Tecnología Genotype DNA•STRIP® causadas por micobacterias Diagnóstico de laboratorio: •...
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Tecnología Genotype
DNA•STRIP®
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Infecciones causadas por micobacterias
• Género Mycobacterium: BAAR, aerobios
• Pared celular compleja: exigente desde el punto de vista
nutricional, la mayoría crecen lentamente
• Algunas especies son patógenos (intracelulares obligados) de
humanos, y otras especies oportunistas.
Enfermedades causadas por Micobacterias:
• Tuberculosis: Mycobacterium tuberculosis
• Lepra: Mycobacterium leprae
• Micobacteriosis: infecciones debido a otras micobacterias
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Infecciones causadas por micobacterias
Diagnóstico de laboratorio:
• Coloraciones que denotan ácido resistencia
• Cultivo
• Técnicas de biología molecular
• Las infecciones por Micobacterias son difíciles de tratar. Son
naturalmente R a varios atb y pueden desarrollar resistencia
a otros atb.
• La mayoría son susceptibles a claritromicina y rifampicina,
pero se conocen cepas resistentes a estos antibióticos.
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Evaluación
Aislamiento de ADN
PCR multiplex
Hibridización reversa
Revisión de la tecnologíaDNA••••STRIP®
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Tecnología DNA•Strip®
Aislamiento del ácido nucleico
AMPLIFICACION selectiva de varios fragmentos del
AN aislado utilizando primers específicos
marcados com biotinaPCR multiplex
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Tecnología DNA•Strip®
Hibridizacion:
El DNA amplificado se coloca en la matriz de DNA•STRIP® donde se
encuentran sondas de ADN específicas
La reacción de hibridización lleva al desarrollo de
bandas visibles en la matriz del DNA•STRIP®
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Evaluación
Aislamiento de ADN
PCR multiplex
Hibridización reversa
Revisión de la tecnologíaDNA••••STRIP®
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Aislamiento del DNA
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Aislamiento del DNA
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Extracción del ADN: GenoLyse
500µl de muestra decontaminada
100µl de lisisbuffer
15 min 10.000 gDescartar sobrenadante
5 min 95°C100µl de buffer de neutralización
5 min Máxima velocidad
5µl de sobrenadantea PCR
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Evaluación
Aislamiento de ADN
PCR multiplex
Hibridización reversa
Revisión de la tecnologíaDNA••••STRIP®
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Amplificación por PCRpara Mycobacterium CM/AS/MTBC
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Amplificación por PCRpara MTBSRplus v2.0
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Evaluación
Aislamiento de ADN
PCR multiplex
Hibridización reversa
Revisión de la tecnologíaDNA••••STRIP®
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Union del conjugado streptavidina -fosfatasa alcalina a la biotina de los hibridos
Tinción enzimática con el sustrato de la fosfatasa alcalina
Separación de amplicones en DNA simple cadena
Remoción del AN pegado inespecíficamente a las sondas
Pegado de los amplicones marcados con biotina a las sondas del strip
Sustrato
Desnaturalizaciónde los productos de PCR
Hibridización
Lavado astringente
Conjugado
Hibridización Reversa
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Desnaturalización
Separación de los amplicones en DNAsc
(labelled, double-stranded DNA)PCR product
chemical denaturation
labelled, single-stranded DNA
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Hibridización
Pegado de los productos de PCR
Son de
Membra nstreifen
45 °C
Son de
Membra nstreifen
45 °C
Sond e
Memb ranstreifen
45 °C
probe
45°C
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Lavado Astringente
de productos de PCR pegados inespecíficamente
45°C
no mismatch
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misma tch !
Lavado Astringente
de productos de PCR pegados inespecíficamente
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Conjugado
Pegado de los complejos conjugados
conjugate
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Reacción del Sustrato
Coloración enzimática
substratecolorless
substratebrown
DNA•STRIP®
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Evaluación
Aislamiento de ADN
PCR multiplex
Hibridización reversa
Revisión de la tecnologíaDNA••••STRIP®
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Evaluación
Linea Positiva: la intensidad es mayor o igual que la del control universal (UC).
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Tecnología DNA•Strip®
Interpretación de Resultados
La interpretación es realizada
comparando el perfil de bandas
desarrollado en el DNA•Strip® con
un templado para evaluación
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Tecnología DNA•Strip®
Interpretación de Resultados
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Comparación del perfil de bandas de DNA strip con el cuadro de interpretación
Tecnología DNA•Strip®
Interpretación de Resultados
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Utilización del polimorfismo de los genes
• Todos los ensayos DNA•STRIP® se denominan “GenoType”.
• “GenoType” porque usa el polimorfismo de la estructura genética de la Mycobacteria.
• El uso de PCR es para lograr máxima sensibilidad.
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DNA•Strip® technology es principalmente usada para:
• Enfermedades asociadas al polimorfismo genético
• Diferenciación de especies microbianas
• Determinación de Resistencia antibiótica
• Diagnóstico dental: determinación de marcadores periodontopatogénicos y riesgo genético de desarrollo de periodontitis.
Tecnología DNA•Strip®
Aplicaciones
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Material Requerido
– Cabina de seguridad Clase II
- Baño termostático
- Baño sonicador (opcional)
- Microcentrífuga
– Plataforma de agitación/TwinCubator®
– Termociclador
- Material descartable
– DNA polymerasa termoestable (hot start) con bufferIncluída en MTBDRplus v2.0
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� Flexibilidad: Permite varias amplificaciones en la misma corrida
� No requiere purificación de AN (excepto en MYCO Direct)
� No requiere TB viable (excepto en MYCO Direct)
� Puede realizarse aún cuando el cultivo/muestra este contaminada
� Resultados rápidos (6 hs)
� Permite detección de infecciones mixtas
DNA•Strip® technology
Fortalezas
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GenoType® Series Micobacterias
GenoType® Mycobacterium CM/AS
GenoType® MTBC
GenoType® MTBDRplus
GenoType® MTBDRsl
GenoType® Mycobacteria Direct (RNA)
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Evaluación
Aislamiento de ADN
PCR multiplex
Hibridización reversa
GenoType Mycobacterium CM/AS
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• CM: identificación de14 especies de Mycobacterias
atípicas más comunes, y complejo Mycobacterium
tuberculosis
• AS: identificación de 16 especies de Mycobacterias atípicas
adicionales
• A partir de bacterias en medio sólido o líquido.
• No aplicable para muestras clínicas
• Controles:
� Control de conjugado (CC)
� Control Universal (UC)
� Control de género (GC)
GenoType Mycobacterium CM/AS
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GenoType Mycobacterium CM
Diferenciación entre 14 especies de Mycobacterias atípicas más comunes y M. Tuberculosis complex
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GenoType Mycobacterium AS
Diferenciación entre 16 especies adicionales de Mycobacterias atípicas
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Evaluación
Aislamiento de ADN
PCR multiplex
Hibridización reversa
GenoType MTBC
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• Diferenciación dentro del complejo M. tuberculosis
• A partir de bacterias en medio sólido o líquido.
• No aplicable para muestras clínicas
• Controles:
� Control de conjugado (CC)
� Control Universal (UC)
� Sonda específica de MTBC
GenoType MTBC
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GenoType MTBC
Diferenciación dentro del complejo M. tuberculosis
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Evaluación
Aislamiento de ADN
PCR multiplex
Hibridización reversa
GenoType MTBDRplus v2.0
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Bases Moleculares de R en MTBC
Drug Gene Locus Gene function Percentage of
Resistance
Isoniazid katG
inhA
ahpC-Promoter
Catalase-Peroxidase
Enoyl-ACP-Reduktase
Alkyl-Hydroxid-Peroxidase
40 - 100 %
appr. 25 %
appr. 10 %
Rifampicin rpoB ß-Subunit of RNA-Polymerase
> 90 %
Pyrazinamide pncA Pyrazinamidase appr. 95 %
Streptomycin rpsL
rrs
ribosomal Protein S12
16S rRNA
appr. 60 %
appr. 20 %
Ethambutol embB Arabinosyl-Transferase appr. 60 %
Chinolone gyrA DNA-Gyrase A appr.80-90%
Aminoglycoside
Cyclic Peptide
rrs 16S rRNA No exact data
MTBDR plusMTBDR sl
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Región de R a Rifampicina del gen rpoB
en MTBC
511 513 516 518 522 526 531 533
rpoB WT2 rpoB WT4 rpoB WT6rpoB WT8rpoB WT7
rpoB MUT1 (D516V)rpoB MUT3 (S531L)
rpoB MUT2B (H526D)
514 515
rpoB WT1 rpoB WT3 rpoB WT5
509508505
rpoB-Wildtype-probes: WT 1 to WT 8
rpoB-Mutation-probes: MUT D516V, H526Y, H526D, S531L
Detección de mutaciones por ausencia de señales wildtype
Detección de mutaciones por presencia de señales de mutación
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Zonas de Reacción del GenoType®
MTBDRplus v2.0
Conjugate Control (CC)Amplification Control (AC)
complex (TUB)M. tuberculosisrpoB
rpoB rpoB rpoB rpoB rpoB rpoB rpoB rpoB
rpoB rpoB rpoB rpoB rpoB
Locus ControlWT1)WT2)WT3)WT4)WT5)WT6)WT7)WT8)
mutation probe 1 ( MUT1)MUT2A)MUT2B)
MUT3)
rpoBrpoBrpoBrpoBrpoBrpoBrpoBrpoB
rpoB rpoB
rpoB
wild type probe 1 ( wild type probe 2 ( wild type probe 3 ( wild type probe 4 ( wild type probe 5 ( wild type probe 6 ( wild type probe 7 ( wild type probe 8 (
mutation probe 2A ( mutation probe 2B ( mutation probe 3 (
katGkatGkatG katG katG
WT) mutation probe 1 ( MUT1)
MUT2)
Locus Controlwild type probe (
mutation probe 2 (
katG
katG inhAinhA inhA inhA inhA inhA inhA
WT1)WT2)MUT1)MUT2)
MUT3A)MUT3B)
colored marker
Locus Controlwild type probe 1 (wild type probe 2 (mutation probe 1 (mutation probe 2 (mutation probe 3A (mutation probe 3B (
inhA inhA inhA inhA
inhA inhA
Control de conjugado (CC)Control de conjugado (CC)Control de conjugado (CC)Control de conjugado (CC)
Debe desarrollar una línea en esta zona, documentando la eficiencia del pegado
del conjugado y de la reacción del sustrato.
Control de amplificación (AC)Control de amplificación (AC)Control de amplificación (AC)Control de amplificación (AC)
Cuando el test es realizado correctamente, el amplicón control generado durante
la amplificación se unirá a la zona de control de amplificación. Si la banda está
ausente, indica que hubo errores durante la preparación de la amplificación, o
indica la presencia de inhibidores de la PCR en el extracto de ADN. Esta banda
puede dar una señal débil.
M. tuberculosis M. tuberculosis M. tuberculosis M. tuberculosis complex (TUB)complex (TUB)complex (TUB)complex (TUB)
Esta zona hibridiza con amplicones generados a partir de todos los miembros
conocidos del complejo Mycobacterium tuberculosis. Si la banda TUB es negativa,
la bacteria testeada no pertenece al complejo M. tuberculosis y no puede ser
evaluada por este test.
Sondas Sondas Sondas Sondas rpoB rpoB rpoB rpoB , , , , katG and inhAkatG and inhAkatG and inhAkatG and inhA
Estas zonas de reacción detectan la región de los genes respectivos documentando
por presencia o ausencia la resistencia a rifampicina y/o isoniazida. .Si un patrón
se desvía del patrón wild type indica resistencia de la cepa testeada.
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• Evaluación de la resistencia del complejo M. tuberculosis a
Rifampicina e Isoniazida (Diferencia la R de bajo y alto
nivel)
• A partir de bacterias en medio sólido o líquido.
• Muestras pulmonares con ZN + y ZN -
• Controles:
� Control de conjugado (CC)
� Control de amplificación (UC)
� Control complejo MTBC (TUB)
� Control de zona del Locus para cada gen
GenoType MTBDRplus v2.0
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GenoType MTBDRplus v2.0
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GenoType MTBDRplus
MTBC y su Resistencia a Rifampicina y/o Isoniazida
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Ejemplos de resultados
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Evaluación
Aislamiento de ADN
PCR multiplex
Hibridización reversa
GenoType MTBDRsl
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Bases Moleculares de R en MTBC
Drug Gene Locus Gene function Percentage of
Resistance
Isoniazid katG
inhA
ahpC-Promoter
Catalase-Peroxidase
Enoyl-ACP-Reduktase
Alkyl-Hydroxid-Peroxidase
40 - 100 %
appr. 25 %
appr. 10 %
Rifampicin rpoB ß-Subunit of RNA-Polymerase
> 90 %
Pyrazinamide pncA Pyrazinamidase appr. 95 %
Streptomycin rpsL
rrs
ribosomal Protein S12
16S rRNA
appr. 60 %
appr. 20 %
Ethambutol embB Arabinosyl-Transferase appr. 60 %
Chinolone gyrA DNA-Gyrase A appr.80-90%
Aminoglycoside
Cyclic Peptide
rrs 16S rRNA No exact data
MTBDR plusMTBDR sl
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Región de R a Fluoroquinolonas del gen gyrAen MTBC
gyrA WT3
gyrA MUT2
gyrA MUT3A
gyrA
gyrA
gyrA
M
M
M
UT3B
UT3C
UT3D
gyrA UT1 M
gyrA WT1
gyrA WT2
88 91 92 94
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GCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCAGTGGCCTAACCCTCGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGT
1401 1402
1484
…
…
Región de R a Aminoglucósidos/P. cíclicos del gen rrsen MTBC
WT1
WT2
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306
WT
embB MUT 1AembB MUT 1B
Región de R a Etambutol del gen embBen MTBC
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Conjugate Control (CC)Amplification Control (AC)
complex (TUB)M. tuberculosisgyrA (gyrA)gyrA gyrAgyrA gyrAgyrA gyrAgyrA gyrA gyrA gyrA gyrA gyrA gyrA gyrA gyrA gyrA gyrA gyrA
Locus Control WT1)WT2)WT3)
mutation probe ( MUT )
wild type probe 1 ( wild type probe 2 ( wild type probe 3 ( mutation probe 1 ( MUT1) mutation probe 2 ( MUT2) mutation probe 3A ( MUT3A) mutation probe 3B ( MUT3B) mutation probe 3C ( MUT3C)
3D 3D
rrs (rrs)rrs rrsrrs rrsrrs rrsrrs rrs
Locus Control wild type probe 1 ( wild type probe 2 ( WT2)
mutation probe 2 (
WT1)
mutation probe 1 ( MUT1)MUT2)
embB (embB)embB embBembB embBembB embB
Locus Controlwild type probe 1 (mutation probe 1A (mutation probe 1B (
WT1)
MUT1A)MUT1B)
colored marker
GenoType® MTBDRsl
Gen gyrA: resistencia a fluoroquinolonas
Gen embB: resistencia aetambutol
Gen rrs: resistencia a péptidos cíclicos y aminoglucósidos
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MTBC y su resistencia a Fluoroquinolonas y/o Péptidos cíclicos y/o Etambutol
GenoType MTBDRsl
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Evaluación
Purificación del ARN
Amplificación por NASBA
Hibridización reversa
GenoType® Mycobacteria Direct
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• Detección simultanea del complejo M. tuberculosis y de 4 especies de Mycobacterium no tuberculosis: M. avium, M. intracellulare M.malmoense, y M. kansasii
• A partir de la muestra clínica (pulmonar y extrapulmonar –excepto sangre), con ZN + ó ZN -.
• Target: rRNA de Mycobacterias
• Amplificación por reacción de NASBA
• ARN Control Interno (AC) para monitorear los pasos de extracción y amplificación.
• ARN Control Positivo incluído en el kit (*)
• Tiempo total del ensayo: ~ 4 horas
GenoType® Mycobacteria Direct
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GenoType® Mycobacteria Direct
M. malmoenseM. malmoenseM. malmoenseM. malmoense
Conjugate Control (CC)Conjugate Control (CC)Conjugate Control (CC)Conjugate Control (CC)
M. intracellulareM. intracellulareM. intracellulareM. intracellulare
M. aviumM. aviumM. aviumM. avium
M. kansasiiM. kansasiiM. kansasiiM. kansasii
M. tuberculosis M. tuberculosis M. tuberculosis M. tuberculosis complexcomplexcomplexcomplex
Amplification Control (AC)Amplification Control (AC)Amplification Control (AC)Amplification Control (AC)Amplificación del Control interno
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GenoType® Mycobacteria DirectVentajas
• Detección simultanea de 5 especies clínicamente relevantes de mycobacterias a partir de muestras clínicas pulmonares y extrapulmonares, ZN+ ó ZN-
• Control Interno y Control Positivo
• No requiere equipos costosos: TwinCubator®, termociclador
• Admite procesar pocas muestras (4 a 24)
• Aislamiento de RNA de alto grado de pureza para prevenir inhibiciones de la reacción NASBA
• Tiempo del ensayo: 4 h
• Detección de CELULAS VIVAS → Conveniente en pacientes tratados
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Geno Type Performance
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Geno Type Performance
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Geno Type MTBDRplus v2.0 Performance
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Geno Type MTBDRplus v2.0 Performance
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Automatización
GT-48-Blot® or GT-20-Blot®
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Algunas publicaciones…
• AJRCCM January 2008Rapid Molecular Screening for Multidrug-Resistant Tuberculosis in a High-Volume Public Health Laboratory in South AfricaMarinus Barnard1, Heidi Albert2, Gerrit Coetzee3, Richard O’Brien2, and Marlein E. Bosman11National Health Laboratory Services (NHLS), Greenpoint, Cape Town, South Africa; 2Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND), Geneva, Switzerland; and 3National TB Reference Laboratory, NHLS, Sandringham, Johannesburg, South Africa
• JCM August 2006Evaluation of the GenoType Mycobacteria Direct Assay for Detection of Mycobacterium tuberculosis Complex and Four Atypical Mycobacterial Species in Clinical SamplesF. Franco-A´ lvarez de Luna, P. Ruiz, J. Gutie´rrez, and M. Casal*Microbiology Service, Reina Sofia University Hospital, and Mycobacteria Reference Center, Faculty of Medicine, Cordoba University, Cordoba, Spain
• ERJ 2008 GenoType MTBDR assays for the diagnosis of multidrug-resistant tuberculosis: a meta-analysisD.I. Ling*, A.A. Zwerling* and M. PaiDept of Epidemiology, Biostatistics and Occupational Health, McGill University, and Respiratory Epidemiology and Clinical Research Unit, Montreal Chest Institute, Montreal, QC, Canada
• JCM February 2006Evaluation of the New GenoType Mycobacterium Assay for Identification of Mycobacterial SpeciesCristina Russo,1 Enrico Tortoli,2* and Donato Menichella1Microbiology Laboratory, Bambino Gesu` Hospital, Rome,1 and Regional Reference Center for Mycobacteria, Microbiology and Virology Laboratory, Careggi Hospital, Florence,2 Italy
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Gracias por su atención!