Técnicas de Interacción Secundaria_ Fundamentos y Aplicaciones
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Técnicas de interacción secundaria: fundamentos y aplicaciones.
Comisión 4 Julieta Fernández Lynch
Técnicas Inmunológicas
Se basan en la reacción de interacción Antígeno- Anticuerpo (alta afinidad y especificidad )
Antígeno
Cualquier molécula o fragmento molecular que puede ser reconocido por receptores de células de la Respuesta Inmune.
Determinantes antigénicos o epitopes
Región del antígeno que se combina con el sitio de unión
de los receptores linfocitarios.
Epitopes discontinuos ó conformacionales
Epitopes contínuos
Estructura de los anticuerpos
El isotipo viene determinado exclusivamente por la cadena pesada de la molécula
de Ig.
Hay 5 isotipos fundamentales o clases (IgG, IgM, IgD, IgA, IgE))
Hay isotipos menores (o subclases): IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y IgA1 e IgA2
Los individuos normales producen todos los isotipos.
Bloquean la capacidad infectiva de microorganismos
Neutralizan toxinas y enzimas.
Favorecen la eliminación del microorganismo (fagocitosis, activación de
complemento, ADCC).
Clases de Ig - determinados por el tipo de cadena pesada
FUNCIONES
Policlonalidad
Producción de Ac:
Colaboración T-B
INMUNOGLOBULINAS:
ISOTIPOS
Clasificación de los antígenos en función de las células
involucradas en la generación de anticuerpos
T dependientes
-B, Th
ej. proteínas
T independientes
-B, no Th
ej. polisacáridos,
LPS
Características de la respuesta de Acs a Ags T-dependientes
Respuesta Primaria
Se desarrolla en 1 - 2 semanas (7-10 días)
Incluye respuesta celular y de anticuerpos
Los anticuerpos predominantes son de
isotipo IgM
Los niveles de anticuerpos declinan
rápidamente
Respuesta Secundaria (“memoria”)
Se desarrolla mucho más rápido y persiste
por más tiempo
Incluye respuesta celular y de anticuerpos
El anticuerpo predominante es de isotipo
IgG (“switch de isotipo”)
Aumenta la calidad de los anticuerpos
(madurez de la afinidad)
Niv
el d
e A
cs
Semanas
Unión no covalente
Unión Antígeno- Anticuerpo
Unión Antígeno- Anticuerpo
La interacción antígeno-anticuerpo es un equilibrio químico que puede ser explicado aplicando la Ley de acción de masas.
Las constantes de afinidad son del orden de 1010 M-1
AFINIDAD
Es la sumatoria de las fuerzas atractivas y repulsivas entre el paratope y el
epitope específico. Se define por una constante de equilibrio (Ka), según la
ley de acción de masas.
AVIDEZ
Es la fuerza con la que un anticuerpo multivalente se une a un antígeno
multivalente. Su valor es mayor que la suma de las afinidades.
Interacción Antígeno-Anticuerpo
Valencia-Afinidad/Avidez
Anticuerpo
Fab
IgG/(Fab’)2
IgG/Fab’)2
IgM
valencia efectiva
1
1
2
5
valencia Ag
1
1
n
n
K equilibrio
104
104
107
1011
Afinidad/avidez
Afinidad
Afinidad
Avidez
Avidez
Afinidad intrínseca
Afinidad funcional
Ag • Determinación de
grupo sanguíneo
• Control de calidad de Anticuerpos monoclonales
• PCR
Ac • HAI CHAGAS
• Anticuerpos anti D
• Anticuerpos anti-desoxirribonucleoprot.
USOS
Aplicación
Registro de productos de
diagnóstico in vitro
Control de calidad
Historia clínica de pacientes,
terapeutica y/o efectos
adversos.
Caracterización de Anticuerpos Terápeuticos.
Si los anticuerpos son un reactivo….
¿Cómo los obtengo?
¿Qué característica tienen que presentar?
Proliferan distintos clones de LB que reconocen al Ag
Inmunógeno
A
SUERO POLICLONAL
En un suero policlonal hay distintas Ig, provenientes de diferentes
clones, que reconocen distintos epitopes del inmunógeno o el
mismo epitope pero con distintas afinidades
Tanto el Ac naranja como el rojo reconocen al
epitope naranja aunque con distinta afinidad
Hapteno
Molécula pequeña que puede actuar
como epitope, pero es incapaz de
provocar por sí misma una respuesta.
Ejemplos: Dinitrofenol (DNP), Vit B12, Hormonas T3 y T4.
Anticuerpos derivados de un sólo clon de células B, son de carácter
homogéneo . Reconocen un sólo epitope idénticamente (con
igual afinidad)
Anticuerpos
monoclonales
Las Ig como antígenos
Inoculo con IgG humana
IgGh
Suero anti-IgGh
+ suero anti-IgGh
Reconoce IgG y cadenas
L de todos los isotipos
monoespecificidad
A
¿¿Los Ac monoclonales son
monoespecíficos??
¿¿Monoclonal = monoespecífico??
Ac monoclonal anti- proveniente del Ag A
B
Frente a B se comporta
como monoespecífico
C Reconoce a C, por lo tanto
no es monoespecífico
Interacción
Primaria
Interacción
secundaria
EPITOPE - PARATOPE
NO VISUALIZABLE
Técnicas Inmunológicas
VISUALIZABLE
Resultado
cualitativo
positivo negativo
cuantitativo
concentración
semicuantitativo
tÍtulo
Interacción primaria
• Reacción dada por un paratope y un epítope • Se deben mantener condiciones fisiológicas • No se visualiza directamente • Ag y/o Ac monovalente • Bajas concentraciones de Ag y/o Ac (pg/ml)
Radionucleído RIA
Enzima EIA
Fluorocromo IFI, IFD
Interacción Secundaria
Condiciones
Ag y Ac por lo menos bivalente
Alta concentración de Ag y de Ac (mg/ml)
Se ve influenciada por factores ambientales (Temperatura,
fuerza iónica, pH) y necesita tiempo
Es la interacción Ag-Ac que se visualiza fácilmente
Los Ac monoclonales, ¿dan interacción secundaria?
Complejos
solubles
El Ag debe comportarse como bivalente o polivalente frente al suero inmune utilizado
para que así se forme la red que permite la precipitación o aglutinación. En otras palabras
cada molécula antigénica debe tener al menos dos epitopes que puedan ser
reconocidos por los distintos Ac del suero.
¿Qué valencia tienen los haptenos (Hp)?
Son
monovalentes
Por sí solos no dan
reacciones de
interacción secundaria
Reacciones de Interacción Secundaria
Precipitación (Ag Soluble)
Aglutinación (Ag particulado)
Técnica de Interacción Secundaria:
Precipitación
Prozona Zona equivalencia
Exceso de antígeno
PRECIPITACIÓN EN MEDIO GELOSADO
• Inmunodifusión radial (IDR)
• Doble Inmuno Difusión (DID)
* La mayoría de las proteínas difunden libremente a través de poros de un gel. * Al contactarse antígenos y anticuerpos específicos se forma una banda de precipitación en el punto en que ambos alcanzan equivalencia. * Sirven para determinar la concentración de Ags (cuantitativos) o para comparar Ags y evaluar su pureza o para determinar isotipo de Ig específica (cualitativos).
ti
em
po
Y Y
Y
Y Y
Y
Y
Y Y Y
Y Y
Y Y
Y
Y Y
Y
Y
Y
Y Y
Y
Y
Y Y
Y
Y Y
Y
Y
Y
Y Y
Y
Y
Y Y
Y
Y
Y
Y Y
Y
Y
Y
Y Y
Doble Inmuno Difusión
Identidad No Identidad Identidad
Parcial
Técnica Cualitativa
En los pocillos del agar se enfrentan los antígenos y el suero. Si existen
anticuerpos que reconocen a alguno de los antígenos se forma una banda
de precipitación en la zona de equivalencia para ese sistema.
La posición de las bandas permite evidenciar similitudes y diferencias entre
los antígenos según el antisuero al que se enfrentan.
1
3
4
2
8
7 6
5
Si Golimumab fuera un monoclonal IgG κ, cómo demostraría por DID esto? (Suponga que siembra en 1 el Golimumab)
1: Golimumab 2: 3: 4: 5: 6: 7: 8:
Inmunodifusión radial - IDR
Técnica Cuantitativa
Utilidad: determinación de la conc. de inmunoglobulinas y otras proteínas séricas
En el agar se encuentra el suero monoespecífico para
la proteína que se desea medir. Se realiza la
incubación y se determina el tamaño del halo de
precipitación que se interpola en la curva de
calibración.
TP Cuantificación de Golimumab
AGLUTINACIÓN
Requisitos para que se produzca la reacción
de aglutinación
* Ag particulado multivalente
* multivalencia del Ac
* especificidad del Ac
* Tº fisiológica
* pH fisiológico
* Concentración salina fisológica
Clasificación de las reacciones de
aglutinación
Semicuantitativa Cualitativa
• Antígenos naturalmente particulados. Ej: GR, Bacterias DIRECTA
• Antígenos “ artificialmente " particulados. Ej: Partículas de látex, GR
INDIRECTA
• Anticuerpos unidos a partículas. Ej: Partículas de látex, GR REVERSA
AGLUTINACIÓN DIRECTA
Sistema ABO
• Descubiertos en 1901 por Karl Landsteiner
• 4 fenotipos principales (A, B, AB, O)
Utilidad Aglutinación Directa
Tipificación de GR: Sistema ABO
GENOTIPO FENOTIPO (grupo) Ac Presentes
(isoaglutininas)
AA/A0 A anti B
BB/B0 B anti A
AB AB Ninguno
0 0 anti A y B
Bombay Ninguno anti A, B y H
TP
Tipificación
Título: Valor relativo que indica cuántas veces puedo diluir el suero
para que siga dando reacción positiva, en este caso con
capacidad de aglutinar
AGLUTINACIÓN DIRECTA
SEMICUANTITATIVA
TP Titular un suero anti D de formulación comercial (GR Rh +)
+ GR
Latex Antígeno
+
Anticuerpo
20 ul Control (-)
20 ul Control (+)
20 ul GR no sensib.
20 ul 20 ul 20 ul GR sensib.
20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul Diluyente
20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul Suero (1/4)
11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
CONTROLES MUESTRAS
Indirecta o Pasiva Antígenos “artificialmente " particulados.
TP Control de calidad de Kit de HAI para la detección de anticuerpos anti T. cruzi
20 ul Control (-)
20 ul Control (+)
20 ul GR no sensib.
20 ul 20 ul 20 ul GR sensib.
20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul Diluyente
20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul Suero (1/4)
11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
CONTROLES MUESTRAS
muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1
2
3
4
AGLUTINACIÓN REVERSA
TP AI: Detección de Ac anti desoxirribonucleoproteínas, AR: Detección PCR
AGLUTINACIÓN REVERSA
+
Anticuerpos Específicos
Partículas LATEX o GR
Partículas sensibilizadas
+ Muestra incógnita
(Antígeno Soluble?)
Malla de Aglutinación
1° Sensibilización de GR
2° Reacción de Aglutinación
Y Y
Utilidad Detección de Ag soluble multivalentes
Ej: Detección de hCG en orina , HBsAg en suero,
Cryptococcus neoformans, E.coli enteropatógena en LCR
Sistema Rh
• Comprende más de 40 Ag. que se ubican en:
la superficie de GR y sus precursores en M.O.
pero no en otras células, secreciones o fluídos orgánicos.
• Estos Ag. son proteínas, de todos ellas, 5 son los más importantes: D,E,e,C,c
– El orden de su poder inmunológico en forma decreciente es: D, c, E, e, C. Las variantes más débiles del D se llaman Du.
ACTIVIDAD ANTIGÉNICA INTENSA SÓLO EL Ag D
Rh+: INDIVIDUO CON aglutinógeno D
Rh-: INDIVIDUO SIN aglutinógeno D-SIN aglutinina anti-D
(diferencia con el sistema ABO)
TIPIFICACIÓN SE REALIZA CON SUERO ANTI-D
Diferencias entre Ac de los sistemas ABO y Rh
SISTEMA ABO SISTEMA Rh
IgM IgG
Naturales Inmunes
Aglutinantes No aglutinantes
Completos INCOMPLETOS
Carbohidratos Polipéptidos
No pueden difundir y carecen de Receptores en placenta
SEGUIMIENTO DE LA MADRE PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA
1° Fase
2° Fase
+
Suero Materno (tiene Ac āAgD?)
GR
Rh +
+
GR sensibilizados con Ac maternos āAgD
SUERO DE COOMBS Malla de aglutinación
ANÁLISIS DEL BEBÉ PRUEBA DE COOMBS DIRECTA
GR bebé (están sensibilizados
con Ac āAgD maternos?)
+
Anticuerpos anti inmunoglobulinas humanas
- SUERO DE COOMBS -
Malla de aglutinación
Se puede prevenir casi completamente con el
uso de Inmunoglobulina anti-Rho (D)
¿Cómo puede prevenirse la
Isosensibilización Rh materno-fetal?
1 dosis en hemorragia fetal (aborto, amniocentesis,
muestreo vellosidades coriónicas)
1 dosis preparto (300mcg), semana 28. Seguimiento
con Prueba Coombs Indirecta
(Positiva: indica dosis adecuada)
1 dosis posparto, dentro de las 72 hs
Detección de Anticuerpos generados por Drogas
Efecto adverso (poco frecuente): - Antibioticos (penicilina, cefalosporinas) - Antiinflamatorios
no esteroideos (diclofenac)
- Quinina - Oxalplatino
Anemia hemolítica autoinmune inducida por
drogas (DIIHA)
¿Cómo podríamos determinarlo?
Droga Suero paciente
Coombs directa La muestra son los GR del paciente