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Estructura y organización del h

Genética Médica – Tema 2

genoma humano: genes, familias génicas y

polimorfismos del DNABibliografía:

Inma Martín Burriel Genética Médica. Tema 2Curso 2009-10 Estructura y organización del genoma

Griffits AJ et al. (2000) pp23-28; pp376-378Tamarin RH (1996) pp203-220, pp414-419Klug WS y Cummings MR (1999) pp277-298, pp528-539

Tema 2

• Estructura y organización del Genoma• Polimorfismos genéticos:

– Variaciones en el número de repeticiones– Mutaciones puntuales

• Aplicaciones de los polimorfismos genéticos en Medicinagenéticos en Medicina

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Estructura en doble hélice del DNA:

10pb /vueltaDestrógiraBases apiladas perpendicularmente

Genoma

DNA eucariótico

Genes funcionales DNA de secuencia DNA separadorde copia única repetida DNA separador

Secuencias funcionales Secuencias sin funciónconocida

Secuencias funcionalesNo codificantes

Familias de genes codificantes(y pseudogenes asociados)

Familias de genes dispersos

Familias de genes en tándem

Repeticiones heterocromatinaDel centrómero

VNTR

Secuencias derivadasDe transposiciones

Familias de genes en tándemTransposones

Retrotransposones

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DNA eucariótico

Genes funcionales DNA de secuencia DNA separador

Genoma

de copia única repetida DNA separador







VNTR



Retrotransposones

Genes de copia únicaInicio transcripción

FintranscripciónIntrón 1 Intrón 2 Intrón 3

Gen eucariota

Unidad de transcripción

Región reguladoraaguas arriba

Promotor

5’UTR

Exón 1 Exón 2 Exón 3 Exón 4

Región reguladorainterna

Región reguladoraaguas abajo

• Codifican para una única proteínaCodifican para una única proteína• Se encuentran en una única posición del

genoma (un individuo 2 copias)

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DNA eucariótico

Genes funcionales DNA de secuencia DNA separador

Genoma

de copia única repetida DNA separador







VNTR



Retrotransposones

• Familia génica:– “grupo de genes de un genoma que derivan

d t ú ”

Familias génicas

de un ancestro común”

Familia de las globinas (beta globina):5 loci en HSA11Orden según la expresión en el desarrolloPosición y longitud de intrones similarEvolución concertada

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–Genes cuyos productos son requeridos en grandes cantidades:• Organizador Nucleolar (NO):


g ( )– Localizado en los brazos cortos de cromosomas

acrocéntricos (13, 14, 15, 21 y 22) aunque pueden traslocarse

– Contiene hasta 800 copias del gen del rRNA (18S + 28S)

• Genes del RNAt:– 50 sitios cromosómicos– 10 a 100 copias/sitio

• Genes de las Histonas–Se mantiene la identidad de secuencia

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Familia de genes dispersos

• Familias de genes dispersos:– Actinas: de 5 a 30 genes– Queratinas: + de 20Queratinas: + de 20– Cadena pesada de la Miosina: 5-10– Tubulinas: 3-15– Globinas: hasta 5– Región variable de las inmunoglobulinas: 500– Histonas: 100-1000

• Las secuencias entre genes pueden variaró• Genes homólogos pueden tener funciones

diferentes• Algunos pierden la función pseudogenes

Genoma

DNA eucariótico

Genes funcionales de copia única

DNA de secuencia repetida DNA separadorde copia única repetida







VNTR


TTransposones

Retrotransposones

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DNA repetido

Secuencias de DNA no codificante dispersas y repetidas en tándem

¿DNA basura?- ¿Regulación de la expresión?- ¿Mecanismo de reparación?- ¿Puntos de recombinación?

Variación en el número de repeticiones

Entrecruzamiento desigual Fallo en la alineación de cadenas de DNA en la replicación

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DNA repetido en tándem

• DNA satélite:– repeticiones de formaciones muy grandes (100 kb y

algunas Mb)– DNA no transcrito

Regiones de heterocromatina principalmente en – Regiones de heterocromatina, principalmente en centrómeros (DNA alfoide)

Modelos de organización centromérica


• DNA minisatélite (VNTR)– Repeticiones de tamaño moderado (60pb)– Distribuidas por todo el genoma, principalmente en telómeros– Normalmente no se transcriben– Tipos:

• DNA minisatélite hipervariable• DNA telomérico

F ió DNA t l é iFunción DNA telomérico:Solucionar los problemas de replicación de los extremos del cromosoma

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• DNA microsatélite (STR):– Short Tandem Repeat– Pequeñas formaciones (generalmente <

150pb) de repeticiones en tándem de


150pb) de repeticiones en tándem de secuencias muy simples (de 1 a 4 nucleótidos)

– Repartidas por todo el genoma, normalmente en intrones. Frecuentes y altamente polimóficos (número medio de alelos 10)

– Herencia mendeliana codominante

CA CA CA CA CA CA

CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA

Alelo 1

Alelo 2

VNTR Tamaño (Kb)

Unidad repetición

Método detección


Satélites 100-500 20 kb Centrifugación ClCsElec. campos pulsados

Minisatélites(VNTR)

0,1-20 20-40 pb Elec. agarosa

Microsatélites(STR)

pb 1-4pb Elec. AcrilamidaSecuenciación

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VNTR Tamaño (Kb)

Unidad repetición

Método detección


Satélites 100-500 20 kb Centrifugación ClCsElec. campos pulsados

Minisatélites(VNTR)

0,1-20 20-40 pb14-100 pb

Elec. agarosa

Microsatélites(STR)

pb 1-4pb Elec. AcrilamidaSecuenciación

Polimorfismos de DNA: Presencia de distintos alelos en la población

Polimorfismos

• Polimorfismo genético:– Cuando un locus presenta al menos 2 alelos

y la frecuencia alélica del más raro es > 5% locus polimórfico.

– El polimorfismo (la variación) garantiza la adaptación de una especie a condiciones

bi t l bi t dambientales cambiantes, a expensas de producir mutaciones graves causantes de una enfermedad.

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DNA minisatélite hipervariable

• Localización dispersa en todos los cromosomas entre 0 1-20 kb de longitud cromosomas, entre 0,1 20 kb de longitud, de repeticiones en tándem cortas

• Secuencia repetida común (core):GGGCAGGAXG

• Son muy polimórficas• Se encuentran principalmente en intronesSe encuentran principalmente en intrones• Estas secuencias se han empleado como

“huellas dactilares”


Detección del polimorfismo: Digestión del DNA con enzimas de restricción + Southern (hibridación con sonda)

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4 5

7

9 10 11

8

6

INDIVIDUO 2

1

4

1

32

3 3’

32

1

32

4

1

32

4

3’3

2

4

1

3

1 1’

1

32

1

1

32

4

1’

1

32

4

1

32

2

4

1

3

2’2

1

3

1

32

2 2’

2

10 11 INDIVIDUO 1

10

4

6

8

INDIVIDUO 2

11

7

455

9

44

INDIVIDUO 1

4

6

8

5

7

9

3

5

7

4

6

5

7

4

6

8

5

7

4

6

8

54

6

4

65

7

5

7

9

54

10

4

6

8

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• Funciones de los VNTRs:– Regulación de puntos activos de recombinación


– Control de segregación de los cromosomas (por su localización centromérica)

– Estabilización de los cromosomas durante la replicación (por su localización en telómeros)

– Podrían dar estabilidad a los cromosomas

Aplicaciones• Aplicaciones:– Identificación individual (medicina forense)

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DNA microsatélite

• Localización dispersa en todos los cromosomas

• Se encuentran en intrones • Se encuentran en intrones y DNA espaciador, raramente en secuencia codificante.

• A veces asociados a secuencias repetidas dispersas por el genoma (SINES o LINES).

• Secuencia repetida de 1 a 4 pb4 pb.

• Son muy polimórficas.• Las secuencias

flanqueantes a la repetición son únicas.

Detección del polimorfismo: PCR

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• Visualización de los microsatélites:– http://www.unizar.es/lagenbio/recursos/

DNA microsatélite

ACGT

Secuenciación: Genotipado:

• Implicaciones de las secuencias microsatélites en medicina:– Expansión de microsatélites de trinucleótidos:

DNA microsatélite

p• Síndrome de X frágil (FMR-1) (CCG)n• Distrofia miotónica (DM) (CTG)n• Enfermedad de Huntington (HD) (CAG)n• Ataxia de Friedreich (FA)• Nueve formas de ataxia espinocerebelar

(SCA)(SCA)–Expansión de tetranucleótidos: DM2–Expansión de pentanucleótidos: SCA10

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• Mecanismos de patogeneicidad de los microsatélites:

E f d d d h i i ió d

DNA microsatélite

– Enfermedades de herencia recesiva expansión de tripletes que interfiere la transcripción del gen mutado (no proteína)

– Enfermedades con herencia dominante expansión de tripletes produce una proteína alterada

– Enfermedades con herencia dominante producidas por expansiones en regiones no codificantes expansiones en el ARN función celular alterada?

• Aplicaciones:– Identificación individual

DNA microsatélite

– Análisis evolutivo de poblaciones– Diagnóstico directo en enfermedades

genéticas causadas por expansión de trinucleótidos

– Diagnóstico indirecto de enfermedadesDiagnóstico indirecto de enfermedades genéticas:

• Ligamiento entre microsatélites polimórficos y genes causantes de enfermedad.

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Identificación individual

Análisis de 15 marcadoresmicrosatélites

Diagnóstico directoEjemplo: Diagnóstico corea de Huntington

Nº repet Clasificación E.H.<27 Normal No27 35 I t di N27-35 Intermedio No36-39 Penetrancia I +/->39 Penetrancia T Si

1 2

3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7

45

22201816

12

18

Diagnóstico indirecto

Ejemplo: Diagnóstico portadores enfermedades recesivas

Fibrosis quística

HSA7

Ms1

CFTRMs2

Ms3

CFTR* CFTR*

127 125

?

222

152

220

154

?

1

123 125

CFTR*

220

150

220

154

2

123 125

CFTR*

220

150

220

154

3

127 129

?

222

152

218

152

?

4

123 129

?

220

150

218

152

?

5

127 129

?

222

152

218

152

?

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Etiología Detección Frecuencia genómica

Resumen de polimorfismos genéticos

Etiología Detección Frecuencia genómica

Microsatélites errores de DNAp PCR 1/30.000 bp(short tandem slippagerepeats)

STRs

Minisatélites entrecruzamiento Southern variable, baja(variable no of no equilibradotandem repeats) unequal crossing over

VNTRs

RFLPs mutaciones Southern-PCR baja(restriction fragmentlength polymorphisms)

SNPs mutaciones PCR 1/1000 bp(Single nucleotide Polymorphisms)

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Mutaciones Puntuales

Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales:• Variación de un nucleótido en una posición determinada.• Frecuencia:1/1000pb

También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)• También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)

En regiones codificantes:

Mutaciones con cambio aminoacídicoGCA (Ala) GTA (Val)

Alelo 1Alelo 2

TACGAGCTATACGGGCTA

Mutaciones:- Cambio de base- Inserción - Deleción

Mutaciones sin sentidoAAA (Lys) TAA (stop)

Mutaciones silentesGCA (Ala) GCC (Ala)

Deleción

Metodología para determinar mutaciones puntuales

• SNP:– Mutaciones puntuales

detectable por un variado número de técnicas:

• RFLPs:– Mutaciones puntuales que se

localizan en una secuencia reconocida por una enzima de

• Como los RFLP (si producen/eliminan un sitio de corte)

• Secuenciación• Minisecuenciación• Sondas específicas• SSCPs• PCR en tiempo real…

– Baja variabilidad (2 alelos)Localización:

restricción.– Detección mediante enzimas

de restricción y Southern Blotting

– PCR + enzima de restricción– Baja variabilidad (2 alelos).– Localización:

• Exones• Genes de copia única

– Localización:• Exones• DNA de copia única

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RFLPs

Determinación mediante Southern

Diagnóstico genético por RFLPs

Polimorfismo debido amutaciones puntualesEn el gen de la globina normal lasecuencia correspondiente al 5th-RE RE RE RE RE

Ms t I I

RFLP(Restriction fragment lenght polymorfism)

p7th aminoácido del péptido beta-globina es CCTGAGGAG que esreconocida por la enzima derestricción MstII. En la variablepatológica de la anemia falciforme,eritrocitos en hoz-sickle, se produceuna mutación puntual de A a T,lo que invalida el reconocimientopor MstII. En la correspondientedi tió i áti

A a

A a

AA Aa aa

digestión enzimática se genera unúnico fragmento de 1,3 kb en lugarde los dos fragmentos de 0,2 kb y1,1 kb propios del gen normal. Losdiferentes fragmentos se detectanpor técnica de Southern blotting

Aa Aa aaAA

AaAa

aaaa aaAA

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Determinación mediante PCR-RFLPs

Mutación:Alelo 1Alelo 2

TGGACGTCTTGGATGTCT

Aat II

PCR:TGGACGTCTTGGAGGTCT

Fragmento PCR

PCR Alelo 1 Alelo 2

Electroforesis

Genética Médica

• SNP:– Mutaciones puntuales

detectable por un variado número de técnicas:

• RFLPs:– Mutaciones puntuales que se

localizan en una secuencia reconocida por una enzima de

Según metodología de detección

• Como los RFLP (si producen/eliminan un sitio de corte)

• Secuenciación• Minisecuenciación• Sondas específicas• SSCPs• PCR en tiempo real…

– Baja variabilidad (2 alelos)Localización:

restricción.– Detección mediante enzimas

de restricción y Southern Blotting

– PCR + enzima de restricción– Baja variabilidad (2 alelos).– Localización:

• Exones• Genes de copia única

– Localización:• Exones• DNA de copia única

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SNPs

• SNP: Single Nucleotide Polymorphisms:– Presentación muy frecuente (1/300 pb)

10 30 ill d SNP l – 10 a 30 millones de SNP en el genoma humano

– Dos posibles alternativas en cada individuo– Herencia es muy estable (baja tasa de

mutación 10-6 vs 10-3 de los microsatélites)– Fácil estandarización– Aplicaciones en la determinación de

enfermedades y en farmacogenética

Determinación de SNPs

MCL1

Secuenciación:

PCR en tiempo real con sondas alelo específicas:

Minisecuenciación:

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• Implicaciones de las mutaciones puntuales en medicina:– Pueden originar diferencias muy sutiles o

Mutaciones puntuales

g yprovocar la muerte

– Mutaciones en líneas germinales:• Neurofibromatosis (dominante)• Acondroplasia (dominante)• Hemofilia (Factor VII, ligado al X)

– Mutaciones somáticas:Mutaciones somáticas:• Cáncer: mutaciones de protooncogenes

– Origen: fallo en la reparación del DNA o agentes mutágenos

• Aplicaciones de los polimorfismos del DNA

Genética Médica

DNA:– Identificación individual (Medicina

forense)–Construcción de los mapas génicos–Ligamiento con fenotiposg p

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Ejemplo: Determinación de portadores de Fibrosis Quística

Nora Riveros Ka Juan Ríos Hb (2005) Detección indirecta deNora Riveros Ka, Juan Ríos Hb (2005). Detección indirecta de portadores de fibrosis quística en dos familias chilenas mediante análisis de polimorfismos en el ADN asociados fuertemente al gen CFTR. Rev Méd Chile 2005; 133: 648-654

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