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Tema 8. Funcionamiento del DNA (I)

Genética CC. Mar 2004-05

Genética CC Mar 2004/5 • D. Posada, Universidad de Vigo 2

Objetivos

• Transcripción• RNAs y procesamiento

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Dogma Central de la BiologíaMolecular

• DNA ⇒ RNA ⇒ proteína

• Transcripción seguida detraducción

Transcripción

Traducción


Nucleótidos RNA

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Cadena RNA

La cadena del RNA se parecea una cadena única de DNA,ya que esta formado por unesqueleto de azúcar–fosfato,con un base ligada a laposición 1’ de cada ribosa. Lasuniones azúcar–fosfato serealizan entre las posiciones 5’y 3’ del azúcar, como en elDNA, por lo que la cadena delDNA tiene un extremo 5’ alprincipio y otro 3’ al final.


RNA versus DNA1. El RNA es de cadena única, por lo que es más flexible y puede

adoptar estructuras complejas, incluso intramoleculares.

2. El RNA utiliza como azúcar la ribosa en vez de la desoxirribosa. Laribosa contiene un grupo OH (hidroxilo) en el carbón 2’, mientras queel DNA tiene una H en esa posición.

3. Los nucleótidos de RNA (ribonucleótidos) contienen las basesadenina, citosina, guanina, como el DNA, pero contienen uracilo envez de timina. El uracilo puede formar enlaces de hidrógeno con laadenina, tal como la timina.

4. El RNA puede catalizar importante reacciones biológicas. Los RNAque funcionan como enzimas se denominan ribozimas.

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Tipos de RNA•RNA mensajero (mRNA): codifica la secuencia aminoacídica de unaproteína. Los mRNAs son los tránscritos de los genes codificadores,también llamados genes estructurales.

•RNA transferente (tRNA): transporta los aminoácidos a los ribosomasdurante la traducción.

•RNA ribosomal (rRNA): constituye los ribosomas al unirse a lasproteínas ribosómicas. En los ribosomas el mRNA se traduce enproteínas.

•RNA pequeño nuclear (snRNA): forma junto a determinadasproteínas los complejos moleculares utilizados en el procesamiento delRNA eucariótico.


Transcripción en procariotas

• La transcripción es la síntesis de una copia deRNA a partir de un segmento de DNA.

• El RNA es sintetizado por la enzima RNApolimerasa (o transcriptasa). En procariotas,una única RNA polimerasa cataliza esteproceso. Esta enzima no necesita cebadorespara iniciar la transcripción y carece dehabilidades de corrección de errores.

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Transcripción en procariotas

• La RNA polimerasa desenrrolla la doble hélice deDNA al principio del gen. Sólo una de las dos hebrasde DNA, la 3’-5’, se transcribe en RNA, por lo que elRNA se sintetiza en dirección 5’-3’.

• Los precursores del RNA son los ribonucleósidostrifosfato ATP, CTP, GTP y UTP.

• La RNA polimerasa selecciona el siguiente nucleótidode la cadena de RNA que debe añadirse según lasbase expuesta en la cadena de DNA, por las reglas deapareamiento de bases:

DNA 3’-ATACTGGAC-5’

RNA 5’-UAUGACCUG-3’


Estructura del gen procariota

• Promotor: es una secuencia situada, corriente arriba de la secuenciacodificadora de RNA, que interactúa con la RNA polimerasa. Aseguraque la transcripción comienza siempre en el mismo sitio.

• Secuencia codificadora: es la secuencia de DNA que será transcrita enRNA por la RNA polimerasa.

• Terminador: es una secuencia situada corriente abajo de la secuenciacodificadora de RNA que especifica dónde termina la transcripción.

Caja Pribnow (-10)

5’-TATAAT-3’

Caja (-35)

5’-TTGACA-3’

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Iniciación y elongación de latranscripción en procariotas

El factor sigma esesencial parareconocer lasregiones -10 y -35del promotor.

La transcripciónproduce 30-50nucleótidos porsegundo.


Terminación de la transcripción enprocariotas

• Secuencias terminadoras señalizan laterminación– Dependientes de rho– Independientes de rho (figura)

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Transcripción en eucariotas

• Hay varias polimerasas• Los tránscritos han de ser procesados para ser

funcionales

Molécula Localización RNA que sintetiza Sensibilidad a la

–amanitina

RNA polimerasa I nucleolo 28S rRNA, 18S rRNA, 5.8S rRNA Menor RNA polimerasa II nucleoplasma mRNA, snRNAs Mayor RNA polimerasa III nucleoplasma tRNA, 5S rRNA, snRNAs Intermedia


Transcripción de genes codificadores porla RNA polimerasa II en eucariotas

• Precursor del mRNA (pre-mRNA)

• Promotores:

– Basales: caja TATA (–25, TATAAAA), señala elpunto exacto de iniciación de la transcripción.

– Proximales: caja CAAT (–75) y caja GC (–90,GGGCGG), contribuyen a la orientación de laRNA polimerasa.

• Factores basales de transcripción (TFs) (p.e.,TFIID)

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Ensamblaje del complejo depreiniciación (PIC)

1.TFIID (subunidad de unión a la cajaTATA (TBP) + factores asociados a la TBP(TAFs)) se une a la caja TATA para formarel complejo comprometido inicial.

2.El complejo TATA-TFIID actúa como sitiode unión para la TFIIB.

3.Se unen la RNA polimerasa y el factorTFIIF, formando el complejo mínimo deiniciación de la transcripción.

4.Los factores TFIIE y TFIIH se unenformando el complejo completo deiniciación de la transcripción, tambiénllamado complejo de preiniciación (PIC).


Transcripción de genes codificadorespor la RNA polimerasa II

• Los activadores son TF que se unena secuencias intensificadoras paraestimular la transcripción.

• Los intensificadores (“enhancers”)se encuentran en copia única o enmúltiples copias. Suelen situarsecorriente arriba, pero tambiéncorriente abajo, en el mismo gen.Pueden estar a miles de pb del gen quecontrolan. También hayintensificadores en procariotas,siempre cerca de los promotores.

• Los represores son TF que se unen a las secuencias silenciadoras parareprimir la transcripción.

• Los activadores y los represores son específicos de célula y tejido, de formaque son responsables de las diferencias de expresión génica en diferentescélulas y tejidos.

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mRNA eucariota

• Secuencia líder (5’UTR)

• Secuencia codificadora: especifica la secuencia aminoacídicade la proteína codificada por el gen.

• Secuencia trailer (3’UTR): puede contener información queseñala la estabilidad de un mRNA particular.


Procesamiento RNA procariotasversus eucariotas

Procariotas Eucariotas

1º tránscrito de RNA RNA maduro pre-mRNA Transcripción + Traducción Acopladas Separadas Genes codificados (cistrones) Uno o varios (policistrónicos) Uno (monocistrónicos)

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Maduración mRNA eucariota

• Encaperuzado 5’

• Cola poli(A)

• La región codificadora contiene regionesregiones codificantes (exones) y nocodificantes (intrones) => SPLICING


Maduración mRNA eucariota

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Encaperuzado 5’

• Encaperuzado 5’: Una vez que laRNA polimerasa ha sintetizado20-30 nucleótidos de pre-mRNA,una enzima caperuzadora añadeun nucleótido de guanina. Losazúcares de los dos siguientesnucleótidos también sonmetilados.

• La caperuza 5’ estará presente enel mRNA maduro, ya que esesencial para que el ribosoma seuna el extremo 5’ del mRNA enel paso inicial de la traducción.


Cola poli(A)• Cola poli(A): Adición de 50-250

nucleótidos de adenina por unaenzima. Estabilizar el mRNA.

• En eucariotas no hay secuencias determinación, la transcripción pasadoel sitio poliA cientos o miles denucleótidos.

• Más tarde se produce un corte en elsitio poliA y la adición de la colapoli(A).

Adición de poli(A) en mamíferos

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Corte y empalme del mRNA (“mRNA splicing”)

• Los intrones típicamenteempiezan por 5’GU yacaban con AG’3

1. Corte intrón 5’2. Lazo entre el extremo 5’

libre del intrón y una A dela secuencia del punto deramificación del intrón

3. Corte intrón 3’4. Ligamiento de los exones


Spliceosoma

Spliceosomas: pre-mRNA + partículas nucleares pequeñas deribonucleoproteínas (snRNPs). snRNPs = snRNAs + 6-10 proteínas.

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Splicing alternativo

Splicing alternativo de la alfa-tropomosina


Edición del RNA• La edición del RNA consiste en la modificación del RNA maduro

después de la transcripción

• La edición del RNA debe de hacerse con precisión -> guía delRNA (gRNA)

• Muchas secuencias de mRNA de mitocondrias y cloroplastos enplantas son editadas (C-a-U).

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Ribosomas

• Ribosoma procariotas (E.coli) 70S– Subunidad 50S: 23S rRNA + 5S rRNA + 34 proteínas– Subunidad 30S: 16S rRNA + 20 proteínas

• Ribosoma eucariotas (mamíferos) 80S– Subunidad 60S: 28S rRNA + 5.8S rRNA + 5S rRNA + ~50 proteínas– Subunidad 40S: 18S rRNA + ~35 proteínas


Transcripción de genes rRNA enprocariotas

• Unidades de transcripciónde rRNA (rrn): 16S-23S-5S, con espaciadoresinternos (IS)

• RNA polimerasa -> pre-rRNA (líder + 16S-23S-5Scon IS + trailer)

• El pre-RNA se asocia conproteínas ribosomales

• RNAasa III corta el pre-RNA -> precursores 16S,23S y 5S

• Enzimas -> 16S, 23S y 5Smaduros

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Genes rRNA en eucariotas

• Unidades repetitivas del rRNA en tándem (100 o 1000 veces)– NTS-ETS-18S-ITS-5.8S-ITS-28S-ETS– Espaciador no transcrito (NTS)– Espaciador externo (ETS)– Espaciador interno (ITS)

• Como resultado de la transcripción se forman nucleolos alrededor deestas unidades, que llegan a producir 103 - 106 ribosomas

• 5S se sintetiza en otros genes


Transcripción rRNA en eucariotas• RNA polimerasa I ->

pre-rRNA.• El procesamiento del

pre-rRNA tiene lugar encomplejos formados porel pre-rRNA, 5S rRNA yproteínas ribosómicas.– Se elimina primero la

5’ ETS.– Se divide el nuevo

precursor en dosmoléculas precursorasque darán lugar al 18SrRNA por un lado, y al28S y 5.8S por el otro.

Figura. Transcripción y procesamiento del rRNA eucariota en células humanas

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Transcripción 5S rRNA en eucariotas

• RNA polimerasa III

• Se inicia al ligarse losfactores de transcripción alpromotor, región controlinterna (ICR), que seencuentra dentro de la regióntranscrita.

• La transcripción del 5Sproduce directamente 5Smaduros.


Auto corte y empalme (“auto-splicing”)• Algunos genes rRNA presentan

intrones

• El pre-rRNA se pliega formando unaestructura secundaria que promuevela eliminación del intrón:

1.El intrón es cortado en su extremo5’, al que se le añade una guanina

2.El intrón es cortado en su extremo 3’

3.Se ligan los dos exones

4.El intrón escindido forma un lazo, yse corta produciéndose además unapequeña molécula lineal

• RNA catalíticos o ribozimas

• Origen de la vida ¿DNA? ¿RNA?

Auto corte y empalme (“auto-splicing ”) de intrones en el 28S pre-rRNA de Tetrahymena

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RNA transferente (tRNA)

• Los tRNAs adquieren una forma de trébol al aparearse bases complementariasen diferentes regiones de la molécula.

• Se distinguen 4 tallos (”stems”) separados por 4 lazos (“loops”).• El lazo II, o lazo anticodón, contiene los tres nucleótidos del anticodón que se

emparejarán con los tres nucleótidos de un codón determinado en el mRNAdurante la traducción.


Transcripción tRNA

• RNA polimerasa III ->pre-tRNA

• Copia única(procariotas) o múltiple(eucariotas)

• Todos acaban en CCA• Promotores internos• Algunos genes tRNA

eucariotas presentanintrones

tRNA.Tyr

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Transcriptasa inversa

• mRNA ⇒ cDNA• En retrovirus• Sin actividad

exonucleásica 3’-5’• Ingeniería genética

(rt-PCR)

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