UNIVERSIDAD CENTROAMERICANA FACULTAD DE CIENCIA, TECNOLOGÍA Y AMBIENTE

Determinación y cuantificación mediante HPLC de los ácidos carboxílicos del mucílago de Coffea arabica a diferentes pH

durante la etapa de fermentación

Tesis para obtener el Título de Ingeniero en Calidad Ambiental

AUTOR: Roberto Rivas Hermann

Tutor: MSc. Carlos Vallejos

Asesora: Dra. Susan Jackels

Managua, Nicaragua

Septiembre, 2006

CONTENIDO

RESUMEN/ ABSTRAC

1 INTRODUCCIÓN

2 OBJETIVOS

3 MARCO TEÓRICO

4 MARCO METODOLOGICO

5 RESULTADOS

6 DISCUSIÓN

7 CONCLUSIONES

8 RECOMENDACIONES

9 BIBLIOGRAFÍA

10 ANEXOS

Índice de tablas

TABLA 1 .COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL CAFÉ VERDE TABLA 2 - COMPARACIONES ENTRE DISTINTOS TIPOS DE DETECTORES TABLA 3 - MONTAJE EXPERIMENTAL TABLA 4 - VARIABLES E INDICADORES TABLA 5 - IDENTIDAD DE LOTE PROCESADO, FECHA DE RECOLECCIÓN DE MUESTRA Y FECHA DE

CONCLUSIÓN DEL EXPERIMENTO TABLA 6 - MATERIALES Y EQUIPOS UTILIZADOS DURANTE LA FASE DE LABORATORIO (ETAPA DE EXTRACCIÓN

DE ÁCIDOS CARBOXÍLICOS Y DE MONITOREO RÁPIDO CON REFLECTOQUANT) TABLA 7 - CONDICIONES DE ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO TABLA 8 - CARACTERÍSTICAS DE LOS ÁCIDOS CARBOXÍLICOS UTILIZADOS COMO ESTÁNDARES TABLA 9 - CONDICIONES DE ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO PARA EL ANÁLISIS CUALITATIVO (TIEMPOS Y ORDEN

DE ELUSIÓN DE ÁCIDOS CARBOXÍLICOS) TABLA 10 - MUESTRAS CON QUE SE REALIZÓ EL ANÁLISIS CUALITATIVO TABLA 11 - MUESTRAS UTILIZADAS PARA EL ANÁLISIS CON HPLC TABLA 12 - INSTRUMENTO PARA LA RECOLECCIÓN DE DATOS TABLA 13 - ORDEN DE ELUSIÓN DE ÁCIDOS CARBOXÍLICOS, ANÁLISIS CUALITATIVO TABLA 14 - PICOS EN LOS CROMATOGRAMAS Y ÁCIDOS CARBOXÍLICOS A LOS QUE CORRESPONDEN TABLA 15 - TIEMPOS DE RETENCIÓN PARA LOS ÁCIDOS UTILIZADOS EN LA ELABORACIÓN DE LA CURVA DE

CALIBRACIÓN TABLA 16 - CONDICIONES DE DILUCIÓN DE ESTÁNDARES PARA LA ELABORACIÓN DE LA CURVA DE

CALIBRACIÓN TABLA 17 - LÍMITES DE DETECCIÓN DEL MÉTODO PARA CADA ÁCIDO TABLA 18 - MATRIZ DE RESULTADOS PARA ÁCIDO GALACTURÓNICO TABLA 19 - MATRIZ DE RESULTADOS PARA ÁCIDO FÓRMICO TABLA 20 - MATRIZ DE RESULTADOS PARA ÁCIDO MÁLICO TABLA 21 - MATRIZ DE RESULTADOS PARA ÁCIDO ACÉTICO TABLA 22 - MATRIZ DE RESULTADOS PARA ÁCIDO CÍTRICO TABLA 23 - MATRIZ DE RESULTADOS PARA ÁCIDO PROPIÓNICO TABLA 24 - TABLA DE DATOS PARA ANÁLISIS ESTADÍSTICO ENTRE GRUPOS, ÁCIDO GALACTURÓNICO TABLA 25 - TABLA DE DATOS PARA ANÁLISIS ESTADÍSTICO ENTRE GRUPOS, ÁCIDO FÓRMICO TABLA 26- TABLA DE DATOS PARA ANÁLISIS ESTADÍSTICO ENTRE GRUPOS, ÁCIDO MÁLICO TABLA 27- TABLA DE DATOS PARA ANÁLISIS ESTADÍSTICO ENTRE GRUPOS, ÁCIDO ACÉTICO TABLA 28- TABLA DE DATOS PARA ANÁLISIS ESTADÍSTICO ENTRE GRUPOS, ÁCIDO CÍTRICO TABLA 29- TABLA DE DATOS PARA ANÁLISIS ESTADÍSTICO ENTRE GRUPOS, ÁCIDO PROPIÓNICO

TABLA 30 - PRUEBAS DE NORMALIDAD PARA LOS DATOS DE COMPARACIONES ENTRE GRUPOS DE PH

(CONFIGURACIÓN ANOVA 1 VÍA) TABLA 31 - PRUEBA DE LEVENE PARA MUESTRAS A LAS QUE SE REALIZARÍA LA PRUEBA ANOVA TABLA 32 - RESULTADOS PRUEBA ANOVA DE UNA VÍA TABLA 33- RESULTADOS DE LA PRUEBA KRUSKALL WALLIS PARA ÁCIDO MÁLICO Y PROPIÓNICO TABLA 34 - PRUEBA DE LA MEDIANA TABLA 35- DATOS PARA ANÁLISIS ESTADÍSTICO ENTRE GRUPOS Y ENTRE EXPERIMENTOS (ANOVA 2 VÍAS) TABLA 36 - RESULTADOS PRUEBA ANOVA DE 2 VÍAS TABLA 37 - DATOS DE REFLECTOQUANT PARA EL ANÁLISIS ESTADÍSTICO ENTRE GRUPOS TABLA 38 - PRUEBAS DE NORMALIDAD PARA LOS DATOS DE COMPARACIONES ENTRE GRUPOS DE PH

(CONFIGURACIÓN ANOVA UNA VÍA) TABLA 39 - RESULTADOS PRUEBA ANOVA DE UNA VÍA PARA DATOS DE REFLECTOQUANT TABLA 40 - PRUEBA DE CONTRASTES PARA ANOVA UNA VÍA, DATOS DE REFLECTOQUANT TABLA 41 - DATOS DE REFLECTOQUANT PARA EL ANÁLISIS ESTADÍSTICO ANOVA DOS VÍAS, Á. MÁLICO Y Á.

LÁCTICO TABLA 42 - RESULTADOS PRUEBA ANOVA DE 2 VÍAS PARA RESULTADOS DE REFLECTOQUANT TABLA 43- LISTA DE ARCHIVOS DE CROMATOGRAMAS DE MUESTRAS Y EL PATRÓN INTERNO QUE SE

UTILIZARON PARA DETERMINAR LOS ÓRDENES DE ELUSIÓN TABLA 44 - LISTA DE ARCHIVOS CROMATOGRAMAS UTILIZADOS PARA LA ELABORACIÓN DE LA CURVA DE

CALIBRACIÓN TABLA 45- MATRIZ DE CONCENTRACIONES DETERMINADAS PARA LOS ÁCIDOS MÁLICO Y LÁCTICO MEDIANTE

REFLECTOQUANT ®

Índice de figuras

FIGURA 1 - SECCIÓN LONGITUDINAL DEL CAFÉ CEREZO FIGURA 2 - CONSTITUCIÓN DEL TEJIDO DE PERICARPIO DE COFFEA ARABICA VAR. TYPICA CRAMER.

EXAMINACIÓN POR MICROSCOPÍA LUEGO DE FERMENTACIÓN (20 H) FIGURA 3 - DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESAMIENTO DE CAFÉ POR LA VÍA HÚMEDA FIGURA 4 – ESTRUCTURA DEL MUCÍLAGO Y DEL PERGAMINO ANTES DE LA FERMENTACIÓN FIGURA 5 - COMPORTAMIENTO DEL PH EN FUNCIÓN DEL TIEMPO DE FERMENTACIÓN FIGURA 6 - CROMATOGRAFÍA DE ELUSIÓN FIGURA 7 - COMPONENTES DEL SISTEMA DE HPLC FIGURA 8 - DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO EXPERIMENTAL, FINCA LA CANAVALIA FIGURA 9 - SEPARACIÓN DE GRANOS DE CAFÉ DE ACUERDO A SU ESTADO DE MADUREZ FIGURA 10 - RECIPIENTES DE FERMENTACIÓN DEL CAFÉ FIGURA 11 HOJAS DE DATOS UTILIZADAS PARA EL CONTROL EXPERIMENTAL DE LOTES DE CAFÉ EN LA FASE

EXPERIMENTAL FIGURA 12- DIAGRAMA DE FLUJO DE LA FASE DE LABORATORIO FIGURA 13- MÓDULOS DEL SISTEMA HPLC UTILIZADOS EN LA PRESENTE INVESTIGACIÓN FIGURA 14 - ÁCIDO PIRAZINCARBOXÍLICO (PATRÓN INTERNO) FIGURA 15 - CURVA DE CALIBRACIÓN PARA EL ANÁLISIS POR EL MÉTODO DEL PATRÓN INTERNO FIGURA 16 - DEFINICIONES DEL LÍMITE DE DETECCIÓN DEL MÉTODO (MDL) FIGURA 17 - CURVA DE CALIBRACIÓN PARA ÁCIDO GALACTURÓNICO FIGURA 18 - CURVA DE CALIBRACIÓN PARA ÁCIDO FÓRMICO FIGURA 19 - CURVA DE CALIBRACIÓN PARA ÁCIDO MÁLICO FIGURA 20 - CURVA DE CALIBRACIÓN PARA ÁCIDO LÁCTICO FIGURA 21 - CURVA DE CALIBRACIÓN PARA ÁCIDO ACÉTICO FIGURA 22 - CURVA DE CALIBRACIÓN PARA ÁCIDO CÍTRICO FIGURA 23 - CURVA DE CALIBRACIÓN PARA EL ÁCIDO PROPIÓNICO FIGURA 24 - GRÁFICOS “CAJAS DE PUNTOS” O BOXPLOTS PARA DETERMINAR PUNTOS ABERRANTES DENTRO

DE LOS DATOS DE CADA GRUPO PARA CADA ÁCIDO FIGURA 25 - COMPORTAMIENTO DE LAS CONCENTRACIONES DE ÁCIDO MÁLICO Y ÁCIDO LÁCTICO A MEDIDA

QUE AVANZA EL PROCESO DE FERMENTACIÓN, DATOS DE REFLECTOQUANT FIGURA 26- COMPORTAMIENTO DE LAS CONCENTRACIONES PROMEDIO DE LOS ÁCIDOS ANALIZADOS EN

DEPENDENCIA DEL PH FIGURA 27 -CONCENTRACIONES DE ÁCIDOS ORGÁNICOS CONFORME AVANZA EL PROCESO FERMENTATIVO FIGURA 28 - GRÁFICOS DE CAJAS “BOXPLOTS”, ANÁLISIS ANOVA 2 VÍAS ENTRE EXPERIMENTOS

FIGURA 29 - GRÁFICA Y TABLA CON EL COEFICIENTE DE CORRELACIÓN PARA ÁCIDO MÁLICO, TÉCNICA DEL

REFLECTOQUANT Y HPLC FIGURA 30 - CONCENTRACIONES DE ÁCIDO LÁCTICO A MEDIDA QUE DISMINUYE EL PH EN QUE SE

INTERRUMPE LA FERMENTACIÓN FIGURA 31 - GRÁFICA Y TABLA CON EL COEFICIENTE DE CORRELACIÓN PARA ÁCIDO LÁCTICO. FASE

EXPERIMENTAL Y FASE DE LABORATORIO FIGURA 32 - GRÁFICA Y TABLA DE CORRELACIÓN (PEARSON) PARA LOS DATOS DE PH MEDIDOS EN LA FASE

EXPERIMENTAL CON EL SISTEMA REFLECTOQUANT Y CON CINTAS INDICADORAS FIGURA 33- GRÁFICA Y TABLA DE CORRELACIÓN (PEARSON) ENTRE LAS MEDICIONES DE PH, FASE

EXPERIMENTAL Y FASE DE LABORATORIO FIGURA 34 - LOCALIZACIÓN DE LA FINCA LA CANAVALIA FIGURA 35- MAPA DE USO DEL SUELO EN LA FINCA LA CANAVALIA.

Dedicatoria

A mis padres Geovannie y Abelardo por el apoyo incondicional durante todos

estos años

Agradecimientos

Esta investigación no hubiera sido posible sin la motivación de los profesores

Susan Jackels (Seattle University) y Charles Jackels (University of Washington)

quienes iniciaron el proyecto solidario “Café para la justicia - Coffee for Justice”.

Agradezco al Profesor Carlos Vallejos (Universidad Centroamericana) por el

asesoramiento y el trabajo conjunto durante toda la investigación.

Todas las personas con quienes trabajé en esta larga tarea: el personal de la finca

La Canavalia - ADDAC y al personal de Seattle University.

A la Facultad de Ciencia, Tecnología y Ambiente (Universidad Centroamericana)

por mantener lazos de intercambio con Universidades hermanas, lo cual permite y

permitirá que otros estudiantes participen en proyectos como éste.

Resumen/ Abstract

En la fermentación del café (Coffea arabica) procesado por vía húmeda, la degradación por parte de la microflora (bacterias y levaduras principalmente) de azúcares constituyentes del mucílago va acompañada de un aumento progresivo de ácidos carboxílicos y por consiguiente de una caída del pH. Estos ácidos se han relacionado con la aparición por un lado de "malos sabores" o por otro lado de "notas de sabor" en las muestras catadas profesionalmente. Para conocer la influencia que tendría la interrupción de la fermentación a diferentes pH en las concentraciones de dichos ácidos se realizaron tratamientos a muestras de Coffea arabica, variedad caturra, recolectadas y procesadas en la finca La Canavalia (San Ramón, Matagalpa) durante la temporada 2005-2006, posteriormente se cuantificaron los ácidos carboxílicos mediante Cromatografía Líquida de alto Desempeño (HPLC). Se comprobó que a medida que avanza el proceso fermentativo algunos ácidos muestran tendencias de aumento en sus concentraciones, sin embargo no se identificaron diferencias remarcables entre los grupos de tratamiento, esto debido a las diferencias inherentes a cada lote experimental.

Palabras claves: Coffea arabica, procesamiento húmedo, fermentación, mucílago, HPLC, ácidos carboxílicos

The fermentation of Coffea arabica during the wet processing method is originated by the consumption of sugars within the mucilage by micro flora. As a result, the concentration of carboxilic acids increases and thus the pH falls. At some concentrations these carboxilic acids are related to the apparition of "off-flavors" or "flavor notes". With the aim of know which would be the relationship among the stage of fermentation and the concentration of these acids, coffee samples (Coffea arabica, var. caturra) of La Canavalia farm (San Ramón, Matagalpa) were processed during the harvest season 2005-2006 and their fermentation interrupted at different pH. Then the concentration of representative carboxilic acids was analyzed by HPLC. Although the statistical tests didn't show clearly differences among treatments, a pattern in the increasing and decreasing concentration of some acids was obtained. Differences among experimental batches might be a cause for such a lack of clearly defined differences among groups.

Key words: Coffea arabica, wet processing, fermentation, mucilage, HPLC, carboxilic acids

1 INTRODUCCIÓN

La reciente “crisis” originada por el colapso del mercado mundial del café ha

causado severas condiciones económicas para los productores de café en países

productores, incluyendo Nicaragua. Como resultado, muchos productores de café

desean mejorar la calidad y consistencia de su café con el propósito de tener

acceso a los mercados de café especiales.

En Nicaragua los productores cultivan Coffea arabica y lo procesan por medio del

beneficiado húmedo en el cual es crucial la etapa de fermentación. Para

determinar cuál es el punto idóneo para interrumpir la fermentación mediante el

“lavado” del café los productores utilizan un método tradicional, éste no es preciso

para determinar cuándo el café se ha sobrefermentado. El tiempo de fermentación

juega un papel crucial: una sobrefermentación produce café con sabores

desagradables, una sub-fermentación redundaría en café pergamino con

remanentes de mucílago.

El conocimiento teórico de la química de la fermentación es clave para la

propuesta de un método alternativo para predecir cuándo interrumpirla. Los

últimos estudios plantean que el mucílago es separado del café pergamino

(parénquima) principalmente por los cambios en su pH a lo largo del tiempo de

fermentación (Avallone et al, 2001a). Por esta razón se considera que el pH

tendría una funcionalidad muy importante para predecir cuándo interrumpir la

fermentación (Puerta-Quintero, 1999, 2001).

Si bien se sabe que estos cambios de pH son el resultado de un aumento gradual

en la concentración de ácidos carboxílicos producidos por microorganismos resta

por investigarse qué consecuencias tendría la interrupción de la fermentación del

mucílago a un pH específico sobre la formación de ácidos carboxílicos

característicos de sabores desagradables en el café.

El propósito de esta investigación es responder a esta pregunta mediante la

identificación y la cuantificación de algunos ácidos carboxílicos del mucílago del

café a diferentes etapas de su fermentación (grupos experimentales). Para

identificar y cuantificar los ácidos carboxílicos se utilizó la técnica Cromatografía

Líquida de alto Desempeño (HPLC1). Como técnica de control se utilizó el sistema

espectrofotométrico de campo, Reflectoquant, para medir las concentraciones de

ácido láctico y ácido málico.

Mediante HPLC se lograron identificar seis ácidos carboxílicos: galacturónico,

málico, propiónico, cítrico, acético y fórmico. El ácido láctico solamente se

identificó con el sistema Reflectoquant.

Los análisis de los resultados no arrojaron diferencias significativas de importancia

entre las concentraciones de ciertos ácidos entre los grupos. Excepciones a esto

fueron los ácidos málico y láctico.

Puesto que esta investigación se enmarca dentro del proyecto Café por la Justicia

(Coffee for Justice), los resultados de esta tesis fueron retomados por

investigadores de ese proyecto para establecer correlaciones con los puntajes

obtenidos por las mismas muestras en una catación profesional de café

(Jackels et al, 2006).

1 HPLC: siglas internacionalmente reconocidas para la Cromatografía Líquida de Alto Desempeño,

provienen del inglés High Performance Liquid Chromatography.

De forma paralela a los experimentos controlados de las muestras cuyas

concentraciones en ácidos carboxílicos se determinaron, el equipo de Café por la

Justicia distribuyó 100 kits a igual número de productores. Estos kits contenían lo

necesario para que sus usuarios experimentaran la interrupción de la fermentación

en sus lotes de café a diferentes pH: se comparó el pH con que normalmente

interrumpen la fermentación (mediante el método tradicional) con una interrupción

a un pH cercano a 4,6. Los resultados también fueron catados por un equipo

profesional (Jackels et al, 2006).

Con ambas experiencias los productores de café se beneficiarán de un método de

evaluación sencillo para lograr uniformidad en el procesamiento del café en la

finca, especialmente en el paso de fermentación. La consistencia y calidad en la

producción de café pergamino ayudará en la comercialización internacional del

café orgánico de las fincas de pequeños productores de Matagalpa.

2 OBJETIVOS

2.1 GENERAL

Identificar los principales ácidos carboxílicos del mucílago de café (Coffea arabica)

en dependencia del pH en el cual se interrumpe su fermentación.

2.2 ESPECÍFICOS

• Determinar cualitativamente la presencia de ácidos carboxílicos en las

muestras de mucílago de café (Coffea arabica) para diferentes pH de

interrupción de la fermentación.

• Cuantificar las concentraciones de los ácidos carboxílicos identificados en

el mucílago de café (Coffea arabica) para diferentes pH de interrupción de

la fermentación.

• Establecer las relaciones estadísticas entre los ácidos carboxílicos

cuantificados en el mucílago de café (Coffea arabica) y las diferentes

etapas en que se interrumpe su fermentación.

3 MARCO TEÓRICO

3.1 EL MERCADO INTERNACIONAL DEL CAFÉ

3.1.1 De la producción a la oferta en el mercado internacional del café

El café es una bebida “moderna” cuya masificación surgió a raíz de la revolución

industrial (Daviron y Lerin, 1990). Secunda al petróleo en cuanto al producto

comercial con más intercambios a nivel mundial ya que los ingresos por sus

ventas exceden anualmente los 70 billones de dólares estadounidenses. Se

estima que el 75 % de sus 25 millones de productores, están catalogados como

pequeños productores (Brown, 2004).

Dos especies de café se cultivan para ser comercializadas: (a) El Arábica (Coffea

arabica) principalmente en Brasil, Colombia, México, Centroamérica, Perú y al

este de África. Tiene un sabor menos amargo que Robusta, más acidez y más

cuerpo. (b) El Robusta (Coffea canephora) principalmente en Brasil, Indonesia,

Uganda, Costa de Marfil e India. Tiene un sabor fuerte, amargo y menos acidez

(Nestlé, 2004).

Desde el año 2000, la producción mundial de café alcanza anualmente más de

110 millones de sacos de 60 kg. Geográficamente la producción se reparte de la

siguiente forma: 47% en América del Sur, 25 % en los países de Asia/ Pacífico,

15% en América Central y un 13% en África. Nicaragua aporta el 1,23 % de la

producción mundial. La mayor parte del café producido se exporta hacia los países

occidentales. (Voituriez, 2005).

3.1.2 La crisis internacional del café

La sobreproducción mundial de café, la puesta en el mercado de grandes

cantidades de café de baja calidad y las ligeras caídas en la demanda de café han

sido causas importantes de la crisis económica más grande del comercio mundial

de café. Al momento más fuerte de su caída, los precios perdieron el 64% de su

valor en dos años. Entre 1996 y el 2001, la libra de café “verde” pasó de 130 a 42

centavos de dólar. Esto no había acontecido en más de 30 años (Voituriez, 2005;

Brown, 2004; OI, 2002).

Esta crisis ha debilitado las economías de los países que dependían en gran

medida de los ingresos por la venta de café. En América Central el café puede

aportar entre el 2% y el 8% del PIB y representa cerca de un millón de empleos

(Varangis et al, 2003). En Nicaragua, alrededor de 30 000 familias poseen fincas

de café, esto redunda en empleos para 150 000 – 200 000 familias (IICA, 2004;

Gómez, 2005).

Además de importantes consecuencias para los grandes y los medianos

productores, la precariedad ha recaído principalmente sobre los pequeños

productores de café, quienes han tenido que disminuir sus gastos en salud,

educación y en la canasta básica (Varangis et al, 2003; OI, 2002, 2003).

3.1.3 Perspectivas y recomendaciones para afrontar posibles futuras crisis

Luego del año 2004, los precios están en alza: un 36% con relación a los del 2001

y 20% con relación a los del 2003 (Voituriez, 2005). La constitución de reservas

importantes de café en los países importadores, muestra que hay una tendencia

de alzas en los precios. Sin embargo todo el optimismo se debe dejar a un lado

puesto que el mercado de café a mostrado a lo largo del tiempo que es

susceptible a fluctuaciones imprevisibles y a consecuencias catastróficas (Brown,

2004; OI, 2003).

Como estrategias para evitar que crisis similares impacten nuevamente a los

pequeños productores, se han propuesto: la promoción del consumo del café en

países productores y países de economías emergentes, la diversificación de

producción agrícola y la producción de cafés especiales (Scholer, 2004; Varangis

et al, 2003; OI, 2002, 2003).

Se ha planteado que en Nicaragua, la producción de cafés especiales y la

posterior certificación de estos (Café orgánico, Café Comercio Justo, Café de

Sombra, Café producido amigablemente con las aves) por parte de los pequeños

productores podría mejorar sus condiciones de vida en las zonas cafetaleras de

Matagalpa y Jinotega (CRS, 2004, Varangis et al, 2003). Sin embargo, grandes

esfuerzos deben hacerse para mejorar la calidad del café producido y obtener

dichas certificaciones (van Hilten et al, 2002).

3.2 EL CAFÉ: UN GRANO COMPLEJO

3.2.1 Botánica

La planta de café pertenece al género Coffea de la familia Rubiacea. De acuerdo a

Belitz y Grosch (1999) y a Wood (1998) se han censado alrededor de 70 especies

de café, sin embargo solamente tres se cultivan: Coffea arabica, la cual provee el

75% de la producción mundial, C. canephora, alrededor del 25% y C. liberica y

otros, con menos de 1%.

A pesar que la presencia de estas especies está confinada a las regiones

tropicales (Daviron y Lerin, 1990), Coffea arabica se cultiva en altitudes

comprendidas entre 800 y 2000 m bajo temperaturas templadas, al contrario de C.

robusta la cual puede crecer a altitudes inferiores a los 800 m.

Luego del cultivo en viveros, las plantas jóvenes son sembradas al inicio de la

época lluviosa. Además de recomendarse un suelo fértil y con pH superior a 5.5,

otros factores ambientales afectan al cafeto: la disponibilidad de agua, la

iluminación, la ventilación, los fuertes vientos y las sequías (Wood, 1998).

Luego de la siembra hay que esperar hasta 3-4 años para que los frutos empiecen

a producirse, se espera un rendimiento de productividad máximo de 10-15 años.

En edad adulta, la altura de la planta puede variar entre 3 a 12 m dependiendo de

la especie, sin embargo se trata de mantenerla entre 2-2.5 m para facilitar la

recolección (Sánchez-Martín, 2005).

3.2.2 Estructura del grano de café

La planta del café produce flores blancas y a partir de ellas se forman los frutos en

una drupa de 1.5 cm aproximadamente (Figura 1). La drupa está recubierta por un

exocarpio o piel que es verde en un inicio, posteriormente cambia a color amarillo,

algo más tarde se torna roja, paso previo al color carmesí que adquiere en la

madurez completa (esta es la razón por la que se le conoce como cereza o uva),

algunas variedades maduran a color amarillo (Guharay et al, 2000). De acuerdo a

Avallone et al (1999) el exocarpio consiste en una capa de pequeñas células

epidérmicas (~10 x 30 µm).

De acuerdo a Belitz y Grosch (1999), el pericarpio exterior encierra un mesocarpio

(15 a 25% masa/masa de la fruta). Este mesocarpio se divide en un mesocarpio

exterior de color amarillezco (pulpa) y un mesocarpio interior (mucílago) con un

contenido de pectinas 1,9 veces inferior al de la pulpa (García et al, 1991).

El endocarpio también se conoce como pergamino, es de color amarillezco o de

color grisáceo-verdoso (cascarilla), en el interior de estas estructuras se encuentra

el grano de café propiamente dicho, este consiste por lo general de dos

hemisferios elípticos, pegados por su parte plana. Cada grano está recubierto por

una fina membrana de tonalidad plateada. Otras veces, 10-15% de las cerezas

solamente tienen un grano esférico (caracolillo).

Una presentación más clara sobre la estructura de este conjunto de capas

(pericaripio) así como sus anchuras promedio y la forma de las células que las

conforman se presenta en la Figura 2.

Figura 1 - Sección longitudinal del café cerezo

Adaptado de: Avallone et al (2000). Figura 2 - Constitución del tejido de pericarpio de Coffea arabica var. typica cramer. Examinación por microscopía luego de fermentación (20 h).

Las células que conforman la piel tienen una anchura de 10 x 30 µm, la pulpa tiene un espesor de 1 mm, el mucílago 300 µm. El pergamino por su parte tiene una anchura de 50-110 µm, este último está conformado por esclerénquimas transversales (~25 µm) y esclerénquimas longitudinales (~150 x 25 µm). Adaptado de: Avallone et al (1999).

3.2.3 Composición química del café verde

Flament (2001) compila los resultados más importantes en la investigación sobre

los constituyentes del café. Tal como lo comentan Merrit et al (1970) la

composición del grano de café verde es muy compleja, pero básicamente consta

de celulosas, lignina, grasas, cenizas, sacarosa, ácido clorogénico y proteínas.

Importantes investigaciones se han hecho para identificar compuestos químicos

precursores del sabor en el café verde, sin embargo las investigaciones más

importantes se han realizado en el café tostado (Belitz y Grosch, 1999).

Los constituyentes químicos del grano del café, son los que en última instancia

determinarán la calidad de la taza de café. Los factores que determinan estas

diferencias en composición todavía no se comprenden en su totalidad, sin

embargo es un hecho que entre estos factores se pueden nombrar: las variedades

cultivadas, el proceso post-cosecha, la sombra y la altitud (Decazy et al, 2003).

Belitz y Grosch (1999) consideran que el café verde está compuesto por una

buena parte de extracto soluble en agua, lípidos, azúcares, sacarosa, fibra cruda,

ácidos cítrico, málico, oxálico y clorogénicos, cafeína, trigonelina y minerales

(Tabla 1).

Tabla 1 .Composición química del café verde.

COMPONENTE CANTIDAD (% en extracto seco)

Extracto acuoso 29.0-36.2 Proteína bruta 8.7-12.2 Grasa 8.3-17.0 Azúcares reductores (Expresados como glucosa) 0-0.5 Azúcares reductores (Expresados como sacarosa)

2-9

Sacarosa 6-7 Fibra bruta 10-11.7 Acido cítrico 0.5-1.15 Acido málico 0-0.5 Acido oxálico < 0.2 Ácidos clorogénicos 4.5-11-1 Cafeína 0.9-2.6 Trigonelina 0.24-1.2 Minerales 3.0-5.4 Fuente: Belitz y Grosch (1999).

3.2.4 Características organolépticas del café

Puerta-Quintero (1996) explica que en la evaluación sensorial de la calidad de los

alimentos se usa el método de calificación por medio de escalas que describen las

categorías para cada característica del producto, esto se denomina método

descriptivo cuantitativo. Los laboratorios de catación de café analizan en base a

estas escalas una serie de parámetros complejos (aroma del café molido, aroma

de la bebida, la acidez, el amargo, el cuerpo, impresión global o sabor),

posteriormente a estos parámetros se les aplican técnicas de estadística: análisis

multivariado, distribución de frecuencias y perfiles de la taza de café para obtener

una valoración global del lote de café.

La relación entre la calidad de la taza de café y los constituyentes químicos del

grano pasan por la línea del análisis sensorial (Ojijo, 1993). Lo importante es que

evaluaciones de ese tipo se realizan gracias a técnicas sensoriales cuya base

envuelve tanto la percepción del aroma en el epitelio olfativo gracias a los

constituyentes químicos notablemente olorosos, como el sabor que se detecta en

la cavidad oral por los constituyentes físico-químicos de la bebida.

El objetivo de esta sección no es la mera compilación de listas, sino relacionar los

compuestos censados por la literatura en el café verde como precursores a otros

sabores en el café tostado, aquellos sabores que imparten las notas de sabores

claves en las evaluaciones de calidad de la taza.

Se hace énfasis en las contribuciones de los ácidos carboxílicos, por ser estos el

objeto de investigación en esta tesis.

3.2.4.1 Notas aromáticas comunes en el café y sus orígenes químicos o sustancias asociadas

Es importante destacar que la mayoría de las investigaciones con base en la

química sensorial del café se han realizado teniendo en cuenta el café tostado

(Holscher et al, 1990). Sin embargo, no hay que olvidar que los compuestos

químicos del café tostado tienen su origen en el café verde, por ello,

Merrit et al (1970) clasifican los compuestos precursores de compuestos volátiles

en el café tostado en los siguientes grupos: hidrocarburos, aldehídos, cetonas,

éteres, compuestos heterocíclicos, sulfurosos y aromáticos.

En el café, la complejidad de diferentes sustancias químicas se combinan de

formas diferentes para crear una armonía natural de notas distintivas del aroma.

En el argot del café, estas notas se reconocen de acuerdo a sus similitudes con

sensaciones o percepciones con odores similares de sustancias más familiares en

la vida ordinaria: “olor a madera”, “tierroso”, “mohoso”, “frutoso”, “floral”.

A continuación se presentan algunas de las notas aromáticas más importantes en

el café tostado, los compuestos químicos precursores en el café verde y cómo se

originan durante el procesamiento o las operaciones poscosecha.

Frutoso (Fruity): Este es un aroma que recuerda a frutas maduras. En

concentraciones moderadas, el aroma frutal es deseable puesto que acentúa la

percepción de fineza o acidez. Holscher et al (1990) atribuyen este aroma a

compuesto cetónico β-damascenona, este es un producto de carotenoides.

Otros compuestos que acentúan este aroma son los ácidos alifáticos de cadena

corta, especialmente el Ácido 2-ethil butírico (Ojijo, 1993).

Caramelo (caramelly): sensación aromática producida por un conjunto de

compuestos formados por azúcares con radicales carbonilo medianamente

volátiles, que encontramos en el olor del café y producen sensaciones que

recuerdan los dulces o jarabes. Es una nota apreciada y Holscher et al (1990) lo

asocian al furaneol (2,5 dimethil-4-hidroxi-3(2H)-furanona) el cual es un producto

de la degradación de carbohidratos. Otros compuestos que tienen influencia en el

aroma a caramelo son: alcohol furfural, ácido furancarboxílico, hidroximetilfurfural

(HMF), etilfuraneol, cicloteno, isomaltol, maltol, 5-hidroximaltol y 5-hidroxil-5, 6-

Hidromaltol (Dart y Nursten, 1985).

Otras notas aromáticas importantes son listadas por Sánchez-Martín (2005):

Fruto seco (nutty): Sensación aromática producida por una gama de aldehídos y

cetonas medianamente volátiles que recuerda a los frutos secos tostados.

Malteado (malty): sensación aromática producida por una gama de aldehídos y

cetonas moderadamente volátiles que producen sensaciones que recuerdan los

granos tostados.

Chocolatado (chocolaty): sensación aromática, producida por un conjunto de

compuestos, moderadamente volátiles, presentes en el retrogusto del café

(aftertaste), que producen sensaciones que recuerdan el chocolate amargo o

vainilla.

Especiado (spicy): sensación aromática producida por una gama de compuestos

hidrocarbonatos ligeramente volátiles presentes en el retrogusto del café, que

producen sensaciones que recuerdan a la corteza de la canela o del clavo de olor.

Terpénico (turpeny): sensación aromática producida por un conjunto de

hidrocarburos y nitrilos que aparecen en el retrogusto del café y produce una

sensación similar a las resinas, los productos terpénicos o medicinales parecidos

al alcanfor.

3.2.4.2 El café sobrefermentado y sus defectos asociados

Algunos de los defectos organolépticos más objetables son introducidos a los

productos de café por los llamados granos sobrefermentados o “malolientes”. Por

lo general la ocurrencia de estos granos se asocia a sabores frutosos, putrefactos

o desagradables, por lo general conllevan a la discriminación de los lotes

afectados en el comercio de café.

En su trabajo Bade-Wegner et al (1997) estiman que los compuestos ácido

2-metilbutanóico etilester (2-MBEE), ácido 3-Metilbutanóico (3-MBEE) y ácido

ciclohexanóico (CHEE), son responsables por el sabor sobrefermentado en cafés

arabica y robusta.

Algunas de las notas de sabor características al sabor sobrefermentado se notan a

continuación:

Herbal (Green): Es una nota aromática sugestiva de un verdor intenso como el

pasto. De acuerdo a Puerta-Quintero (1996) esta nota redunda en una evaluación

media para el aroma. Según Holscher et al (1990) su origen puede ser el resultado

del compuesto químico 2, 6 (E,Z-) nonadienal. El mismo autor también revela que

el compuesto n-hexanal imparte un odor similar. Ambos compuestos son

generados por la fracción lípida del café verde.

Maderoso (Woody): Ojijo (1993) estima que este es un defecto atribuido a la

sustancia nerolidol, un terpeno. Presumiblemente los terpenos del café tostado se

originan por diterpenos en el café verde (Arnaud, 1988). Otros autores (Viani,

1988; Parliment et al, 1973) han asociado al compuesto 2(E)-nonenal con esta

nota.

Carbonizado (carbony): sensación aromática originada por un conjunto de

compuestos heterocíclicos ligeramente volátiles, presentes en el retrogusto del

café, que producen sensaciones fenólicas similares a un cresol o la piridina, que

recuerdan las sustancias quemadas.

Uno de los defectos más nombrados en la literatura es el de los granos “rio”, este

se caracteriza por tener notas fenólicas, medicinales o mohosas.

Spadone y Liardon (1987) atribuyen al compuesto químico 2, 4, 6- Trichloro-

methoxi-benceno (TCA) como el responsable de este defecto. En otra

investigación Holscher et al (1995) concluyeron que posibles causas de la

generación de este compuesto pueden ser metabolitos de algunos pesticidas,

aunque antes, Dentan (1987) estimaba que los granos que exhiben estas

características son ricos en Aspergillus fumigatus.

Finalmente Cantergiani et al (2001) relacionaron el defecto mohoso/tierroso a los

compuestos geosmin, 2-metilisoborneol, 2, 4,6-tricloroanisol y en menor medida a

tres metoxi- pirazinas (2-metoxi-3-isopropil/-3-sec-butil-/-3-isobutil-pirazina). Como

posible causa incluyeron al secado durante la poscosecha.

3.2.4.3 Ácidos carboxílicos

Los ácidos carboxílicos pueden encontrarse de forma natural en las semillas de

café verde tanto de arabica como de robusta y aportan entre el 1.1-3.1%, en

porcentaje (m/m). Illy y Viani (1995), desglosan este aporte de la siguiente

manera: ácido fórmico (0.14%), acético (trazas), oxálico (trazas-0.2%), málico (0.3-

0.7%), succínico (trazas-0.15), cítrico (0.5-1.5) y quínico (0.3-0.6% en arábicas).

Al parecer la producción de ácidos carboxílicos en el café verde es un aspecto

determinante para la obtención de granos tostados balanceados en acidez (Illy y

Viani, 1995). En el café tostado han sido identificados cerca de 34 ácidos, 15 de

los cuales son volátiles y están presentes en pequeñas cantidades en el aroma.

En el tueste hay una reducción en la suma de cítrico y málico y aumenta en alguno

de los otros, como el quínico y ácidos volátiles.

Los ácidos acético, málico y cítrico son importantes para percibir la acidez. Los

ácidos presentes actúan sinérgicamente y sus efectos en el aroma son más

importantes que aquellos en su relación con el pH. La percepción de la acidez es

el resultado de un conjunto de efectos de todos esos ácidos juntos. De hecho, es

agradable si un ácido no prevalece, mientras comienza a ser desagradable si uno

de ellos predomina. Esto es debido a los efectos combinados de gusto, aroma y

sensaciones táctiles tales como cuerpo y astringencia.

Los datos cuantitativos de los ácidos carboxílicos del café tostado varían

dependiendo de la especie y variedad del café, del grado y condiciones de tueste.

Los aspectos negativos de los ácidos carboxílicos también han sido recopilados

por distintos investigadores, con especial énfasis en sus formaciones durante las

etapas de procesamiento (café verde).

Wootton (1966) mencionaba la relación entre algunos ácidos carboxílicos, el pH, la

degradación del mucílago y la formación de aromas desagradables en el café.

Hacía hincapié en los ácidos láctico y acético, los cuales parecen aparecer en

etapas tempranas de la fermentación. Los ácidos propiónico y butírico aparecen

en etapas más tardadas y posiblemente son los responsables por el aroma

defectuoso a “cebolla”. También reportaba la presencia de ácido fórmico.

Dinu (2001) estima que el ácido galacturónico es un constituyente fundamental de

los polímeros que forman las pectinas, las pectinas como se mencionará más

adelante son polisacáridos esenciales de las paredes celulares de las plantas.

López et al (1989) investigaron con más detalle la formación de ácidos

carboxílicos con relación al tiempo de fermentación, aunque no confirmó una

relación causal entre las concentraciones de estos ácidos y la degradación de la

calidad del café a lo largo del tiempo, este estudio sirve de guía para otras

investigaciones en esta línea. Encontraron los siguientes ácidos: galacturónico,

málico, láctico, cítrico y propiónico. El equipo de Avallone et al (2001b) utilizó

solamente ácido acético y ácido láctico como indicadores de progreso de la

fermentación, llegaron a la conclusión que estos ácidos tienden a aumentar a

medida que avanza el tiempo de fermentación y disminuyen los azúcares

(glucosa, fructosa y sacarosa).

3.3 DEL CAFÉ CEREZO AL CAFÉ PERGAMINO: UN PRODUCTO SENSIBLE

3.3.1 Cosecha

En su investigación, Guharay et al (2000) plantean que en Nicaragua la recolecta

inicia a mediados de octubre y finaliza a mediados de marzo. El estado de

madurez de las cerezas (o uvas) de café durante la recolecta es determinante en

la calidad final del café. Estas están maduras cuando el pericarpio es de color rojo

brillante, las sobremaduras son de color violeta a negro y las no maduras todavía

verdes. Para producir café de calidad Gutiérrez et al (2005) recomiendan

recolectar solamente cerezas maduras.

La cosecha puede ser mecánica, se han propuesto interesantes y sofisticados

mecanismos para la recolección de cerezas de café, por ejemplo: la cosecha

mediante el impacto a las ramas por medio de un equipo especial que también

desprende y recoge los frutos (García et al, 2001), o el sistema descrito por

Campillo et al (2001) en el cual un sistema de ventosas se encarga de agarrar y

desprender los frutos de café.

En la investigación de Tulet et al (1994) se presenta que tanto los costos, las

características inherentes del sistema de cultivo del café, como la mejor calidad de

los granos obtenidos hacen que el sistema de recolección manual sea el más

utilizado. En Nicaragua la cosecha se realiza de forma manual. Úbeda Aguilar

(1997) recomienda hacerla en tres etapas: el graniteo, el corte pleno y la repela.

La primera consiste en eliminar los primeros frutos maduros, brocados (afectados

por la broca del café: Hypothenemus hampei), sobremaduros, enfermos o

defectuosos, esto se hace para que el resto de la cosecha quede libre de estos

frutos y así evitar una calidad inferior de la cosecha. En la segunda etapa se corta

entre el 80% y 85% de la cosecha, poniendo atención en cortar solamente el café

maduro. Finalmente se debe hacer una repela cuando no quede más que un 9 a

13% de cosecha, aquí se debe de dejar libre la planta y el suelo de toda clase de

frutos para evitar que plagas como la broca se refugien en ellos.

El cómo optimizar la recolección manual es motivo de investigación en centros

como Cenicafé (Centro Nacional para la Investigación del Café, Colombia), el

trabajo de Vélez et al (1999) es una guía completa de cómo el recolector debe

realizar sus movimientos en el zurco, alrededor de la planta, con su cuerpo y con

sus manos.

3.3.2 Procesamiento post-cosecha

La transformación del café cereza en café pergamino se denomina beneficio del

café, este puede realizarse por medio de dos variantes: la vía húmeda y la vía

seca (Illy, 2000).

Puerta-Quintero (1999) plantea que el proceso por vía seca se utiliza para

procesar la mayoría del café robusta de África (con la excepción de Zaire),

también plantea que en Brasil se procesa por el mismo método tanto café arábica

como café robusta. En el proceso seco, luego de recolectadas, las cerezas de café

son secadas inmediatamente bajo el sol y se extienden alrededor de 30 kg/ m2.

Muchas veces es difícil conseguir que las muestras alcancen un contenido ideal

de humedad (12%) tan solo con el secado bajo el sol, por lo tanto un secado

artificial se realiza con la ayuda de secadores mecánicos (Soccol, 2003). Como

variante dentro del beneficiado en seco Belitz y Grosch (1999) indican que algunas

veces las cerezas frescas son apiladas y dejadas a merced de su propio calor

durante 3-4 días para que la pulpa se fermente, luego se llevan a un proceso

similar al anteriormente comentado. Los cafés aquí recolectados se conocen como

cafés naturales, marcados por su cuerpo.

El beneficiado húmedo es utilizado principalmente para procesar café Arábica en

América Central, Colombia y África. Muchos autores convienen que el café

producido por este método es el de mejor calidad (Flament, 2001; Belitz y Grosch

1999, Puerta-Quintero, 1999).

Con este método el fruto del café es transformado en tres etapas:

- La eliminación de la pulpa por fermentación y lavado.

- El secado y la obtención del café pergamino.

- El secado hasta un 12% de humedad, trillado, clasificado, selección y

ensacado.

Como se verá en el siguiente párrafo lo planteado por Daviron y Lérin (1990) no

siempre es aplicable a todos los países, ellos infieren que por lo general con los

cafés procesados por la vía húmeda, el productor organiza la recolecta y vende su

café en cerezas, raramente como pergamino, el cual se obtiene por lo general en

pequeñas unidades conocidas como beneficios húmedos. El descascarillado y la

clasificación se realizan en unidades más grandes (beneficios secos), los cuales

exigen inversiones más importantes, como por ejemplo en la utilización de

selectores electrónicos de granos.

3.3.2.1 El procesamiento del café en Nicaragua

El café procesado en Nicaragua es 100% Arábica (Gómez, 2005), razón por la

cual es de esperar que la vía húmeda sea la más utilizada por los productores en

detrimento de la vía seca (Berríos et al, 2005). Por su parte, Parrilli (1997) estima

que en la zona cafetalera de Carazo, por la cercanía entre las fincas y las plantas,

se realizan ambos procesos (beneficiado húmedo y beneficiado seco), mientras

que en Matagalpa, Jinotega y Nueva Segovia, por lo general las plantas sólo

hacen el beneficiado seco, dejando a los productores el proceso húmedo, con esta

división del procesamiento se obtiene mayor ventaja competitiva ya que muchas

veces los beneficios secos están relacionados con una comercializadora

exportadora.

En las recomendaciones para procesar cafés especiales, Berríos et al (2005) y

Gutiérrez et al (2005), consideran que el procesamiento del café por la vía húmeda

debe comprender las etapas fundamentales que se resumen en la Figura 3 y se

explican posteriormente.

Figura 3 - Diagrama de flujo del procesamiento de café por la vía húmeda

Normalmente el café es procesado mediante la vía húmeda, la cual consta de dos fases: el beneficiado húmedo y el beneficiado seco, por lo general el primero se realiza en las fincas de los productores y el segundo en un beneficio construido para este propósito. Adaptado de Soccol (2003).

• La recepción y la clasificación:

El café debe transportarse inmediatamente al beneficio húmedo. Se procura

eliminar los granos verdes, pintos o secos colocando cada tipo de grano en un

contenedor diferente.

Un registro de los envíos de café cerezo al beneficio húmedo es de suma

importancia para determinar el tiempo que ha transcurrido desde el corte del café

hasta su llegada al beneficio húmedo.

Una clasificación por medio de la prueba de flotación debe realizarse: esta

consiste en verter el café en una pila con agua. Los frutos y el material que flota

(frutos secos, brocados, enfermos, palos, hojas) deben ser retirados.

La mezcla de frutos con diferentes calidades disminuirá la calidad del café

obtenido.

• El despulpado

Después de la limpieza y clasificación, los frutos del café se procesan para

eliminar la pulpa. Esto se realiza por lo general con máquinas despulpadoras,

estas pueden ser de tambor o de disco (Sánchez-Martín, 2004).

En el caso de las despulpadoras de tambor, hay un cilindro giratorio con las

paredes interiores rugosas y con una cubierta estacionaria o coraza que cubre un

tercio de su superficie. Los frutos se alimentan directamente desde los tanques de

clasificación al despulpador, resultando estrujados al entrar en el hueco,

rompiéndose el fruto y expulsando suavemente los granos recubiertos con la piel

apergaminada.

En los otros tipos de despulpadores, un disco vertical con una cara rugosa gira

junto a una placa lisa casi vertical, de modo que la abertura entre los dos,

ajustable, es menor en la dirección de rotación del disco.

Carpio Zavala (1998) reporta que cuando la despulpadora mecánica está mal

calibrada o cuando hay mezclas de variedades de cerezas, se dan heridas o

cortes en el grano verde que lo desvalorizan. También las diversidades en las

texturas y diámetros de las cerezas dificultan al trabajador elegir la calibración más

adecuada para el equipo. Una solución a esto es ajustar la despulpadora de

acuerdo al tamaño del grano, con granos más grandes al inicio de la cosecha y

más pequeños al final (Gutiérrez et al, 2005).

A pesar que Puerta-Quintero (2001) recomienda no utilizar agua ni para el

despulpado ni para transportar las pulpas o los granos despulpados, Sánchez-

Martín (2005) enfatiza que normalmente se utiliza en la práctica. Por otro lado es

de suma importancia limpiar diariamente la despulpadora, para evitar que se forme

suciedad y para retirar los granos que puedan estar atrapados, también se

recomienda revisar diariamente el funcionamiento del despulpador: en el caso que

se observe grano mordido, quebrado o machacado, se debe ajustar y corregir

cualquier problema (Berríos et al, 2005; Gutiérrez et al, 2005;

Carpio Zavala, 1998).

• La fermentación

En el transcurso del procesamiento del café por la vía húmeda, el café despulpado

debe someterse a una etapa importante para su preparación: el desmucilaginado

o fermentación. Aunque es posible utilizar máquinas para retirar el mucílago

(Oliveros y Roa, 1995), la verdad es que el método de la fermentación o

desmucilaginado natural es el que más se utiliza en Nicaragua.

El objetivo de esta fermentación es degradar el mucílago que se encuentra

adherido a la cascarilla del grano para obtener café pergamino que será

consecuentemente secado. En Nicaragua la fermentación se realiza en pilas de

concreto, madera o plástico, todas deben poseer desniveles apropiados y filtros en

las salidas. Carpio Zavala (1998) indica que la ventaja de utilizar pozas de

concreto es que es más fácil higienizarlas.

Como se verá más adelante (Sección 3.4.1.2) los tiempos de fermentación varían

de un sitio a otro dependiendo de un sinnúmero de factores y no debe ser

interpretado como un parámetro perfecto para determinar cuándo interrumpir la

fermentación (Carpio Zavala, 1998; Berríos et al, 2005).

Los productores utilizan como parámetro para determinar cuando la fermentación

se ha completado el llamado método tradicional o punteo, en este los productores

introducen hasta el fondo un trozo de madera grueso y limpio en diferentes partes

de la masa del café fermentado y luego lo retiran. Si al retirar el objeto de la masa

de café en fermentación quedara bien hecho el hueco dejado por el mismo, quiere

decir que el café ya está listo, entonces se debe proceder a lavar inmediatamente

el café (Jackels y Jackels, 2005).

Berríos et al (2005) recomienda el método de la muestra, el cual consiste en tomar

una muestra de café con la mano, si al apretarla está áspera y suena a cascarilla,

el café ya puede lavarse, si por el contrario el café está aún muy pegajoso, no

debe lavarse todavía. Se puede agregar un poco de agua para verificar si

desprende el mucílago o no.

• El lavado y la clasificación

El lavado se efectúa con el fin de eliminar del grano de café los productos de la

fermentación que ocasionan sabor agrio a la bebida de café, si no se retiran

rápidamente (Carpio Zapata, 1998; Puerta-Quintero, 1999), dentro de estos

productos se incluyen los restos del mucílago degradado (Belitz y Grosch, 1999).

Zambrano e Isaza (1994) reportan un consumo de agua de entre 20 y 30 L por

cada kg de café pergamino lavado.

Después del lavado la apariencia del grano pergamino debe ser limpia y de olor

agradable. El café que resulta del lavado se conoce como pergamino, al tacto este

debe ser limpio y al frotarlo entre los dedos y chocarlos entre sí deben sonar.

Por lo general el lavado se realiza en canales de concreto (o de correteo)

aledaños a las pilas de fermentación. Estos canales prueban ser muy eficientes

para clasificar los granos de café: por lo general los granos de inferior calidad son

arrastrados en primera instancia por la corriente, los granos de superior calidad

permanecen en la parte trasera del canal.

Wootton (1963a, b, c) hace énfasis en la influencia que puede tener la calidad del

agua durante el proceso de la fermentación y el lavado, otros autores, entre ellos

Puerta-Quintero (2001), alertan sobre la posibilidad de obtener café sobre-

fermentado o de muy mala calidad si se utiliza agua sucia o contaminada.

Gutiérrez et al (2005) previenen que el agua de lluvia captada por lagunas de

tierra o en pilas de agua puede ser otra causa de sabores y olores desagradables

en el café.

Puerta-Quintero (1999) plantea que café de excelente calidad se puede obtener

siempre y cuando se proceda a secar el café recién lavado. López et al (1989)

también consideran que los cafés que son sujetos a almacenamiento y contienen

una humedad cercana a 14% son susceptibles a desarrollar malos sabores y

aromas.

La etapa final del beneficiado húmedo, es decir antes de que el café abandone la

finca, es el secado en cajas de cedazo o zarandas, aquí los granos deberán de

moverse constante, evitando que hayan granos con diferentes grados de humedad

en un mismo lote. Muchas veces el tiempo de permanencia en estas zarandas es

como máximo tres días, tratando de cubrir el lote durante las noches o los días

lluviosos. Cuando hay condiciones para transportar el café hasta el beneficio seco,

se considera que el grano está “oreado”.

Es posible que en muchas fincas se requiera mano de obra para un preclasificado

en las cajas de cedazo, sin embargo un clasificado más eficaz se logra por medio

de los canales de correteo.

• El secado

Es la etapa del procesamiento húmedo en la cual se busca que el grano de café

pierda humedad. El contenido en agua de 65% que inicialmente tiene una cereza

de café, se reduce hasta un 10 a 12% (Illy, 2002).

El secado se realiza en los llamados beneficios secos, los cuales se encuentran

(caso generalizado en los departamentos de Matagalpa y Jinotega) en otro sitio

diferente al del área de cosecha y de beneficiado húmedo (Parrilli, 1997). De

acuerdo a Belitz y Grosch (1999) los granos pueden secarse al sol en pisos de

concreto (o como se puede apreciar en Sébaco, en otras superficies como el pasto

o sobre plásticos), también se suelen utilizar secadores mecánicos.

Roa et al (2000) presentan una variedad considerable de secadores: entre ellos

Wilken, Guardiola, Torres y Moreira. Todos comparten la peculiaridad que el gasto

de energía se centra en el poder calentar una masa de aire, la cual transmitirá el

calor a los granos de café. La eficiencia radica en el conseguir un secado

uniforme.

Algunos manuales de producción hacen mucho énfasis en las condiciones de

secado en patios (Roa et al, 2000). Este tipo de secado es el que se realiza en

Solcafé, la cooperativa que procesa la mayoría del café exportado como orgánico

o como comercio justo. Entre las recomendaciones principales que debe cumplirse

para procesar esos tipos de café, así como los cafés de calidad en general figuran

las siguientes:

- Darle prioridad al secado en patios de ladrillo o cemento, en detrimento del

secado sobre plástico. Estos patios deben de mantenerse limpios y libres de tierra.

- Se recomienda esparcir el café en capas que no sobrepasen los 5 cm y debe de

moverse constantemente con el propósito de obtener un punto de secado

uniforme.

-Durante las noches se amontonan y se cubren con láminas impermeables al agua

o con plásticos.

El indicador físico más importante para comprender la evolución del secado de los

granos es la humedad (Sánchez-Martín, 2005), sin embargo, Berríos et al (2005)

resumen una serie de indicadores alternativos o empíricos.

Con relación a la humedad, se debe tener en cuenta que inicialmente es de 53%

aproximadamente, cambios en la coloración del grano pueden ser de utilidad para

diagnosticar el contenido de humedad: un cambio de color de blanquecino a casi

negro surge cuando la humedad es cercana al 30%. El café está listo cuando se

tiene un color gris verdoso, característico de granos con un 12% de humedad o

con un color gris azulado que posee un 10% de humedad (Valencia, 1978).

• La trilla y la clasificación

Luego del secado los granos se llevan a unas máquinas de trilla para eliminar el

pergamino y finalmente se da brillo al grano y se eliminan los restos de cascarilla,

obteniéndose el café verde.

Sánchez-Martín (2005) comenta que los granos de café verde varían de tamaño y

forma, la razón de esto la da Illy (2005), al indicar que se busca uniformidad en el

producto, para asegurar la homogeneidad del tostado y de molido. La clasificación

se realiza con tamices perforados que funcionan mecánicamente y que separan

los granos según el tamaño. También se utilizan chorros de aire para eliminar los

fragmentos de granos y las sustancias extrañas.

La selección de los granos de color defectuoso se realiza a mano en la mayoría de

los casos, aunque se ha dado un gran desarrollo en los instrumentos de detección

fotoeléctrica para detectar y eliminar granos sobrefermentados (Gibson y Butty,

1976). Cada zona productora tiene sus propios números o nombres de

clasificación y distintos tamices de determinación.

• El almacenamiento

La susceptibilidad del café para obtener malos sabores y olores durante el

almacenamiento ha sido ampliamente descrita en la literatura sobre el tema,

algunos autores como Spadone y Liardon (1989) y López-Garay et al (1987)

sistematizaron los cambios en la calidad del café a lo largo del tiempo de

almacenamiento. Una conclusión importante de ambos estudios es que

independientemente de lo bien almacenado que se encuentre el café siempre va a

ver una degradación a lo largo del tiempo. Muy a pesar de esto, pueden

emprenderse algunas acciones para evitar dicha degradación en la calidad.

Dentro de estas recomendaciones, Berríos et al (2005) y Puerta-Quintero (2001)

recomiendan que la humedad de los granos se debe mantener con un 11% razón

por la cual la humedad relativa no debe sobrepasar el 65%.

Los aromas de sustancias químicas, fertilizantes, comidas, combustibles u otros

productos pueden contaminar fácilmente al café, razón más que suficiente para no

almacenar dichos compuestos cerca del café.

Berríos et al (2005) también recomienda almacenar el café en sacos de yute o en

sacos bien limpios y de preferencia nuevos. Al parecer el piso y las paredes de la

bodega pueden contaminar los granos, razón por la cual se debe evitar el contacto

con estos sacos.

3.4 LA FERMENTACIÓN DEL CAFÉ

De acuerdo a Tchana et al (1985) la forma en que se desarrolle la fermentación

tiene una gran influencia en la calidad final del café. Si el mucílago no es

eliminado, impide el proceso de secado y la superficie de los granos se vuelve

pegajosa, creando problemas de manipulación (Sánchez-Martín, 2005), también

se previenen las post-fermentaciones en el secado al sol y se evita un posible

deterioro de la calidad del café, que podría ocurrir como consecuencia de

fermentaciones indeseables (Berríos et al, 2005).

Si el mucílago debe ser eliminado, bien se podrían utilizar máquinas

desmucilaginadoras (Oliveros y Roa, 1995), sin embargo en Nicaragua el 89.5%

de los productores tienen fincas menores de diez manzanas y muchos de ellos

realizan el beneficiado húmedo en sus fincas (Gómez, 2005), la relación

producción-procesado no es lo suficientemente elevada para hacer una inversión

elevada en tecnología de este tipo (Parrilli, 1997) y Avallone et al (2002)

consideran la fermentación como el método más barato.

Por lo tanto al ser la fermentación tan importante en Nicaragua, se debe tener un

conocimiento adecuado de los mecanismos que se interrelacionan en la

degradación del mucílago, lo contrario puede llevar a sobrefermentaciones o

subfermentaciones, ambas son responsables de defectos en la bebida (Puerta-

Quintero, 1999; Wootton, 1963a).

En 1998, Wood planteaba que la fermentación en el café era el resultado de la

degradación de las pectinas del mucílago. Esta sección trata de poner en relieve la

validez de anteriores teorías con respecto a investigaciones más recientes y desde

esa base cimentar la aproximación teórica de esta tesis.

3.4.1 Principios básicos de la fermentación

3.4.1.1 Microorganismos

Muchas de las investigaciones sobre la microbiología de la fermentación del café

están orientadas a determinar las posibilidades de utilizar inóculos para optimizar

la fermentación mediante la disminución del tiempo que toma degradar el

mucílago (Wootton, 1963a). Otras investigaciones han tenido como objetivo

identificar los microorganismos responsables de malos aromas y sabores luego de

la fermentación (Vanos, 1987). Últimamente Avallone et al (2001b) han

demostrado que la forma más adecuada de controlar la fermentación no es

mediante el inóculo de colonias que produzcan enzimas pectolíticas, si no que una

fermentación controlable debería de buscar la optimización de la relación bacterias

y levaduras.

En la opinión de Silva et al (2000) hay tres roles importantes de los

microorganismos en el procesamiento del café: (i) producción de enzimas

pectinolíticas para degradar el mucílago (ii) generación de aromas y sabores

indeseables y (iii) producción de micotoxinas debido al pobre drenaje y

almacenamiento. Debido a las particularidades del procesamiento por vía húmeda,

existen posibilidades de contaminación por la máquina durante el despulpado.

Avallone et al (2001b) investigaron la relación entre la formación de

microorganismos (bacterias y levaduras) con parámetros bioquímicos

(degradación de azúcares y producción de ácidos carboxílicos). De acuerdo a

estos investigadores, las colonias que se aislaron con mayor frecuencias eran

coniformes comúnmente encontradas en el ambiente e identificados como

Klebsiella (73%) y Erwinia (28%). Otras especies que producen pequeñas

cantidades de ácidos carboxílicos (Erwinia, Aeromonas) también fueron censadas.

Es posible que el agua utilizada en el proceso de despulpado contenga cargas

superiores de microflora aeróbica mesofílica (enterobacterias). Por esta razón

Puerta-Quintero (1999) no recomienda utilizar agua durante el despulpado. Silva

et al (2000) identificaron 63 colonias de bacterias en cerezas de café.

Este equipo aisló muestras de bacterias lácticas (Ln. Mesenteroides dextranicum,

Lb brevis), ambas especies demostraron ser heterofermentativas, es decir podían

generar ácido acético y ácido láctico. Lb brevis se reporta como consumidora de

ácido galacturónico. Vanos (1987) identificó dos grupos de bacterias lácticas en

muestras de café sobrefermentado: Lactobacilli y Streptocci.

El equipo de Avallone et al (2001b) estimó la presencia de levaduras (Kloeckera,

Candida) con capacidades importantes para la producción de etanol.

Silva et al (2000) identificaron por su parte 15 géneros de levaduras en las

cerezas. Masoud et al (2004) subrayaron la importancia de las levaduras en el

proceso fermentativo: en su investigación estimaron un aumento importante en el

número de levaduras con predominancia de Hanseniaspora uvarum durante la

fermentación, sin embargo durante el secado dicha especie tendió a disminuir.

Con relación a los mohos, la investigación más extensa fue realizada por Silva et

al (2000) quienes aislaron 292 colonias e identificaron 282 a nivel de género:

Cladosporium (39.7%), Fusarium (34.2%), Penicillium (28.8%) y Aspergillus

(2.7%).

Los datos revelados por las investigaciones de Silva et al. (2000) indican la

predominancia de una fermentación dominada por bacterias, sin embargo, estiman

que los cambios de pH (la disminución de éste debido a la producción de ácidos

carboxílicos) conllevarían a un cambio en la relación entre bacterias y levaduras.

Estas últimas podrían perfectamente disminuir el pH en la ausencia de bacterias,

tal y como lo reportan Serrat et al (2002).

3.4.1.2 Tiempos de fermentación

Como ya se comentó, la interrupción de la fermentación viene determinada por el

punto el que el mucílago ya se ha degradado y debe lavarse. Se comentó sobre

los distintos indicadores para determinar el punto de lavado.

Uno de los indicadores es el tiempo de fermentación, aunque esto ya ha sido

desaconsejado debido a las particularidades medioambientales de cada “terroir”

(Decazy et al, 2003). Por esta razón, existe mucha variabilidad en cuanto a los

tiempos de fermentación reportados por distintos autores.

Jackels y Jackels (2005) reportan tiempos de 20 a 25 horas de fermentación en

fincas cafetaleras del norte de Nicaragua. Esto concuerda con lo que López et al

(1989) reportan como café correctamente fermentado (19 horas), por el contrario a

las 144 horas indicaban que el café estaba sobrefermentado.

En cafés del este africano, Wootton (1963c) reportaba que el mucílago se

despegaba completamente del pergamino en un tiempo de 36 a 84 horas, sin

embargo hacía mención de las opiniones divergentes en cuanto a la oportunidad

de disminuir o aumentar este tiempo mediante la adición de enzimas, la

fermentación bajo agua o la adición de soda cáustica (Tchana et al, 1985). En otro

artículo Wootton (1966) realiza una sistematización interesante sobre la relación

entre calidad del café obtenido en dependencia de pequeñas variaciones a la

fermentación tradicional (pre-lavado, agitación durante la fermentación), concluye

que a pesar de algunas cualidades visuales que pudieran adquirir los granos,

mediante tales variaciones, existen riesgos de alargar durante más tiempo la

fermentación y por lo tanto aumentar los costos. Quizás por estas razones aún se

considera la fermentación en seco o tradicional como la más utilizada (Avallone et

al, 2002).

Avallone et al (1999) realizaron sus experimentos con muestras de café arabica

que fueron fermentadas durante 20 horas.

Tchana et al (1985) reportan tiempos de fermentación de 16 a 72 horas en las

zonas caficultoras de Camerún, sin embargo en sus experimentos demostraron

que cuando se sobrepasaban 36 horas, los granos obtenidos eran susceptibles a

tener gustos indeseables.

Puerta-Quintero (1999) exponía que la fermentación se realizaba durante 12 a 18

horas y hacía énfasis en lo crítico que suponía este parámetro (el tiempo), puesto

que existe un riesgo real de obtener cafés sobrefermentados, también hacía

énfasis en el riesgo que supone mezclar cafés despulpados durante diferentes

tiempos. Sin embargo en otra publicación, Puerta-Quintero (2001) recomendaba

no dejar fermentar el café por más de 16 horas, justamente para evitarse riesgos

de obtención de cafés sobrefermentados.

Una de las razones por las cuales se inició el proyecto café por la justicia es para

determinar un parámetro más adecuado para determinar cuándo la fermentación

puede interrumpirse. Como se ha visto el tiempo de fermentación no parece ser un

parámetro apropiado.

3.4.2 Sobre la degradación del mucílago

3.4.2.1 El mucílago

En la opinión de Belitz y Grosch (1999) el mucílago está constituido por 84.2% de

agua, 8.9% de proteína, 4.1% de azúcares, 0.91% de sustancias pectínicas y por

0.7% de cenizas. Previos reportes acerca de la estructura del mucílago asumían el

mucílago como un hidrogel sin estructura celular (García et al, 1991).

En Avallone et al (1999) se plantea que el mucílago posee una estructura

convencional de tejido y posee paredes celulares constituidas por celulosa,

sustancias pectolíticas y polisacáridos. El espesor puede ser cercano a 300 µm y

las células que lo conforman son de dos a tres capas de células alongadas (largo

~160 µm; ancho de 15-50 µm), no se han observado paredes celulares

secundarias. La presencia de sustancias pécticas fue confirmada por Avallone et

al (2000) y en García et al (1991).

El mucílago que permanece luego del despulpado industrial y antes de la

fermentación está conformado principalmente por células alongadas que se

encuentran unidas al pergamino esclerenquimatoso por sus bases (Figura 4).

Figura 4 – Estructura del mucílago y del pergamino antes de la fermentación.

3.4.2.2 Gradiente osmótico y cambio de pH

Wootton (1963a, b) plantea que durante la fermentación, enzimas microbiológicas

o endógenas del café se encargarían de degradar las sustancias pectínicas del

mucílago, cambiando su textura de un hidrogel a un hidrosol (Carbonell y

Vilanova, 1952; Wilbaux, 1956; Rolz et al. 1982). Otros investigadores han

reportado la presencia de Kluyveromyces marxianus en aguas residuales del

lavado de café, esta levadura es productora de poligalacturonasa, una enzima

capaz de degradar las pectinas del mucílago (Serrat et al, 2002).

Esta hipótesis ha sido rebatida por Avallone et al (1999) quienes compararon la

estructura celular del mucílago antes y después de la fermentación (20 horas). Por

medio de técnicas microscópicas y por estudios bioquímicos de los constituyentes

polisacáridos del mucílago (Avallone et al, 2001a) se apreció que las sustancias

M-cw: Paredes celulares del mucílago, Pa: Pergamino, IE: Epidermis interior, Sc: Esclerénquima. Adaptado de: Avallone et al (1999)

pectolíticas no son fraccionadas durante la fermentación por enzimas endógenas o

bacteriales, en caso que fuesen fraccionadas sucedería a niveles muy bajos o no

detectables.

Un trabajo adicional presentado por Avallone et al (2002) sobre microorganismos

pectolíticos detectados durante la fermentación del mucílago demuestra que estos

producen la enzima pectateliasa a niveles óptimos de pH 8.5 (hay que tener en

cuenta que la fermentación se realiza en condiciones ácidas pH 5.3-3.5), por otro

lado, dicha enzima es incapaz de depolimerizar pectinas esterificadas del

mucílago sin previa de-esterificación.

Al inicio de la fermentación, poco antes del despulpado, el mucílago forma un

tejido continuo que cubre el pergamino. Cuando el mucílago está expuesto al aire

ambiental, la flora microbiológica natural empieza a desarrollarse en la superficie

del mucílago (Ver Sección 3.4.1.1). Estos microorganismos parecen ser

responsables de la disminución importante (∼60% luego de 20 horas) de la

concentración del total de azúcares simples (glucosa, fructosa y sucrosa) a

medida que la fermentación avanza en el tiempo, contrariamente la microflora

produce ácidos láctico y acético, lo cual induce una acidificación de un pH de 6.3 a

4.1 (Avallone et al, 2001b). Cuando las azúcares son metabolizadas, se induce un

gradiente de presión osmótica desde afuera hacia adentro del mucílago. Esto se

compensaría con un flujo de agua y posteriormente turgencia en las células. Es

muy probable que este gradiente de presión osmótica ejerciera suficiente presión

como para romper las paredes celulares en el sitio en que se unen al pergamino.

Simultáneamente, ácidos carboxílicos se producen e inducen un gradiente de pH,

al parecer la disminución del pH induce alteraciones fisico-químicas en las

paredes celulares, por ejemplo activación de enzimas en las paredes celulares,

alteración del gel péctolítico (Avallone et al, 1999).

En términos prácticos, estas nuevas hipótesis sobre la fermentación del mucílago

inducen a proponer la utilización de inóculos con buenas características

fermentativas. En Wootton (1966) se discute sobre bacterias lácticas como una

posibilidad, todo ello en detrimento de los microorganismos pectolíticos.

3.4.3 Hacia la propuesta de un indicador químico apropiado para la interrupción de la fermentación

Jackels y Jackels (2005) publicaron los resultados de un estudio de campo sobre

los cambios químicos que acompañan la fermentación del café in situ en cuatro

fincas del departamento de Matagalpa, Nicaragua. En ese estudio instrumentos

alimentados por baterías se utilizaron para medir temperatura, la concentración del

ion hidrógeno (pH), glucosa, etanol y ácido láctico a lo largo de siete lotes de café

en fermentación en tres fincas pequeñas y en una finca cafetalera grande. A pesar

que las condiciones como temperatura, altitud, infraestructura y tiempo de

fermentación variaron entre los lotes, se observó un patrón en el cual el pH se

presentaba inicialmente en el rango de 5.5-5-7 y posteriormente decaía de forma

abrupta a un pH de 4.6 cerca del fin de la fermentación. Un gráfico de este

comportamiento en el pH se muestra en la Figura 5:

Figura 5 - Comportamiento del pH en función del tiempo de fermentación.

Elapsed Time (h)

0 5 10 15 20

pH

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

Fuente: Jackels y Jackels (2005)

Inmediatamente después de despulpar el café y al inicio del proceso de

fermentación, el pH era de 5.5 o arriba y permanecía en este rango hasta 3-4

horas antes de completarse la fermentación (aproximadamente 16 horas en esta

figura). En ese momento empieza a decaer linealmente hasta al menos dos horas

después de completarse la fermentación. En los casos estudiados, el tiempo en

que se completaba la fermentación variaba desde nueve horas hasta casi veinte

horas. Basados en una comparación de siete perfiles de pH, se determinó que la

fermentación concluía a un pH de aproximadamente 4.6 (cuando se midió con

agua purificada que contenía sustancias amortiguadoras).

Este perfil de pH tiene una gran utilidad práctica para los productores de café

porque implica que una simple medida de pH de la masa de granos en

fermentación puede tener un valor predictivo para determinar cuando la

fermentación estará completada y también puede detectar si el lote se ha

sobrefermentado. Con una medición de pH el productor puede predecir si el lote

de café estará listo en 3 -4 horas y por lo tanto podría planear un lavado al

momento oportuno. Por otro lado, los productores también pueden determinar si

los granos se han sobrefermentado cuando realizan una primera valoración en la

mañana, en tal caso puede reajustar su horario diario de lavado para evitar tal

sobrefermentación en posteriores lotes. En cualquier caso este método tendría

más utilidad que el método tradicional (Sección 3.3.2.1).

Durante el estudio de campo, también se perfilaron los niveles de glucosa, etanol y

ácido láctico. Se observó que la concentración de glucosa disminuyó en el

transcurso de la mayoría de los lotes en fermentación, por el contrario las

concentraciones en etanol o ácido láctico aumentaron considerablemente

(aproximadamente de forma exponencial) cerca de completada la fermentación.

Estos indicadores, así como los eventuales estudios que se realizarían con otros

ácidos carboxílicos se relacionarían más con la calidad del sabor de café, como lo

evidenciarían las presencias de compuestos precursores de sabores

desagradables en la mezcla fermentativa que eventualmente influenciarían el

sabor en el café tostado (Holscher et al, 1990; Puerta-Quintero, 1999).

3.5 FUNDAMENTOS DE LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTO DESEMPEÑO (HPLC)

La cromatografía es un método físico de separación en el cual los componentes a

separar se distribuyen entre dos fases, una que es estacionaria (fase estacionaria)

mientras que la otra (la fase móvil) se mueve en una dirección determinada. De

acuerdo a la naturaleza de las fases, Toshihiko (1999) clasifica la HPLC dentro

de la cromatografía líquido-líquido, la fase móvil la constituyen disolventes

orgánicos o acuosos con o sin modificadores, la fase estacionaria está formada

por moléculas unidas mediante enlaces covalentes a un soporte de sílica.

El objetivo de la técnica cromatográfica es la obtención de un cromatograma que

permita el análisis cualitativo y cuantitativo de todos y cada uno de los analitos

presentes en una muestra

Por la metodología de trabajo, la HPLC se clasifica como cromatografía de elusión

porque la muestra se introduce en un momento determinado y la fase móvil circula

continuamente. Los componentes de la muestra salen de la columna como zonas,

que en el caso ideal presentan una distribución gaussiana de concentración y

están separadas unas de otras (Figura 6).

Figura 6 - Cromatografía de elusión

Los siguientes componentes hacen parte de la HPLC:

- Eluyentes

- Sistema de impulsión

- Sistema de inyección de muestra

- Columna

- Detector

- Sistema de control y adquisición de datos.

El cromatograma que resulta cuando la fase móvil ha transportado al analito y este se manifiesta como un señal (respuesta del detector al analito que es graficada en dependencia del tiempo), esta señal forma picos, posteriormente se integra el área bajo los mismos (Adaptado de Willard, Merrit, Dean y Settle, 1988).

Figura 7 - Componentes del sistema de HPLC.

La HPLC puede ser de fase normal y de fase inversa.

La HPLC de fase normal posee una fase estacionaria polar, los componentes

más comunes son: gel de sílice, alúmina, gel de sílice modificado con grupos

amino, diol y ciano. La fase móvil por su parte es apolar (ciclohexano, CCl4,

tolueno, CHCl3, CH2Cl2, THF, dioxano).

En este tipo de cromatografía y como resultado de las interacciones analito- fase

estacionaria, en el cromatograma los compuestos menos polares aparecerán

antes que los compuestos más polares.

La HPLC de fase inversa está constituida por una fase estacionaria no polar cuyos

componentes más comunes son: sílica modificada con grupos C2, C8 y C18., sílica

modificada con grupos fenilo, o polímeros orgánicos poco polares (estireno-

divinilbenceno). La fase móvil es polar (agua, metanol, acetronitrilo).

Adaptado de Sadek (2000).

En el cromatograma los compuestos más polares y de menor tamaño aparecerán

antes que los compuestos menos polares y de mayor tamaño.

Existe una disponibilidad variada de detectores en HPLC, los más comunes son:

- Absorción Ultravioleta / Visible

- Índice de refracción

- Fluorescencia

- Conductimétrico

- Electroquímico

- Másico (dispersión de luz)

- Espectrómetro de masas

La Tabla 2 adaptada de Skoog et al (1998) compara las características de

estabilidad, selectividad, gradiente y sensibilidad para seis diferentes detectores.

Si se compara el detector de absorción UV-VIS, con los otros tipos de detectores

se puede notar que sus ventajas radican en su alta estabilidad, sin embargo su

selectividad es media y su sensibilidad es variable.

Tabla 2 - Comparaciones entre distintos tipos de detectores

Detector Estabilidad Selectividad Gradiente SensibilidadAbsorción UV-VIS Alta Media Si Variable (alta)

Índice de refracción Baja No No 500 ngFluorescencia Alta Si Si Variable (0.1 ng)

Conductimétrico Baja Si No 5 ngElectroquímico Baja Si Si 0.01 ng

Másico Media No Si 50 ng

Fuente: Skoog et al (1998)

4 MARCO METODOLOGICO

4.1 DISEÑO EXPERIMENTAL

4.1.1 Tipo de estudio

La investigación consistió en un estudio experimental en el cual se aplicó un

diseño con grupos aleatorizados y posprueba únicamente. Esto conllevó a la

formación de tres grupos. Un cuarto grupo: “inicial”, se utilizó como control.

4.1.2 Universo de estudio

Se estableció como el Universo de estudio el total de lotes de café recolectados

y procesados a razón de un lote por día en el beneficio húmedo de la finca La

Canavalia (San Ramón, Matagalpa, Nicaragua) entre el 1º de diciembre del 2005

al 30 de enero del 2006.

4.1.3 Muestra

La investigación se realizó con 10 muestras de café despulpado. Cada una de

estas muestras provino de un lote diferente de café procesado en la finca La

Canavalia. Para seleccionar los lotes se utilizó un muestreo no estadístico, más

bien resultante del criterio de los investigadores: cada muestra provenía de una

fecha diferente y de acuerdo al plan de recolecta de café de la finca, esto brindó

mucha variabilidad al café tomado como muestra. Por otro lado, para seleccionar

la muestra representativa de cada lote (60 kg) se utilizó un muestreo aleatorio

simple.

4.1.4 Montaje experimental

Para cada muestra se formaron tres grupos (G1, G2, G3), con dos repeticiones de

10 kg cada uno. A la variable independiente de estos grupos se aplicó un

tratamiento (X1, X2, X3). Las consecuencias del tratamiento se observaron en la

variable dependiente (O1, O 2, O 3). Ver Tabla 3.

Tabla 3 - Montaje experimental

RG1 (duplicado) X1 (Interrupción de fermentación pH= 4,8-4,5) O1 RG2 (duplicado) X2 (Interrupción de fermentación pH= 4,4-4,1) O2 RG3 (duplicado) X3 (Interrupción de fermentación pH= 4,0-3,6) O3

R= Formación aleatoria de los grupos (de Random, en inglés)

4.1.5 Variables e indicadores

La Tabla 4 presenta la operacionalización de las variables independiente y

dependiente. Debido a la complejidad de esta última, se ha decidido dividirla en

seis subvariables: estas son los ácidos cuyas concentraciones se analizaron de

forma similar (por eso es el mismo indicador).

Tabla 4 - Variables e indicadores

Variable

Sub variable Indicadores Escala de medida

Tipo de variable

Tipo de escala de medida

pH de interrupción de fermentación (Independiente)

Valor de pH pH Cuantitativa Continua

Escala de proporción o razón

Á. Acético Á. Fórmico A. Propiónico A. Láctico A. Cítrico A. Málico

Concentración de ácido orgánico. (Dependiente)

A. Galacturónico

Altura y área de pico del analito en el cromatograma (Cromatografía líquida de alto desempeño)

Concentración (masa /Volumen)

Cuantitativa continua

Escala de proporción o razón

4.2 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

La Figura 8 resume las etapas que se realizaron en la fase experimental. A

grandes rasgos se puede dividir en: (a) una etapa de procesamiento previo de las

muestras, muchas tareas fueron realizadas por el personal de la finca, razón por la

cual se puede considerar que las muestras eran representativas de las

condiciones de procesamiento locales. (b) Una etapa experimental en la cual las

muestras fueron monitoreadas y se les aplicó el tratamiento.

Figura 8 - Diagrama de flujo del proceso experimental, Finca la Canavalia.

Nótese que solamente 200 g de la muestra se destinaron para los análisis cromatográficos. La mayor parte de las muestras se utilizaron para una investigación (Jackels et al, 2006) sobre las cualidades de las bebidas producidas por los distintos lotes de café.

4.2.1 Recolección de las muestras

La fase experimental se realizó en la finca cafetalera La Canavalia (Figura 35,

Anexos, Sección 10), esta se localiza en la Comunidad Yasica Sur, Municipio de

San Ramón, Matagalpa (Figura 34, Anexos, Sección 10) . La altitud de la finca es

de 747 m.s.n.m. Posee una temperatura que oscila entre los 20º a 26º C. y una

pluviosidad que varían entre los 2000 a 2400 mm (INIFOM, 2001).

En Nicaragua predomina el cultivo de la especie Coffea arabica, por tanto esa fue

la especie que se tomó para realizar los experimentos y específicamente la

variedad caturra, la cual predomina en las plantaciones de La Canavalia.

Se hizo coincidir la realización de los experimentos con la época de cosecha de

café. De esta forma, la proveniencia de los lotes de café estaba en dependencia

del plan de corte de la finca.

La Tabla 5 presenta las fechas en que se recolectaron las muestras así como el

día en que se concluyó el experimento. Es de notar que los experimentos

concluyeron normalmente un día después de recolectadas las muestras, más

adelante se discute el porqué.

Tabla 5 - Identidad de lote procesado, fecha de recolección de muestra y fecha de conclusión del experimento.

Día ID experimento

Fecha de recolección de muestras

Fecha de conclusión del experimento

1 B 29-dic-06 30-dic-06 2 C 30-dic-05 31-dic-05 3 D 31-dic-05 01-ene-06 4 E 02-ene-06 03-ene-06 5 F 03-ene-06 04-ene-06 6 G 04-ene-06 05-ene-06 7 H 06-ene-06 07-ene-06 8 J 07-ene-06 08-ene-06 9 K 08-ene-06 09-ene-06

10 L 09-ene-06 10-ene-06

Antes del despulpado, el café se separó por categorías: los granos rojos, los

granos verdes y los granos oscuros (Figura 9). Posteriormente, los granos se

vertieron en un tanque lleno de agua, allí se identificaron y eliminaron aquellos que

flotaban (clasificado).

Figura 9 - Separación de granos de café de acuerdo a su estado de madurez

Las muestras de café que se utilizaron para los experimentos siguieron el mismo tratamiento que el café recolectado en la finca. Se procuró realizar una selección de granos rojos y se descartaron granos verdes y sobrefermentados (de color más oscuro) Cortesía de S. Jackels.

4.2.2 Despulpado

El despulpado de las muestras de café se realizó con una despulpadora de

tambor, este tipo de despulpadora consiste en un cilindro giratorio con las paredes

interiores rugosas y con una cubierta estacionaria o coraza que cubre un tercio de

su superficie. El espacio entre el tambor y la coraza es ajustable y disminuye en el

sentido de giro del tambor. Los frutos se alimentaron mediante un sistema de

tuberías directamente desde los tanques de clasificación al despulpador,

resultando estrujados al entrar en el hueco, rompiéndose el fruto y expulsando

suavemente los granos recubiertos con la piel apergaminada. La capacidad media

de este despulpador fue de 1200 a 1500 Kg/h de frutos.

La finca adquirió este despulpador gracias al apoyo de CRS en fechas recientes,

por lo tanto al ser relativamente nuevo y estar bien ajustado, se obtuvieron granos

con calidad aceptable de despulpado (pocos granos presentaba pulpa adherida).

4.2.3 Fermentación

Luego de despulpados, los granos de café se depositaron en un tanque de

fermentación. Se procedió a seleccionar 60 kg de forma aleatoria, procurando

obtener una cantidad representativa de todo el lote. Los 60 kg se distribuyeron a

razón de 10 kg en cada uno de los seis recipientes exclusivamente diseñados para

los experimentos (Figura 10).

Figura 10 - Recipientes de fermentación del café

(a) El conjunto de fermentación de café consistió en cuatro elementos: dos baldes, una tapa de filtro de lixiviados y un aislante. El recipiente de recolección de lixiviados permitió reproducir las condiciones de buenas prácticas de fermentación recomendadas por Gutiérrez, Medina y Gómez (2005) y Aguilar (1997) sobre la instalación de drenajes en las pilas de fermentación con el fin de evacuar esos lixiviados. (b) El sistema de fermentación en funcionamiento: 10 kg de café recién despulpado es vertido en los baldes experimentales.

a

b

Cortesía de S. Jackels.

4.2.4 Control experimental

4.2.4.1 Matriz para el control de datos

Con el fin de monitorear las condiciones experimentales, se ideó un instrumento

de trabajo opcional: una ficha de laboratorio para registrar los cambios surgidos en

la variable independiente (pH) a lo largo del tiempo. Esta ficha se presenta en la

Figura 11, consta de dos filas con los datos generales: el código del experimento

(ID, el mismo código que se mencionó en la Tabla 5), las fechas (la fecha en que

inició y la fecha en que concluyó), la hora en que se realizó el despulpado. La

columna de las Mediciones contiene información sobre los datos que se debían

de registrar cada vez que se indagaba sobre el estado de la fermentación: la hora

en que se realizaron las mediciones, la temperatura de los granos en

fermentación, el pH medido con Reflectoquant ®, el pH medido con cintas de

color, la concentración en parámetros químicos (etanol, ácido láctico, glucosa).

Cabe destacar que el pH medido con Reflectoquant fungía como control, ya que

normalmente los productores utilizarán el método de las cintas de color. Teniendo

en cuenta los factores de incertidumbre ligados a la lectura de las cintas de color,

el método cuantitativo de Reflectoquant ayudará a precisar el grado de exactitud y

validez de las lecturas cualitativas.

La columna de los números de baldes señala que a cada uno de los seis baldes

se les dio un código distinto (ver última fila: código del lote) y por lo tanto se

trataron como mediciones independientes.

Se puede notar que existen algunas columnas especiales que contienen la

inscripción “Lavado del set #”, esto indica que cuando alguno de los lotes

presentes en los baldes alcanzara el pH indicado (≈4.6, ≈ 4.1, o ≈ 3.9), se

procedía a interrumpir la fermentación y era necesario lavar las muestras para

eliminar el mucílago remanente.

Figura 11 Hojas de datos utilizadas para el control experimental de lotes de café en la fase experimental.

(a) En la primera hoja se indican los datos generales, el inicio de la fermentación, datos intermedios y se registra si se tomaron muestra para el primer lavado (pH≈ 4.6).

(b) En la segunda hoja se incluyen los datos relevantes sobre las muestras a las que se ha de hacer la segunda interrupción de la fermentación (pH≈4.1) y en la tercera interrupción (pH≈3.9).

4.2.4.2 Medición de la temperatura

La temperatura se registró mediante un termómetro digital. Este se introdujo

durante unos segundos (hasta que los datos fueran constantes) en la masa de

granos en fermentación.

4.2.4.3 Medición del pH

Los granos de café se obtuvieron de la masa de café en fermentación. Con una

cuchara grande se hizo un hoyo en el centro de la masa, se levantaron granos del

centro de la masa (20 gramos) y se llenó hasta la marca del vaso marcado

“granos”. Se llenó de agua pura (20 mL) el vaso marcado “agua” hasta la marca.

Luego el agua se agregó al vaso “granos” y se revolvió por 15 segundos.

Posteriormente el pH se midió por uno de dos métodos:

(a) Cintas de pH, colorpHast ® de EMD Chemicals. Se disponía de un set de

cintas que marcaban en el rango de 4.0-7.0 (Catálogo EM-9582-1) y otro en el

rango de 2.5-4.5 (Cat. EM-9581-3).

Se introdujo la cinta de pH en la solución de la taza “granos” y se mantuvo

sumergida por 5 segundos. Se sacó la cinta y se removió el exceso de líquido.

Inmediatamente se comparó la cinta de pH con la tarjeta de colores para

determinar el valor de pH. Si el color concordaba con la tarjeta, se anotaba el

número. Si el color estaba entre dos bloques de colores se anotaba el número

entre los dos bloques de colores

(b) Cinta de Test pH en el rango de 1.0- 5.0 (Cat. EM-16894-1) para el Sistema de

Análisis Reflectoquant ® (Cat. EM-16950-1) de EMD Chemicals.

Ambos datos se registraron en la anterior hoja de datos.

4.2.4.4 Medición de ácido láctico

Solamente se midió la concentración de ácido láctico antes de lavar las muestras

cuyo pH hubo alcanzado el valor deseado. Esto se hizo con la misma solución de

granos y agua a las que se midió el pH.

Para ello se utilizó el mismo sistema Reflectoquant ® con cintas de medición de

ácido láctico (Cat. EM-16127-1) cuyo rango de medición oscila entre 1-60 mg/mL.

Este test determinó la presencia de ácido láctico total (suma de D-Láctico y L-

Láctico),

4.2.4.5 Medición de Glucosa

La concentración de glucosa se midió solamente antes de lavar las muestras cuyo

pH hubo alcanzado el valor previsto en el diseño experimental. Se utilizó el

sistema Reflectoquant ® con cintas de medición de glucosa (Cat. EM-16720-1)

cuyo rango de detección oscila entre 1-100 mg/mL. Los datos se agregaron a la

matriz de registro de datos.

4.2.4.6 Medición de etanol

Al igual que los otros dos parámetros, los registros se hicieron solamente cuando

las muestras alcanzaron un pH deseado para su lavado. También se utilizó el

sistema Reflectoquant ® con cintas de medición de etanol (Cat. EM-16130-1) con

un rango de detección entre 20-200 mg/mL).

4.2.4.7 Medición de ácido málico (Fase de laboratorio solamente)

Solamente se midió la concentración de ácido málico durante la fase de

laboratorio (Sección 4.3). Esto se hizo con la misma mezcla de granos y agua a

las que se midió el pH.

Se utilizó el sistema Reflectoquant ® con cintas de medición de ácido málico cuyo

rango de medición oscila entre 1 – 60 mg/mL. En la fase de laboratorio por lo

general las muestras se diluyeron a un factor 1:10.

4.2.5 Interrupción de la fermentación

4.2.5.1 Toma de muestra y refrigeración para posterior análisis cromatográfico

Cuando la muestra alcanzó el pH requerido, y antes de proceder al lavado del café

contenido en determinado balde, se procedió a tomar alrededor de 500 g de forma

representativa del café contenido en dicho balde.

Estas muestras de café se empacaron en bolsas plásticas con cierre hermético y

se guardaron apropiadamente en el congelador de la finca (que tenía temperatura

cercana a los 0ºC).

Para transportar las muestras hasta Managua y posteriormente hasta el

laboratorio en Seattle, se utilizaron hieleras portátiles con congelantes químicos,

para mayor seguridad se mantuvo la temperatura cercana a 0ºC dentro de estas

hieleras.

Las muestras permanecieron en un congelador a una temperatura constante y

cercana a 0ºC hasta que se realizaron los análisis cromatográficos.

De acuerdo a Masoud et al (2004) la temperatura cercana al punto de

congelamiento es un método para interrumpir la fermentación, ya que se logra

disminuir el crecimiento de la microflora a niveles en los cuales la producción de

subproductos metabólicos no es considerable.

4.2.5.2 Lavado de muestras para posterior catación

Luego que se separaron 200 g para congelamiento, el resto de la muestra de café

dentro de cada balde se utilizaría para una catación profesional.

Esta catación permitiría tener una idea de las diferencias entre las calidades

obtenidas para los distintos lotes, como complemento al análisis cromatográfico de

los ácidos carboxílicos (Jackels et al, 2006).

Para interrumpir la fermentación, se realizó un “lavado” a pequeña escala de la

muestra contenida en el balde. En condiciones normales, los productores utilizan

grandes cantidades de agua y grandes tanques para realizar este lavado.

Para lavar cada una de las muestras se utilizaron seis barriles de agua limpia y un

cucharón de aluminio. El objetivo era remover el mucílago que pudiera quedar

adherido a las paredes.

Con ayuda de un colador se retiraron todos los materiales flotantes y de forma

manual se retiraron los restos de pulpa.

4.3 PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO

La fase de laboratorio se realizó en tres etapas sucesivas (Figura 12):

primeramente, una etapa de extracción de los ácidos carboxílicos con el fin de

obtener una solución diluida del mucílago presente en cada una de las muestras.

Esta solución fue posteriormente analizada mediante HPLC.

De forma paralela se realizó un monitoreo rápido mediante la técnica de las cintas

de pH, ácido láctico y ácido málico del sistema Reflectoquant ® (Ver

Sección 4.2.4).

4.3.1 Protocolo de extracción de ácidos carboxílicos.

El protocolo indicado en la Figura 12, estaba diseñado para analizar cada una de

las muestras por separado. Por esta razón, antes de iniciar con el

descongelamiento se levantó un registro de las muestras que había en existencia

y posteriormente se decidió realizar las extracciones en el orden correspondiente a

cada experimento. De esta forma, cada día se realizaron solamente extracciones

para las muestras de un día de experimentos.

Puesto que el objetivo era realizar las diluciones de acuerdo al mismo factor de

dilución con que se realizaron durante la fase experimental (en ese entonces se

llenó un vaso plástico con granos de café hasta la marca de 50 mL), de cada una

de las muestras descongeladas se tomó el equivalente a 30 g de café y se agregó

un volumen de 50 mL de agua destilada con calidad HPLC.

Figura 12- Diagrama de flujo de la fase de laboratorio.

A grandes rasgos la fase de laboratorio se dividió en tres etapas importantes: la extracción de los ácidos carboxílicos, la medición de parámetros químicos (pH, ácido láctico y ácido málico) para tener una impresión inicial de la muestra antes de realizar el análisis cromatográfico y la cuantificación cromatográfica.

Las muestras se agitaron durante 45 minutos con un agitador magnético,

experimentalmente se determinó que este era el tiempo más conveniente para

extraer el mucílago que permanecía adherido a los granos de café. Se llegó a esta

conclusión tras realizar análisis de muestras variando el tiempo de agitación

sucesivamente en 30, 45 y 60 minutos.

Luego de la agitación, se extrajo líquido sobrenadante con la ayuda de una pipeta

Pasteur y se distribuyó en cuatro viales de 1 mL. Con la ayuda de una micro

centrífuga se procedió a centrifugar a una velocidad de 10 000 revoluciones por

minuto durante cinco minutos.

Se decantó la solución sobrenadante de los viales con ayuda de la pipeta Pasteur

en un filtro de micro fibra de vidrio de 0.45 µm. Posteriormente la solución filtrada

se vertió en una jeringa y se hizo pasar por un filtro de 0.2 µm de nylon.

La solución obtenida estaba lista para ser analizada por medio de HPLC antes de

mezclarla con un patrón interno (Ver la Sección 4.3.4) bajo determinadas

condiciones cromatográficas y a un factor de dilución específico

(Ver Sección 4.3.2).

Los volúmenes de la muestra (1400 µL) y el del patrón interno (200 µL) se

midieron con una micro pipeta (rango de 100 a 1000 µL), estos se vertieron en

viales de 1.5 mL para HPLC y se sellaron con un tapón de caucho. Una vez

sellados se agitaron fuertemente y se colocaron en el auto inyector del HPLC.

La Tabla 6 resume los materiales y equipos que se utilizaron durante la etapa de

extracción de los ácidos.

Tabla 6 - Materiales y equipos utilizados durante la fase de laboratorio (etapa de extracción de ácidos carboxílicos y de monitoreo rápido con Reflectoquant)

Etapa Material Cantidad Fabricante Pesado Balanza analítica 1 ScienTech,

Loveland, CO, USA Espátula 1 Beaker de 150 mL 1 por muestra Adición de agua Agua HPLC 50 mL Acros, New Jersey,

NJ, USA Probeta de 50 mL 1 Agitación Agitador magnético

con imanes 1 por muestra Hach, Loveland, CO,

USA Cronómetro Centrifugado Pipeta Pasteur 1 por muestra Fischer Scientific Viales de

centrifugado 4 por muestra

Micro centrífuga 1 Filtrado Microfiltro de 0.45

µm 1 por muestra Whatman Schleider

& Schuell, New Jersey

Microfiltro de 0.2 µm 1 por muestra Fischer Scientific Vial con tapa de

rosca para preservar el filtrado.

1 por muestra

Encapsulado para HPLC

Viales para HPLC 1 por muestra Agilent

micro pipeta, rango 100 a 1000 µL

1 Gilson pipetman

Puntas para micro pipeta

1 para muestra,1 para patrón interno

Medición rápida de parámetros químicos

Procesador Reflectoquant

2 EMD Chemicals

Cintas reflectoquant 1 set de 50 cintas (Ácido láctico, málico, pH)

EMD Chemicals

4.3.2 Condiciones de análisis cromatográfico

El instrumento de HPLC con el cual se realizaron los análisis está constituido por

un set de módulos individuales (Figura 13):

1. Un reservorio de solventes para la fase móvil. Como fase móvil se utilizó

una solución de fosfato de amonio dibásico (NH4H2PO4) al 0.5 % a un pH

de 2.8. Esta fase móvil la recomiendan López et al (1989) para el análisis

con HPLC de ácidos carboxílicos en el mucílago del café. Antes de

empezar a utilizar la fase móvil se desgasificó por medio de un

desgasificador de ultrasonido, el propósito era evitar que burbujas

interfirieran en el análisis.

2. La fase móvil se distribuía a la columna por una bomba, en este caso se

utilizó una bomba ISCO, modelo 2350. Esta debía ser programada para que

fluyera la fase móvil a una presión constante. Se controló la presión y el

flujo (volumen /min) porque de esta forma habrá una separación constante

basada en la presión y en el tiempo de análisis. En este caso se utilizó un

flujo isocrático (constante) de 0.8 mL/min y la presión se mantuvo en el

rango de 740 - 810 PSI.

3. Antes de la columna de separación se recomienda colocar una “columna de

protección” o “pre-columna” para prevenir la contaminación o daños en la

columna principal por partículas pequeñas presentes en la muestra o en la

fase móvil. Para este análisis se ha utilizado una precolumna Prevail para

ácidos carboxílicos (Diámetro interno de 4.6 mm y largo de 7.5 mm).

4. La columna de separación contiene el “empacado” necesario para cumplir

con la separación deseada de compuestos. En este caso se utilizó una

columna de fase inversa Alltech Prevail para ácidos carboxílicos, con 5µm

de empacado, con diámetro interno de 4.6 mm y largo de 150 mm (Alltech

Chromatography, Deerfield, IL, EEUU).

5. El inyector automático utilizado, Alltech 570, trae incorporado su

controlador. Posee un carrusel con espacio para 100 viales, en cada vial

(cuya capacidad es de 1.5 mL) se puede colocar una muestra. El

controlador solamente permite controlar para el conjunto de muestras los

parámetros de volumen de inyección (20 µL), el número de repeticiones (3),

el tiempo de análisis (20 minutos). Luego de cada inyección, para evitar

cualquier contaminación, el circuito en contacto con la muestra se enjuaga

con el mismo líquido de la fase móvil, se programó un volumen de 100 µL

para este enjuague.

6. Se utilizó un detector de absorbancia Ultravioleta/ Visible, Spectraphysics,

SP 8450. Este permitió ajustar la longitud de onda en 214 nm, tal como

recomiendan López et al (1989) para la detección de ácidos carboxílicos en

muestras de mucílagos de café.

7. Para la recolección de datos se utilizó el sistema Peak Simple, el cual está

compuesto por un hardware y un software. El detector se conecta

directamente al hardware, posteriormente la señal es enviada al sistema de

análisis por medio del software Peak Simple V. 3.29 de SRI, Inc (2004).

Este sistema permite simplificar la integración manual y automática de las

áreas bajo los picos, identificar los picos en el cromatograma (“agregando”

componentes en dependencia de sus tiempos de retención), realizar tareas

más complejas como la extrapolación de diferentes cromatogramas,

exportar los resultados hacia otros programas como Microsoft Excel ®,

guardar los cromatogramas en archivos y posteriormente abrirlos en

cualquier otra computadora, obtener reportes impresos de los datos

obtenidos.

Un resumen de las condiciones de análisis cromatográfico se presenta en la

Tabla 7.

Tabla 7 - Condiciones de análisis cromatográfico.

Compuesto Fosfato de amonio dibásico 0.5%, pH 2.5-2.8

Bomba ISCO 2350 Flujo 0.8 mL/min

Fase móvil

Presión 740-850 PSI Tipo de columna Fase inversa, Alltech Prevail para ácidos

carboxílicos. Dimensiones (diámetro interno x largo)

4.6 x 150 mm

Fase estacionaria

Diámetro del empacado 0.5 µm Modelo Alltech 570, inyector automático Volumen inyectado 100 µL Número de inyecciones 3 Tiempo de análisis 20 minutos

Inyector

Volumen de enjuague entre inyecciones

100 µL

Modelo Spectraphysics, SP 8450. Detector Longitud de onda 214 nm Hardware Sistema Peak Simple Recolección de

datos Software Peak Simple, V. 3.29, SRI, Inc (2004)

Figura 13- Módulos del sistema HPLC utilizados en la presente investigación.

Los módulos del sistema HPLC utilizados en la presente investigación consisten en (a) Reservorio de solventes para la fase móvil (b)Un sistema de bombeo ISCO 2350, ISCO inc, USA acoplado a un sistema de programación por gradiente ISCO 2360 (c) Inyector Alltech 570 (d) Columna Alltech Prevail para ácidos carboxílicos, Chrom 9384 (e) Detector Ultra Violeta Spectraphysics, SP 8450 UV/Vis Detector (f) Sistema para colectar los datos Peak Simple Chromatography Data System (g) Computadora para visualización y almacenamiento de la información, se utilizó el software Peak Simple Version 3.29 de SRI, Inc (2004).

4.3.3 Análisis cualitativo

El análisis cualitativo tiene como objetivo identificar los tiempos de retención o el

orden de elusión de los compuestos en una muestra, en este caso los ácidos

carboxílicos, para esto se hicieron los siguientes ensayos:

1. Inyección de muestras estándares de los ácidos carboxílicos que se

presumía estarían presentes en las muestras de café. Se utilizaron ácidos

carboxílicos (galacturónico, málico, cítrico, láctico, propiónico, acético y fórmico)

diluidos en agua destilada con calidad HPLC, algunas características de estos

ácidos se detallan en la Tabla 8. Para cada ácido se analizaron cinco

concentraciones diferentes (1, 2, 3, 4, 5 mg/mL), se registraron los tiempos y por

ende, el orden de elusión de los compuestos. Las condiciones de análisis se

presentan en la Tabla 9.

Tabla 8 - Características de los ácidos carboxílicos utilizados como estándares.

Ácido Grado de pureza

Fabricante Fórmula Peso Molecular

(g/mol)

Fase

Fórmico 95 – 97% Sigma Chemical, USA

HCOOH 46.0 Líquido

Propiónico ND ND CH3CH2COOH 74.0 Líquido Galacturónico 98% Fluka, Suiza C6H9NaO7 216.12 Sólido

Málico ND Sigma, China C4H6O5 134.09 Sólido

Láctico ND J.T. Baker Chemical, USA

C3H6O3 90.1 Líquido

Acético 100% Fisher Scientific, USA

CH3COOH 60.0 Líquido

Cítrico 99.9% J.T. Baker Chemical, USA

H3C6H5O7 192.13 Sólido

ND: No indicado en el envase pero mayor a 95% de acuerdo a los registros del inventario

en el laboratorio.

Tabla 9 - Condiciones de análisis cromatográfico para el análisis cualitativo (tiempos y orden de elusión de ácidos carboxílicos)

Sistema de bombeo: Beckmann. Sistema de inyección: Inyector automático Alltech 570. Volumen de inyección: 100 µl Columna: Alltech Prevail para ácidos carboxílicos Chrom 9384 Fase móvil: Fosfato de amonio 0.5 %, pH 2.8 Flujo: 1 mL /min Detector: Spectraphysics SP 8450 UV/Vis Detector Tiempo de elusión: 15 minutos

2. Se realizó un análisis de los tiempos y órdenes de elusión de los ácidos

carboxílicos tomando en cuenta un medio diferente al agua con calidad HPLC,

este medio fue el extracto de mucílago de café. Se utilizaron las mismas

condiciones cromatográficas con que se analizaron todas las muestras (Tabla 7).

En este caso se utilizaron ácidos carboxílicos estándares (Tabla 9), estos

estándares se mezclaron en una sola solución a una concentración de 8 mg/mL.

Posteriormente se realizaron diferentes ensayos con muestras representativas de

cada grupo experimental (Tabla 10).

Los resultados de los cromatogramas de las soluciones de mucílago más los

estándares se compararon con los cromatogramas resultantes de soluciones de

mucílago sin estándares. Esto se realizó con la sobreposición de cromatogramas

mediante el software PeakSimple ®, de esta forma fue posible apreciar los

tiempos de retención en que hubo aumento en las áreas de los picos.

Tabla 10 - Muestras con que se realizó el análisis cualitativo.

Grupo experimental /pH

en que se interrumpió la fermentación

Código Características de la solución

1400 µL muestra, 200 µL estándares a 8 mg/mL 1400 µL muestra, 200 µL ácido fórmico (1mg/mL) *

3.7 5307 D

1400 µL muestra, 200 µL patrón interno (blanco) 1400 µL muestra, 100 µL estándares 1400 µL muestra, 200 µL estándares

3.9 6832 K

1400 µL muestra, 200 µL patrón interno (blanco) 1400 µL muestra, 100 µL estándares 1400 µL muestra, 200 µL estándares

4.8 6346 E

1400 µL muestra, 200 µL patrón interno (blanco) 1400 µL muestra, 100 µL estándares 1400 µL muestra, 200 µL µL estándares

6.3 8410 B

1400 µL muestra, 200 µL patrón interno (blanco) (*) Se realizó este ensayo con ácido fórmico para determinar la posición de este pico con respecto a la de un pico aledaño.

4.3.4 Análisis cuantitativo

El análisis cuantitativo permitió determinar la cantidad de analito presente en la

muestra. En los análisis cromatográficos se pueden utilizar una amplia variedad de

métodos para cuantificar al analito, Snyder (1997) menciona como más

sobresalientes a las normalizaciones tanto interna como con factor de respuesta y

a los patrones externo o interno.

En esta investigación se utilizó el método del patrón interno, Johnson y Stevenson

(1978) indican que éste sirve para minimizar los errores asociados a la

preparación de la muestra, del aparato y de la técnica.

Este método consiste en la adición de un estándar que posee un tiempo de

retención diferente, pero que estructuralmente está relacionado con la muestra. Se

prepara una mezcla de ácidos carboxílicos estándares y del patrón interno para

ser inyectada en el cromatógrafo. La composición puede determinarse a través de

las áreas de los picos del patrón interno y del compuesto de interés. Cabe

destacar que esta técnica no deja establecido que todos los compuestos han sido

elucidados y detectados en el cromatograma, en efecto, esta técnica a menudo

indica que podrían existir otros compuestos en la muestra original pero no han

sido determinados (por eso es importante realizar un análisis cualitativo de forma

paralela).

Los requisitos que debe cumplir una solución para ser considerada patrón interno

son los siguientes:

• El pico producido debe destacarse claramente del resto de los picos en la

muestra.

• Debe elucidarse cerca de los picos de interés.

• Debe ser similar en concentración y respuesta al detector que los picos de

interés.

• No debe de reaccionar con ningún compuesto en la mezcla.

• No debe de estar presente en la muestra original.

• Debe ser de alta pureza y de disponibilidad inmediata.

El compuesto que cumplió todos estos requisitos y por lo tanto se utilizó como

patrón interno es el ácido pirazincarboxílico, cuya fórmula es C5H4O2N2, su

estructura molecular se presenta en la Figura 14.

Esta técnica también requirió disponibilidad de estándares puros de los

compuestos de interés (ya se presentaron en la Tabla 8). Con los estándares se

prepararon diferentes mezclas que contenían los compuestos de interés a

diferentes concentraciones, pero todos contenían la misma cantidad de patrón

interno. Luego de realizar el análisis cromatográfico y de obtener las áreas bajo los

picos, se preparó una curva de calibración (Figura 15) al graficar la concentración

de ácido (Cm) en dependencia de Ai/ Api (donde Ai es el área de los estándares y

Api es el área del patrón interno).

Figura 14 - Ácido pirazincarboxílico (patrón interno).

Figura 15 - Curva de calibración para el análisis por el método del patrón interno.

Puesto que la cantidad de patrón interno que se adiciona a las muestras y a los estándares es la misma (Cmpi) el eje de las X se puede representar simplemente como la concentración en ácido (Cmi). Adaptado de Johnson y Stevenson (1978).

Adaptado de Smith y Martell (1989).

El patrón interno que se seleccionó, presentó un tiempo de retención de 13.633

minutos, el cual es diferente del resto de ácidos carboxílicos utilizados como

estándares. Se decidió utilizar una concentración de 0.05 mg/mL, porque se

observó que la absorbancia en UV/Vis a la longitud de onda de 214 nm brinda un

área similar al resto de estándares, el cromatograma puede verse en Anexos,

Sección 10.

4.4 ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

4.4.1 Cálculo de la incertidumbre asociada a la curva de calibración

Se utilizaron las técnicas de análisis estadístico propuesto por Loconto (2006). La

curva de calibración obtenida por el método del patrón interno se analizó con el

objetivo de identificar qué tan confiable son los parámetros obtenidos por el

método de los mínimos cuadrados. Para ello primeramente se encontró la

desviación estándar de la recta de calibración sumando los cuadrados de las

diferencias entre las respuestas experimentales y calculadas del detector para los

N puntos de calibración (Ecuación 1):

Ecuación 1

Aquí Sy/x representa la desviación estándar de los residuales verticales y N-2

representa el número de grados de libertad. N es el número de números puntos de

datos x, y que se utilizaron para construir la recta de calibración, menos un grado

de libertad utilizado para calcular la pendiente y un segundo grado de libertad que

se utilizó para determinar el intercepto en y.

2)( 2

/ −−

= ∑N

yyS

ci

ei

xy

La incertidumbre tanto de la pendiente como del intercepto de la curva de

calibración se encontraron utilizando las siguientes ecuaciones, las cuales

permitieron calcular tanto la desviación estándar de la pendiente, Sm (Ecuación 2),

como la desviación estándar en el intercepto, Sb (Ecuación 3):

Ecuación 2

Ecuación 3

4.4.2 Cálculo de la incertidumbre asociada a la interpolación de resultados

Para una determinada respuesta del instrumento, y0, el valor correspondiente x0

se obtuvo por la interpolación de la curva de calibración. La desviación estándar

en x0 se obtuvo mediante la Ecuación 4:

Ecuación 4

En donde Sx0 representa la desviación estándar en el valor interpolado x0 y L

representa el número de réplicas en la medición de y0 para la calibración, teniendo

N puntos de datos x, y.

∑ −=

N

i i

xym

xx

SS /

∑∑

−=

N

i i

i ixyb

xxN

xSS

2

2/

∑ −

−++= N

i i

xyx

xxmyy

NLmS

S 22

20/

0)(11

4.4.3 Cálculo de los límites de detección del método

Una de las principales ventajas de utilizar métodos instrumentales de análisis es

que estos son capaces de detectar y determinar trazas y ultratrazas de los

analitos. En términos generales, el límite de detección de un analito puede

describirse como la concentración que brinda una respuesta del instrumento

distinta a la del “blanco” o la del “ruido”.

En esta investigación se utilizó la fórmula planteada por la Agencia de Protección

Ambiental de Estados Unidos (U.S. Environmental Protection Agency, 2004) para

calcular el límite de detección del método (MDL), este se define como la mínima

concentración de una sustancia que puede medirse y puede reportarse con un

99 % de confianza que la concentración del analito será mayor de cero. MDL no

implica ni exactitud ni precisión en el método cuantitativo.

El método de la USEPA especifica un mínimo de siete réplicas (n) de muestras

con cantidades bajas añadidas de un estándar. Estas réplicas se analizan por

medio del instrumento y su señal se registra, los datos producirán una distribución

normal. Por lo tanto este método consiste en la concentración a la cual no más

que 1% de las mediciones en blanco resultan en detecciones falsas positivas (esto

implica reportar una detección cuando la sustancia no está presente en la

muestra), para su cálculo se utilizó la Ecuación 5:

Ecuación 5

ciasignifican de nivellibertad de grados 1-ncon Student de t de valor t

n deestándar desviación s7 esn general lopor

oinstrument el mediante analizados estándares de réplicas de número n:dondeEn

===

=

α

99.0,1M =−+= αntsDL

El significado de esta definición se ilustra con más detalles en la Figura 16. La

curva A representa la distribución normal de los valores medidos de la señal del

blanco. Es posible identificar un punto y = P, en la parte más alta de esta

distribución e indicar que una señal mayor que este valor difícilmente pueda

deberse al blanco, mientras que una señal inferior a P se asume como resultado

de la muestra blanco.

Figura 16 - Definiciones del límite de detección del Método (MDL)

Finalmente se calculó el valor de concentración que corresponde a este límite de

detección mediante una sustitución en la recta de calibración obtenida por el

método de los mínimos cuadrados (Ecuación 6), los valores MDL corresponden al

límite de detección (Ecuación 5).

Ecuación 6

El método de la Agencia de protección Ambiental de Estados Unidos está diseñado para una concentración que provean un rango falso positivo de no más del 1 por ciento (s es la desviación estándar; t es el valor de la t de Student al 99 % de confianza). Adaptado de USEPA (2004)

pendienteerceptoMDLxerceptoMDL

/)int( xpendiente int

0

0

−=+=

4.4.4 Muestras analizadas

Las muestras a las que se realizó análisis cromatográfico se presentan en la

Tabla 11.

Tabla 11 - Muestras utilizadas para el análisis con HPLC

Experimento Código pH (papel) Archivo del cromatograma

5082 4.5 coffee_nic1408189 3.9 coffee_nic798410 6.3 coffee_nic883470 4.3 coffee_nic852585 4.2 coffee_nic826053 4.7 coffee_nic1492837 4.2 coffee_nic1466053 6.3 coffee_nic1521510 4 coffee_nic1435307 3.7 coffee_nic1121293 4.2 coffee_nic1185122 3.9 coffee_nic1156346 4.8 coffee_nic1343727 4.2 coffee_nic1319370 3.8 coffee_nic1287118 4.4 coffee_nic1379296 4.7 coffee_nic1596181 3.9 coffee_nic1568071 6.1 coffee_nic1685000 4 coffee_nic1719801 4.2 coffee_nic1746615 4.4 coffee_nic1802935 6.1 coffee_nic1835169 4.5 coffee_nic1862935 4.6 coffee_nic189

Beneficio coffee_nic1928507 4 coffee_nic1986319 3.8 coffee_nic1956319 6.1 coffee_nic2015583 4.3 coffee_nic2276832 3.9 coffee_nic2306174 4.7 coffee_nic2336174 6.1 coffee_nic2367060 4.2 coffee_nic2393539 3.9 coffee_nic2428548 3.8 coffee_nic245

B

C

D

E

F

K

L

G

H

J

Los nombres de los archivos listados corresponden al archivo impreso del

cromatograma, se puede ver que cada muestra se analizó por triplicado, ello tenía

el objetivo de obtener una desviación estándar y un análisis estadístico más

apropiado.

4.4.5 Instrumento de obtención de datos

Consistió en una matriz dividida en tres columnas (grupos experimentales).

Existen divisiones horizontales cada 10 filas (una fila por muestra) para un registro

separado de cada subvariable (Tabla 12). Los resultados recolectados en el

instrumento se presentan en la Sección 5.2.3.

Tabla 12 - Instrumento para la recolección de datos.

Concentración de ácido orgánico

Inicial (pH= 6.1-6.3)

1 (pH= 4,8-4,5)

2 (pH= 4,4-4,1)

3 (pH= 4,0-3,6)

Á. Acético 10 filas, 1 por muestra

A. Propiónico 10 filas

A. Láctico 10 filas

A. Cítrico 10 filas

A. Málico 10 filas

A. Galacturónico 10 filas

Grupos y duplicados

Subvariables

4.4.6 Técnicas estadísticas para el análisis de los datos

Para el análisis estadístico, se siguieron las recomendaciones de Miller y Miller

(2000). Se utilizó el software SPSS V.11.0 (Lead Software, 1991) con el fin de

realizar las pruebas estadísticas de forma más eficiente.

Se hicieron dos tipos de análisis a los datos plasmados en el instrumento de

investigación. Primeramente se hicieron comparaciones estadísticas para

identificar las fuentes de variación entre los grupos (inicial, uno, dos y tres) sin

tomar en consideración las variaciones debidas a los experimentos. En ese caso

se tomó en cuenta una configuración de ANOVA una vía.

A los datos configurados mediante ese diseño (Ver Sección 5.3.1) se realizó en

primer lugar un análisis exploratorio (Ver Sección 5.3.2) con el propósito de

determinar si seguían una distribución normal (prueba Kolmogorov-Smirnov). Con este mismo análisis exploratorio se obtuvieron gráficos de cajas o boxplots

con el propósito de evaluar de una forma rápida aspectos como la distribución de

los valores alrededor de la mediana y la identificación de potenciales puntos

aberrantes. Los puntos sospechosos de ser aberrantes se sometieron a una

prueba estadística (Prueba de Dixon para pruebas con 3 a 7 datos, o la Prueba de Grubbs para mayor número de datos) para determinar si se descartaban o no

de los datos antes de proceder con otras pruebas.

Cuando se hubo determinado si las muestras seguían una distribución normal, se

utilizó la prueba paramétrica ANOVA una vía (Sección 5.3.2.1). Una variación de

la prueba ANOVA una vía permitió realizar contrastes entre grupos para

determinar entre cuáles yacían las tendencias que hacía variar entre sí a los

grupos.

Se utilizó una prueba no paramétrica en caso que los datos no siguieran una

distribución normal: prueba Kruskali-Wallis, la prueba de las Medianas se utilizó

como una prueba no paramétrica de respaldo (Sección 5.3.2.2).

Posteriormente los datos se analizaron tomando en cuenta las variaciones tanto

entre grupos como entre experimentos, en ese caso se utilizó una configuración

experimental ANOVA dos vías (Sección 5.3.4).

Dicha configuración permite comparaciones solamente si no existen espacios en

blanco tanto para las columnas como para las filas presentes en el instrumento de

investigación. Es decir, las columnas y las filas por comparar deben poseer el

mismo número de datos.

5 RESULTADOS

5.1 ANÁLISIS CUALITATIVO

5.1.1 Orden de elusión de ácidos carboxílicos

El primer experimento tuvo como objetivo determinar el orden de elusión de los

ácidos carboxílicos que se deseaban identificar y cuantificar en el mucílago de

café. Como se indicó en la sección 4.3.3, esto se realizó con estándares de ácidos

carboxílicos diluidos con agua calidad HPLC, las concentraciones de trabajo

fueron de 1, 2, 3, 4 y 5 mg/mL. Los tiempos de elusión promedio para cada

concentración de cada ácido facilitaron la determinación del orden de elusión, la

Tabla 13 presenta este orden y los cromatogramas se pueden consultar en

Anexos, Sección 10.

Tabla 13 - Orden de elusión de ácidos carboxílicos, análisis cualitativo

Ácido orgánico

Tiempo de elusión promedio (min)

Orden de elusión

Galacturónico 2.0 1Fórmico 2.5 2Málico 3.0 3Láctico 3.7 4Acético 4.2 5Citríco 5.3 6Propiónico 11.1 7

Esta identificación se realizó con las condiciones de análisis cromatográfico

establecidas en la Tabla 9, pág. 66. Aunque las condiciones de análisis

cromatográfico cambiarían para la elaboración de la curva de calibración y para el

análisis de las muestras, el conocimiento de los órdenes de elusión fue

fundamental para identificar los picos en dichos análisis.

Uno de los elementos que se modificó en los posteriores análisis fue el flujo de

elusión de la fase móvil, originalmente este fue de 1 mL/min, sin embargo esto

probó ser un flujo muy alto, no suficiente como para separar los componentes de

la muestra y por ende la resolución de los picos en el cromatograma no era

adecuada. Con un flujo de 0.8 mL/min se separaron mejor los componentes y los

picos se pudieron integrar mejor.

5.1.2 Identificación de ácidos carboxílicos en las muestras

Los picos que se eluyeron en cada uno de los cromatogramas se identificaron

inicialmente por letras en orden alfabético (A-M), esto con el objetivo de agilizar el

análisis cuantitativo (determinación de áreas) y así evitar errores de adjudicación

de identidad a un determinado pico. En el diseño de impresión de cada

cromatograma se agregó un reporte en el cual se identificaban estos picos con su

tiempo de elusión, altura y área.

Los datos de cada uno de estos picos junto con su área se añadieron a una hoja

de cálculos (hoja madre), para posteriormente identificar a qué ácidos

correspondían cada uno de estos picos y luego utilizar los datos de área para

propósitos del análisis cuantitativo.

Para realizar dicha identificación, se seleccionaron tres muestras representativas

de todo el conjunto disponible y provenientes de experimentos diferentes, pero

que mostraron una resolución aceptable de los picos para cada ácido orgánico.

Cada muestra se separó en tres viales y a cada vial se añadieron diferentes

volúmenes de la mezcla de ácidos carboxílicos a una concentración de 8 mg/mL,

al tercer vial se añadió solamente el patrón interno (una descripción detallada de

este procedimiento se indicó en la Sección 4.3.3).

El propósito de añadir una mezcla de estándares era aumentar el área de los

picos de la muestra, posteriormente se sobrepondrían ambos cromatogramas (la

muestra sin la mezcla de ácidos y la muestra con la mezcla de ácidos), la

diferencia en el área de cada uno de los picos identificados previamente con las

letras de la A-M indicarían qué picos presentaron un aumento sustancial.

La seguridad o la decisión de otorgarle a un determinado pico un ácido en

particular, se basaría en los hallazgos previos del orden de elusión (ver

Sección 5.1.1).

Luego de analizados los cromatogramas para las tres muestras se encontró que

los picos que incrementaron fueron A, C, D, E, G, I, K y L. El pico M correspondía

por defecto al patrón interno: ácido pyrazincarboxílico. Los cromatogramas se

pueden consultar en Anexos, Sección 10.3.

Basado en los anteriores resultados, se concluyó que los siguientes picos en los

cromatogramas correspondían a los siguientes ácidos (Tabla 14).

Tabla 14 - Picos en los cromatogramas y ácidos carboxílicos a los que corresponden

Picos en el cromatograma Ácido orgánico al que correspondería A Galacturónico B Fórmico D Málico E ND* G Acético I Cítrico L Propiónico M Patrón interno (Pirazinecarboxílico)

* Al inicio este pico se creía que pertenecía al ácido láctico.

Una dificultad especial se presentó inicialmente con la identificación de los picos D

y E, sus tiempos de elusión eran muy similares y por lo tanto habían posibilidades

de cometer errores al otorgarle un valor en especial. Finalmente un análisis con

adición de ácido Málico permitió concluir que el pico D correspondía a dicho ácido.

El pico E por el contrario constituyó una identificación particularmente difícil y se

concluyó que no correspondía a ninguno de los siete estándares utilizados,

aunque en un inicio se creía que dicho pico correspondería al ácido láctico, como

se verá más adelante los controles realizados con el sistema Reflectoquant ® no

arrojaron resultados concordantes en cuanto a la concentración. Por otro lado al

adicionar una concentración más concentrada de la mezcla de estándares, el pico

E parece dividirse en dos, con la aparición de un segundo pico muy cerca de la

localización F.

Por esta razón el ácido láctico no pudo identificarse con la misma seguridad como

la manifestada para los anteriores picos.

5.2 ANÁLISIS CUANTITATIVO

5.2.1 Curvas de calibración

Para la elaboración de las curvas de calibración se utilizaron las condiciones de

análisis especificadas en la Tabla 7, página 63. Básicamente se cambió el flujo de

elusión de la fase móvil hacia 0.8 mL/min con el fin de definir mejor los picos del

cromatograma.

Con las nuevas condiciones de análisis, los tiempos de retención variaron

significativamente, de hecho como parámetro para definir la identidad de cada pico

se utilizaron los rangos de tiempos de retención especificados en la Tabla 15.

Tabla 15 - Tiempos de retención para los ácidos utilizados en la elaboración de la curva de calibración

Tiempo de retención (min)

Componentes

Inicio Fin

Á. Galacturónico 1.95 2.45 Á. Fórmico 2.464 2.954 Á. Málico 3.154 3.511 Á. Láctico 3.643 4.18 Á. Acético 4.287 4.747 Á. Cítrico 5.867 6.534 Á. Propiónico 10.214 11.664 Patrón Interno 14.121 15.344

Como se indicó en la sección 4.3.3, la elaboración de esta curva requirió la

disponibilidad de soluciones estándares constituidas por mezclas de ácidos

carboxílicos a una concentración específica y con una concentración igual de

patrón interno en cada una de estas soluciones estándares. En la Tabla 16 se

resumen las condiciones de dilución de los diferentes estándares con los que se

preparó la curva de calibración.

Tabla 16 - Condiciones de dilución de estándares para la elaboración de la curva de calibración.

Concentración de ácidos carboxílicos

en la mezcla

(mg/mL)

Volumen total (µL)

Volumen de ácidos

en la mezcla

(µL)

Volumen de patrón

interno 0.05

mg/mL (µL)

0.4 1.2 2.4 4 6 8

Blanco

1600 1400 200

Cabe destacar que se realizaron tres repeticiones para cada medición. Los datos

incluidos la Tabla 16 se utilizaron como factor de dilución para calcular la

concentración real de los estándares al momento de determinar sus áreas. Se

presentan a continuación los gráficos que contienen las curvas de calibración para

cada uno de los ácidos carboxílicos objetos de estudio, los cromatogramas

correspondientes se presentan en Anexos, Sección 10.4.

Como se definió en la Figura 15, el eje y corresponde al promedio del cociente del

área del estándar entre el área del patrón interno. El eje x por su parte

corresponde a la concentración del estándar tomando en cuenta el factor de

dilución.

Al sustituir y en la ecuación de la línea de regresión, se obtiene la concentración

del ácido en la muestra. Bajo cada gráfico se incluye las estadísticas siguientes:

Sy/x (Ecuación 1), xbar que corresponde al promedio del eje x, ybar corresponde

al promedio del eje y, Sslope corresponde a Sm (Ecuación 2), Sintercept

corresponde a Sb (Ecuación 3), Slope corresponde a la pendiente de la ecuación

de regresión, n al número de puntos x, y.

Para cada uno de los ácidos cuantificables en esta investigación se presenta un

gráfico en el que se incluye la ecuación de la curva y su coeficiente de determinación R2. Bajo el gráfico se incluyen dos tablas, en la primera se

incluyen los datos con que se elaboró la curva y en la segunda los estadísticos de

importancia. A continuación se listan los ácidos y el número de figura que

corresponde a su gráfico de calibración.

Ácido orgánico Figura Galacturónico Figura 17 Fórmico Figura 18 Málico Figura 19 Láctico Figura 20 Acético Figura 21 Cítrico Figura 22 Propiónico Figura 23

Es importante destacar que el coeficiente de determinación R2 no indica por sí

solo la calidad de la correlación, pero su raíz cuadrada R (coeficiente de

correlación) si es adecuado. En las gráficas se indica solamente el primero, esto

se debe a que es el que presenta por defecto el Software Microsoft Excel ®, sin

embargo la mayoría de las curvas de regresión poseen un coeficiente con un valor

superior a R2 =.99. Al calcular R, el valor obtenido es muy aproximado. Esto lleva

a la conclusión que las curvas de calibración poseen una excelente correlación.

Se puede apreciar que los valores del intercepto en y son negativos, esto se

analizó con detalle y es posible que sea el resultado de un error sistemático en la

etapa de medición de volúmenes o por parte del instrumento.

Figura 17 - Curva de calibración para ácido galacturónico

Calibration Curve for Galacturonic Acid

y = 1.2083x - 0.1343R2 = 0.997

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

Concentration (mg/mL)

Ai/A

pi

Ci (mg/ml) Ai/Api

Sy/x 0.190.00 0.00 xbar 2.750.35 0.41 ybar 3.191.05 1.14 Sslope 0.032.10 2.23 Sintercept 0.113.50 3.89 Slope 1.215.25 6.08 Intercept -0.137.00 8.57 n 7.00

Datos de la curva de calibración, ácido galacturónico

Datos Estadísticos

Figura 18 - Curva de calibración para ácido fórmico

Calibration Curve for Formic Acid

y = 3.1534x - 0.2802R2 = 0.9975

-5

0

5

10

15

20

25

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Concentration (mg/mL)

Ai/A

pi

Ci (mg/ml) Ai/ApiSy/x 0.46

0 0.00 xbar 2.750.35 1.02 ybar 8.391.05 3.07 Sslope 0.07

2.1 6.16 Sintercept 0.263.5 10.23 Slope 3.15

5.25 15.83 Intercept -0.287 22.43 n 7.00

Datos estadísticosDatos de la curva de calibración, ácido fórmico

Figura 19 - Curva de calibración para ácido málico

Calibration Curve for Malic Acid

y = 2.9278x - 0.2847R2 = 0.9974

-5

0

5

10

15

20

25

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Concentration (mg/ml)

Ai/A

pi

Ci (mg/ml) Ai/ApiSy/x 0.43

0 0.00 xbar 2.750.35 0.93 ybar 7.771.05 2.81 Sslope 0.07

2.1 5.67 Sintercept 0.253.5 9.46 Slope 2.93

5.25 14.67 Intercept -0.287 20.81 n 7.00

Datos de la curva de calibración, ácido málico

Datos estadísticos

Figura 20 - Curva de calibración para ácido láctico

Calibration Curve for Lactic Acid

y = 1.6744x - 0.225R2 = 0.995

-2

0

2

4

6

8

10

12

14

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

Concentration (mg/mL)

Ai/A

pi

Ci (mg/ml)

Ai/Api

Sy/x 0.340.00 0.00 xbar 2.750.35 0.51 ybar 4.381.05 1.55 Sslope 0.052.10 3.14 Sintercept 0.193.50 5.27 Slope 1.675.25 8.22 Intercept -0.227.00 11.98 n 7.00

Datos estadísticosDatos de la curva de calibración, ácido láctico

Figura 21 - Curva de calibración para ácido acético

Calibration Curve for Acetic Acid

y = 1.7445x - 0.1809R2 = 0.9971

-2

0

2

4

6

8

10

12

14

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

Concentration (mg/mL)

Ai/A

pi

Ci (mg/ml) Ai/Api Sy/x 0.270.00 0.00 xbar 2.750.35 0.55 ybar 4.621.05 1.67 Sslope 0.042.10 3.36 Sintercept 0.163.50 5.60 Slope 1.745.25 8.73 Intercept -0.187.00 12.41 n 7.00

Datos de la curva de calibración, ácido acético

Datos estadísticos

Figura 22 - Curva de calibración para ácido cítrico

Calibration Curve for Citric Acid

y = 4.2093x - 0.6756R2 = 0.992

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

Concentration (mg/mL)

Ai/A

pi

Ci (mg/ml)

Ai/Api Sy/x1.09

0.00 0.00 xbar 2.750.35 1.26 ybar 10.901.05 3.83 Sslope 0.172.10 7.73 Sintercept 0.623.50 12.86 Slope 4.215.25 20.29 Intercept -0.687.00 30.33 n 7.00

Datos estadísticosDatos de la curva de calibración, ácido cítrico

Figura 23 - Curva de calibración para el ácido propiónico

Calibration Curve for Propionic Acid

y = 1.8139x - 0.1955R2 = 0.9927

-2

0

2

4

6

8

10

12

14

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

Concentration (mg/mL)

Ai/A

pi

Ci (mg/ml) Ai/Api Sy/x 0.450.00 0.00 xbar 2.750.35 0.63 ybar 4.791.05 1.96 Sslope 0.072.10 3.28 Sintercept 0.263.50 5.63 Slope 1.815.25 8.97 Intercept -0.207.00 13.09 n 7.00

Datos de la curva de calibración, ácido propiónico

Datos estadísticos

5.2.2 Límite de detección del método (MDL o LDM)

Como se mencionó anteriormente, el LDM sirve para indicar bajo cual

concentración el método posee un gran margen de error para asegurar la

presencia o ausencia de un analito.

Para la obtención del LDM se siguieron los procedimientos estipulados en la

Sección 4.4.3. Recapitulando, se corrieron 12 repeticiones de análisis de una

muestra que contenía los siete estándares de ácidos carboxílicos y el patrón

interno a una concentración tan baja como una de las utilizadas para elaborar la

curva de calibración. Posteriormente, se determinó la desviación estándar del

cociente del área de cada ácido entre el área del patrón interno (para cada

cromatograma). Esta desviación estándar se multiplicó por el valor de la t de

student (n-1, α=0.99). Los resultados se indican en la Tabla 17.

Tabla 17 - Límites de detección del método para cada ácido.

Ácido s (Ai/Api) n t MDL X0

(mg/mL) Galacturónico 0.0130 0.0398 0.1441Fórmico 0.0288 0.0879 0.1167Málico 0.0232 0.0707 0.1214Láctico 0.0121 0.0368 0.1563Acético 0.0129 0.0393 0.1262Cítrico 0.0276 0.0840 0.1805Propiónico 0.0575

12 3.05

0.1755 0.2046

Hay que señalar que el valor de X0 se obtuvo mediante los datos de la curva de

calibración para cada ácido en particular, razón por la cual se expresa como

mg/mL.

5.2.3 Matrices de resultados con las concentraciones de ácidos carboxílicos determinadas analíticamente mediante HPLC

El diseño experimental que se explicó en la Sección 4.4.5 permite ver que cada

ácido se analizó por separado. El objetivo de esta sección es presentar de forma

general los resultados (mg/mL) obtenidos para cada ácido. Las secciones

posteriores analizarán el comportamiento de cada ácido por separado. Los

cromatogramas pueden consultarse en Anexos, Sección 10.5.

Para determinar las concentraciones en ácidos carboxílicos en las distintas

muestras, se recurrió al procedimiento del patrón interno (Sección 4.3.4), para ello

se utilizó también la curva de calibración de cada ácido orgánico, tal como se

explicó anteriormente.

Posteriormente la concentración se determinó al sustituir la media del cociente del

área del ácido (encontrado en cada cromatograma) entre el área del patrón interno

del mismo cromatograma (eje y) en la ecuación de la curva de calibración.

La desviación estándar (Sx0) se determinó mediante la Ecuación 4 y se indica con

color rojo en la columna de la izquierda de cada concentración. Las tablas de

resultados también permiten apreciar la conformación de los grupos

experimentales (el grupo beneficio fueron muestras obtenidas fuera de las

condiciones experimentales y no se incluirán en los posteriores análisis

estadísticos), el grupo inicial incluye las muestras cuya fermentación se

interrumpió entre los pH de 6.1 y 6.3. El grupo 1 por su parte incluye las muestras

cuya fermentación se interrumpió entre los pH de 4.5 y 4.8. Las muestras del

grupo 2 se interrumpieron a un pH entre 4.1 y 4.4 y las muestras del grupo 3 a un

pH entre 3.7 y 4.

A continuación se presentan los ácidos galacturónico (Tabla 18), fórmico

(Tabla 19), málico (Tabla 20), acético (Tabla 21), cítrico (Tabla 22) y propiónico

(Tabla 23).

Tabla 18 - Matriz de resultados para ácido galacturónico

B 7.35 0.16C 16.32 0.35DEF 6.15 0.14 6.37 0.14G 8.98 0.19H 8.61 0.18 12.30 0.26J 12.67 0.27K 14.24 0.30L 8.29 0.17

B 13.00 0.27C 13.58 0.29DE 9.72 0.20F 7.38 0.16GH 10.93 0.23 7.80 0.16JK 10.26 0.21L

B 9.18 0.19 11.27 0.24C 11.68 0.24D 11.59 0.24E 9.67 0.20F 12.70 0.27G 8.03 0.17H 20.14 0.44JK 10.38 0.22L 7.90 0.17

B 8.75 0.18C 14.92 0.32D 12.91 0.27 11.54 0.24E 5.67 0.13F 8.22 0.17G 7.87 0.17HJ 10.50 0.22 10.34 0.22K 12.22 0.26L 8.29 0.17

Exp.Ácido

Gal

actu

róni

co

Concentraciones (mg/ ml)

Grupo 2 (pH =4.4-4.1)

Grupo 3 (pH=4.0-3.6)

4.4 4.3 4.2

4 3.9 3.8 3.7

Grupo 1 (pH =4.8-4.5)

6.3 6.1

4.8 4.7 4.6 4.5

Benef. Inicial

En color rojo se presentan las desviaciones estándares de los resultados (Obtenidas mediante la Ecuación 4).

Tabla 19 - Matriz de resultados para ácido fórmico

B 0.36 0.11C 0.50 0.11DEF 0.36 0.11 0.32 0.11G 0.46 0.11HJ 0.79 0.11KL

B 0.43 0.11C 0.61 0.11DE 0.39 0.11F 0.31 0.11GH 0.43 0.11 0.33 0.11JKL

B 0.34 0.11 0.37 0.11C 0.53 0.11D 0.51 0.11E 0.34 0.11F 0.41 0.11G 0.35 0.11H 0.48 0.11JKL

B 0.37 0.11C 0.62 0.11D 0.51 0.11 0.49 0.11E 0.29 0.11F 0.33 0.11G 0.36 0.11HJ 0.41 0.11KL

Benef. Inicial

3.7

Grupo 1 (pH =4.8-4.5)

6.3 6.1

4.8 4.7 4.6 4.5

4.3 4.2

4 3.9 3.8

Exp.Ácido

Fórm

ico

Concentraciones (mg/ ml)

Grupo 2 (pH =4.4-4.1)

Grupo 3 (pH=4.0-3.6)

4.4

En color rojo se presentan las desviaciones estándares de los resultados (Obtenidas mediante la Ecuación 4).

Tabla 20 - Matriz de resultados para ácido málico

B 0.32 0.12C 0.35 0.12DEF 0.21 0.12 0.26 0.12G 0.32 0.12H 0.19 0.12 0.26 0.12J 0.28 0.12K 0.28 0.12L 0.17 0.12

B 0.23 0.12C 0.35 0.12DE 0.20 0.12F 0.21 0.12GH 0.20 0.12 0.17 0.12JK 0.19 0.12L

B 0.22 0.12 0.23 0.12C 0.31 0.12D 0.22 0.12E 0.20 0.12F 0.22 0.12G 0.19 0.12H 0.27 0.12JK 0.19 0.12L 0.17 0.12

B 0.21 0.12C 0.32 0.12D 0.20 0.12 0.20 0.12E 0.17 0.12F 0.18 0.12G 0.18 0.12HJ 0.19 0.12 0.20 0.12K 0.21 0.12L 0.27 0.12

Exp.Ácido

Mál

ico

Concentraciones (mg/ ml)

Grupo 2 (pH =4.4-4.1)

Grupo 3 (pH=4.0-3.6)

4.4 4.3 4.2

4 3.9 3.8

Benef. Inicial

3.7

Grupo 1 (pH =4.8-4.5)

6.3 6.1

4.8 4.7 4.6 4.5

En color rojo se presentan las desviaciones estándares de los resultados (Obtenidas mediante la Ecuación 4).

Tabla 21 - Matriz de resultados para ácido acético

B 0.31 0.12C 0.35 0.12DEF 0.36 0.12 0.28 0.12G 0.31 0.12H 0.23 0.12 0.26 0.12J 0.28 0.12K 0.28 0.12L 0.23 0.12

B 0.38 0.12C 0.40 0.12DE 0.23 0.12F 0.34 0.12GH 0.25 0.12 0.33 0.12JK 0.29 0.12L

B 0.34 0.12 0.36 0.12C 0.36 0.12D 0.48 0.12E 0.30 0.12F 0.23 0.12G 0.28 0.12H 0.29 0.12JK 0.37 0.12L 0.20 0.12

B 0.32 0.12C 0.47 0.12D 0.41 0.12 0.40 0.12E 0.24 0.12F 0.25 0.12G 0.28 0.12HJ 0.27 0.12 0.35 0.12K 0.29 0.12L 0.26 0.12

Exp.Ácido

Acé

tico

Concentraciones (mg/ ml)

Grupo 2 (pH =4.4-4.1)

Grupo 3 (pH=4.0-3.6)

4.4 4.3 4.2

4 3.9 3.8

Benef. Inicial

3.7

Grupo 1 (pH =4.8-4.5)

6.3 6.1

4.8 4.7 4.6 4.5

En color rojo se presentan las desviaciones estándares de los resultados (Obtenidas mediante la Ecuación 4).

Tabla 22 - Matriz de resultados para ácido cítrico

B 0.26 0.21C 0.26 0.21DEF 0.21 0.21 0.22 0.21G 0.25 0.21H 0.23 0.21 0.22 0.21J 0.23 0.21K 0.24 0.21L 0.22 0.21

B 0.27 0.20C 0.31 0.20DE 0.24 0.21F 0.24 0.21GH 0.23 0.21 0.22 0.21JK 0.28 0.20L

B 0.24 0.21 0.25 0.21C 0.27 0.20D 0.29 0.20E 0.24 0.21F 0.23 0.21G 0.24 0.21H 0.25 0.21JK 0.26 0.21L 0.23 0.21

B 0.25 0.21C 0.32 0.20D 0.29 0.20 0.29 0.20E 0.22 0.21F 0.22 0.21G 0.23 0.21HJ 0.23 0.21 0.26 0.21K 0.26 0.21L 0.22 0.21

Benef. Inicial

3.7

Grupo 1 (pH =4.8-4.5)

6.3 6.1

4.8 4.7 4.6 4.5

4.3 4.2

4 3.9 3.8

Exp.Ácido

Cítr

ico

Concentraciones (mg/ ml)

Grupo 2 (pH =4.4-4.1)

Grupo 3 (pH=4.0-3.6)

4.4

En color rojo se presentan las desviaciones estándares de los resultados (Obtenidas mediante la Ecuación 4).

Tabla 23 - Matriz de resultados para ácido propiónico

B 0.13 0.20C 0.13 0.20DEF 0.11 0.20 0.13 0.20G 0.12 0.20H 0.17 0.20 0.13 0.20J 0.12 0.20K 0.15 0.20L 0.16 0.20

B 0.14 0.20C 0.13 0.20DE 0.14 0.20F 0.13 0.20GH 0.13 0.20 0.12 0.20JK 0.14 0.20L

B 0.12 0.20 0.12 0.20C 0.14 0.20D 0.13 0.20E 0.14 0.20F 0.15 0.20G 0.14 0.20H 0.13 0.20JK 0.16 0.20L 0.16 0.20

B 0.12 0.20C 0.13 0.20D 0.13 0.20 0.13 0.20E 0.12 0.20F 0.13 0.20G 0.12 0.20HJ 0.13 0.20 0.13 0.20K 0.17 0.20L 0.15 0.20

Benef. Inicial

3.7

Grupo 1 (pH =4.8-4.5)

6.3 6.1

4.8 4.7 4.6 4.5

4.3 4.2

4 3.9 3.8

Exp.Ácido

Pro

pión

ico

Concentraciones (mg/ ml)

Grupo 2 (pH =4.4-4.1)

Grupo 3 (pH=4.0-3.6)

4.4

En color rojo se presentan las desviaciones estándares de los resultados (Obtenidas mediante la Ecuación 4).

5.3 ANÁLISIS ESTADÍSTICO

5.3.1 Tablas de datos para análisis estadísticos entre grupos

El análisis estadístico entre grupos analiza los valores de concentraciones

obtenidas para cada uno de los grupos sin tomar en consideración las diferencias

entre experimentos. Una prueba paramétrica típica y representativa la constituye

la configuración ANOVA de una vía.

En este caso los grupos son los conjuntos de pH que se especificaron con

anterioridad y para agruparlos se van a tomar en cuenta todos los valores que se

incluyan dentro de ese rango. En esta sección solamente se presentan las tablas

que sirvieron de “alimentación” para las pruebas estadísticas.

A continuación se presentan los datos para los ácidos galacturónico (Tabla 24), fórmico (

Tabla 25), málico (Tabla 26), acético (Tabla 27), cítrico (Tabla 28) y propiónico

(Tabla 29).

Tabla 24 - Tabla de datos para análisis estadístico entre grupos, Ácido galacturónico

Inicial G1 G2 G36.3719 9.7245 12.6971 14.91557.3475 13.5783 20.1431 7.86658.9796 7.3790 9.1762 10.497912.2969 10.2629 10.3750 8.7515

12.6683 10.9316 11.2735 12.906014.2431 12.9968 11.6850 8.222416.3197 7.8049 11.5932 12.2159

8.29 9.6696 5.6711

8.0291 10.3402

7.9028 8.287911.5425

Ácido Galacturónico, grupos experimentales (mg/mL)

Tabla 25 - Tabla de datos para análisis estadístico entre grupos, Ácido fórmico

Inicial G1 G2 G30.3152 0.3099 0.4056 0.61550.3565 0.3330 0.4753 0.35700.4601 0.3929 0.3371 0.37210.4997 0.4269 0.3656 0.51280.7893 0.4311 0.5257 0.3254

0.6130 0.5127 0.28760.3400 0.41120.3497 0.4851

Ácido Fórmico, grupos experimentales (mg/mL)

Tabla 26- Tabla de datos para análisis estadístico entre grupos, Ácido málico

Inicial G1 G2 G30.3172 0.2017 0.2238 0.31730.3529 0.3492 0.2670 0.18040.2631 0.2123 0.2239 0.18920.3183 0.1893 0.1879 0.20890.2607 0.1954 0.2328 0.20190.2846 0.2253 0.3096 0.18270.2751 0.1675 0.2183 0.2122

0.17 0.2049 0.16880.1943 0.20010.1673 0.2736

0.1955

Ácido Málico, grupos experimentales (mg/mL)

Tabla 27- Tabla de datos para análisis estadístico entre grupos, Ácido acético

Inicial G1 G2 G30.3052 0.2297 0.2274 0.47270.3505 0.3971 0.2929 0.28300.2821 0.3357 0.3361 0.27210.3052 0.2862 0.3689 0.32120.2629 0.2516 0.3557 0.41380.2817 0.3761 0.3554 0.24690.2810 0.3279 0.4780 0.2874

0.23 0.3029 0.23900.2767 0.35280.2015 0.2630

0.3969

Ácido Acético, grupos experimentales (mg/mL)

Tabla 28- Tabla de datos para análisis estadístico entre grupos, Ácido cítrico

Inicial G1 G2 G30.2588 0.2362 0.2275 0.32230.2582 0.3136 0.2469 0.22500.2156 0.2395 0.2445 0.23270.2515 0.2756 0.2564 0.25090.2205 0.2334 0.2479 0.29350.2339 0.2744 0.2703 0.21870.2421 0.2204 0.2930 0.2584

0.2429 0.22380.2404 0.26160.2330 0.2202

0.2869

Ácido Cítrico, grupos experimentales (mg/mL)

Tabla 29- Tabla de datos para análisis estadístico entre grupos, Ácido propiónico

Inicial G1 G2 G30.1251 0.1428 0.1528 0.13300.1255 0.1265 0.1276 0.12480.1262 0.1275 0.1195 0.13380.1226 0.1419 0.1592 0.12240.1257 0.1280 0.1214 0.12620.1175 0.1445 0.1382 0.12530.1528 0.1223 0.1274 0.1718

0.16 0.14480.1359 0.12040.1614 0.1266

0.1496

Ácido Propiónico, grupos experimentales (mg/mL)

5.3.2 Análisis estadístico entre grupos

El análisis estadístico entre grupos se realizó según lo estipulado en la Sección

4.4.6. Se inició con un análisis exploratorio de los datos (EDA), este permitió

determinar si las técnicas estadísticas que se utilizarían posteriormente para

comparar los grupos serían las más apropiadas.

Se realizó una prueba de normalidad para determinar si los grupos de pH dentro

de cada ácido se ajustaban a una distribución normal. Con este propósito se

realizaron dos pruebas de forma paralela para los seis ácidos carboxílicos: la

prueba de Kolmogorov-Smirnov y la prueba de Shapiro-Wilk.

Ambas prueban la hipótesis nula que los datos poseen una distribución normal. Un

nivel de significancia particularmente bajo (generalmente menor a 0.05) indica que

la distribución de los datos difiere significativamente de una distribución normal. A

continuación se presenta una matriz resumen de la prueba que se realizó con el

software SPSS ® (Tabla 30).

En este caso se analizaron los datos para la prueba Kolmogorov-Smirnov, estos

muestran que no hay distribución normal para las concentraciones de ácido málico en dos de los grupos: G1 (pH 6.1-6.3) y G4 (pH 3.7-4). Las

concentraciones en ácido propiónico tampoco se ajustan a una distribución

normal en los grupos G1 y G4. Las concentraciones para los otros ácidos

muestran una distribución normal.

Tabla 30 - Pruebas de normalidad para los datos de comparaciones entre grupos de pH (configuración ANOVA 1 vía)

Tests of Normality

.196 8 .200* .939 8 .606

.152 7 .200* .939 7 .633

.251 10 .074 .793 10 .012

.149 11 .200* .978 11 .956

.236 8 .200* .920 8 .429

.322 7 .027 .747 7 .012

.205 10 .200* .933 10 .479

.315 11 .003 .782 11 .006

.201 8 .200* .947 8 .678

.154 7 .200* .957 7 .797

.165 10 .200* .960 10 .783

.218 11 .149 .914 11 .272

.179 8 .200* .907 8 .336

.265 7 .146 .897 7 .313

.250 10 .078 .888 10 .160

.186 11 .200* .892 11 .146

.392 8 .001 .746 8 .007

.289 7 .079 .835 7 .088

.169 10 .200* .928 10 .426

.292 11 .010 .729 11 .001

PH_GROUP"6.1-6.3"4.5-4.84.2-4.43.7-4"6.1-6.3"4.5-4.84.2-4.43.7-4"6.1-6.3"4.5-4.84.2-4.43.7-4"6.1-6.3"4.5-4.84.2-4.43.7-4"6.1-6.3"4.5-4.84.2-4.43.7-4

CONC_GAL

CONC_MAL

CON_ACE

CON_CIT

CON_PROP

Statistic df Sig. Statistic df Sig.Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

* .267 5 .200* .881 5 .314.284 6 .141 .879 6 .264.229 8 .200* .848 8 .091.172 8 .200* .950 8 .713

"6.1-6.3"4.5-4.84.2-4.43.7-4

CONC_FOR

This is a lower bound of the true significance.*.

Lilliefors Significance Correctiona.

Con estos resultados se concluyó que una prueba no paramétrica para encontrar

diferencias entre grupos debía realizarse tanto a los grupos de las

concentraciones de ácido málico como a los del ácido propiónico.

Los grupos en los otros ácidos se podrían comparar mediante una prueba

paramétrica, en este caso ANOVA una vía.

Se puede apreciar que los valores obtenidos para las dos pruebas son similares y

comparables, la prueba Shapiro-Wilk es particularmente útil cuando el número de

datos es bajo.

Como parte de las pruebas EDA, se obtuvieron gráficos sobre la distribución de

los valores de los datos (boxplots o cajas de puntos) para los datos de cada uno

de los ácidos cuyos grupos se ajustaron a una distribución normal (Figura 24). El

objetivo de estos es poseer de forma gráfica una impresión sobre posibles datos

discordantes.

En estos gráficos, la línea gruesa negra dentro de cada caja marca el cincuentavo

percentil (50avo) o la mediana de la distribución. Los límites inferior y superior

dentro de cada caja marcan el veinticincoavo (25avo) y el setenticincoavo (75avo)

de cada distribución, respectivamente. Las barras que aparecen arriba y debajo de

cada caja no marcan datos discordantes, pero estos se marcan mediante “O”, el

número que aparece al lado corresponde a la línea de los datos con que se

“alimentó” a la prueba estadística, y en última instancia en donde se encontrará el

valor “sospechoso”. Los valores extremos se marcan con un asterisco (*).

Figura 24 - Gráficos “cajas de puntos” o boxplots para determinar puntos aberrantes dentro de los datos de cada grupo para cada ácido

(a) A. galacturónico, (b) A. Acético, (c) A. cítrico (d) A. fórmico. En el eje de las x se indican los distintos grupos experimentales.

111078N =

3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"

CO

NC

_GA

L

30

20

10

0

17

(a)

111078N =

3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"

CO

N_A

CE

.5

.4

.3

.2

.1

22(b)

8865N =

3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"

CO

NC

_FO

R.9

.8

.7

.6

.5

.4

.3

.2

10

5

(d)

111078N =

3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"

CO

N_C

IT

.34

.32

.30

.28

.26

.24

.22

.20

22

(c)

Se puede apreciar que para el ácido galacturónico hay un probable punto

discordante para uno de los valores del Grupo 3 (pH =4.2- 4.4). Se aplicó la

prueba de Grubbs para determinar si el punto se descartaba o no se descartaba y

se encontró que el punto correspondiente a una concentración de 20.14 mg/mL

debía eliminarse (con un nivel de significancia del 5%) para ello se comparó un

valor tabular de Grubbs de 2.29, con el valor calculado de 2.54, al ser este último

mayor que el valor tabular, se decidió no tomar en cuenta el valor para los análisis

de varianza.

El ácido acético por su parte presentó un valor discordante en el grupo 3

(marcado mediante el número 22), este valor se examinó con la prueba de Grubbs

y el valor calculado (1.85) fue inferior al valor tabular (2.29) por lo tanto no fue

necesario descartar este punto de la serie de datos.

El ácido cítrico presentó también un punto discordante en el grupo 3, al realizar la

prueba de Grubbs, se concluyó que el valor debía preservarse.

El ácido fórmico presentó dos valores discordantes, uno en el grupo 1 y otro en el

grupo 2. En ambos casos se aplicó la prueba de Dixon, ya que el número de

datos era inferior a 7. Para ninguno de los dos grupos se descartaron los puntos

aberrantes ya que los valores de Q calculada fueron inferiores a la Q tabular a un

5% de nivel de significancia.

5.3.2.1 Análisis ANOVA de una vía

Los datos que se adaptaron a una distribución normal fueron analizados mediante

la prueba ANOVA de una vía. Esta prueba la hipótesis que las medias de dos o

más grupos no son significativamente diferentes.

Antes se realizó la prueba estadística de Levene (Tabla 31) en la cual se prueba la

hipótesis nula que las varianzas entre los grupos son iguales, esto es importante

de saber antes de realizar la prueba ANOVA, porque ésta solamente se puede

realizar si las varianzas de los grupos son iguales.

Tabla 31 - Prueba de Levene para muestras a las que se realizaría la prueba ANOVA

Test of Homogeneity of Variances

.866 3 23 .4731.957 3 32 .1402.685 3 32 .063

CONC_FORCON_ACECON_CIT

LeveneStatistic df1 df2 Sig.

Test of Homogeneity of Variances

C_gal

2.566 3 31 .072

LeveneStatistic df1 df2 Sig.

Los resultados de la prueba de homogeneidad de varianzas indican que los

niveles de significancia para los grupos en los cuatro ácidos son mayores a .05,

esto sugiere que las varianzas para los distintos ácidos son iguales y que la

prueba ANOVA se podría aplicar.

Los resultados de la prueba ANOVA se presentan en forma de matriz (Tabla 32),

esta matriz presenta la variación para cada ácido en dos componentes principales.

La variación entre grupos (Between Groups) estima la variación de las medias

de los grupos alrededor de una media general. La variación dentro del grupo

(Within Groups) representa la variación de puntajes individuales alrededor de sus

medias respectivas. Sig. Indica el nivel de significancia para la prueba F, valores

de significancia bajos (<.05) indican diferencias entre los grupos.

Los resultados presentados muestran que los grupos experimentales no poseen

diferencias estadísticas, esto se aprecia en valores de significancia relativamente

altos.

Tabla 32 - Resultados prueba ANOVA de una vía.

ANOVA

C_gal

2.414 3 .805 .115 .951216.585 31 6.987218.999 34

Between GroupsWithin GroupsTotal

Sum ofSquares df Mean Square F Sig.

ANOVA

.018 3 .006 .432 .732

.324 23 .014

.343 26

.006 3 .002 .449 .719

.146 32 .005

.153 35

.002 3 .001 .720 .547

.024 32 .001

.026 35

Between GroupsWithin GroupsTotalBetween GroupsWithin GroupsTotalBetween GroupsWithin GroupsTotal

CONC_FOR

CON_ACE

CON_CIT

Sum ofSquares df Mean Square F Sig.

5.3.2.2 Pruebas no paramétricas para datos de ácidos sin distribución normal

Los ácidos málico y propiónico no estaban sujetos a una distribución normal, por

esta razón a ambos se les aplicaron pruebas no paramétricas, específicamente la

prueba Kruskal Wallis y la prueba de comparación de medianas. Ambas pruebas

están diseñadas para probar la significancia de las diferencias entre múltiples

grupos, básicamente cumplen el papel sustituto de la prueba ANOVA.

La prueba Kruskal-Wallis mide cuanto los rangos dentro de un grupo difieren del

rango medio del resto de los grupos, el valor chi-cuadrado se obtiene en base a

estos valores de los rangos. Los grados de libertad para la prueba estadística chi-

cuadrado son iguales al número de grupos menos uno.

La significancia asintomática estima la probabilidad de obtener un estadístico chi-

cuadrado mayor o igual al que se presenta, en el caso que verdaderamente no

hubiese diferencias entre los rangos de los grupos. Cuando el valor es inferior a

.05 hay diferencias entre los grupos.

En el caso de los ácidos málico y propiónico la prueba Kruskal Wallis no arroja

diferencias entre los grupos (Tabla 33).

Tabla 33- Resultados de la prueba Kruskall Wallis para ácido málico y propiónico

Test Statisticsa,b

7.286 2.7473 3

.063 .432

Chi-SquaredfAsymp. Sig.

CONC_MAL CON_PROP

Kruskal Wallis Testa.

Grouping Variable: PH_GROUPb.

La prueba de la mediana, tiene como hipótesis nula que las mediana de todo el

conjunto de datos es una buena aproximación con el centro de cada uno de los

grupos experimentales. Para probar esta hipótesis, cada grupo se divide en dos

subgrupos: aquellos cuyos valores se ajustan cerca o bajo la mediana, y aquellos

cuyos valores son superiores a los de la mediana. El resultado es una tabla de

frecuencias de dos vías con dos filas y un número n de columnas donde n es el

número de categorías de la variable agrupadora. En la Tabla 34- a, por ejemplo, la

primera celda es el número de valores de concentración de ácido que para el

grupo 1 son superiores a la mediana.

La prueba de la Mediana detecta diferencias en la localización y forma entre los

grupos. La mediana lista la mediana general ignorando la membresía a

determinados grupos. Si los grupos no difieren, la mediana general debería

eventualmente separar cada grupo. El estadístico chi-cuadrado compara las

separaciones observadas a las separaciones teóricas. Los niveles de significancia

inferiores a .05 indican que los grupos difieren estadísticamente.

En el caso del ácido málico el nivel de significancia (Asymp. Sig.) .023, por lo

tanto los grupos dentro del ácido málico diferirían entre sí. Por otro lado, las

concentraciones de los grupos en ácido propiónico poseen un nivel de

significancia (Asymp. Sig) de .127, por lo que se concluye los grupos no se

diferencian entre sí.

Tabla 34 - Prueba de la mediana

(a) Tabla de Frecuencias

Frequencies

7 3 6 21 4 4 92 5 7 46 2 3 7

> Median<= Median> Median<= Median

CONC_MAL

CON_PROP

"6.1-6.3" 4.5-4.8 4.2-4.4 3.7-4PH_GROUP

(b) Datos estadísticos de la prueba de la mediana

Test Statisticsb

36 36.212250 .127450

9.497a 5.704a

3 3.023 .127

NMedianChi-SquaredfAsymp. Sig.

CONC_MAL CON_PROP

4 cells (.0%) have expected frequencies less than5. The minimum expected cell frequency is 3.5.

a.

Grouping Variable: PH_GROUPb.

5.3.3 Tablas de datos para análisis estadísticos entre grupos y entre experimentos

El análisis estadístico entre grupos y entre experimentos analiza los valores de

concentraciones obtenidos para cada grupo y toma en consideración las

diferencias entre experimentos. Una prueba paramétrica típica y representativa la

constituye la configuración ANOVA de dos vías.

En este caso los grupos son los conjuntos de pH que se identificaron con

anterioridad, para agruparlos se va a tomar en cuenta todos los valores que se

incluyan dentro de ese rango para cada experimento por separado. Si dentro del

rango de pH para cada experimento hay más de un valor se calculará el promedio

de esos valores. Uno de los requerimientos para las pruebas de dos vías es que

se tenga el mismo número de valores para las columnas y para las filas, en esto

se diferencia de la configuración precedente. Por tal razón no fue posible obtener

más que una matriz de 4 filas (experimentos) por 4 columnas (grupos) para los 7

ácidos en estudio

En esta sección se presentan las tablas que sirvieron de “alimentación” a las

pruebas estadísticas. A. galacturónico (Tabla 35 a), fórmico (Tabla 35b), málico

(Tabla 35c), acético (Tabla 35d), cítrico (Tabla 35e) y propiónico (Tabla 35f).

Tabla 35- Datos para análisis estadístico entre grupos y entre experimentos (ANOVA 2 vías)

(a)

Inicial (mg/mL)

G1 (mg/mL)

G2 (mg/mL)

G3 (mg/mL)

B 7.348 12.997 10.225 8.752C 16.320 13.578 11.685 14.915F 6.372 7.379 12.697 8.222K 14.243 10.263 10.375 12.216

Exp GruposÁcido Galacturónico

(b)

Inicial (mg/mL)

G1 (mg/mL)

G2 (mg/mL)

G3 (mg/mL)

B 0.356 0.431 0.351 0.372C 0.500 0.613 0.526 0.615F 0.315 0.310 0.406 0.325

Exp GruposÁcido Fórmico

(c)

Inicial (mg/mL)

G1 (mg/mL)

G2 (mg/mL)

G3 (mg/mL)

B 0.317 0.225 0.228 0.209C 0.353 0.349 0.310 0.317F 0.263 0.212 0.224 0.183K 0.275 0.189 0.188 0.212

Exp GruposÁcido Málico

(d)

Inicial (mg/mL)

G1 (mg/mL)

G2 (mg/mL)

G3 (mg/mL)

B 0.305 0.376 0.346 0.321C 0.351 0.397 0.355 0.473F 0.282 0.336 0.227 0.247K 0.281 0.286 0.369 0.287

Exp GruposÁcido Acético

(e)

Inicial (mg/mL)

G1 (mg/mL)

G2 (mg/mL)

G3 (mg/mL)

B 0.259 0.274 0.246 0.251C 0.258 0.314 0.270 0.322F 0.216 0.240 0.228 0.219K 0.242 0.276 0.256 0.258

Exp GruposÁcido Cítrico

(f)

Inicial (mg/mL)

G1 (mg/mL)

G2 (mg/mL)

G3 (mg/mL)

B 0.125 0.144 0.120 0.122C 0.125 0.127 0.138 0.133F 0.126 0.128 0.153 0.125K 0.153 0.142 0.159 0.172

Exp GruposÁcido Propiónico

5.3.4 Análisis estadístico entre grupos y entre experimentos (ANOVA 2 vías)

La prueba ANOVA de dos vías analiza la hipótesis que las medias de dos o más

grupos no son significativamente diferentes. Existen otros datos o pruebas que se

obtienen y realizan de forma paralela a ANOVA.

Los resultados de la prueba ANOVA se presentan en forma de matriz (Tabla 36),

esta matriz presenta la variación para cada ácido en dos componentes principales

o fuentes de variación: la variación entre filas (rows) estima la variación entre los

experimentos. La variación entre columnas (columns) representa la variación

entre los grupos. El valor F calculado debe ser superior al valor F-crítico (F-Crit)

para considerar que existen diferencias ya sea entre filas o entre columnas. El

valor P indica el porcentaje de certeza con un .05 de nivel de significancia (en el

caso de los á. galacturónico y cítrico se trabajó con .1 como nivel de significancia)

que la diferencia entre los grupos (si las hay) no se deba al azar, por lo general

esto se manifiesta cuando el valor se aproxima a cero.

Los resultados de la Tabla 36-a muestran que para el á. galacturónico hay

diferencias claramente remarcables entre los experimentos (rows) pero no entre

los grupos (columns). Esto se manifiesta en valores de F calculado superiores a F

crítica, en este caso se utilizó un nivel de significancia de 0.1 para calcular F. Las

diferencias entre los experimentos no se deben al azar de acuerdo al valor P, en

cambio el hecho que no existan diferencias entre los grupos indican que esto se

debería al azar.

Por otro lado, la prueba para el á. málico (Tabla 36-b), presenta diferencias claras

tanto entre los grupos de pH como entre los experimentos. Los valores de P

relativamente bajos indican que las diferencias no se deben al azar.

El á. cítrico por su parte presenta diferencias entre los grupos de pH, las

diferencias entre los experimentos también es remarcable. Al igual que para el á.

galacturónico, se utilizó un nivel de significancia de 0.1 para el cálculo de F.

Ambas diferencias no se deberían al azar de acuerdo a estos resultados.

El á. fórmico presenta diferencias entre experimentos pero no entre los grupos

experimentales. Las diferencias entre los experimentos no se deben al azar, en

cambio el hecho que entre grupos no haya diferencias podría deberse al azar, en

parte debido al valor relativamente elevado del coeficiente P.

Por su parte, se pueden apreciar diferencias entre los experimentos pero no entre

los grupos tanto para el ácido acético como para el á. propiónico. En ambos casos

las diferencias entre los experimentos no serían el resultado del azar, pero sí el

hecho que no existan diferencias entre los grupos se debería al azar.

Tabla 36 - Resultados prueba ANOVA de 2 vías

Source of Variation SS df MS F P-value F critRows 68.52777357 3 22.84259 3.26403 0.073326 2.812863Columns 0.11817867 3 0.039393 0.005629 0.999373 2.812863Error 62.98449855 9 6.998278

Total 131.6304508 15

(a) Á. Galacturónico

Source of Variation SS df MS F P-value F critRows 0.035034891 3 0.011678 26.46682 8.49E-05 3.862548Columns 0.01299707 3 0.004332 9.818529 0.003375 3.862548Error 0.003971187 9 0.000441

Total 0.052003148 15

(b) Á. Málico

Source of Variation SS df MS F P-value F critRows 0.008659529 3 0.002887 13.35677 0.001156 2.812863Columns 0.002415798 3 0.000805 3.726215 0.054411 2.812863Error 0.001944975 9 0.000216

Total 0.013020303 15

(c) Á. Cítrico

Source of Variation SS df MS F P-value F critRows 0.1151609 2 0.05758045 23.6655458 0.001424 5.143253Columns 0.00611956 3 0.00203985 0.83837925 0.520357 4.757063Error 0.01459855 6 0.00243309

Total 0.13587901 11

(d) Á. Fórmico

Source of Variation SS df MS F P-value F critRows 0.031752 3 0.010584 4.635999 0.031792 3.862548Columns 0.004007 3 0.001336 0.585051 0.639759 3.862548Error 0.020547 9 0.002283

Total 0.056306 15

(e) Á. acético

Source of Variation SS df MS F P-value F critRows 0.002043 3 0.000681 4.957748 0.026658 3.862548Columns 0.000232 3 7.72E-05 0.561768 0.653589 3.862548Error 0.001236 9 0.000137

Total 0.003511 15

(f) A. Propiónico

5.4 MEDICIONES CON REFLECTOQUANT

Los resultados de las mediciones de reflectoquant para los ácidos málico y láctico

se han resumido en una matriz (Tabla 45, Anexos, Sección 10.6).

5.4.1 Tablas de datos para análisis estadísticos entre grupos

El análisis estadístico entre grupos analiza los valores de concentraciones

obtenidos para cada uno de los grupos sin tomar en consideración las diferencias

entre experimentos. Una prueba paramétrica típica y representativa la constituye

la configuración ANOVA de una vía.

En este caso los grupos son los conjuntos de pH que se especificaron con

anterioridad y para agruparlos se van a tomar en cuenta todos los valores que se

incluyan dentro de ese rango. En esta sección solamente se presentan las tablas

que sirvieron de “alimentación” para las pruebas estadísticas, tanto para ácido

málico como para ácido láctico (Tabla 37).

Tabla 37 - Datos de Reflectoquant para el análisis estadístico entre grupos.

Ácido Málico Ácido Láctico Inicial

(mg/mL) G1

(mg/mL)G2

(mg/mL) G3

(mg/mL) Inicial

(mg/mL)G1

(mg/mL)G2

(mg/mL) G3

(mg/mL)139 95 151 150 27 36 60 93125 145 83 72 17 42 44 108190 86 65 103 21 25 43 48198 74 61 84 15 33 46 62166 73 62 136 18 26 31 75186 128 135 73 18 36 32 69159 60 102 75 14 31 41 59

93 96 47 57 79 52 31 28 118 97 39 31 159 19 104.5 56

5.4.2 Análisis estadístico entre grupos

Se inició con un análisis exploratorio de los datos (EDA), este permitió determinar

si las técnicas estadísticas que se utilizarían posteriormente para comparar los

grupos serían las más apropiadas.

Se realizó una prueba de normalidad para determinar si los grupos de pH dentro

de cada ácido se ajustaban a una distribución normal. Con este propósito se

realizaron dos pruebas de forma paralela para los siete ácidos carboxílicos: la

prueba de Kolmogorov-Smirnov y la prueba de Shapiro-Wilk.

Ambas prueban la hipótesis nula que los datos poseen una distribución normal. Un

nivel de significancia particularmente bajo (generalmente menor a 0.05) indica que

la distribución de los datos difiere significativamente de una distribución normal. A

continuación se presenta una matriz resumen de la prueba que se realizó con el

software SPSS ® (Tabla 38).

Con estos se resultados se concluyó que una prueba paramétrica podría

realizarse para encontrar diferencias entre grupos para ambos ácidos.

Los gráficos de caja (boxplots) no se presentan aquí, pero en ellos no se

encontraron datos aberrantes o fuera de rango, se concluye por lo tanto que no

era necesario eliminar ningún dato y por lo tanto se pudo realizar directamente la

prueba ANOVA una vía.

Los datos que se adaptaron a una distribución normal fueron analizados mediante

la prueba ANOVA de una vía.

Tabla 38 - Pruebas de normalidad para los datos de comparaciones entre grupos de pH (configuración ANOVA una vía).

Tests of Normality

.195 7 .200* .940 7 .642

.207 7 .200* .906 7 .368

.148 10 .200* .919 10 .346

.181 11 .200* .928 11 .391

.267 7 .143 .890 7 .274

.154 7 .200* .953 7 .757

.165 10 .200* .912 10 .295

.120 11 .200* .971 11 .899

PH_GROUP"6.1-6.3"4.5-4.84.2-4.43.7-4"6.1-6.3"4.5-4.84.2-4.43.7-4

CONC_MAL

CON_LAC

Statistic df Sig. Statistic df Sig.Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

This is a lower bound of the true significance.*.

Lilliefors Significance Correctiona.

Los resultados de la prueba ANOVA se presentan en forma de matriz (Tabla 39),

esta matriz presenta la variación para cada ácido en dos componentes principales.

La variación entre grupos (Between Groups) estima la variación de las medias

de los grupos alrededor de una media general. La variación dentro del grupo

(Within Groups) representa la variación de puntajes individuales alrededor de sus

medias respectivas. Sig. Indica el nivel de significancia para la prueba F, valores

de significancia bajos (<.05) indican diferencias entre los grupos.

Los resultados presentados muestran que los grupos experimentales si poseen

diferencias estadísticas, esto se aprecia en valores de significancia bajos.

Para ambos ácidos se realizó una prueba de contrastes para determinar entre qué

grupos se presentaban las diferencias.

Los contrastes se enlistan en la Tabla 40, a. En este caso, cuatro contrastes son

investigados, el primero compara el grupo inicio con el grupo G3 (pH=3.7 -4.0). El

segundo compara los grupos intermedios (G1, pH = 4.5 – 4.8 con G2, pH= 4.2-

4.4). El tercero compara los grupos G2 con G3. El cuarto compara los grupos G1 y

G2 con el grupo G3.

Tabla 39 - Resultados prueba ANOVA de una vía para datos de Reflectoquant

ANOVA

27011.071 3 9003.690 8.960 .00031149.971 31 1004.83858161.043 347525.948 3 2508.649 9.209 .0008444.452 31 272.402

15970.400 34

Between GroupsWithin GroupsTotalBetween GroupsWithin GroupsTotal

CONC_MAL

CON_LAC

Sum ofSquares df Mean Square F Sig.

Por su parte los resultados de la prueba de contrastes se enlistan en la

Tabla 40-b. En este caso el software realizó las pruebas de contrastes a ambos

casos, asumiendo tanto que hay igualdad de varianzas como que no hay igualdad

de varianzas, en la tabla se pueden apreciar los cuatro tipos de contrastes

anteriormente explicados para cada uno de los ácidos.

Puestos que los datos presentan igualdad de varianzas, se asumirán como válidos

los datos presentados en la columna “assume equal variances”.

Para el ácido málico solamente el contraste 1 ha indicado diferencias entre el

grupo inicial y el G3.

Para el ácido láctico se puede apreciar que solamente para los contrastes 1 y 4 se

han percibido diferencias entre los grupos. Es decir que el grupo inicial y el G3,

presentan diferencias, así como el G1, G2 con el G3.

Tabla 40 - Prueba de contrastes para ANOVA una vía, datos de reflectoquant

(a)

Contrast Coefficients

-1 0 0 10 -1 1 00 0 -1 10 -.5 -.5 1

Contrast1234

"6.1-6.3" 4.5-4.8 4.2-4.4 3.7-4PH_GROUP

(b)

Contrast Tests

-65.64286 15.32635 -4.283 31 .000.471429 15.62152 .030 31 .976

5.600000 13.85037 .404 31 .6895.835714 12.34329 .473 31 .640

-65.64286 14.67480 -4.473 15.103 .000.471429 15.39460 .031 13.137 .976

5.600000 14.41052 .389 19.000 .7025.835714 12.97824 .450 19.440 .658

40.337662 7.9798693 5.055 31 .0008.685714 8.1335535 1.068 31 .294

17.509091 7.2113769 2.428 31 .02121.851948 6.4266991 3.400 31 .00240.337662 8.3637379 4.823 10.792 .001

8.685714 3.6209769 2.399 14.995 .03017.509091 8.6733414 2.019 12.322 .06621.851948 8.3977674 2.602 10.981 .025

Contrast1234123412341234

Assume equal variances

Does not assume equalvariances

Assume equal variances

Does not assume equalvariances

Mal_Refl

Lac_Refl

Value ofContrast Std. Error t df Sig. (2-tailed)

Las concentraciones tanto del ácido málico como del ácido láctico para los datos

de reflectoquant se graficaron en dependencia del pH en que se interrumpió la

fermentación. Se pueden apreciar dos comportamientos diferentes tanto para el

ácido málico como para el ácido láctico. El primero (Figura 25-a) presenta un

comportamiento decreciente, a medida que avanza el proceso fermentativo su

concentración disminuye, se mantiene casi constante entre los G1, G2 y G3,

aumenta ligeramente en G3.

El ácido láctico por su parte, para el cual no se obtuvieron datos mediante el

sistema HPLC presenta un comportamiento diferente (Figura 25-b), con la

concentración aumentando de forma casi constante desde 20 mg/L al inicio hasta

alrededor de 60 mg/L hasta el G3.

Figura 25 - Comportamiento de las concentraciones de ácido málico y ácido láctico a medida que avanza el proceso de fermentación, datos de Reflectoquant.

(a) Á. málico (b) Á. láctico. Las concentraciones se presentan en mg/L, debido a que esta es la unidad de medida de Reflectoquant.

3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"

Mea

n of

CO

N_L

AC

70

60

50

40

30

20

10

(b)

3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"

Mea

n of

CO

NC

_MA

L

180

160

140

120

100

80

(a)

5.4.3 Análisis estadístico entre grupos y entre experimentos (ANOVA 2 vías)

Las siguientes tablas sirvieron de “alimentación” a la prueba estadística ANOVA

dos vías para los resultados de Reflectoquant (Tabla 41).

Tabla 41 - Datos de Reflectoquant para el análisis estadístico ANOVA dos vías, á. málico y á. láctico

(a) Ácido Málico Exp Inicial G1 G2 G3

B 139 128 63.5 84C 125 145 135 150F 190 86 151 73K 159 74 61 75

(b) Ácido Láctico Exp Inicial G1 G2 G3

B 27 36 37 62C 17 42 32 93F 21 25 60 69K 14 33 46 59

Los resultados de la prueba ANOVA se presentan en forma de matriz (Tabla 42),

se puede apreciar que para el á. málico no se determinaron diferencias ni entre los

grupos (Columns) ni entre los experimentos (Rows), esto se explica por valores F

calculada inferiores a los de F tabular. Por otro lado, los valores de P indicarían

que de cierta forma el azar sería responsable de estas similitudes entre los grupos

y experimentos.

Tabla 42 - Resultados prueba ANOVA de 2 vías para resultados de Reflectoquant.

(a) Á. Málico Source of Variation SS df MS F P-value F crit

Rows 5243.922 3 1747.974 1.400836 0.304813 3.862548Columns 8167.922 3 2722.641 2.18194 0.159894 3.862548Error 11230.27 9 1247.807 Total 24642.11 15

(b) Á. Láctico Source of Variation SS df MS F P-value F crit

Rows 149.1875 3 49.72917 0.354909 0.786919 3.862548Columns 5554.688 3 1851.563 13.2143 0.001201 3.862548Error 1261.063 9 140.1181 Total 6964.938 15

En el caso del á. láctico, las diferencias entre experimentos no son evidentes y por

el contrario se podría concluir que sus similitudes se deberían al azar (un valor P

relativamente alto). En el caso de los grupos, hay diferencias claras y el valor P

bajo indica que otras son las causas (no el azar) de esas diferencias.

6 DISCUSIÓN

En la Sección 5.1.2 se presentaban las aproximaciones más importantes en

cuanto a los picos identificados para distintas muestras de ácidos, se hacía énfasis

en lo acontecido para el pico E, cuyo aumento no correspondía al ácido láctico, tal

como se asumió en un principio, sino que al ácido láctico más otro pico de carácter

desconocido.

Se realizaron posteriormente una serie de experimentos para determinar a qué

ácido en particular correspondía este pico. Se utilizó como ayuda la hoja de

referencia de la columna HPLC, la cual indica que casi en el mismo tiempo de

retención que el ácido láctico se retiene el ácido ascórbico. También se consultó la

bibliografía (Belitz y Grosch, 1999), la cual indicó que el ácido ascórbico se

encuentra presente en la fruta del café. Posteriormente, se realizaron

experimentos para determinar si el pico E correspondía a dicho ácido. Los

resultados (Anexos, Sección 10.7) confirmaron esta hipótesis.

Los resultados obtenidos para el límite de detección (Tabla 17) demuestran que

dicho límite ronda los 0.12 mg/mL para el á. málico y los 0.20 mg/mL para el á.

propiónico. Como se mencionó con anterioridad esta sería la concentración

mínima bajo la cual se podría asegurar que la señal que se observa corresponde

a la muestra y no a interferencias inherentes al equipo (USEPA, 2004). Esto es

importante tenerlo en cuenta al momento de analizar hasta qué concentraciones

es capaz de analizarse con los métodos e instrumentos planteados en esta

investigación.

Otra aproximación para comprender la magnitud de los límites con los cuales la

metodología aquí utilizada es capaz de trabajar la constituyen las incertidumbres

planteadas en las tablas de resultados (Tabla 18 - Tabla 23). En dichas tablas,

para cada ácido se reportó la desviación estándar a la par de cada una de las

concentraciones calculadas para las muestras.

Se puede observar que para el ácido galacturónico (Tabla 18) las desviaciones

estándares de los resultados no implican un nivel de incertidumbre muy grande.

Esto se debe a que las concentraciones calculadas son los suficientemente

grandes como para verse afectadas por dicho valor.

El ácido fórmico por su parte (Tabla 19), posee valores de desviaciones

estándares que agregarían incertidumbre al resultado calculado. Sin embargo los

valores de incertidumbre no exceden los valores de las concentraciones

calculadas, lo que no pondría en riesgo la validez del resultado. Una conclusión

similar se desprendería de las concentraciones calculadas para el ácido málico

(Tabla 20) y para el ácido acético (Tabla 21), cuyas concentraciones y

desviaciones estándares se acoplan al mismo rango de valores.

Los valores del ácido cítrico (Tabla 22) y del ácido propiónico (Tabla 23) poseen

las desviaciones estándares más remarcables de todo el conjunto de ácidos

analizados (0.20 mg/mL). En el caso del ácido cítrico esta concentración se

compara muy de cerca con los valores obtenidos para la mayor parte de las

muestras, por lo cual se podría concluir que gran parte de los valores

determinados para dicho ácido “encajarían” dentro de un margen de incertidumbre

suficientemente importante. Algo un poco más drástico acontece con el á.

propiónico, para el cual las concentraciones determinadas son inferiores a la

incertidumbre.

Para analizar los resultados incluidos en el instrumento de investigación, se

perfilaron dos alternativas, y se plasmaron en la sección de resultados: un diseño

ANOVA 1 vía con el fin de comparar solamente los grupos de pH y un diseño

ANOVA 2 vías con el fin de identificar diferencias tanto entre dichos grupos como

entre los experimentos.

El diseño ANOVA 1 vía tiene la desventaja que asume que todos los datos dentro

del mismo grupo han sido obtenidos de una forma similar, por esa razón antes de

aplicar la prueba de análisis de varianza (ANOVA 1 vía) hubo que determinar si

dichos datos dentro de los grupos se ajustaban a una distribución normal. En

efecto, esto permitió identificar que había menos datos para los grupos Inicial y G1

que para los grupos G3 y G4.

Se utilizaron menos datos para el análisis del ácido fórmico (

Tabla 25) debido a que durante los días en que se realizó dicho experimento las

condiciones experimentales variaron un poco con relación a las que se venían

manifestando en días previos, uno de los aspectos más destacables fue la

temperatura, durante el día en que se llevó a cabo el análisis (26/06/06) la

temperatura del laboratorio y en especial en el sitio en donde se encontraba el

equipo de HPLC sufrió un incremento cercano a los 10 ºC con relación a los días

con que previamente se habían analizado otras muestras. Esto fue una de las

causas por las cuales los picos en los cromatogramas presentaron tiempos de

elusión diferentes a los que en día previos venían presentando, además, se pudo

observar que a temperaturas más altas el pico que representaba al á. fórmico se

fusionaba con el pico de á. galacturónico, razón por la cual no fue posible

identificarlo y estos datos no se pudieron incluir en el instrumento de investigación.

A pesar que en general los resultados obtenidos tanto para la prueba ANOVA 1

vía (Sección 5.3.2.1) y como los resultados de la prueba de Kruskall- Wallis

(Sección 5.3.2.2) no indicaron diferencias importantes entre los grupos, los

resultados deben analizarse con más detenimiento para identificar los

comportamientos de las concentraciones de los ácidos a medida que el proceso

fermentativo avanza (disminución del pH).

Los primeros resultados arrojados por la prueba de ANOVA 1 vía para los grupos

dentro de los ácidos que se adaptaron a una distribución normal arrojaron

comportamientos diferentes para sus medias. El ácido fórmico (Figura 26-a)

presentó un comportamiento decreciente: inicialmente su concentración se

encuentra sobre 0.48 mg/mL y desciende bajo 0.42 mg/mL a medida que el pH

disminuye, posteriormente aumenta ligeramente cuando disminuye el pH de

interrupción, sin embargo, la prueba ANOVA no indicó que estos promedios

defirieran entre sí, claramente se puede apreciar que los grupos G1, G2 y G3

poseen concentraciones muy similares.

Por otro lado, el ácido acético (Figura 26-b) parece comportarse de forma

diferente, el pH inicial arroja concentraciones cercanas a 0.29 mg/mL,

posteriormente la concentración aumenta súbitamente a 0.32 mg/mL, durante los

valores de pH con los cuales la fermentación se interrumpió, posteriormente el

aumento de la concentración de este ácido muestra solamente ligeros

incrementos. El comportamiento de este ácido fue reportado de forma similar en

el estudio de Avallone et al (2001b), Wootton (1963b) también reportó el

incremento de este ácido conforme el pH disminuye. Esto hace entrever la

influencia que definitivamente tiene este ácido tanto en la disminución del pH

como en el ser precursor del ácido acético en café tostado. De acuerdo a Flament

(2002), cuando el café se tuesta, la cantidad de á. acético aumenta por un factor

de 3. El mismo autor señala que concentraciones más altas de este ácido se

encontrarían en granos defectuosos, concentraciones más bajas se encontrarían

en granos en buen estado. La desventaja es que el olor producido es fuerte,

punzante y ácido, además de ser desagradable cuando está altamente

concentrado.

El ácido cítrico (Figura 26-c) presenta también una tendencia de aumentar su

concentración a medida que disminuye el pH en que se interrumpe su

fermentación, de forma tal que la concentración promedio en el grupo inicial es

inferior a 0.24 mg/ml, posteriormente registra un incremento cuando la

fermentación se interrumpe a un pH entre 4.5 y 4.8. Una ligera disminución en la

concentración del ácido se registra cuando el pH se interrumpe en un pH entre 4.2

y 4.4, para finalmente incrementar su concentración nuevamente cuando la

fermentación se interrumpe entre los pH 3.7 y 4. La literatura (Flament, 2002)

indica que el á. cítrico es de suma importancia para controles del sabor en el café

tostado, por ende las concentraciones de este ácido en el café verde son

precursores esenciales junto con la temperatura de tueste para obtener sabores

agradables cuando las concentraciones de este ácido se encuentran entre 0.02 a

0.08% de peso en seco.

El ácido galacturónico (Figura 26-d) por su parte registra una tendencia de

disminución de su concentración a medida que el proceso de fermentación avanza

(pH disminuye). Inicia con una concentración de ácidos por encima de 10.8 mg/mL

y progresivamente disminuye (al pH comprendido entre 4.5 y 4.8, de una forma un

poco más pronunciada a 10.4), posteriormente la concentración disminuye de

forma menos pronunciada que para la primera disminución entre los G2 y G3.

Algunos investigadores (Dinu, 2001) indican que el á. galacturónico y el á.

poligalacturónico son constituyentes importantes de las pectinas. Las anteriores

teorías sobre la degradación del mucílago presuponían que la degradación del

mucílago se debía a la digestión de las pectinas por enzimas presentes en

microorganismos (García et al, 1991).

El ácido málico por su parte (Figura 26-e) presenta una concentración decreciente

a medida que el proceso de fermentación avanza. Inicialmente la concentración

del ácido presenta valores cercanos a 0.28 mg/mL, se registra luego una

disminución pronunciada al pH de 4.5-4.8, posteriormente la concentración en este

ácido no presenta cambios perceptibles, manteniéndose constante en el rango de

los G1, G2 y G3. Ligeramente se puede apreciar que en el G3 la concentración del

ácido es inferior que en el G1 y G2. Este patrón en el comportamiento de la

concentración del ácido málico a medida que avanza el proceso fermentativo es

muy similar al que se midió mediante la técnica del Reflectoquant (Figura 25-a),

esto puede dar una indicación que ambas técnicas estarían correlacionadas y que

definitivamente el patrón observado para este ácido tiene una relación con la caída

del pH.

A pesar de estas diferencias en cuanto al carácter de la distribución, en ambos

casos hubo diferencias entre los grupos debido a las características del

comportamiento de la concentración del ácido málico en dependencia del pH y en

base a la prueba de contrastes que se realizaron a los datos de reflectoquant

(Tabla 40). La literatura (Flament, 2002) reporta que este ácido es responsable de

la acidez junto con los ácidos acético y cítrico. Por lo general el á. málico se asocia

con notas de sabores acaramelados.

Algunos de los grupos dentro del ácido propiónico tampoco se ajustaron a una

distribución normal, por lo tanto se realizó una prueba no paramétrica y los

resultados de esta indicaron que no había diferencias entre los grupos. Esto

explicaría el comportamiento presentado por dicho ácido en el transcurso de la

fermentación (Figura 26-f), se puede apreciar que a medida que el proceso

fermentativo avanza, aumenta ligeramente la concentración de dicho ácido entre

el grupo inicial y el G1, posteriormente dicho aumento se hace un poco más

pronunciado entre el G1 y el G2, finalmente disminuye entre G2 y G3. Wootton

(1963a, b) indica que este ácido solamente aparece en etapas muy avanzadas del

proceso fermentativo, no en las etapas tempranas. Por esta razón, los valores

obtenidos fueron muy bajos y con alta incertidumbre. El á. propiónico está

asociado a notas de sabores desagradables (aroma a cebollas), con los resultados

obtenidos no se puede decir categóricamente que el pH más bajo influye en el

aumento de la concentración de dicho ácido.

Figura 26- Comportamiento de las concentraciones promedio de los ácidos analizados en dependencia del pH

Vistos los comportamientos para todos estos ácidos, se puede decir que en

términos generales para la prueba ANOVA 1 vía, los resultados no arrojaron

diferencias significativas entre todos los grupos. Los gráficos de concentración en

(a) Concentraciones de á. fórmico (b) Concentraciones de á. acético (c) Concentración de á. cítrico (d) Á. galacturónico (e) Á. málico (f) Á. Propiónico

3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"

Mea

n of

CO

N_A

CE

.33

.32

.31

.30

.29

.28

3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"

Mea

n of

CO

NC

_FO

R

.50

.48

.46

.44

.42

.40

3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"

Mea

n of

CO

N_C

IT

.26

.25

.24

.23

(a) (b)

(c)

3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"

Mea

n of

C_g

al11.0

10.8

10.6

10.4

10.2

10.0

(d)

3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"

Mea

n of

CO

NC

_MA

L

.30

.28

.26

.24

.22

.20

(e)

3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"

Mea

n of

CO

N_P

RO

P

.140

.138

.136

.134

.132

.130

(f)

dependencia del pH en que se interrumpe la fermentación hacen indicar que en

realidad hubo ligeros cambios en las concentraciones de los ácidos.

Un análisis más detallado de estas variaciones en dependencia del avance del

proceso fermentativo fue ya estudiado por López et al (1989). En dicho estudio se

estudiaron los mismos ácidos carboxílicos que en la presente investigación y de

forma paralela se estudiaron las características organolépticas de las muestras

ensayadas. En cuanto al comportamiento de los ácidos, algunas características

importantes pueden apreciarse en la Figura 27, al igual que en el presente estudio

las concentraciones determinadas para los ácidos acético, fórmico, cítrico y

fórmico fueron inferiores a 0.5 mg/mL a lo largo del proceso fermentativo. Las

concentraciones de ácido galacturónico fueron inferiores a

3.5 mg/mL, en cambio en la presente investigación se registraron concentraciones

superiores a 10 mg/mL, análisis cualitativos posteriores mediante HPLC indicaron

que el ácido tartárico y el ácido glucorónico presentaban tiempos de retención

similares al del ácido galacturónico, lo cual hace sospechar que este aumento en

las concentraciones tenga sus causas inmediatas en la mezcla de dichos ácidos y

no exclusivamente á. galacturónico (Anexos, Sección 10.7).

Otro ácido que muestra una fuerte presencia en las muestras analizadas por

López et al (1989) es á. málico, el cual posee concentraciones de importancia en

dicho estudio, aunque en la presente investigación sus concentraciones no difieren

mucho de las que se determinaron para los otros ácidos (con excepción de á.

galacturónico). La situación de á. láctico ya se discutió con anterioridad y se

mencionaron los problemas inherentes a su separación mediante técnicas

cromatográficas.

Se aprecia que en ambos estudios las concentraciones de los ácidos, a pesar que

varían de cierta forma en el transcurso del proceso fermentativo, no siguen un

patrón claramente definido de aumento categórico en las concentraciones

promedio de los ácidos (ver última línea en ambas gráficas). Algunas

explicaciones puede encontrarse en el comportamiento individual de las

concentraciones de ciertos ácidos. Por ejemplo, el á. acético y el á. fórmico

tienden a aumentar conforme avanza el proceso fermentativo, otro ácido

(propiónico) mantiene una concentración relativamente constante mientras que el

á. galacturónico disminuye.

Los resultados de la prueba ANOVA 2 vías (Sección 5.3.4) indican diferencias

importantes entre los experimentos. Para cinco de los ácidos (con excepción de á.

fórmico) se compararon 4 experimentos (B, C, F y K) debido a que la prueba

ANOVA 2 vías solamente se puede realizar cuando el número de datos es igual

para todas las columnas y para las filas. Un análisis estadístico por medio de la

técnica gráfica de las “cajas de puntos” muestra que el experimento C presenta

diferencias remarcables con respecto al resto de experimentos (Figura 28). El

cuaderno de experimentos no registra anotaciones excepcionales para el día en

que se realizó el experimento C. Al contrario de otros días experimentales en los

que se indicaron comentarios especiales para cuando la temperatura disminuyó

sobremanera con relación a los días previos. Esto lleva a estimar que los análisis

realizados mediante la técnica ANOVA 1 vía deben analizarse con cuidado,

básicamente porque las semejanzas o diferencias entre grupos podrían estar

influenciadas por características inherentes a dichos experimentos. Wootton

(1963a) ya había comentado sobre las altas variabilidades que existen entre

diferentes lotes de café provenientes inclusive de una misma finca, otorgaba como

causas de estas variabilidades a factores como las condiciones de cada planta y al

grado de madurez de las frutas, ambos factores podrían influenciar las

características bioquímicas de los granos. En este caso se debe tener en cuenta

que cada experimento consistió en muestras provenientes de puntos distintos de

la finca.

Figura 27 -Concentraciones de ácidos orgánicos conforme avanza el proceso fermentativo

6.1-6.3

4.5-4.8

4.2-4.4

3.7-4-0

Prom

edio

Fórm

ico

Mál

ico

Acé

tico

Cítr

ico

Pro

pión

ico

Gal

actu

róni

co

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

Concentración de ácidos en dependencia del pH de interrupción de la fermentación

C (m

g/m

l)

pH de interrupción de fermentación

(a) Concentraciones de á. orgánicos identificadas por López et al (1989) (b) Concentraciones de á. orgánicos identificadas en la presente investigación. En ambos casos las unidades son mg/mL.

(a)

(b)

Figura 28 - Gráficos de cajas “boxplots”, análisis ANOVA 2 vías entre experimentos

444N =

FCB

C_F

OR

MIC

.7

.6

.5

.4

.3

.2

4444N =

KFCB

C_P

RO

P

.18

.17

.16

.15

.14

.13

.12

.11

4444N =

KFCB

C_C

ITR

IC.34

.32

.30

.28

.26

.24

.22

.204444N =

KFCB

C_A

CE

TIC

.5

.4

.3

.2

4444N =

KFCBC

_MA

LIC

.4

.3

.2

.14444N =

KFCB

Gal

_Aci

d

18

16

14

12

10

8

6

4

(a) (b)

(c) (d)

(a) A. galacturónico, (b) A. málico, (c) A. acético (d) A. cítrico (e) Á. Propiónico (f) Á. Fórmico. Eje X presenta los experimentos.

(e) (f)

Las pruebas ANOVA de 2 vías solamente indicaron diferencias estadísticas entre

las concentraciones de á. málico y á. cítrico cuando se realizaron comparaciones

entre los cuatro grupos para dicho experimento, reforzando nuevamente los

resultados ya obtenidos con ANOVA 1 vía para el á. málico. Como también la

impresión que las muestras obtenidas de diferentes experimentos realmente

tenían diferencias entre sí.

Los análisis mediante reflectoquant constituyeron una valiosa fuente de

información al momento de determinar las concentraciones para el ácido láctico

(Ver Sección 5.4.2). Se puede apreciar claramente que la concentración de dicho

ácido aumenta de forma proporcional al avance del proceso fermentativo

(disminución del pH). La cuestión es hasta qué punto los datos mediante este

sistema son comparables o confiables en comparación a los obtenidos mediante la

técnica del HPLC.

Lo anterior puede analizarse mediante correlaciones entre ambas técnicas, en

este caso tomando como referencia el ácido málico para el cual hay suficientes

datos obtenidos mediante ambas técnicas (Figura 29). El resultado de las

correlaciones entre ambas técnicas indica .598, para un nivel de significancia de

0.01 (prueba de 2 colas). En parte se puede decir que es un valor aceptable, con

una correlación positiva, sin embargo indica en buena parte las variabilidades que

con anterioridad se presentaron para ambas técnicas como las diferencias en

cuanto a los límites de detección y a las distribuciones obtenidas. No debe

descartarse que la técnica HPLC implica un protocolo mucho más extenso, lleva

más procedimientos y por lo tanto las probabilidades de realizar errores en el

laboratorio aumentan.

Figura 29 - Gráfica y tabla con el coeficiente de correlación para ácido málico, técnica del reflectoquant y HPLC.

La técnica del Reflectoquant obvia la centrifugación y las continuas filtraciones,

razón por la cual hay más probabilidades que partículas mayores interactúen con

las cintas de medición y tiendan a otorgar un valor inferior en la concentración del

ácido. Asimismo en la fase de campo el tiempo de agitación fue muy inferior

(alrededor de 15 segundos, contrario a la fase de laboratorio que fueron 45

minutos más o menos.

Como se ha indicado en la Sección 4.2.4.4, página 54, el ácido láctico se midió

también durante la fase experimental. Una medición en dicha fase se vislumbra de

gran utilidad para determinar si las características de las muestras en cuanto a la

concentración de los ácidos sufren variaciones debido al procedimiento

experimental y de análisis instrumental.

Los resultados de las mediciones de las concentraciones de ácido láctico durante

la fase experimental (Figura 30) muestran un comportamiento similar a las

concentraciones de ácido láctico medidas durante la fase de laboratorio

(Figura 25-b). Se puede apreciar un incremento en las concentraciones del ácido a

El coeficiente de correlación de Pearson se presenta cuando se compara la columna M_Refl con la columna M_HPLC.

M_HPLC (mg/ml)

.4.3.2.1

M_R

efl (

mg/

ml)

.20

.18

.16

.14

.12

.10

.08

.06

.04

Correlations

1 .598**. .000

36 36.598** 1.000 .

36 36

Pearson CorrelationSig. (2-tailed)NPearson CorrelationSig. (2-tailed)N

M_Refl (mg/ml)

M_HPLC (mg/ml)

M_Refl(mg/ml)

M_HPLC(mg/ml)

Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).**.

medida que avanza el proceso fermentativo, este incremento fue reportado por

Wootton (1963b) y comprobado por Avallone et al (2001b).

Figura 30 - Concentraciones de ácido láctico a medida que disminuye el pH en que se interrumpe la fermentación

Si las gráficas de las medias en dependencia de los grupos indican similitudes en

los comportamientos del ácido láctico en las fases experimental y de laboratorio,

en tanto control experimental, se compararon para determinar que tan bien

correlacionados estaban los valores de concentración obtenidos en ambas fases.

El coeficiente de Pearson es de .877. Lo cual implica que la correlación es muy

importante entre ambas mediciones, y esto prueba que las características de las

muestras se mantuvieron de forma adecuada (Figura 31). Sin embargo, ligeras

diferencias se aprecian en cuanto a las concentraciones determinadas en distintas

etapas del análisis. En efecto, se puede apreciar en la Figura 31 que los valores

medidos en la fase experimental (campo) son distintos a los registrados para las

mismas muestras en la fase de laboratorio. En una investigación de este tipo, en el

que se trataron de mantener constantes las condiciones de extracción de los

ácidos en la fase experimental (Sección 4.2.4), junto con las condiciones de

En el eje de las x se indican los distintos grupos experimentales durante los cuales se interrumpió la fermentación, en el eje de las y el promedio de las concentraciones de ácido láctico para los distintos grupos experimentales.

"3.7-4""4.2-4.4""4.5-4.8""6.1-6.3"

Mea

n of

C_L

_FIE

L

120

100

80

60

40

20

0

extracción durante la fase de laboratorio (Sección 4.3.1), es de extrañar que

dichos cambios ocurrieran.

Figura 31 - Gráfica y tabla con el coeficiente de correlación para ácido láctico. Fase experimental y fase de laboratorio

Una causa de estos cambios es el factor de dilución empleado para disolver las

muestras en agua destilada, a pesar que se trató de emplear un factor de dilución

similar para ambas fases, se obviaron mediciones cuantitativas con instrumentos

volumétricos en la fase experimental, en su defecto se utilizaron recipientes de

plástico graduados para representar el límite máximo de granos o de agua

purificada (tratando de representar al máximo las condiciones en que los

cafetaleros utilizarían el método). Por otro lado en la fase de laboratorio las

mediciones se realizaron con frascos volumétricos y también se llevó un registro

más estricto de las masas y volúmenes con que se diluyó cada muestra.

El coeficiente de correlación de Pearson indica un valor de .877, esto hace entrever que los valores de concentración de ácido láctico en la fase experimental (C_L_Fiel) tienen una muy buena correlación con los valores de ácido láctico de la fase de laboratorio (C_L_Lab).

Correlations

1 .877**. .000

34 34.877** 1.000 .

34 34

Pearson CorrelationSig. (2-tailed)NPearson CorrelationSig. (2-tailed)N

C_L_FIEL

C_L_LAB

C_L_FIEL C_L_LAB

Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).**.

C_L_FIEL

4003002001000

C_L

_LA

B

120

100

80

60

40

20

0

En la misma línea de las comparaciones entre las mediciones de las

concentraciones de á. láctico durante la fase de campo y durante la fase

experimental, se realizaron comparaciones de las mediciones del pH durante

ambas fases, se persigue un mismo objetivo: determinar si durante el transcurso

de interrupción de la fermentación y el almacenamiento mediante congelamiento,

las muestras sufrieron cambios importantes en sus características.

De forma previa a las comparaciones de pH entre ambas etapas, se realizó una

correlación entre los pH medidos mediante la técnica del reflectoquant y aquellos

determinados mediante las cintas de pH en la fase experimental (Sección 4.2.4.3).

Los resultados de la correlación indican un valor de p = .986 (Figura 32). Esto

hace entrever la validez de las mediciones con la técnica de las cintas, a pesar de

la dificultad que implica dicha técnica cualitativa (debido a la subjetividad de los

colores y por ende las diferentes percepciones dependiendo de quien haga la

medición).

Figura 32 - Gráfica y tabla de correlación (Pearson) para los datos de pH medidos en la fase experimental con el sistema Reflectoquant y con cintas indicadoras

El coeficiente de correlación de Pearson se presenta cuando se comparan los datos de pH con Reflectoquant (pH_Ref_F) con el pH medido mediante las cintas (pH_strip). Ambos conjuntos de datos fueron obtenidos durante la fase de campo.

PH_STRIP

6.56.05.55.04.54.03.5

PH

_RE

F_F

6.5

6.0

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

Correlations

1 .986**. .000

27 27.986** 1.000 .

27 27

Pearson CorrelationSig. (2-tailed)NPearson CorrelationSig. (2-tailed)N

PH_STRIP

PH_REF_F

PH_STRIP PH_REF_F

Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).**.

Puesto que los grupos experimentales se formaron en base a las mediciones de

pH realizadas con el sistema cualitativo de las cintas se puede tener la seguridad

que dicho agrupamiento fue correctamente realizado.

Una segunda interrogante podría surgir cuando se analizan los datos del pH: tras

el tiempo de transporte y almacenamiento ¿las muestras preservaron su

constancia en pH?

Para responder a esta interrogante se correlacionaron los datos de pH obtenidos

mediante la técnica de las cintas cualitativas durante la fase de campo con los

datos obtenidos mediante las mediciones cuantitativas mediante Reflectoquant en

la fase de laboratorio (Figura 33). Los resultados de dicha correlación arrojan un

valor de p=.903. Es decir la relación se mantuvo constante durante ambas fases.

Figura 33- Gráfica y tabla de correlación (Pearson) entre las mediciones de pH, fase experimental y fase de laboratorio

Las mediciones de pH durante la fase de campo mediante las cintas cualitativas (pH_Field), se correlacionaron con las mediciones cuantitativas durante la fase de laboratorio (pH_lab).

Correlations

1 .903**. .000

34 34.903** 1.000 .

34 34

Pearson CorrelationSig. (2-tailed)NPearson CorrelationSig. (2-tailed)N

PH_FIELD

PH_LAB

PH_FIELD PH_LAB

Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).**.

PH_LAB

6.05.55.04.54.03.53.0

PH

_FIE

LD

6.5

6.0

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

En la Figura 33 se puede apreciar que los valores de pH medidos mediante la

técnica Reflectoquant en la Fase de laboratorio (pH_lab), tienden a arrojar valores

ligeramente inferiores que aquellos medidos en el campo con las cintas

(pH_Field). El equipo investigador discutió con anterioridad este hecho, se piensa

que el agua utilizada en la fase de campo (agua purificada comercial) posee

sustancias amortiguadoras (buffer) que tienden a otorgar valores de pH diferentes

a los que se obtienen cuando dichas mediciones se realizan con agua destilada (el

caso de la fase de laboratorio).

7 CONCLUSIONES

Los análisis cualitativos realizados mediante la técnica HPLC permitieron separar

e identificar 6 ácidos carboxílicos: á. galacturónico, á. fórmico, á. málico, á.

acético, á. cítrico y á. propiónico.

El ácido láctico se identificó mediante la técnica Reflectoquant, sin embargo no se

pudo separar mediante las condiciones de análisis cromatográfico empleadas

debido a que el á. ascórbico presentó un tiempo de retención que se extrapoló con

el del á. láctico.

Los análisis estadísticos de los datos obtenidos mediante HPLC y utilizando la

prueba ANOVA 1 vía y la prueba no paramétrica Kruskal-Wallis no indicaron

diferencias estadísticas entre las concentraciones para los distintos grupos de pH

para los cuales se interrumpió la fermentación.

Cuando se configuraron los datos mediante un diseño ANOVA 2 vías y se

compararon los grupos de pH y los días experimentales, surgieron diferencias

entre los días experimentales.

Las diferencias entre días experimentales explicarían que no hubiese diferencias

al realizar un análisis ANOVA 1 vía. Es de esperar que dentro de un mismo

universo de estudio (cosecha dentro de una finca) existan diferencias en las

composiciones químicas de los granos de café.

Por otro lado, los promedios de las concentraciones de cada ácido dentro de cada

grupo (tomando en cuenta todos los valores) indican un incremento conforme

avanza la fermentación para ácidos representativos como acético, cítrico y málico.

Los datos de Reflectoquant obtenidos para el á. málico se correlacionaron con los

obtenidos con HPLC y la correlación fue altamente positiva, lo cual valida la

técnica del Reflectoquant.

Los datos de Reflectoquant también fueron útiles para conocer el comportamiento

del á. láctico, el cual, como se explicó con anterioridad, no pudo ser detectado

mediante HPLC. Para este ácido se comprobó un comportamiento de aumento de

la concentración conforme avanza el proceso fermentativo.

8 RECOMENDACIONES

De acuerdo a las pocas diferencias observadas entre grupos experimentales

mediante el diseño ANOVA 1 vía, para futuras investigaciones se recomienda

realizar un diseño experimental más centrado en la constitución de grupos y

bloques para un análisis de varianza ANOVA 2 vías.

A grandes rasgos, los resultados no demuestran diferencias muy marcadas entre

los grupos experimentales. Sin embargo, al analizar el patrón de las

concentraciones de los distintos ácidos conforme avanza la fermentación, se

aprecian aumentos de concentraciones en ácidos representativos como acético,

cítrico y láctico. Esto debe tomarse en cuenta al momento de elaborar un manual

destinado a un control más adecuado del proceso fermentativo, especialmente si

se requieren evitar concentraciones muy elevadas de estos ácidos (lo cual ocurre

por lo general en el G2 y G3, con pH entre 3.7- 4.0).

De acuerdo a los resultados presentados por Jackels et al (2006) en los resultados

de la catación profesional de las muestras utilizadas para este estudio difícilmente

se apreciaron diferencias significativas entre el grupo de pH en el cual se

interrumpió la fermentación y la calidad organoléptica del café. Sin embargo los

resultados muestran valores de calidad ligeramente superiores y con menor

incertidumbre para las muestras cuya fermentación se interrumpió en el pH del

G1.

Los resultados del mismo estudio (Jackels et al, 2006), pero con los experimentos

realizados de forma independiente por productores de café con los kit distribuidos

en sus fincas, indicaron mejoras remarcables en la calidad del café cuya

fermentación fue interrumpida en un pH cercano a 4.6. Dichas mejoras fueron

destacables en aquellos productores que midieron adecuadamente el pH y

registraron los valores de forma correcta.

Los anteriores resultados, así como el patrón identificado para determinados

ácidos (acético, cítrico y láctico) en la presenta investigación, además de la

correlación muy buena entre la técnica cualitativa de las cintas de pH y la técnica

cuantitativa de medición de pH mediante Reflectoquant, permite recomendar

futuras prácticas con el uso del kit para controlar el pH de fermentación. Un

aspecto fundamental es la utilización correcta del kit: la lectura adecuada de los

pH indicados por los colores de las cintas, anotar los datos correctos. Se ha

discutido la posibilidad de capacitar en la realización de esas tareas a los

miembros más jóvenes de las familias, tomando en cuenta que están envueltos en

el sistema educativo y que conjugan los conocimientos heredados de sus mayores

en cuanto al procesamiento del café con una apertura personal para aceptar

modificaciones a las técnicas con que procesan el café.

La longitud de onda del detector UV (214 nm) detectó interferencias en el tiempo

de retención del ác. Láctico. El ác. interferente fue ácido ascórbico, se recomienda

por tanto realizar ensayos con longitudes de onda diferentes con el fin de

comparar la detección excluyente del ácido ascórbico.

Como se apreció, la técnica HPLC tiene sus limitantes al realizarse análisis con

“café verde”. Las comparaciones de calidad basadas en las concentraciones de

determinados ácidos se podrían mejorar al utilizar “café tostado” y la técnica de

Cromatografía de Gas (GC). Ambas experiencias podrán desarrollarse con

instrumentos ya existentes en la Universidad como parte de futuros proyectos de

tesis.

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10 ANEXOS

10.1 MAPA DE LOCALIZACIÓN DE LA FINCA CAFETALERA LA CANAVALIA Y MAPA DE LA FINCA

Figura 34 - Localización de la finca la Canavalia,

La finca se localiza en la parte alta de la cuenca del Río Grande de Matagalpa, en el Municipio de San Ramón, Departamento de Matagalpa. La zona cafetalera más importante de Nicaragua se localiza en las partes altas de las cuencas fluviales

Figura 35- Mapa de uso del suelo en la finca La Canavalia.

La fi

nca

tiene

una

pro

ducc

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dive

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cada

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caf

etal

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de 1

78 m

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(125

.42

Ha)

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36 m

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nas

(26

Ha)

par

a el

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de c

afé

orgá

nico

.

10.2 ORDEN DE ELUSIÓN DE ÁCIDOS CARBOXÍLICOS

Como se indicó en la Sección 5.1.1, el primer experimento consistió en identificar

el orden de elusión de los ácidos carboxílicos durante un análisis cromatográfico.

A continuación se presentan cromatogramas para cada una de las soluciones

estándares de ácidos carboxílicos, en las cuales había solamente un ácido

presente a una concentración de 3 mg/mL.

Al final se presenta también el cromatograma del patrón interno, se puede apreciar

que bajo condiciones de análisis similares presenta un tiempo de elusión diferente

al conjunto de ácidos carboxílicos estándares, asimismo su área con una

concentración de 0.05 mg/mL se acopla al área del resto de estándares.

Tabla 43- Lista de archivos de cromatogramas de muestras y el patrón interno que se utilizaron para determinar los órdenes de elusión.

Ácido orgánico Archivo Orden (luego de esta página)

Galacturónico Roberto 05 1

Fórmico Roberto 36 2Málico Roberto 11 3Láctico Carlos 13 4Acético Roberto 30 5Citríco Roberto 17 6Propiónico Roberto 24 7Pirazincarboxílico (Patrón Interno)

Newinternal 028

10.3 IDENTIFICACIÓN DE ÁCIDOS CARBOXÍLICOS EN LAS MUESTRAS

En el siguiente set de cromatogramas se presentan los resultados del análisis

cualitativo cuyo fin era determinar el carácter de los picos eluidos para las

muestras de café.

Como se mencionó en la Sección 5.1.2 para el primer análisis se utilizó una

muestra de café (6832K) con un pH bajo (3.9), a esta muestra se le agregaron

100µl de mezcla de estándares (ácidos carboxílicos) a 8 mg/mL, el cromatograma

resultante (coffee_nic253) puede apreciarse de color azul en la primera página del

set de cromatogramas. A este cromatograma se le sobrepuso el cromatograma

coffee_nic254, que consiste en la misma muestra (6832K) más 200 µl de la

mezcla de estándares. Se puede apreciar claramente un incremento en las áreas

de determinados picos, esto conlleva a una primera conclusión sobre los picos que

corresponden a los ácidos carboxílicos de interés y los que no corresponden.

Lo anterior se comprueba en el segundo cromatograma del set, en el cual a la

muestra 6832K + 200 µl de la mezcla de estándares (Coffee_nic 255) se ha

comparado con el cromatograma de esta muestra más 200 µl de patrón interno

(Coffee_nic 258), un incremento en las áreas se aprecia en los picos identificados

como A, C, D, E, G, I, K y L.

Estos mismos picos muestran un incremento en la muestra de pH 4.8 (6346E), en

el tercer cromatograma del set. En ese caso se comparó el cromatograma

Coffee_nic 261 (muestra + 200 µl de estándares de ácidos carboxílicos), con los

cromatogramas Coffee_nic 264 (muestra + 100 µl de estándares de ácidos

carboxílicos) y Coffee_nic 267 (muestra + 200 µl de patrón interno).

10.4 CROMATOGRAMAS UTILIZADOS PARA LA ELABORACIÓN DE LAS CURVAS DE CALIBRACIÓN

Los siguientes cromatogramas se utilizaron para obtener los datos de la curva de

calibración (Ver Sección 5.2.1). Cabe destacar que los análisis se realizaron por

triplicado, sin embargo a continuación se presentará solamente un cromatograma

representativo.

Tabla 44 - Lista de archivos cromatogramas utilizados para la elaboración de la curva de calibración

Mezcla de ácidos (mg/mL)

Archivo Orden en el set de cromatogramas

0.4 Coffee_nic 91 1 1.2 Coffee_nic 92 2 2.4 Coffee_nic 95 3 4 Coffee_nic 98 4 6 Coffee_nic 101 5 8 Coffee_nic 105 6

10.5 CROMATOGRAMAS CORRESPONDIENTES A LAS MUESTRAS DE MUCÍLAGO ANALIZADAS MEDIANTE HPLC

Experimento Código pH (papel) archivo5082 4.5 coffee_nic1408189 3.9 coffee_nic798410 6.3 coffee_nic883470 4.3 coffee_nic852585 4.2 coffee_nic826053 4.7 coffee_nic1492837 4.2 coffee_nic1466053 6.3 coffee_nic1521510 4 coffee_nic1435307 3.7 coffee_nic1121293 4.2 coffee_nic1185122 3.9 coffee_nic1156346 4.8 coffee_nic1343727 4.2 coffee_nic1319370 3.8 coffee_nic1287118 4.4 coffee_nic1379296 4.7 coffee_nic1596181 3.9 coffee_nic1568071 6.1 coffee_nic1685000 4 coffee_nic1719801 4.2 coffee_nic1746615 4.4 coffee_nic1802935 6.1 coffee_nic1835169 4.5 coffee_nic1862935 4.6 coffee_nic189

Beneficio coffee_nic1928507 4 coffee_nic1986319 3.8 coffee_nic1956319 6.1 coffee_nic2015583 4.3 coffee_nic2276832 3.9 coffee_nic2306174 4.7 coffee_nic2336174 6.1 coffee_nic2367060 4.2 coffee_nic2393539 3.9 coffee_nic2428548 3.8 coffee_nic245

F

K

L

G

H

J

B

C

D

E

10.6 MATRICES DE RESULTADOS CON LAS CONCENTRACIONES DE ÁCIDOS CARBOXÍLICOS DETERMINADAS MEDIANTE REFLECTOQUANT

En las siguientes matrices se presentan las mediciones realizadas para los ácidos

málico y láctico mediante Reflectoquant ®.

La configuración de las matrices es igual a la utilizada para recolectar los datos

mediante HPLC, con las filas indicando las separaciones entre experimentos y las

columnas las separaciones entre pH.

Para las mediciones de estos parámetros se utilizaron las mismas muestras que

para el análisis mediante HPLC.

Tabla 45- Matriz de concentraciones determinadas para los ácidos málico y láctico mediante reflectoquant ®

Benef.6.3 6.1 4.8 4.7 4.6 4.5

B 139.00 B 128.00

C 125.00 C 145.00D DE E 95.00F 190.00 F 86.00G 198.00 GH 80.00 166.00 H 73.00 60.00J 186.00 JK 159.00 K 74.00L 159.00 L

4.4 4.3 4.2 4 3.9 3.8 3.7B 65.00 62.00 B 84.00C 135.00 C 150.00D 102.00 D 136.00 104.50E 93.00 E 52.00F 151.00 F 73.00G 79.00 G 72.00H 83.00 HJ J 103.00 97.00K 61.00 K 75.00L 118.00 L

Benef.6.3 6.1 4.8 4.7 4.6 4.5

B 27.00 B 36.00C 17.00 C 42.00D DE E 36.00F 21.00 F 25.00G 15.00 GH 37.00 18.00 H 26.00 31.00J 18.00 JK 14.00 K 33.00L 19.00 L

4.4 4.3 4.2 4 3.9 3.8 3.7B 43.00 31.00 B 62.00C 32.00 C 93.00D 41.00 D 75.00 56.00E 47.00 E 28.00F 60.00 F 69.00G 31.00 G 108.00H 44.00 HJ J 48.00 31.00K 46.00 K 59.00L 39.00 L 57.00

Grupo 2 (pH =4.4-4.1) Grupo 3 (pH=4.0-3.6)

Á. Málico Concentraciones (mg/ l)

Exp.Á. Láctico Concentraciones (mg/ l)

Inicial Grupo 1 (pH =4.8-4.5)

Exp. Inicial Grupo 1 (pH =4.8-4.5)

Grupo 2 (pH =4.4-4.1) Grupo 3 (pH=4.0-3.6)

10.7 CROMATOGRAMAS DE COMPONENTES ASOCIADOS AL ÁCIDO GALACTURÓNICO

El archivo “glucoronic 04” consiste en un cromatograma con los 7 ácidos

estándares, se puede apreciar que el área del ácido galacturónico es 189.5100,

con un tiempo de retención de 2.083 min, en color azul se revelan los picos para

esta mezcla se sobreponen en color rojo los picos del archivo glucoronic03. A esta

mezcla de 7 ácidos se agregó ácido glucorónico (glucoronic03) y el área en donde

se había registrado el á. galacturónico aumentó hasta 892.8160. El tiempo de

retención fue de 1.966 casi sobrepuesto con el tiempo de retención anteriormente

registrado para á. galacturónico.

En el cromatograma “tarta02” presenta los tiempos de retención y las áreas

medidas para una mezcla de 7 ácidos. En este caso el ácido galacturónico

presenta un tiempo de retención de 2.300 minutos y un área de 809.6140 min.

En el archivo “tarta01” se presenta un cromatograma en el cual a la anterior

mezcla de ácidos se ha agregado á. tartárico, como se puede ver el resultado es

la aparición de un pico con área 14323 .9145 y con tiempo de retención de 2.316

min. Con un tiempo de retención similar al del á. galacturónico.

10.8 CROMATOGRAMAS PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPONENTE ASOCIADO AL ÁCIDO LÁCTICO

En los siguientes cromatogramas se presentan los resultados del análisis

realizado al ácido ascórbico, en el primero de ellos (mezcladeacidos08) se

presenta el análisis de una mezcla de ácidos estándares con los siguientes

órdenes de elusión: galacturónico, fórmico, málico, láctico, acético, cítrico y

propiónico. Se puede apreciar que para el componente ácido láctico (tiempo de

retención 3.683 min) el área en este cromatograma es de 982.05, en el segundo

cromatograma, (mezcladeacidos07) en el que a la misma concentración de ácidos

en mezcla se ha añadido ácido ascórbico, se aprecia que para el mismo tiempo de

retención de ácido láctico el área ha aumentado a 1764.61.

El tercer cromatograma (mezcladeacidos09) en el que se ha analizado el á.

ascórbico en solitario, demuestra que el tiempo de retención de dicho ácido es

muy similar al del á. láctico y por ende en el previo cromatograma el aumento en el

área se debía a la inclusión de á. ascórbico.