Tema 7: Reacciones enzimáticas multisustrato.

Nomenclatura y clasificación de mecanismos de reacción. Derivación de

la ecuación de velocidad para reacciones bisustrato.

1. Introducción. En la cinética enzimática estudiada hasta ahora hemos considerado la reacción S↔P en la que

se ha considerado solamente sustrato y un producto de la reacción, excepto la reacción

catalizada por las proteasas. Sin embargo en el conjunto de las reacciones enzimáticas este es

más bien un caso excepcional, restringido a las reacciones de isomerización. Las reacciones

más generalizadas suponen la presencia de dos o más sustratos que reaccionan para dar dos o

más productos de reacción.

En el caso de las oxidorreductasas catalizan reacciones bisustrato aunque algunas veces

podemos ver que hay tres sustratos y tres productos, por lo que en este caso sería trisustrato.

Esto ocurre porque también intervienen en la reacción los protones, solo que este sustrato se

suele despreciar porque se suele trabajar en un ambiente tampón, en el que H+ se mantiene

constante.

Otras enzimas como las transferasas e hidrolasas también son bisustrato, en éstas últimas uno

de ellos es el agua. Las liasas son de orden superior a dos pues en ella intervienen más de dos

sustratos. Por último, el grupo de las ligasas catalizan reacciones multisustrato.

Para estudiar más a fondo todas estas reacciones multisustrato se establecen distintos tipos

atendiendo al orden en el que entren estos al centro activo y a la existencia o no de formas

modificados del enzima.

El estudio cinético de este tipo de reacciones se lleva a cabo partiendo de una familia de

rectas, cada una de ellas con uno de los sustratos actuando como variable independiente y el

otro como constante. Para simplificar este estudio en las reacciones bisustrato se puede llevar

a cabo una aproximación al modelo de las reacciones monosustrato en algunos casos como

por ejemplo en las reacciones catalizadas por las hidrolasas. Esta aproximación se lleva a cabo

haciendo que uno de los sustratos este a concentración variable y otro de ellos a

concentración saturante y fija y que por tanto todo el enzima este unido a ese sustrato. De

este modo se harían dos estudios uno con concentración saturante de A y otro con

concentración saturante de B.

Esta ecuación es similar a la de Michaelis-Menten pues estamos trabajando con enzimas

michaelianos.

2. Clasificación y nomenclatura de reacciones multisustrato.

Hay un sistema de nomenclatura validado por el SEBBM que determina lo siguiente para las

especies que participan en las reacciones multisustrato. Estas reacciones se clasifican

atendiendo al número de sustratos y productos.

Se utilizan los siguientes símbolos:

Para la nomneclatura general de las reacciones en sí e indicar cuantos sustratos y productos

participan en ellas se utilizan los prefijos latinos:

Un ejemplo de Ter Ter serían las reacciones catalizadas pro las ligasas sintetasas en las que

dos compuestos se unen a expensas de la hidrólisis de ATP u otros nucleótidos trifosfato.

Para las reacciones bisustrato a lo largo de la historia se han propuesto varios sistemas de

representación de los mecanismos de estas reacciones pero el que más éxito ha tenido ha sido

el mecanismo de Cleland. Este mecanismo hace alusión al orden en el que entran los sustratos

y en el que salen los productos y a las formas enzimáticas que se forman durante el curso de la

reacción.

De acuerdo con la simbología de Cleland, la reacción se simboliza por una línea horizontal en la

que se representan mediantes flechas verticales la entrada de sustratos y salida de productos.

3. Mecanismos generales: Tipos de reacciones multisustrato.

Atendiendo a la entrada de sustratos y a la salida de productos, a la formación o no del

complejo ternario EAB y a la aparición de especies modificadas del enzima podemos

determinar los siguientes tipos de reacciones multisustrato:

Modelo secuencial o de desplazamiento simple: Se forma el complejo ternario EAB,

este a su vez puede ser:

Ordenado: La entrada de los sustratos y luego la salida de los productos se

realiza en un orden determinado. De forma que el segundo sustrato solo se

unirá al enzima si el primero está presente en el centro activo.

Al azar: Ambos sustratos pueden incorporarse al enzima independientemente

sin seguir un orden establecido, es decir, el mecanismo de la reacción no

distingue si se forma [EAB] o [EBA].

El modelo al azar sería muy similar al ordenado y solo se diferencian en el tipo de

inhibición que ejercen los productos sobre las reacciones de los sustratos.

En ambos casos el complejo ternario EAB se forma antes de liberar los productos. Sin embargo

algunas veces no se forma este complejo en las reacciones bi-bi secuencial ordenado. Este

mecanismo se conoce con el nombre de Mecanismo de Theorell-Chance y para el no existe ni

el complejo EAB ni el EPQ porque este se encuentra durante muy poco tiempo por lo que en el

momento que entra el sustrato se libera seguidamente el producto. Un ejemplo de este tipo

sería la reacción catalizada por la alcohol deshidrogenasa.

Modelo ping-pong o de doble desplazamiento: En este caso la entrada del primer sustrato

modifica el enzima formando un enzima modificado antes de la salida de los productos de

la reacción. La entrada de un segundo sustrato completa la reacción recuperándose la

enzima libre, es decir, ocurre una alternancia de entrada y salida de los sustratos y

productos de la reacción.

Un ejemplo de modelo de ping pong sería la reacción catalizada por la alanina

transaminasa. Esta transaminasa tiene como “cofactor” el PLP o piridoxal fosfato que

aparece en la forma intermediaria o de transición del enzima.

Entre las reacciones más complejas podemos encontrar por ejemplo la reacción

multisustrato tri-tri o ter-ter ping pong (Uni-uni-uni-uni-uni-uni Ping-Pong o Heza-uni Ping

Pong) sería la catalizada por la succinato tioquinasa. (EC 6.2.1.4).

Para todos los enzimas está totalmente establecido que tipo de reacción multisustrato

lleva a cabo como se indica en las diapositivas vistas en clase.

4. Estudios cinéticos y parámetros de las reacciones

multisustrato.

Obtención de datos experimentales.

El estudio cinético y la determinación de los parámetros cinéticos de las enzimas que catalizan

este tipo de reacciones se realiza a través de parámetros experimentales pero los

experimentos son algo más complicados que para enzimas monosustrato.

El procedimiento experimental para las reacciones bisustrato es utilizar combinaciones de

tubos con los sustratos A y B, con concentración fija de uno de ellos en primer lugar y luego del

otro.

Las columnas corresponden con la variación

de v con [A] variable y [B] fija. En las filas se

representa la variación de v con [B] variable

y [A] fija.

Los valores experimentales de estas velocidades iniciales se ajustan a la función doblemente

inversa como se observa en la gráfica de las diapositivas.

Aproximación al estado estacionario. Velocidades iniciales e

unidireccionales. Desplazamiento simple.

En estas reacciones intervienen los siguientes parámetros cinéticos:

y : valores máximos de velocidad y

(ambas obtenidas cuando las

concentraciones de A y B son saturantes).

y

: constante de equilibrio de

disociación de EA y EQ.

( y )

,

, y

( , , y ):constantes de Michaelis para A, B, P, Q… con la

misma definición, concentración de sustrato necesaria para que se alcance la mitad de

la velocidad máxima (1/2 Vmax).

Como existen varias Km se indica de la siguiente manera:

KmB(A) = KmA en el equilibro para concentración saturante de B.

Las reacciones bisustrato siguen, al igual que las monosustrato, una misma ley de velocidad

inicial. En ellas se dan condiciones de estado estacionario lo que corresponde a una situación

de velocidad inicial y unidireccional siguiendo las siguientes ecuaciones, una de ellas para los

sustratos (v1) y otra ecuación para los productos (v2).

Si en la siguiente ecuación llevamos a cabo el procedimiento aplicado en las diapositivas y

tenemos en cuenta que tanto la concentración de A como la de B tienden al infinito, ésta se

simplificaría y quedaría de la siguiente forma, pareciéndose mucho a la ecuación de Michaelis-

Menten:

Lo mismo se haría para ,

y .

Aplicando la nomenclatura de Cleland para la denominación de los distintos parámetros

cinéticos, las ecuaciones de velocidad anteriores se escribirían:

Esta ecuación se obtendría con el método de King-Altman que se desarrollará en otra parte del

tema pero su representación gráfica sería la siguiente:

El valor de las constantes del cuadrado se puede despreciar para deducir la ecuación de

velocidad general ya que se establecen equilibrios rápidos entre E y EA por un lado y E y EB por

otro, por lo que se puede deducir que la constante de equilibrio de disociación del complejo

EAB sería la Kcat que determina toda la reacción pues es el paso más lento y limitante de esta.

Por tanto la ecuación de velocidad general quedaría como:

Pero la concentración de esta especie enzimática no la podemos determinar

experimentalmente por lo que lo de tenemos que dejar en función de otras especies

enzimáticas de las que si podamos determinar su concentración.

V=Kcat[EAB] = f ([Eo], [E], [A],etc)

Determinación de parámetros cinéticos.

Para obtención de los parámetros cinéticos se utiliza la ecuación de Lineweaver-Burk (Ecuación

de inversos).

El paso siguiente corresponde a la consideración de la [A] fijo o [B] fijo, quedando las

siguientes ecuaciones:

o

Si tomamos como ejemplo la primera ecuación en la que las distintas [B] sean fijas,

obtendremos una familia de rectas en la representación primaria, en la que representamos el

inverso de la velocidad frente al inverso de la [A]. Obtendremos la siguiente gráfica de la que

se pueden deducir el valor de la pendiente y del punto de intersección con el eje de abcisas.

A continuación se llevaran a cabo las distintas representaciones secundarias donde cada recta

tendrá un valor de la pendiente y del punto de intersección dependiendo de la concentración

de [B] fija. Estas representaciones nos permitirán obtener los diferentes parámetros cinéticos

(Km y Vmax).

Las representaciones secundarias corresponden a la representación de las rectas de los valores

de la pendiente y de intersección con el eje y de la

representación primaria.

Primero se mostrará la representación para la

ordenada en el origen.

Esta recta a su vez tiene una pendiente, un punto de

intersección con el eje y otro con el eje x. Del punto

de intersección con el eje y se puede obtener la

velocidad máxima y del punto de corte con el eje x la

Km.

Como el valor de y para el punto de corte con el eje x vale 0, se simplifica la ecuación

quedando de la siguiente manera:

El siguiente paso es la representación de la ecuación de la pendiente.

En este caso, como ya tenemos el valor de la Km(B) calculada a partir de la ecuación del punto

de intersección y la velocidad máxima, podemos hallar la Km(A). Con el valor de la pendiente

calculamos por último el valor de la Ks(A).

Otra forma de deducir el último parámetro (Ks(A)) sería mediante la representación primaria, a

través del punto de corte de las distintas rectas, como se puede apreciar en el gráfico que

aparece en la parte correspondiente a esta representación.

Aproximación al estado estacionario. Velocidades iniciales e

unidireccionales. Doble Desplazamiento.

El mecanismo de doble desplazamiento conocido como Ping-Pong obedece a una forma

simplificada de la ley general de velocidad inicial ya que carece del término independe de

concentraciones del denominador. Obteniéndose las siguientes ecuaciones:

Esto lo que permite es diferenciar gráficamente ambos mecanismos en base a sus

representaciones primarias, ya que dichos mecanismos se distinguen de los secuenciales

porque en dichas representaciones son haces de rectas paralelas. Esto se consigue gracias a la

aplicación de la ecuación de Lineweaver-burk como se ve en la siguiente gráfica.

Igual que en el mecanismo secuencial se obtienen dos ecuaciones, una de ellas para la

pendiente y otra para la intersección con el eje y que se utilizaran para obtener los parámetros

cinéticos en la representación secundaria.

Estas ecuaciones serían:

La representación secundaria sería una sola debido a lo citado anteriormente de que este

mecanismo sigue un modelo simplificado:

Del punto de intersección se obtiene el valor de la velocidad máxima que se utilizará tanto

para obtener la Km(B) en la ecuación de la pendiente de la representación secundaria como la

Km(A) en la ecuación de la pendiente de la representación primaria. El valor de Km(B) se puede

obtener tanto con el valor de la velocidad máxima como con el punto de corte con el eje x.

Todo este procedimiento tanto para el mecanismo secuencial como para el mecanismo Ping-

Pong, se ha llevado a cabo considerando la concentración de B fija por lo que habría que

repetir el mismo procedimiento considerando fija la concentración de A, obteniendo los

correspondientes parámetros cinéticos.

Inhibición por productos.

El tipo de inhibición de los productos P y Q sobre los sustratos A y B permite diferenciar si un

tipo de mecanismo secuencial es ordenado o al azar como se puede ver en la siguiente tabla:

Los mecanismos cinéticos, aunque a veces son tediosos por el número de datos a manejar,

pueden ayudarnos a comprender propiedades locales de los enzimas. Estas propiedades son

necesarias para entender la responsabilidad de la regulación en un enzima en una

determinada vía metabólica. En la siguiente tabla se resumen los mecanismos conocidos para

algunos enzimas.

Bibliografía:

NUÑEZ DE CASTRO I. Enzimología. Ediciones Pirámide, Madrid, 2001.

SEGEL I.H. Enzyme Kinetics: Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State

Enzyme Systems. Wiley-Interscience, New York, 1993.

JESÚS V. JORRÍN NOVO. Reacciones enzimáticas multisustrato. Nomenclatura y clasificación de

mecanismos de reacción. Derivación de la ecuación de velocidad para reacciones bisustrato.

Bioquímica y Proteómica Vegetal y Agrícola. Departamento de Bioquímica y Biología

Molecular. Universidad de Córdoba.