Determinación de propiedades nutraceuticas. Muestras obtenidas cada 15 minutos

durante la primera hora y cada 30 minutos en las siguientes horas del secado fueron

procesadas de acuerdo a cada método de extracción.

Determinación de fenoles totales

El método propuesto por Singleton y Rossi (1965) usando el reactivo Folin-Ciocalteu fue usado para determinar los fenoles totales.

Extracción de compuestos. Se pesaron 0.5 g de muestra fresca y seca y se extrajo con 5ml

de MeOH acidificado con HCl al 1% sonicado en baño ultrasónico por 30min, se

centrifugo a 1820 rpm por 10 min recuperando el sobrenadante. Se extrae nuevamente con

5 ml de MeOH acidificado con HCl al 1%, se centrifuga y se recupera el sobrenadante.

Posteriormente se filtró el extracto orgánico total con pipeta Pasteur empacada con fibra de

papel y se guardaron en un vial ámbar hasta su análisis.

Reactivo de Folin Ciocalteu. Se disolvió el reactivo comercial 2M en una relación 1:1 con agua destilada.

Curva Standard. Se pesó 36 mg de ácido gálico grado ACS y se aforo a 100 ml con agua

destilada en un matraz obscuro o forrado con aluminio. Se preparó ácido gálico a partir la

solución madre (36 mg/100 ml) a distintas concentraciones (0, 6,12, 18, 24, 30, 36 mg/100

ml) en tubos de ensayo de 10 ml previamente forrados con papel aluminio.

No de tuboConcentración de

ácido galico(mg/100ml)

Solución madreÁcido gálico (ml)

Agua Destilada (ml)

1 36 2.00 0.00

2 30 1.66 0.33

3 24 1.33 0.66

4 18 1.00 1.00

5 12 0.66 1.33

6 6 0.33 1.66

7 0 0.00 2.00

En un tubo de ensaye de 10 ml forrado con aluminio se agregó 2.6 ml de agua destilada y 2

ml de Na2 CO3 al 7 %. Se agito con vortex por 1 min. Adicionar 200 µL de cada

concentración de ácido gálico y 200 µL de reactivo de Folin Ciocalteu.

Después de reposar por 1 hr se leyó la absorbancia a 750 nm. Los resultados se expresaron

en mg de ácido gálico por g de solido seco (mg GAE /g s.s.).

Determinación de actividad antioxidante.

El método de 2,2,-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) fue utilizado como se describe.

Extracción de compuestos. Se pesaron 0.1g de muestra fresca y seca y se extrajo con 5ml

de MeOH al 80% sonicando en baño ultrasónico por 30min, se centrifugo a 1820 rpm por

10 min recuperar el sobrenadante, se extrajo nuevamente con 5ml ml de MeOH al 80%, se

centrifugo y recupero el sobrenadante. Posteriormente se filtró el extracto orgánico total

con pipeta pasteur empacada con fibra de papel y se guardaron en un vial ámbar hasta su

análisis.

Curva Standard. Se pesó 25 mg de ácido ascórbico grado ACS y se aforo a 100 ml con

metanol al 80%. Se preparó ácido ascórbico a distintas concentraciones en tubos de ensayo

de 10 ml previamente forrados con papel aluminio a partir de la solución madre de ácido

ascórbico (25 mg/100mL).

No de tuboConcentración

(mg/100ml)

Solución madre

Ácido ascórbico (ml)Metanol al 80% (ml)

1 25.0 2.00 0.00

2 21.0 1.68 0.32

3 17.0 1.36 0.64

4 12.5 1.00 1.00

5 9.0 0.72 1.28

6 5.0 0.40 1.60

7 0.0 0.00 2.00

Solución de DPPH: Se pesaron 3.9 mg de DPPH y se aforo a 100ml con MeOH al 80%.

sonicando en baño ultrasónico por 20 min. A cada diluciones del estándar (ácido

ascórbico), se agregó 100μl de cada dilución a una celda para espectrofotómetro y se

adiciono 2.9 ml de solución de DPPH y se dejó reposar por 30 min. Se midio la

absorbancia a 517nm utilizando como blanco metanol al 80%.

Determinación de la actividad antioxidante. Se adiciono 100μl de extracto orgánico a una

celda de espectrofotómetro seguido de 2.9 ml de solución de DPPH, se dejó reposar 30 min

y se leyó la absorbancia a 517nm utilizando como blanco metanol al 80%. Los resultados se

expresaron en mg de ácido ascórbico equivalentes por g de solido seco (mg EAA/g s.s.)

después de la corrección que se explica en la sección conversión de unidades de la

concentración.

Determinación de antocianinas totales.

El método pH-diferencial fue utilizado para determinar el contenido de antocianinas

totales.

Extracción de compuestos. Se pesaron de 1 a 0.1 g de muestra fresca y seca y se extrajo con

5ml de EtOH acidificado con HCl al 1% sonicado en baño ultrasónico por 30min, se

centrifugo a 1820 rpm por 10 min recuperando el sobrenadante. Se extrajo nuevamente

con 5 ml de EtOH acidificado con HCl al 1%, se centrifuga y se recupera el sobrenadante.

Posteriormente se filtró el extracto orgánico total con pipeta Pasteur empacada con fibra de

papel y se guardaron en un vial ámbar hasta su análisis.

Determinación de antocianinas totales: 1.5 ml de extracto orgánico fueron diluidos en

1.5ml de dos diferentes buffers; 0.025 M cloruro de potasio pH = 1.0 y 0.4 M de acetato de

sodio pH = 4.5, respectivamente.

Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, la absorción (A) fue medida

en un espectrofotómetro a λ = 510 y λ = 700 nm

La absorbancia de las muestras (A) fue calculada como sigue:

A=( A¿¿510−A700)pH 1.0−( A¿¿510−A700)pH 4.5¿¿

Total de antocianinas fue calculado como sigue:

TA= A x MW x dfx103

ϵ x p

Donde: TA es antocianinas totales en mg/L, A es la diferencia de la absorbancia entre

soluciones de pH1 y pH 4.5; fd es el factor de dilución; Ɛ la absortividad molar de 26900

Lmol-1cm-1 y MW el peso molecular de 449.82 g mol-1, p es el ancho de la celda del

espectrofotómetro igual a 1.

La conversión a mg se realiza con el ajuste 103. Los resultados son expresados como mg de

cianidin 3-glucosido equivalente por g de solido seco (mg C3GE/g s.s.) después de la

corrección que se explica en la sección conversión de unidades de la concentración.

Conversión de unidades de la concentración de compuestos

Fenoles y actividad antioxidantes fueron determinadas en unidades de mg/100 ml, mientras

que antocianinas fueron calculadas en mg/L por lo que se utilizó las siguientes ecuaciones

para convertirlo a mg/g s.s.:

CF o AA[mggss ]= C e xV s

100 x s . s .m

C A[ mggss ]= C ea x V s

1000 x s . s .m

C e=¿Concentración del extracto de fenoles o actividad antioxidante [mg/100 ml]

Cea= Concentración del extracto de antocianinas [mg/L]

V s=¿Volumen de la solución usada para la extracción [ml]

s . sm=¿Solidos secos en la muestra usada para medir la concentración [g]