Tema 11

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TEMA 11 : TRANSFERENCIA DE GENES EN BACTERIAS O BJETIVOS : Conocer cuáles son los mecanismos de transferencia génica en bacterias, cómo se produce la recombinación de los genes, cuál es su diferencia con la recombinación en Eucariotas, cómo se mapean los genes, qué rol juegan los virus. T emario : 1. TRANSFERENCIA DE GENES EN BACTERIAS 1.1. Trabajando con microorganismos 2. CONJUGACIÓN BACTERIANA 2.1. Descubrimiento de la conjugación 2.2. El factor de fertilidad (F) 2.3. Cepas de alta frecuencia de recombinación (Hfr) 2.4. Factor F 2.5. Mecanismo de la transferencia 2.6. Mapeo cromosómico a escala fina por frecuencia de recombinantes 3. TRANSFORMACIÓN BACTERIANA 4. TRANSDUCCIÓN BACTERIANA 4.1. Bacteriófagos 4.2. Transducción generalizada 4.3. Transducción especializada 1. TRANSFERENCIA DE GENES EN BACTERIAS Las bacterias son organismos Procariotas los cuales carecen de membrana nuclear. Su material genético no está organizado de la misma forma que los Eucariotas. Su genoma está compuesto por un único cromosoma y además contienen ADN extracromosomal denominado Plásmido. Las bacterias no sufren meiosis pero pasan por estadíos análogos a la meiosis. El material genético de las bacterias puede ser transferido a otra bacteria por tres mecanismos diferentes: conjugación, transformación y transducción (Fig. 1). En la conjugación una célula bacteriana transfiere segmentos de ADN a otra célula por contacto directo célula a célula. El

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TEMA 11: TRANSFERENCIA DE GENES EN BACTERIAS

O BJETIVOS : Conocer cuáles son los mecanismos de transferencia génica en bacterias, cómo se produce la recombinación de los genes, cuál es su diferencia con la recombinación en Eucariotas, cómo se mapean los genes, qué rol juegan los virus.

T emario :

1. TRANSFERENCIA DE GENES EN BACTERIAS1.1. Trabajando con microorganismos

2. CONJUGACIÓN BACTERIANA2.1. Descubrimiento de la conjugación2.2. El factor de fertilidad (F)2.3. Cepas de alta frecuencia de recombinación (Hfr)2.4. Factor F′

2.5. Mecanismo de la transferencia

2.6. Mapeo cromosómico a escala fina por frecuencia de recombinantes3. TRANSFORMACIÓN BACTERIANA4. TRANSDUCCIÓN BACTERIANA

4.1. Bacteriófagos4.2. Transducción generalizada4.3. Transducción especializada

1. TRANSFERENCIA DE GENES EN BACTERIAS

Las bacterias son organismos Procariotas los cuales carecen de membrana nuclear. Su material genético no está organizado de la misma forma que los Eucariotas. Su genoma está compuesto por un único cromosoma y además contienen ADN extracromosomal denominado Plásmido. Las bacterias no sufren meiosis pero pasan por estadíos análogos a la meiosis.

El material genético de las bacterias puede ser transferido a otra bacteria por tres mecanismos diferentes: conjugación, transformación y transducción (Fig. 1). En la conjugación una célula bacteriana transfiere segmentos de ADN a otra célula por contacto directo célula a célula. El ADN transferido puede ser parte del genoma bacteriano o puede ser un elemento de ADN extra-genómico llamado Plásmido. Una célula bacteriana puede adquirir del medio un fragmento de ADN e incorporar dicho fragmento dentro de su propio cromosoma por un procedimiento llamado transformación. Además, ciertos virus bacterianos pueden tomar un fragmento de ADN de una bacteria, inyectarlo en otra para luego incorporarse dentro del cromosoma por un proceso denominado transducción.

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Figura 1. Cuatro maneras por la cual el ADN bacteriano puede ser transferido de célula a célula

1.1. Trabajando con microorganismos

Las bacterias son organismos que se multiplican rápido y ocupan poco espacio, por lo tanto son organismos modelo para estudios genéticos. Pueden crecer en un medio líquido o sólido, tal como un gel de agar, sólo con nutrientes básicos. En un medio líquido, las bacterias se dividen por fisión binaria, multiplicándose geométricamente hasta que el medio nutritivo se agota o los factores tóxicos se acumulan a niveles que frenan el crecimiento. Una pequeña cantidad del medio líquido puede ser pipeteado sobre una caja de petri conteniendo agar y se desparrama sobre la superficie con un “rastrillo” desparramador estéril, en un proceso llamado plaqueo. Cada célula se multiplica por fisión, quedando inmovilizadas en el gel, formando una colonia. Cuando la masa alcanza las 107 células se vuelve visible como una colonia. Si la muestra plaqueada originalmente contenía muy pocas células, cada una de las colonias se habrá originado a partir de una célula original. Los miembros de una colonia que comparten un ancestro genético simple son conocidos como un clon.

Las bacterias silvestres (“wild-type”) son prototróficas, porque pueden crecer en un medio nutritivo mínimo (sales inorgánicas, fuente de carbón y agua). Los mutantes auxotróficos o nutricionales son aquellas bacterias incapaces de crecer en un medio de cultivo mínimo, a menos que en el medio se le suministren uno o más componentes nutritivos específicos, tales como adenina, treonina o biotina. Otros tipos de mutantes útiles difieren del silvestre en la capacidad para usar una fuente de energía específica,

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por ejemplo, el silvestre puede usar lactosa y el mutante no (Fig. 2). En otra categoría de mutantes, mientras que las silvestres son susceptibles a un inhibidor, como el antibiótico estreptomicina, los mutantes resistentes pueden dividirse y formar colonias en presencia del inhibidor. Estos mutantes permiten a los genetistas distinguir diferentes razas individuales, suministrando marcadores genéticos (alelos marcadores) para realizar un seguimiento de los genomas y células en un experimento. En la Tabla 1 se resumen algunos fenotipos mutantes bacterianos y sus símbolos genéticos.

Figura 2. Colonias bacterianas sobre un medio coloreado. Las colonias coloreadas de rojo contienen bacterias silvestres (wild-type) capaces de usar lactosa como fuente de energía (lac+). Las células no coloreadas son mutantes incapaces de utilizar lactosa (lac-).

Tabla 1. Algunos símbolos genotípicos usados en genética bacteriana

Símbolo Carácter o fenotipo asociado con el símbolo

bio- Requiere agregar biotina al medio mínimo.

arg- Requiere agregar arginina al medio mínimo.

met- Requiere agregar metionina al medio mínimo.

lac- No puede usar lactosa como fuente de energía.

gal- No puede usar galactosa como fuente de energía.

strr Resistente al antibiótico estreptomicina.

strs Sensible al antibiótico estreptomicina.

Nota: El medio mínimo es el medio sintético básico para crecimiento bacteriano sin suplemento de nutrientes.

2. CONJUGACIÓN BACTERIANA

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Es el proceso unidireccional de transferencia de información genética a través del contacto celular directo entre una célula donadora y una célula receptora. El contacto es seguido por la formación de un puente físico (pili) entre las células. Un segmento del cromosoma de la célula donadora puede ser transferido dentro de la célula receptora y éste puede sufrir recombinación genética con segmentos cromosómicos homólogos de la célula receptora. La célula receptora que ha incorporado un segmento de ADN de la célula donadora se denomina transconjugante.

2.1. Descubrimiento de la conjugación

Fue descubierto en 1946 por Lederberg y Tatum, los cuales estudiaron dos cepas de Escherichia coli que diferían en sus requerimientos nutricionales. La cepa A tenía el genotipo met bio thr+ leu+ thi+ y para crecer requería el suministro de un medio suplementado con metionina y biotina. La cepa B tenía el genotipo met+ bio+ thr leu thi y solo puede crecer en un medio suplementado con treonina, leucina y tiamina.

Lederberg y Tatum mezclaron las cepas A y B de E. coli y la plaquearon sobre un medio de cultivo mínimo (Fig. 3). La mezcla dio origen a algunas colonias prototróficas (met+ bio+ thr+ leu+ thi+) con una frecuencia de 1 en 10 millones de células. Como no apareció ninguna colonia cuando cada cepa fue plaqueada separadamente sobre un medio mínimo, se dijo que la mutación fue la causa de las colonias prototróficas. La mezcla fue producto de un cruzamiento genético que produjo recombinantes.

En otro experimento, Bernard Davis colocó las cepas A y B en un medio líquido sobre cada lado de un tubo en U, separados por un filtro con poros tan pequeños que no permitían el movimiento bacteriano (Fig. 4). El medio fue movido entre los compartimentos por succión y presión alternada, y las células fueron plaqueadas sobre un medio mínimo para chequear la presencia de colonias prototróficas. Ninguna colonia prototrófica apareció, lo cual significa que se necesita el contacto célula con célula para que se produzca el intercambio genético.

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Figura 3. Demostración de Lederberg y Tatum de la recombinación genética entre células bacterianas. (a) El concepto básico: dos cultivos auxotróficos (A- y B-) son mezclados, produciendo cultivos silvestres prototróficos (WT). (b) Células de tipo A o B no pueden crecer sobre un medio mínimo no suplementado (MM), debido a que A y B portan mutaciones que causan incapacidad para sintetizar constituyentes necesarios para el crecimiento celular. Cuando A y B son mezcladas por unas pocas horas y luego plaqueadas, aparecen unas pocas colonias sobre el agar. Estas colonias derivan de una simple célula en la cual ocurrió intercambio de material genético; por lo tanto son capaces de sintetizar todos los constituyentes necesarios para el metabolismo.

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Figura 4. El contacto físico entre bacterias es necesario para la recombinación genética. Cepas bacterianas auxotróficas A y B son puestas a crecer a cada lado de un tubo en forma de U. El líquido puede pasar entre los brazos del tubo mediante la aplicación de presión o succión, pero las bacterias no pueden pasar a través del filtro. Después de la incubación y plaqueo, ninguna colonia recombinante creció en un medio de cultivo mínimo.

2.2. El factor de fertilidad (F)

En 1953 William Hayes demostró que el intercambio genético en E. coli se produce en una sola dirección, con una célula actuando como donadora y otra como receptora. Hayes propuso que la transferencia de material genético se produce por un factor de fertilidad llamado F que la célula donadora posee (F+) y no la receptora (F-). El factor F es un ADN circular que se autoreplica (plásmido) independiente del cromosoma bacteriano. El factor F contiene una región de ADN llamada origen (O). Este es el punto donde comienza la transferencia del ADN a la célula receptora, llevando consigo un número determinado de genes, entre otros el que permite la unión entre las bacterias (F-pili) (Fig. 5).

Figura 5. Bacteria puede transmitir un plásmido (ADN circular) a través de la conjugación. Una célula donadora extiende una o más proyecciones, pili, que se adhiere a una célula receptora y mantiene a las dos bacterias juntas.

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Cuando cepas F+ y F- son mezcladas, ellas pueden conjugar (“aparearse”) (Fig. 6a).

Figura 6. Transferencia de material genético durante la conjugación en E. coli. (a) Transferencia del factor F desde una cepa donadora a una receptora durante el apareamiento entre F+ F-. (b) Producción de cepas Hfr por integración del factor F y transferencia de genes bacterianos desde una célula donadora a una receptora durante el apareamiento Hfr F-

No puede haber conjugación entre dos cepas del mismo tipo de apareamiento (entre dos cepas F+ o dos F-). La transferencia de material genético comienza cuando una cadena del factor F es cortada en el origen y la replicación del ADN continúa desde

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dicho punto (Fig. 6a2). Una vez que el ADN de cadena simple del factor F entra a la receptora F-, la cadena complementaria es sintetizada (Fig. 6a4). Cuando el factor F completo ha sido transferido, las cepas F- se convierten en F+ (Fig. 6a5). En los cruzamientos F+ F- no se transfiere el cromosoma bacteriano, sino sólo el Factor F.

2.3. Cepas de alta frecuencia de recombinación (Hfr)

Lucas Cavalli-Sforza descubrió una cepa de E. coli que producía 1000 veces más recombinantes que la cepa F+. La denominó cepa de alta frecuencia de recombinación (Hfr). Estas cepas poseen el factor F integrado al cromosoma bacteriano mediante un evento de crossing-over (Fig. 6b1-2). Los plásmidos como F que son capaces de integrarse al cromosoma bacteriano son llamados episomas. Cuando el factor F se integra no deja replicas independientes, sino que se replica como parte del cromosoma bacteriano. Durante la conjugación entre Hfr y F-, parte del cromosoma es transferido con el factor F. Las rupturas al azar interrumpen la transferencia antes de que el cromosoma entero sea transferido. Los recombinantes son producidos por doble crossing-over entre el ADN donador lineal y el cromosoma receptor circular.

En cruzamientos Hfr x F- la cepa F- casi nunca adquiere el fenotipo Hfr. Para convertirse en Hfr, la célula receptora debe recibir una copia completa del factor F. Solamente partes del factor F es transferido al comienzo de la conjugación, debido a que el resto del factor F está al final del cromosoma donador. Todo el cromosoma donador debería haber sido transferido para que un factor F funcional sea encontrado en el receptor, lo cual debería ocurrir luego de aproximadamente 100 minutos a 37° C. Esto es un evento extremadamente raro ya que el apareamiento generalmente se interrumpe antes que la segunda parte del factor F sea transferido.

Aproximadamente 1 en 10.000 cepas F+ se convierten en Hfr por la integración del factor F en el cromosoma bacteriano. El proceso inverso, la escisión del factor F también se produce espontáneamente y en muy baja frecuencia, produciendo una cepa F+ de una Hfr. En la escisión, el factor F forma un bucle hacia afuera del cromosoma Hfr, y por un simple evento de crossing-over, se generan un cromosoma hospedante circular y un factor F extracromosomal.

2.4. Factor F′

Se produce cuando el factor F de las células Hfr es escindido del cromosoma. Esto ocurre con baja frecuencia. Algunas veces la escisión del factor F no es precisa y éste puede liberarse llevando consigo segmentos del cromosoma hospedante que se encontraba contiguo al factor F integrado. Como el factor F se integra en diferentes sitios del cromosoma hospedante, diferentes segmentos cromosómicos pueden ser tomados de esta manera. Los factores F conteniendo genes bacterianos son llamados F′ y se los nombra de acuerdo a los genes que portan. Ej. F′ (lac).

Si consideramos una raza de E. coli en la cual el factor F se ha integrado próximo a la región lac+, un conjunto de genes requeridos para el metabolismo de la lactosa (Fig. 7a). Si el bucle hacia afuera no es preciso, los genes hospedantes adyacentes a lac+

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pueden ser incluidos en el lazo (Fig. 7b). Por un simple crossing-over, el ADN plegado hacia afuera es separado del cromosoma hospedante (Fig. 7c) para producir un factor F portando los genes lac+ del hospedante. Los factores F conteniendo genes bacterianos son llamados F′ (prima), y son nombrados de acuerdo a los genes bacterianos que portan.

Figura 7. Producción de un factor F′. (a) Región del cromosoma bacteriano dentro del cual el factor F se ha integrado. (b) El factor F forma un bucle hacia afuera en forma incorrecta de tal forma que incluye una pieza del cromosoma bacteriano, los genes lac. (c) Escisión en la cual un simple crossing-over entre el segmento de ADN con el bucle hacia afuera y el resto del cromosoma bacteriano resulta en un factor F′ llamado F′ (lac).

2.5 Mecanismo de la transferencia

Al final de la década del 50, François Jacob y Elie Wollman estudiaron la transferencia de genes cromosomales desde cepas Hfr a cepas F- que tenían diferencias

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alélicas para un número de genes. El experimento consistió en cruzar Hfr x F- y luego de comenzada la conjugación, en intervalos de tiempo determinado, interrumpirla usando un refrigerador de una heladera para separar las bacterias conjugantes, y luego analizar los transconjugantes de acuerdo a los genes que el donador transfirió al receptor. Este método es llamado apareamiento interrumpido.

El uso del método del apareamiento interrumpido es usado para mapear genes bacterianos y está representado en la Fig. 8a.

Donador: HfrH thr+ leu+ aziR tonR lac+ gal+ strS Receptor: F- thr leu aziS tonS lac gal strR

La cepa HfrH es prototrófica y es resistente al químico inhibidor del crecimiento azida sódica (aziR), resistente a la infección por el bacteriófago T1 (tonR), y sensible al antibiótico estreptomicina (strS). La cepa F- es auxotrófica para treonina (thr) y leucina (leu), sensible al crecimiento del inhibidor químico azida sódica (aziS), sensible a la infección por el fago T1 (tonS), incapaz de fermentar lactosa (lac) o galactosa (gal), y resistente al antibiótico estreptomicina (strR).

En el experimento de conjugación, las dos cepas son mezcladas juntas en un medio líquido a 37° C. La mezcla es removida a varios intervalos de tiempo y son agitadas para separarlas de la conjugación. A través de un plaqueo en un medio de cultivo con agar selectivo, se buscan los recombinantes (transconjugantes) y son analizados en relación al tiempo en el cual el primer gen donador entró en la célula receptora y produjo los recombinantes.

Para este cruzamiento en particular, el medio de cultivo contiene estreptomicina para matar a las cepas parentales HfrH, y la falta de treonina y leucina hace que las cepas parentales F- no puedan crecer. Los genes treonina (thr+) y leucina (leu+) son los primeros genes del donador que son transferidos a las F- para producir un merodiploide, entonces se forman los recombinantes por intercambio de aquellos genes con los genes thr leu de la cepa receptora F- creciendo sobre un medio selectivo. Se pueden usar medios apropiados para testear la aparición de otros genes del donador (aziR, tonR, lac+ y gal+) entre los transconjugantes seleccionados thr+ leu+ strR. Por ejemplo, un medio adicionado con azida sódica puede testear para presencia de aziR del donador.

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Figura 8. Experimento de apareamiento interrumpido involucrando el cruzamiento HfrH thr+ leu+ aziR tonR lac+ gal+ strS F- thr leu aziS tonS lac gal strR. Se ilustra la transmisión progresiva de los genes donador con el tiempo. Los recombinantes son generados por un intercambio de un fragmento donador con los fragmentos homólogos del receptor a partir de doble crossing-over. (a) En varios tiempos después de iniciado el apareamiento, la conjugación es separada y los transconjugantes son plaqueados sobre un medio de agar selectivo para determinar cuales genes han sido transferidos de Hfr a F-. (b) El gráfico muestra la frecuencia (porcentaje) de marcadores genéticos Hfr entre los recombinantes thr+, leu+ y el tiempo de aparición en el receptor. (c) Mapa genético de los genes. La posición de los marcadores representa el tiempo de entrada de los genes dentro del receptor durante el experimento.

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En este experimento, cada gen de la cepa bacteriana Hfr aparece en los recombinantes en un tiempo diferente pero reproducible después que el apareamiento comienza. Este intervalo de tiempo puede ser usado para construir un mapa genético como el de la Fig. 8c, con unidades de mapa en minutos.

La Fig. 8b muestra los resultados. Los genes treonina (thr+) y leucina (leu+) son los primeros en ser transferidos a F- a los 8 minutos (los dos genes son inseparables en un experimento de conjugación debido a están físicamente muy cercanos entre sí). El próximo gen en ser transferido es aziR, y los recombinantes para este gen son vistos a los 9 minutos después de iniciada la conjugación, esto es, un minuto después que entraron los genes thr+ y leu+. Los recombinantes tonR son encontrados a los 10 minutos, luego los recombinantes lac+ aproximadamente a los 16 minutos y los recombinantes gal+ alrededor de los 25 minutos. La máxima frecuencia de recombinantes se hace más pequeña a medida que más tarde entra el gen al receptor, debido a que hay más probabilidades que el apareamiento se rompa.

2.6. Mapeo cromosómico a escala fina por frecuencia de recombinantes

Para que una cepa receptora (exconjugante) adquiera en forma permanente genes donadores, el fragmento donador debe recombinar con el cromosoma receptor. El mapeo por intervalo de tiempo no está basado en frecuencia de recombinación (FR). Sin embargo, es posible usar la frecuencia de recombinación para construir un mapa bacteriano a escala fina.

Primero, necesitamos entender algunas características especiales de los eventos de recombinación en bacterias. La recombinación no tiene lugar entre dos genomas completos como en Eucariotas. Por el contrario, ocurre entre un genoma completo, de la cepa F-, llamado endogenota, y uno incompleto, derivado de la cepa donadora Hfr, llamado exogenota. La célula en este estado tiene dos copias de un segmento de ADN, una copia del exogenota y una copia es parte del endogenota. En este estado la célula es un diploide parcial llamado merocigota. Un simple crossing-over en un merocigota rompería el anillo y entonces no se producirían recombinantes viables (Fig. 9).

Para mantener el círculo intacto, debe ocurrir un número par de crossing-over. Un número par de crossing-over produce un cromosoma circular intacto y un fragmento (Fig. 9). El fragmento lineal es generalmente perdido en el subsiguiente crecimiento celular. Sólo uno de los productos de recombinación recíproco sobrevive.

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Figura 9. Crossing-over entre un exogenota y endogenota en un merocigota. Un simple crossing-over produce un fragmento lineal parcialmente diploide.

Supongamos que nosotros queremos calcular la distancia en un mapa que separa a tres loci cercanos: met, arg y leu. Se asume que por medio de apareamiento interrumpido se demostró que el orden es met, arg, leu, con met transferido primero y leu último. Para examinar los recombinantes para estos tres genes, nosotros sólo debemos estudiar exconjugantes “trihíbridos” que han recibido los tres marcadores del donador. En otras palabras nosotros queremos evaluar el merocigoto diagramado a continuación:

Para hacer esto, primero debemos seleccionar exconjugantes portando el último de los alelos donador, el cual en este caso es leu+. ¿Por qué? Porque si nosotros seleccionamos para el último marcador, entonces conocemos que tales células en algún estado deben contener también los primeros marcadores, arg+ y met+.

El objetivo es contar la frecuencia de crossing-over en diferentes lugares. Los recombinantes leu+ que nosotros seleccionamos pueden o no haber incorporado los otros marcadores donador, dependiendo donde ocurrió el doble crossing-over. El

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procedimiento es primero seleccionar exconjugantes leu+ y luego aislar y testear una muestra grande de estos para ver cuál de los otros marcadores se integraron. Veamos un ejemplo. En el cruzamiento Hfr met+ arg+ leu+ strS F- met- arg- leu- strr, deberíamos seleccionar recombinantes leu+ y entonces examinar para los alelos arg+ y met+, llamados marcadores no seleccionados. La Fig. 10 muestra los doble crossing-over esperados. Un crossing-over debe estar del lado izquierdo del marcador leu y el segundo debe estar del lado derecho. Supongamos que los exconjugantes leu+ son de los siguientes tipos y frecuencias:

leu+ arg- met- 4 %leu+ arg+ met- 9 %leu+ arg- met+ 87 %

Los doble crossing-over necesarios para producir estos genotipos son mostrados en la Fig. 10.

Figura 10. Mapeo por recombinación en E. coli. Después del cruzamiento, la selección se hace para el marcador leu+ que es introducido al final. Los primeros marcadores (arg+

y met+) pueden o no ser insertados, dependiendo del lugar donde ocurrió la recombinación entre el fragmento Hfr y el cromosoma de F-. Las frecuencias de eventos diagramados en (a) y (b) son usados para obtener los tamaños relativos de las regiones

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leu-arg y arg-met. Note que en cada caso solo el ADN insertado en el cromosoma F-

sobrevive, los otros fragmentos se pierden.

Las dos primeras clases son clave porque ellos requieren un crossing-over entre leu y arg en el primer caso, y entre arg y met en el segundo. La frecuencia relativa de estas dos clases refleja los tamaños de estas dos regiones. Se debería concluir que la región leu-arg están a 4 unidades de mapa, y arg-met a 9 unidades de mapa.

En un cruzamiento de este tipo, un potencial recombinante de genotipo leu+ arg-

met+ rquiere 4 crossing-over en lugar de dos (Fig. 10d). Estos recombinantes rara vez son recuperados debido a que su frecuencia es muy baja comparada con las otras clases de recombinantes.

3. TRANSFORMACIÓN BACTERIANA

Es la transferencia unidireccional de ADN extranuclear dentro de la célula, lo cual provoca el cambio del fenotipo de la célula receptora. Fue observada por primera vez por Griffith en 1928 y Avery y colegas en 1944 demostraron que el ADN era el responsable. La transformación bacteriana es usada para mapear genes de ciertas especies bacterianas que no pueden ser realizados por conjugación o transducción. En el mapeo por transformación, el ADN de una célula donadora es extraído, purificado y roto en pequeños fragmentos para ser agregados a bacterias receptoras con genotipos diferentes. La recombinación se produce cuando la bacteria receptora toma esos fragmentos del medio y luego hay recombinación entre los segmentos homólogos. Las células receptoras que cambian su fenotipo por transformación se denominan transformantes.

Las bacterias varían en su capacidad para tomar ADN del medio. Para aumentar la eficiencia de transformación se usan compuestos químicos como el Cloruro de Calcio o las células son expuestas a campos eléctricos en un proceso denominado electroporación. Las células preparadas para tomar ADN por transformación se denominan células competentes.

Hay dos tipos de transformaciones bacterianas: 1) transformación natural, y 2) transformación dirigida. El Bacillus subtilis es un ejemplo de la primera y E. coli de la segunda.

En la transformación sólo una pequeña proporción adquiere el ADN. La transformación se produce en una frecuencia de 1 célula cada 1000. Consideramos un ejemplo de transformación de B. subtilis (Fig. 11). El fragmento de ADN doble cadena del donador es silvestre (a+) para un alelo mutante a en la célula receptora (Fig. 11a). Durante la incorporación del ADN, una de las dos cadenas de ADN es degradad, con lo cual una sola cadena de ADN es dejada dentro de la célula (Fig. 11b). Esta cadena de ADN lineal se aparea con el ADN homólogo del cromosoma circular de la célula receptora para formar una región de triple cadena (Fig. 11c). La recombinación se produce por doble crossing-over entre la cadena de ADN lineal del donador y el ADN doble cadena del receptor (Fig. 11d). El resultado es un cromosoma receptor recombinante: en la región entre los dos crossing-over, una cadena de ADN tiene el segmento de ADN a+ del donador, y la otra cadena tiene el segmento de ADN a del

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receptor. Una región de ADN con información de la secuencias diferentes sobre las dos cadenas es denominado ADN heteroduplexo. El otro producto del evento de doble crossing-over es una pieza de ADN de cadena simple portando un segmento de ADN con el alelo a, el cual es degradado.

Figura 12. Transformación en Bacillus subtilis. (a) El fragmento de ADN bacteriano lineal, doble cadena, portando el alelo a+, y la bacteria receptora portando el alelo a. (b) Una cadena del ADN del donador entra al receptor. (c) La cadena de ADN lineal simple

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se aparea con la región homóloga del cromosoma del receptor, formando una estructura de triple cadena. (d) Un doble crossing-over produce un cromosoma receptor recombinante a+/a y un fragmento de ADN lineal. El fragmento lineal es degradado y por replicación, la mitad de la progenie son transformantes a+ y la mitad no-transformantes a.

Después de la replicación del cromosoma de la célula receptora, el cromosoma de la progenie tiene la información genética del donador sobre ambas cadenas de ADN y este es un transformante a+. El otro cromosoma de la progenie tiene información genética del receptor sobre ambas cadenas de ADN y es un no-transformante a. Se produce igual cantidad de transformantes a+ y no-transformantes a.

La transformación puede ser usada para determinar si los genes están ligados, para determinar el orden génico sobre un mapa y para determinar la distancia entre los genes. Para determinar si dos genes están ligados se usa el siguiente principio: la transformación eficiente de ADN involucra a fragmentos con un tamaño suficiente para incluir unos pocos genes.

Si dos genes, x+ e y+, están apartados sobre el cromosoma, ellos siempre serán encontrados en diferentes fragmentos de ADN. Si tenemos una célula donadora x+ y+ y una receptora x y, la probabilidad de transformación simultánea (co-transformación) de la receptora es igual al producto de la probabilidad de transformación de cada gen por separado (103 x 103 = 1 x 106). Si los dos genes están suficientemente juntos, ellos a menudo serán portados por el mismo fragmento cromosómico, por lo tanto la frecuencia de co-transformación será cercana a la frecuencia de transformación de un sólo gen (1 x 103).

El orden génico puede ser determinado a partir de los datos de co-transformación (Fig. 13).

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Figura 13. Demostración de la determinación del orden génico por co-transformación

Por ejemplo, si los genes p y q son a menudo transmitidos juntos a la célula receptora, entonces estos dos genes deben estar estrechamente ligados. De igual forma, si los genes q y o son a menudo transmitidos juntos, ellos deben estar muy ligados. Para determinar el orden génico se necesita información de p y o. Teóricamente hay dos órdenes posibles: p-o-q y p-q-o. Si el orden es p-o-q, entonces p y o deberían ser co-transformados; mientras que si el orden es p-q-o, entonces p y o rara vez deberían ser co-transformados debido a que ellos están separados. Los datos no muestran co-transformantes para p y o, indicando que el orden génico debe ser p-q-o.

4. TRANSDUCCIÓN BACTERIANA

Es el proceso por el cual un bacteriófago transfiere genes de una bacteria donadora a otra receptora. Estos bacteriófagos son denominados vectores fágicos. La cantidad de ADN que un fago puede transferir es limitada (menos del 1% del cromosoma bacteriano). Una vez que el material genético del donador ha sido introducido dentro del receptor se produce la recombinación genética con regiones homólogas del cromosoma receptor. Los receptores recombinantes son denominados transductantes.

4.1. Bacteriófago

Muchas cepas bacterianas pueden ser infectadas por fagos específicos. Un fago tiene una estructura relativamente simple, consistente de un simple cromosoma de ADN o ARN rodeado por una cubierta proteica. La variación en el número y organización de las proteínas le otorga las características de apariencia de los fagos. Escherichia coli puede ser infectada por fagos T2, T4, T5, T6, T7 y Lambda. Los fagos T2 y T4 son virulentos y siguen el ciclo lítico cuando infectan a la bacteria (Fig. 14). El fago inyecta su cromosoma dentro de la bacteria y los genes del fago toman el control de las funciones celulares, conduciendo a la producción de progenie del fago que son liberados de la bacteria cuando la célula se rompe (lisa). La suspensión de progenie fágica liberada es llamada lisado fágico.

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Figura 14. El ciclo de vida lítico de un fago virulento como T2

El ciclo de vida de es más complejo que el del fago T2 (Fig. 15). Cuando el ADN del fago es inyectado dentro de E.coli, el fago sigue una de las dos vías alternativas. Una es el ciclo lítico, igual que el fago T2. La otra es la vía lisogénica (o ciclo lisogénico). En la vía lisogénica, el cromosoma de no se replica, en su lugar, se inserta (integra) físicamente dentro de una región específica del cromosoma de la célula hospedante, como la integración del factor F. En este estado integrado, el cromosoma del fago es llamado profago. Cada vez que el cromosoma de la célula hospedante se replica, el cromosoma del fago integrado se replica como parte de este. Una bacteria que contiene un fago en el estado de profago se dice que es lisogénica para dicho fago. Al fenómeno de la inserción de un cromosoma de un fago dentro del cromosoma de la bacteria se denomina lisogenia. Los fagos que pueden elegir entre el ciclo lítico y el lisogénico se deneominan fagos moderados.

El estado de profago es mantenido por la acción de un producto génico específico del fago (una proteína represora) que previene la expresión de los genes de esenciales para el ciclo lítico. Cuando el represor es destruido, por ejemplo por factores ambientales tales como la luz ultravioleta, se induce el ciclo lítico. Luego de la inducción, el cromosoma de integrado es escindido del cromosoma bacteriano y el ciclo lítico comienza, generando la producción y liberación de progenie .

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Figura 15. Ciclo de vida del fago moderado. Cuando un fago moderado infecta una célula, el fago puede entrar en el ciclo lítico o lisogénico.

4.2. Transducción generalizada

Es el mecanismo de transducción mediante el cual cualquier gen puede ser transferido de una bacteria a otra. Fue descubierto por Lederberg y Zinder en 1952 cuando analizaban si la conjugación se producía en Salmonella typhimurium. El proceso se produce porque el fago moderado entra en el ciclo lisogénico cuando infecta a E. coli. Si se rompe el ciclo lisogénico, el fago entra en el ciclo lítico produciendo progenies del fago. Durante el ciclo lítico el ADN bacteriano es degradado y en una forma poco frecuente un segmento del ADN bacteriano es empaquetado dentro de la cabeza del fago. Estos fagos son llamados fagos transducientes. La bacteria transducida se llama bacteria transductante.

La transducción generalizada puede ser utilizada para determinar el ligamiento génico, el orden de los genes sobre un mapa y la distancia entre ellos. El procedimiento es idéntico al empleado en la transformación bacteriana. En la cabeza de un fago cabe solamente el 1,5% del ADN cromosómico bacteriano. Solamente si dos genes están

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muy juntos sobre el cromosoma serán encontrados juntos en el mismo fago transduciente. Se utiliza la frecuencia de co-transducción como indicación que dos genes están muy ligados.

Figura 16: Transducción generalizada entre razas de E. coli. (1) Una célula donadora wild-type de E. coli infectada con el fago P1. (2) El ADN de la célula hospedante es roto durante el ciclo lítico. (3) Durante el ensamblaje de las progenies del fago, algunas piezas del cromosoma bacteriano son incorporados dentro de algunas progenies del fago para producir fagos transducientes. (4) Después de la lísis celular, una baja frecuencia de fagos transducientes es encontrado en el lisado fágico. (5) Los fagos transducientes infectan una bacteria receptora auxotrófica. (6) Por un doble crossing-over se produce el intercambio del gen donador a+ con el gen mutante receptor a. (7) El resultado es un transductante a+ con todos los descendientes de dicha célula con el mismo genotipo.

En el proceso de transducción generalizada está representado en la Fig. 16. Normalmente el fago P1 entra al estado lisogénico cuando infecta E. coli (Fig. 16, parte 1). Si el estado lisogénico no es mantenido, el fago pasa al cíclo lítico y produce progenies del fago (Fig. 16, parte 2). Durante el ciclo lítico, el ADN bacteriano es degradado y, a veces, un fragmento del ADN bacteriano es empaquetado dentro de la cabeza del fago en lugar del ADN del fago (Fig. 16, parte 3). Estos fagos son llamados

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fagos transducientes, porque ellos son el vehículo por el cual el material genético puede ser transportado entre bacterias. En el ejemplo mostrado en la figura, los fagos transducientes son aquellos portando los genes de la bacteria donadora a+, b+ o c+. La población de fagos en el lisado fágico (Fig. 16, parte 4) consiste principalmente de fagos normales, pero con la presencia de fagos transducientes en una frecuencia de alrededor de 1 cada 105 progenies, los cuales pueden ser usados para infectar una nueva población de bacterias (Fig. 16, parte 5). La bacteria receptora son de genotipo a. Si un fago transduciente portando el gen a+ infecta a una bacteria receptora portando el gen a se puede producir el intercambio entre dichos genes por el mecanismo de doble crossing-over (Fig. 16, parte 6). El resultado es una bacteria transducida estable llamada transductante (Fig. 16, parte 7).

4.3. Transducción especializada

Algunos fagos moderados pueden transducir solo ciertas secciones específicas del ADN bacteriano. Un ejemplo de fagos de transducción especializada es Lambda (λ) que infecta a E. coli.

En la célula bacteriana, el genoma de λ se integra dentro del cromosoma bacteriano en un sitio específico entre la región gal y la región bio, produciendo un lisógeno (Fig. 17a). Este sitio sobre el cromosoma de E. coli es llamado att λ (sitio de adhesión para λ) y es homólogo con un sitio llamado att en el ADN de λ. Por medio de un simple crossing-over, el cromosoma de λ se integra. En el estado integrado, el fago, ahora llamado profago, es mantenido por la acción de una proteína represora codificada por el fago.

La raza particular de E. coli que es lisogenizada por λ es E. coli K12, y cuando esta contiene el profago λ es llamada E. coli K12 (λ). Cuando el ciclo lítico es iniciado, el cromosoma del fago se pliega hacia fuera generando un cromosoma λ circular separado por un simple crossing-over en el sitio att λ / att (Fig. 17b). En muchos casos, la escisión del cromosoma del fago es precisa y se genera el cromosoma completo del fago λ (Fig. 17b1). En raras ocasiones, el crossing-over ocurre en otro sitio diferente al sitio de reconocimiento homólogo, originando un ADN circular anormal (Fig. 17b2). En el diagrama de la Fig. 17, una pieza del cromosoma de λ ha sido dejada en el cromosoma bacteriano, y una pieza del cromosoma bacteriano, incluyendo el gen gal+ ha sido agregada al resto del cromosoma de λ. Debido a que un gen bacteriano (o genes) es incluido en una progenie del fago, tenemos un fago transduciente, en este caso denominado λd gal+. La letra d es por defectivo, debido a que no todos los genes del fago están presentes, y gal indica que el gen gal de la célula bacteriana hospedante ha sido adquirido. Esto es similar a la producción de cepas F’ por escisión defectiva del factor F. El fago λd gal+ puede replicar y lisar a las células hospedantes en el cual este se produce, sin embargo, debido a que todos los genes de λ aún están presentes: algunos sobre el cromosoma del fago y otros están en el cromosoma bacteriano.

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Figura 17. Transducción especializada por el bacteriófago λ. (a) Producción de una bacteria lisogénica por crossing-over en una región de homología entre el cromosoma bacteriano circular (attλ) y el cromosoma del fago circularizado (att). (b) Producción de un lisado transduciente inicial de baja frecuencia (LFT): La inducción de la bacteria lisogénica causa un bucle hacia fuera. Bucle hacia fuera normal (1) produce fagos λ normales, y bucles hacia fuera anormales raros (2) produce fagos transducientes λd gal+. (c) Transducción de bacterias gal por el lisado inicial producido tanto por (1) trasductantes inestables por la integración de λ y λd gal+ (resultando en un doble lisógeno) o (2) transductantes estables (lisógenos simples) por crossing-over alrededor de la región gal. La inducción del lisógeno doble inestable produce aproximadamente igual número de fagos λd gal+ y fagos λ normales, resultando en un lisado de alta frecuencia de transducción (HFT).

El fenómeno del bucle hacia fuera anormal es un evento raro de tal manera que los lisados fágicos producidos por la infección inicial contienen principalmente fagos

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normales y unos pocos fagos transducientes gal+ (1/105). Debido a esa pequeña proporción de fagos transducientes, el lisado es llamado un lisado transduciente de baja frecuencia (LFT). La infección de bacterias gal con el lisado LFT produce 2 tipos de transductantes (Fig. 17c). En un tipo, el fago λ normal (wild-type) integrado a su sitio normal att λ se le integra el fago λd gal+ por crossing-over dentro de la secuencia común a λ para producir un doble lisógeno (Fig. 17c1). En este caso, ambos tipos de fagos están integrados dentro del cromosoma bacteriano y la bacteria es heterocigoto gal+/gal y por lo tanto puede fermentar la galactosa. Este tipo de transductante es inestable porque el ciclo lítico puede iniciarse por inducción. El fago λ normal tiene un conjunto de genes completo para replicación del virus, de tal manera que controla la formación del bucle hacia fuera y la replicación tanto de sí mismo como de λd gal+. En este caso, el fago λ normal actúa como fago ayudante (helper). De esta manera más de la mitad de la progenie del fago puede ser λd gal+ por lo tanto es llamado lisado transduciente de alta frecuencia (HFT).

El segundo tipo de transductantes producido por el lisado inicial es estable: Este se produce solamente cuando un fago λd gal+ infecta una célula (Fig, 17c2). El gen gal+

portado por el fago puede ser intercambiado por el gen gal bacteriano por un doble crossing-over. Tales transductantes son estables debido que el cromosoma bacteriano contiene un solo tipo de gen gal y ninguno de los genes del fago están integrados.

Por este mecanismo, la transducción especializada sólo puede transducir pequeños segmentos del cromosoma bacteriano que están a un lado u otro del profago. Este mecanismo es usado para mover genes entre bacterias, por ejemplo, para la construcción de razas con genotipos particulares.