora sp, Sarcocystis sp., Cryptosporidium sp., helmintiasis).



- En gastritis de aparición brusca y ante antecedentes compatibles (ingesta de pescado crudo) se debe pensar en la posibilidad de aniisakiasis.

4. RECOGIDA Y CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS

4.1 MUESTRAS FECALES

Para concentración

Las heces las recogerá el paciente en los envases dobles (Miniparasep ®), suministrados para tal fin al paciente junto con una ho ja de instrucciones en los diferentes centros de salud, consultas hospitalarias o bien unidades y servicios de hospitalización, si es que el paciente se encuentra ingresado.

De todas formas se procede con un breve resumen de las mismas:

1) Recoger las heces en un recipiente limpio y seco (cuña, orinal, revista o periódico, bolsa de plástico, por ejemplo) que no contenga restos de jabones o desinfectantes. No usar heces contaminadas con agua u orina.

2) Desenroscar el tapón del envase que contiene líquido en su interior.

3) Utilizar la pala unida al tubo cónico para coger una porción de heces de tamaño inferior al de un guisante, preferentemente de zonas que parezcan contener sangre, mucosidad o líquido.

4) Introducir la pala con la muestra de heces dentro del envase con líquido sin separar la pala del tubo cónico que lleva en su parte posterior y cerrar enroscando fuertemente. Agitar suavemente sin invertir. Guardar el envase a temperatura ambiente (no en frigorífico) hasta su entrega al laboratorio o al centro de salud.

5) A continuación lavarse bien las manos con agua y jabón.

Las heces también podrán recogerse en recipientes estériles, secos y de boca ancha con cierre hermético similares a los utilizados para el coprocultivo. Se instruirá al paciente para que sólo llene los botes hasta la mitad y se asegure de cerrar bien la tapa para evitar derrames y “accidentes” durante su apertura en el laboratorio. Como este tipo de recipientes no lleva conservante, si el transporte se demora es conveniente mantener las heces en nevera (aunque ello implica la pérdida de viabilidad de los posibles trofozoitos presentes en la muestra).

Las muestras fecales tampoco deben contener bario, bismuto, ni medicamentos que contengan aceite mineral, antibióticos, fármacos antipalúdicos. La recogida debe retrasarse entre 5 y 10 días para permitir que desaparezca el bario y como mínimo 2 semanas para que se recuperen de los efectos tóxicos de ciertos antibióticos.



La rentabilidad de la muestra aumenta cuando se hacen estudios seriados (3 muestras recogidas en días consecutivos, o mejor alternos). El análisis de 3 muestras garantiza la detección de más del 99% de las infecciones.

Cuando la sospecha de parasitosis es fuerte y no se detectan parásitos tras uno o dos exámenes seriados deben recogerse muestras fecales tras la administración de un laxante, aunque no todos son válidos para este fin: sulfato de sodio y bifosfato sódico tamponado (Phospho-Soda ®) son dos de los recomendados.

Número de muestras requeridas para detectar los parásitos intestinales

Número de muestras por paciente Porcentaje parasitosis detectadas

1 91’9%

2 97’6%

3 99’8%

4 99’9%

Para detección de antígenos parasitarios

Para este tipo de determinación no son válidas las muestras de heces conservadas (Miniparasep ®) y deberán recogerse siempre en recipientes estériles, secos y de boca ancha con cierre hermético, siguiendo las mismas instrucciones que para la concentración.

4.2 MUESTRAS PERIANALES

Test de Graham

La recogida de muestras perianales puede ser necesaria para el diagnóstico de las infecciones por oxiuros (E.vermicularis) y en ocasiones para Taenia spp. La preparación de una tira adhesiva de celofán transparente (Test de Graham) es el método de elección

Para tomar adecuadamente una muestra parta test de Graham:

1) Sin lavarse, a primera hora de la mañana, separar las márgenes del ano y aplicar, presionando una tira de papel de celo transparente (nunca opaco). Puede ayudarse si lo desea de un depresor o del mismo porta.

2) Pegarlo a continuación, lo más liso posible, en el cristal (porta) entregado al paciente con este fin.

3) No debe contener restos fecales ni polvos de talco.

4) Esperar a tener todas las muestras para llevarlo todo junto al laboratorio. Puede permanecer sin problemas a temperatura ambiente.



5) Pegarlo a continuación, lo más liso posible, en el cristal (porta) entregado

Los exámenes deben ser seriados (3 muestras) y la conservación de la muestra se hace en nevera.

4.3 ASPIRADOS DUODENALES

La recogida y el examen del contenido duodenal es un medio de recuperación de ciertos parásitos (larvas de Strongyloides, huevos de Opisthorchis y Fasciola y Crptosporidium, Isospora, etc. Pero es utilizado más frecuentemente para Giardia . las muestras deben obtenerse por endoscopia o mediante la utilización de una cápsula entérica (Enterotest ®): El paciente debe tragar una cápsula de gelatina fijada a un hilo de nylon suficientemente largo como para llegar hasta el duodeno. Los trofozoítos se fijan al hilo y son extraidos al sacarlo. Las muestras deben recogerse en suero salino y transportadas directamente al laboratorio para su examen microscópico.

4.4 MATERIAL DE SIGMOIDOSCOPIA

El material procedente de sigmoidoscopia puede ser útil para el diagnóstico de la infección por E.histolytica. Las muestras se componen de material raspado o aspirado de la superficie de la mucosa. Deben tomarse como mínimo 6 muestras. El material recogido debe introducirse en suero fisiológico. Las muestras deben ser enviadas inmediatamente al laboratorio y examinadas para detectar la presencia de trofozoitos móviles.



4.5 ASPIRADO DE ABCESOS HEPÁTICOS

Las lesiones supurativas del hígado y de los especios subfrénicos pueden deberse a la infección por E.histolytica También Echinococcus spp también pueden causar lesiones quísticas en el hígado (aunque su punción diagnóstica está contraindicada)

La amebosis hepática (abceso) puede presentarse en ausencia de síntomas intestinales. La muestra debe recogerse del margen de la lesión y no del centro necrótico. La primera porción extraída suele presentar un aspecto blanco-amarillento y rara vez contiene amebas. Las últimas porciones, que son de color rojizo contienen organismos con una mayor probabilidad. Se deben extraer al menos 2 porciones independientes de material exudativo. Con posterioridad a la aspiración, el colapso del abceso y la ulterior entrada de flujo sanguíneo comportan a menudo, la liberación de amebas a partir del tejido. Por lo tanto, las siguientes aspiraciones tienen una mayor probabilidad de detectar organismos. El material aspirado debe ser remitido inmediatamente al laboratorio.

4.6 ORINA

El examen de muestras de orina puede ser útil para el diagnóstico de la infección por Schistosoma haematobium . La orina puede examinarse directamente o tras someterse a un proceso de concentración. Los huevos pueden estar atrapados en la mucosidad o el pus y se encuentran con mayor frecuencia en la última porción de la muestra. La emisión de los huevos es variable por lo que se deben efectuar exploraciones a lo largo de varios días.

5. TÉCNICAS DE EXAMEN

Las muestras deben examinarse sistemáticamente en busca de protozoos (quistes y trofozoitos), huevos y larvas de helmintos. Para una detección óptima de estos agentes infecciosos se precisa la combinación de diversas técnicas de examen.

5.1 EXAMEN MACROSCÓPICO

Debe examinarse la consistencia de la muestra fecal, así como la presencia de sangre, mucosidad, gusanos y proglótides.

En ocasiones (helmintiasis) el estudio macroscópico de las heces puede ser suficiente para detectar al parásito (ej. gusano adulto de Ascaris lumbricoides) o restos parasitarios (proglótides de tenias).



5.2 EXAMEN EN FRESCO DIRECTO

Especialmente indicado en ciertas ocasiones: heces líquidas en busca de trofozoitos, aspirados duodenales, biopsias, muestras de sigmoidoscopia, orinas, etc.

Las muestras se examinarán en montajes con solución yodoyodurada de lugol y/o suero salino para detectar trofozoitos móviles o larvas o cualquier otra forma parasitaria.

5.3 TEST DE GRHAM

Las muestras se observarán en el microscopio, con objetivo de bajo aumento en busca de los huevos de Enterobius vermicularis. En ocasiones excepcionales también es posible encontrar huevos de Taenia spp.

5.4 CONCENTRACIÓN

En muchas ocasiones la densidad de parásitos en las muestras de heces es muy reducida dando lugar a la aparición de resultados falsos negativos al examen microscópico directo. Por este motivo es conveniente recurrir rutinariamente a técnicas de concentración con el objeto de que se produzca un enriquecimiento parasitario de la muestra.

A continuación se describe el método que utiliza nuestro laboratorio:

Parasep ® (Grifols) es un sistema sencillo para el diagnóstico de parásitos en heces.

1 Material que comprende el kit

- 40 tubos cónicos con cucharilla enroscada para la recolección de las heces

- 40 tubos de base recta con tapón de rosca conteniendo formalina al 10% para la adecuada conservación de las heces y posibles estructuras parasitarias.



2 Procedimiento técnico (heces no conservadas)

1. Destape un tubo de base recta (guardar el tapón para reutilizarlo después) y con la ayuda de la cucharilla del extremo del tubo cónico introducir una pequeña porción de heces y de sangre o moco si los hubiese.

2. Si las heces vienen ya recogidas en el dispositivo (heces conservadas) comenzar en este punto. Agite vigorosamente 30 segundos en el vórtex o hasta que las heces se hayan disgregado adecuadamente.

3. Invertir el sistema contenedor-adaptador-tubo cónico y centrifugar 2 minutos a 2.200 r.p.m. No preocuparse si no ha filtrado totalmente, con la centrifugación se terminará de filtrar.

4. Decantar el sobrenadante y si es necesario añadir unas gotas de suero fisiológico. Volver a tapar y colocar el tubo en la gradilla. Examinar el sedimento en fresco al microscopio en busca de parásitos.

5.5 TINCIONES PERMANENTES

A veces, la detección y la correcta identificación de los protozoos intestinales dependen del examen de un frotis con una tinción permanente. Esto es particularmente cierto en el caso de las coccidiosis y las microsporidiosis. Para los coccidios (Isospora belli, Crptospordium, spp, etc) se emplea una tinción ácido-alcohol resitente como el Ziehl-Neelsen modificado o Kinyoun. Estas tinciones no forman parte del procedimiento habitual y se harán según el criterio del microbiólogo en función de las características del paciente y el diagnóstico de sospecha. El frotis se hará a partir del sedimento de heces.

Dado que nuestro laboratorio pertenece a un hospital comarcal con ciertas limitaciones técnicas a veces será necesario recurrir a un laboratorio de referencia para la identificación de algunos parásitos poco comunes en nuestro medio. Para la remisión de dichas muestras consultar PNT 14.

6. DIAGNÓSTICO INMUNOLÓGICO

DETECCIÓN DE ANTICUERPOS

La detección de anticuerpos está indicada en el diagnóstico de algunas infecciones protozoarias y helmínticas:

Amebosis extraintestinal, clonorquiosis, cisticercosis, hidatidosis, etc.

Esta serología no se realiza en nuestro centro y cuando se solicite será remitida a un centro de referencia.



DETECCIÓN DE ANTÍGENOS PARASITARIOS EN HECES

Panel para parásitos Triage ® (BIOSITE) es un test inmunológico enzimático para la detección de antígenos específicos de Giardia intestinales, Entamoeba histolytica/dispar, y Criptosporidium parvum en muestras fecales.

1. Componentes del kit

- Dispositivo de test (20 u)

- Diluyente de la muestra (2x47ml)

- Conjugado de enzima (3ml)

- Solución de lavado (12 ml)

- Sustrato (4ml)

- Controles: positivo y negativo (2ml cada uno)

- Pipetas de transferencia (40 u)

- Tubos para muestra con tapón de rosca azul (20 u)

- Cucharas (20 u)

- Dispositivos de filtrado (20 u)

- Pipeta Biosite ®

- Puntas de pipeta amarillas (20 u)

- Tapas de rosca blancas (20 u)

2 Preparación de las muestras

Los controles positivo y negativo externo deben prepararse y analizarse de la misma forma que las heces líquidas.

1- Mezclar el diluyente invirtiendo el frasco un par de veces y después agréguelo en el tubo hasta la línea de llenado.

2- Adición de la muestra al tubo:

a. Muestras líquidas: Utilizar una pipeta de transferencia para añadir 500 microlitros (marca de 0.5 ml)

b. Muestras sólidas o semisólidas: añadir una medida rasa de la cucharilla

3- Tapar el tubo con el tapón azul y agitar en el vórtex 10 segundos.

4- Desechar el tapón azul e introducir el sistema de filtración con el extremo blanco hacia abajo y volver a tapar el tubo con un tapón blanco.



5- Centrifugar durante 5 minutos a 1.800 r.p.m.

6- Retirar el tapón y con una pipeta de transferencia añadir 500 microlitros (marca 0.5 ml) al centro de la zona test de la placa con cuidado de no tocar las paredes del tubo de muestra.

7- Dejar que la muestra sea absorbida completamente por la placa antes de continuar.

8- Añadir el conjugado (140 microlitros) con la ayuda de la pipeta Biosite y una punta amarilla, en la zona central de la placa e incubar 3 minutos.

9- Lavar dos veces añadiendo cada vez 7 gotas de la solución de lavado mediante el frasco cuentagotas. Dejar que la solución se absorba completamente entre lavado y lavado.

10- Añadir 4 gotas de sustrato en la zona central de la placa e incubar 5 minutos.

11- Lectura de resultados:

a. Zona de control negativo: Los resultados son válidos si no aparerce ninguna banda en esta zona.

b. Zona de control positivo: Los resultados son válidos si aparece un a banda azul en cada una de las tres zonas de control positivo.

c. Zona de test: Aparece una banda de color junto al nombre del parásito si es positivo y no aparece banda si es negativo.

d.

7. DIAGNÓSTICO PRÁCTICO DE LAS PARASITOSIS MÁS FRECUENTES

Los parasitos hallados con más frecuencia en nuestro medio son Giardia lamblia y diversas amebas no patógenas (principalmente E.coli y E.nana) siendo muy infrecuente el hallazgo de la ameba patógena E.histolytica. El diagnóstico microscópico de organismos flagelados como Giardia resulta sencillo mediante la detección de los quistes característicos. En las amebas el examen se centrará en características particulares de los quistes como el tamaño, número de núcleos, posición del nucléolo y el estudio de formas cromidiales. E. histolytica presenta 1-4 núcleos con un nucléolo en posición central y un patrón cromático fino en la periferia mientras que E.coli, de tamaño bastante parejo, posee hasta 8 nucleos. El resto de especies amebianas se distingue fácilmente de la E.histolytica por su tamaño considerablemente más pequeños.



Identificación morfológica de E. histolytica y E.coli

Especie E. histolytica E.coli

Tamaño (ø en µm) Trofozoito Quiste

12-50 10-20

20-30 10-30

Patrón de cromatina nuclear periférica

Anillo fino y disperso Irregulares, en grumos

Eritrocitos ingeridos Presentes Ausentes

Nº de núcleos 1-4 1-8

A pesar de las dudas que suscita la capacidad patogénica de ciertos protozoos, cuando su presencia sea observada de hará constar siempre en el informe.

Otra parasitosis muy frecuente en nuestro medio es la infección por oxiuros. Su diagnóstico se realiza fácilmente mediante la observación de los huevos de E. ermicularis, en el Test de Graham. Ocasionalmente también pueden ser observados en el examen del sedimento.

El diagnóstico definitivo de las infecciones por nematodos reside habitualmente en la detección de huevos o larvas de los parásitos en heces. La anisakiasis se detecta generalmente por endoscopía.

Dado que los huevos de Taenia saginata y Taenia solium son similares, el diagnóstico a nivel de especie de estos cestodos se obtiene mediante el examen de las proglótides eliminadas en las heces (las proglótides de T. saginata muestran un útero mas ramificado que las de T. solium).



ANEXO CON EL RESUMEM DE LAS INSTRUCCIONES PARA LA TOMA DE MUESTRA DE COPROCULTIVOS Y PARÁSITOS EN HECES. Se trata de que el personal que está en contacto con los pacientes (centros de salud, consultas, servicios de hospitalización y recepción de muestras de laboratorio instruyan adecuadamente a los pacientes con respecto a la recogida correcta de este tipo de muestras. Si al paciente se le solicita coprocultivo, rota/adeno y/o toxina de Clostridium difficile. Los coprocultivos no se hacen seriados, por lo que se recogerá una única muestra por petición. Las muestras de heces para coprocultivo -incluida la detección de toxinas A y B de Clostridium .difficile y la detección de antígeno de Rotavirus y Adenovirus- deben recogerse y transportarse en un recipiente estéril y seco de boca ancha preferiblemente de plástico, bien cerrado. Es importante indicar al paciente que nunca lo llene a más de la mitad de su capacidad, ya que basta con una pequeña cantidad de heces (la mitad del tamaño de una nuez) para la realización del cultivo y la determinación de antígenos y/o toxinas. Se pueden admitir muestras en torunda o escobillón con medio de transporte habitual (Amies), -aunque no se recomienda-, en aquellos casos en que la recogida de heces puede resultar muy dificultosa (bebes con heces muy líquidas que se quedan absorbidas por el pañal, etc.), excepto en el caso de sospecha de diarrea por Clostridium difficile, que deberán recogerse siempre en recipiente seco. Si no se van a procesar inmediatamente, deben conservarse refrigeradas a 4ºC.

Si al paciente se le solicita examen parasitológico

Los exámenes parasitológicos se realizan de forma seriada, por lo que se suministrará al paciente material para la recogida de 3 muestras de días diferentes, preferiblemente alternos.

Las heces las recogerá el paciente en los envases dobles (Miniparasep ®), suministrados para tal fin al paciente junto con una hoja de instrucciones en los diferentes centros de salud, consultas hospitalarias o bien unidades y servicios de hospitalización, si es que el paciente se encuentra ingresado.

De todas formas se procede con un breve resumen de las mismas:

1) Recoger las heces en un recipiente limpio y seco (cuña, orinal, revista o periódico, bolsa de plástico, por ejemplo) que no contenga restos de jabones o desinfectantes. No usar heces contaminadas con agua u orina.

2) Desenroscar el tapón del envase que contiene líquido en su interior.

3) Utilizar la pala unida al tubo cónico para coger una porción de heces de tamaño inferior al de un guisante, preferentemente de zonas que parezcan contener sangre, mucosidad o líquido.



4) Introducir la pala con la muestra de heces dentro del envase con líquido sin separar la pala del tubo cónico que lleva en su parte posterior y cerrar enroscando fuertemente. Agitar suavemente sin invertir. Guardar el envase a temperatura ambiente (no en frigorífico) hasta su entrega al laboratorio o al centro de salud.

5) A continuación lavarse bien las manos con agua y jabón.

Nota: ya que las cajas donde se suministran los envases Miniparasep ® llevan el mismo número de hojas de instrucciones para la recogida de la muestra que envases, se le deberá suministrar obligatoriamente una hoja a cada paciente. Si al paciente se le solicita test de Graham Los exámenes de test de Graham se realizan de forma seriada, por lo que se le suminstrará al paciente 3 portas para la recogida de 3 muestras de días diferentes, preferiblemente alternos. Para tomar adecuadamente una muestra parta test de Graham:

1) Sin lavarse, a primera hora de la mañana, separar las márgenes del ano y aplicar, presionando una tira de papel de celo transparente (nunca opaco). Puede ayudarse si lo desea de un depresor o del mismo porta.

2) Pegarlo a continuación, lo más liso posible, en el cristal (porta) entregado al paciente con este fin.

3) No debe contener restos fecales ni polvos de talco.

4) Esperar a tener todas las muestras para llevarlo todo junto al laboratorio. Puede permanecer sin problemas a temperatura ambiente.



Si al paciente se le solicita coprocultivo, rota/adeno y/o toxina de Clostridium difficile y parásitos (con o sin test de Graham) El paciente deberá recoger las 3 muestras para parásitos en sus correspondientes recipientes siguiendo las instrucciones recomendadas en el apartado correspondiente, y el último día deberá recoger la muestra para coprocultivo, rota/adeno y/o toxina Clostridium difficile en el recipiente estéril seco de boca ancha (siguiendo también las instrucciones pertinentes). Si además, se le solicita el test de Graham deberá adjuntar asimismo las muestras correspondientes.

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