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QU APORTAN LOS MTODOS DE AMPLIFICACIN GENTICA ALDIAGNSTICO DE LA TUBERCULOSIS EN LA PRCTICA CLNICA?

Jos Manuel Querol Ribelles, Damiana Gonzlez Granda y Rosario Fors Va

Servicios de Medicina Interna y Microbiologa, Hospital Lluis Alcanyis. Xtiva(Valencia)

La tuberculosis sigue planteando en la actualidad importantes problemasepidemiolgicos, de diagnstico clnico y microbiolgico, y teraputicos. Hay que destacar laalta incidencia de la enfermedad en los pases en vas de desarrollo, entre los que latuberculosis constituye una de las causas ms importantes de morbilidad y mortalidad, y elimpacto que sobre ella esta teniendo la coinfeccin con el virus de la inmunodeficenciahumana. El retraso diagnstico y el deficiente estudio de contactos son las causas msimportantes de la eclosin de miocrepidemias en los pases desarrollados. Los problemas

teraputicos que precisan atencin prioritaria son el cumplimiento correcto de las pautas detratamiento y el aumento de las resistencias de Mycobacterium tuberculosis a lostuberculostticos de primera lnea.

En los ltimos 100 aos, la nica prueba rpida para el diagnstico de tuberculosisha sido el examen microscpico, cuya sensibilidad es aceptable cuanto la muestra analizadacontiene ms de 100.000 bacilos cido-alcohol resistentes (BAAR)/mL, aunque lasensibilidad del mtodo mejora ostensiblemente cuando se trata la muestra y se utiliza elmicroscopio de fluorescencia, pudiendo entonces ser positiva la muestra con menos de10.000 BAAR/mL. Esta sensibilidad podra ser aceptable en la tuberculosis pulmonar, peroes insuficiente en las formas paucibacilares de la enfermedad, como ocurre en la meningitistuberculosa y, en general, en la de tuberculosis extrapulmonar. El aislamiento de M.

tuberculosisen cultivo sigue siendo la clave del diagnstico definitivo de tuberculosis, peroadolece de limitaciones, la ms importante de las cuales es su lentitud que, aunque se havisto parcialmente resuelta con la incorporacin de nuevos mtodos de cultivo, sobre todoradiomtricos (BACTEC-460), an siguen siendo necesarias de dos a tres semanas paraconseguir el crecimiento e identificacin de M. tuberculosis con la aplicacin adicional de

sondas de DNA (AccuProbetest).

Hace algo ms de 10 aos el desarrollo tecnolgico permiti la aparicin de mtodosde amplificacin gentica (AG) que fueron rpidamente introducidos para el diagnsticomicrobiolgico de la tuberculosis. Las pruebas de biologa molecular actualmente en uso enel laboratorio para el diagnstico de tuberculosis son AMTDT (Gen-Probe), basado en la

amplificacin enzimtica del RNA ribosmico, AMPLICOR (Mycobacterium tuberculosisPCRtest, Roche Diagnostic Sytems) basado en la amplificacin del DNA mediante la reaccin encadena de la polimerasa y el LCx (LCR Mycobacterium tuberculosis assay, AbbottLaboratories), sistema de amplificacin que utiliza la reaccin de la ligasa. Aportacionesrecientes, todava no generalizables, son la PCR mltiple para identificacin en una mismamuestra de diferentes especies micobacterianas y, sobre todo, la posibilidad de detectar enla muestra clnica genes de resistencia a los distintos tuberculostticos de primera lnea.

Tras la euforia inicial de los primeros aos, en los que se presuma que podrasustituir al examen microscpico en el diagnstico rpido de la tuberculosis, se pas a unperiodo de cierto pesimismo debido a problemas de reproducibilidad de los resultados entrelos distintos laboratorios, resuelto en parte en la actualidad tras la introduccin de los

mtodos comerciales semiautomatizados. An con todo, el papel de los mtodos de AG anconstituye un dilema, ya que la mayora de estudios publicados parten de muestras ms o

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menos seleccionadas, la mayora patrocinados por las propias casas comerciales, mientrasque faltan estudios amplios, multicntricos, en los que se demuestre definitivamente lautilidad de estas pruebas en la prctica diaria de los laboratorios de microbiologa.

MENINGITIS TUBERCULOSA

Probablemente, la meningitis tuberculosa es la forma de tuberculosis que mayoresproblemas diagnsticos plantean al clnico. Es una situacin urgente, la muerte es casisegura sin tratamiento y, si se retrasa la implantacin de ste, las secuelas neurolgicaspueden ser graves e irreversibles. La sospecha clnica no siempre es consistente y, aunqueel examen del lquido cefalorraqudeo (LCR) aporta datos sugestivos, como son pleocitosislinfocitaria, hipoglucorraquia y el aumento de la cifra de adenosinadesaminasa (ADA),habitualmente se inicia un tratamiento emprico sin tener la certeza de que el diagnsticoser confirmado.

El diagnstico microbiolgico clsico no tiene prcticamente ninguna utilidad ya queel examen microscpico es positivo en menos del 10% de los casos, y el cultivo, an siendo

positivo, tardar ms de dos semanas en el mejor de los casos. As las cosas, los mtodosde AG constituyen una ayuda inestimable en el diagnstico de este cuadro clnico. Ante laausencia de un patrn oro en l diagnostico definitivo de la tuberculosis menngea es difcilevaluar la introduccin de cualquier nuevo mtodo diagnstico. No obstante, si tomamos enconsideracin los estudios publicados que consideran el diagnstico de la meningitistuberculosa como confirmado (aislamiento de M. tuberculosis en cultivo) o altamenteprobable (manifestaciones clnicas compatibles, pleocitosis linfocitaria e hipoglucorraquia,respuesta al tratamiento tuberculosttico), la sensibilidad de los mtodos de AG oscila entreel 60% y el 100%, y la especificidad del 80% al 100%. Podemos concluir que los mtodos deAG son de eleccin en el diagnstico de meningitis tuberculosa por su rapidez, especificidady sensibilidad. Debera ser actualmente una tcnica habitual en el diagnstico del sndromemenngeo con sospecha de esta etiologa.

FORMAS EXTRAPULMONARES DE LA TUBERCULOSIS

El diagnstico de las formas extrapulmonares de la tuberculosis, aunque pocoimportante desde el punto de vista epidemiolgico, constituye sin embargo un reto para elclnico debido a lo proteiforme de sus manifestaciones, en ocasiones a la escasaexpresividad clnica y, en la mayora de los casos, a las dificultades que plantea laconfirmacin microbiolgica mediante los mtodos clsicos. Existen muchos estudiospublicados comparando los mtodos de AG con el examen microscpico y el cultivo, lamayora con muestras seleccionadas y, por lo tanto, no totalmente extrapolables susresultados a la prctica diaria. En la tabla se muestran algunos de los estudios msrepresentativos en muestras clnicas no respiratorias (pus, orina, sangre, LCR, biopsias,

lquido pleural, lquido asctico, heces) que evalan la eficacia de los mtodos de AG encomparacin con el cultivo.

Autor Mtodo N muestras Sensibilidad (%) Especificidad (%)Tortoli, 1997 LCx 147 71 99Lindbrathen, 1997 LCx 17 90 97Piersimoni, 1998 AMTDT 184 54 99Gamboa, 1998 LCx 526 78 99Tortoli, 1999 AMPLICOR 113 59 99Brown, 1999 AMTDT 21 67 75Ruiz, 2000 AMTDT 57 53 100Ruiz, 2000 LCx 57 63 100

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Tomando como trmino de comparacin para el diagnstico de la tuberculosisextrapulmonar el aislamiento de M. tuberculosis en cultivo, los mtodos de AG tienen unamenor sensibilidad, sin embargo, en estas situaciones clnicas, el mtodo de referenciadebera ser el diagnstico clnico ya que no siempre el cultivo es positivo en estassituaciones y, en la prctica clnica, son muchos los casos en que se inicia el tratamientotuberculosttico sin diagnstico microbiolgico, basado en una sospecha clnica slida,datos histopatolgicos (hallazgo de granulomas caseificantes en la biopsia pleural, hepticao ganglionar), radiolgicos (alteracin de la va excretora urinaria en la tuberculosis renal) odatos bioqumicos (elevacin de la ADA en lquido pleural o cefalorraqudeo) e, incluso, conla sola evidencia epidemiolgica. En este contexto clnico es donde los mtodos de AGmuestran mayor sensibilidad que el examen microscpico y el cultivo, aunque los resultadosdeben interpretarse siempre dentro de este contexto.

Comentario adicional merece la utilidad de los mtodos de AG en los en pacientescon infeccin por el virus de la inmunodeficiencia humana, en los que la inmunodepresincelular grave puede hacer que la enfermedad tuberculosa adopte formas atpicas, como uncuadro de fiebre de origen desconocido, enfermedad granulomatosa no caseificante,

tuberculosis pulmonar con radiografa de trax aparentemente normal, coinfeccin pordiferentes microorganismos, entre otras. En estas situaciones se puede detectar M.tuberculosis en muestras clnicas mediante PCR y deben interpretarse como existencia deenfermedad, y no slo de infeccin, en la mayora de los casos.

DIAGNSTICO DE LA TUBERCULOSIS PULMONAR

Para valorar la eficacia de los mtodos de AG en el diagnstico de la tuberculosispulmonar, en realidad lo que interesa es compararlos con el examen microscpico comomtodo de diagnstico rpido. La sensibilidad del ste es variable, aunque la mayora de losautores la sitan en torno al 60-70%, lo que lleva a iniciar tratamientos basados en lasospecha clnica, o al retraso inapropiado de los mismos en espera del resultado del cultivo.

La sensibilidad de los mtodos de AG en el diagnstico de tuberculosis pulmonar,tomando como referencia el cultivo, oscila entre el 85 y el 100%. Cuando se consideran lasmuestras BAAR positivas la sensibilidad de los mtodos de AG puede llegar al 99%, y lo quees ms importante, entre el 30% y el 60% de las muestras negativas tras examenmicroscpico son positivas por AG. Una ventaja adicional de los mtodos de AG en eldiagnstico de la tuberculosis pulmonar es la confirmacin de que las muestras positivas portincin y por AG contienen M. tuberculosis. As pues, los mtodos de AG son actualmente elmtodo de eleccin para el diagnstico rpido de la tuberculosis. En nuestro laboratorio demicrobiologa, en un estudio prospectivo (datos no publicados) basado en la aplicacinsistemtica de la LCx en el diagnstico de tuberculosis pulmonar, encontramos que estemtodo aport el diagnstico inicial de tuberculosis en el 30% de los casos, siendo la

sensibilidad respecto al cultivo del 84%, y la combinacin de la LCx y la tincin de Ziehl-Neelsen permiti el diagnstico rpido de tuberculosis pulmonar en el 90% de los casos.

Aunque la indicacin aceptada de los mtodos de AG es, precisamente, laconfirmacin de que la micobacteria detectada en el examen microscpico es M.tuberculosis, la utilidad en la prctica clnica es mayor si se interpretan los resultados en elcontexto clnico adecuado como la sospecha de primoinfeccin tuberculosa en un ambienteepidemiolgico de riesgo, lesiones pulmonares en pacientes inmunodeprimidos con altoriesgo de reactivacin de lesiones residuales o, incluso, para confirmar retrospectivamenteel diagnstico de tuberculosis en pacientes tratados empricamente desde uno a tres mesesantes. En nuestra experiencia, en un estudio realizado en 105 pacientes diagnosticados detuberculosis pulmonar, detectamos 10 pacientes cuyo cultivo de esputo fue negativo y laPCR positiva, de stos, cinco formaban parte de un estudio de contactos por unamicroepidemia escolar de tuberculosis y mostraban, adems de la intradermorreaccin

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positiva a la tuberculina, un infiltrado pulmonar en los lbulos superiores, tres presentabanun infiltrado pulmonar no cavitado y fueron detectados en un estudio de contactos de altoriesgo, una joven de 14 aos tena un eritema nodoso con radiografa de trax normal y sumadre haba sido diagnosticada recientemente de tuberculosis pulmonar y, finalmente, unpaciente tena una meningitis tuberculosa con radiografa de trax normal y, a la semana deobtener el esputo, ya comenz a apreciarse el patrn miliar en un control radiolgico.

ANLISIS DE LAS DISCREPANCIAS

Probablemente es del anlisis de las discrepancias entre el examen microscpico, elcultivo y los mtodos de AG en un contexto clnico adecuado donde mejor se puede evaluarla utilidad real de los mtodos de AG en la prctica clnica. Tericamente, se pueden darvarias situaciones fruto de la combinacin de los tres mtodos diagnsticos, y cada una deellas debe interpretarse sin olvidar el paciente del que procede la muestra.

Si el examen microscpico es negativo y la AG positiva, probablemente se trata deuna tuberculosis y esta discrepancia sera debida a la mayor sensibilidad de la AG. Si el

examen microscpico es positivo y la AG negativa, probablemente estemos ante unainfeccin por una micobacteria atpica que deberamos investigar exhaustivamente. Si la AGes positiva y el cultivo es negativo podemos estar ante una tuberculosis paucibacilar o unatuberculosis tratada, aunque tambin podra tratarse de un falso positivo de la AG, de ah lanecesidad de analizar los resultados en el contexto clnico del paciente. Por ltimo, si la AGes negativa y el cultivo positivo se trata de una tuberculosis, salvo contaminacionesexgenas.

La interpretacin del anlisis de las discrepancias obviamente parte de la base deuna sospecha clnica, y una vez descartados los problemas inherentes a las tcnicas, comoson la contaminacin, el procesado correcto de las muestras o la presencia de inhibidoresenzimticos. Por eso, en estas situaciones de discrepancia, es conveniente repetir las

tcnicas de diagnstico rpido, es decir, el examen microscpico y la AG.

VENTAJAS Y LIMITACIONES DE LOS MTODOS DE AG

A modo de resumen, las ventajas que aportan los mtodos de AG respecto a losmtodos clsicos en el diagnstico de tuberculosis son la sensibilidad respecto al examenmicroscpico y la rapidez respecto al cultivo en tuberculosis pulmonar. En la tuberculosisextrapulmonar los mtodos de AG son ms sensibles que el examen microscpico y que elcultivo. Adems, la AG permite la confirmacin rpida de que el BAAR detectado en elexamen microscpico es M. tuberculosis. Una ventaja adicional poco explorada es lautilizacin de AG en los medios de cultivo lquido, cuando tanto el examen microscpicocomo la AG de la muestra han sido negativas, lo que puede aportar resultados ms

precoces que la utilizacin de sondas de DNA.

Entre las limitaciones de los mtodos de AG hay que destacar que puede no ser unmtodo tan rpido como se propugna cuando se utiliza en laboratorios de microbiologa queprocesan pocas muestras, debido a que la tcnica slo sera rentable si se realiza una vez ala semana. Otra limitacin a destacar es el anlisis coste-eficacia, teniendo en cuenta que,en la situacin actual, es un mtodo que complementa pero no desplaza a los anteriores y,por lo tanto, significa un aumento de recursos humanos y materiales.

Probablemente, la falta de reproducibilidad es la limitacin ms importante de losmtodos de AG. Hasta ahora, estas tcnicas estn semiautomatizados, lo que puede seruna de las causas de la falta de esta falta de reproducibilidad, incluso con mtodoscomerciales. Noordhoek et al., en un estudio de control de calidad realizado entre 30laboratorios que deban estudiar mediante AG 20 muestras de esputo (10 negativas, 5 con

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100 BCG/ml y 5 con 1000 BCG/ml) encuentran que slo cinco realizaron la identificacincorrecta, 17 laboratorios detectaron BCG en las muestras negativas; de los 13 laboratoriosque no tuvieron falsos positivos, slo cinco detectaron BCG cuando la carga era de 100micobacterias/ml. Adems, no hubo dos laboratorios que utilizaran la misma tcnica durantetodo el procedimiento, 22 utilizaron la PCR y 8 Amplicor o AMTDT. Finalmente, slo 17laboratorios utilizaron dUTP/uracil DNA glucosilasa para evitar la contaminacin cruzada porproductos de amplificacin, lo que no impidi que en ocho ocasiones obtuvieran falsospositivos.

Una limitacin adicional al empleo habitual de los mtodos de AG en la prcticaclnica diaria es el desconocimiento, por parte de los clnicos, del significado de un resultadopositivo en una situacin discrepante, as como el significado epidemiolgico en trminos deinfectividad a la hora de efectuar un estudio de contactos. La respuesta a esta ltimalimitacin debe venir de estudios prospectivos de aplicacin sistemtica de los mtodos deAG en los laboratorios de microbiologa, sin seleccin de pacientes ni de muestras.

INDICACIONES DE LOS MTODOS DE AMPLIFICACIN EN EL DIAGNSTICO DE LA

TUBERCULOSISPartiendo de la base de que se debe intentar diagnosticar la enfermedad tuberculosa

por cualquier mtodo microbiolgico slo cuando existe sospecha clnica, las indicacionesde los mtodos de AG podran ser:

a) Confirmacin de M. tuberculosisen muestras BAAR positivas.b) Diagnstico rpido en muestras respiratorias BAAR negativas.c) Diagnstico rpido de casos difciles (meningitis tuberculosa, tuberculosis diseminada en

pacientes con SIDA).d) Evitar tcnicas cruentas (biopsia pleural, extirpacin de adenopatas, biopsia heptica,

biopsia sea).

e) Evitar tratamientos empricos ante cuadros donde los mtodos tradicionales han sidopoco rentables (tuberculosis renal, tuberculosis intestinal).

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