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TESIS CON CARACTER ABIERTO

PROGRAMA:. MAESTRÍA EN TECNOLOGÍA DE POLÍMEROS

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TITULO: Preprac1ón y caracterización de membranas nollrnéricss permeables obtenidas por deposiclón alternada de polielectrolitos sobre células de Saccharpmyces cerevisiae.

ASESOR: Dr, Sergio Moya FIRMA

M.C. Antonio S. Ledezma Pérez ____________

El Centro de investigación en Qulmica Aplicada clasifica el presenta documento de tesis como ABIERTO.

Un documento clasificado como Abierto se expone en los estantes del Centro de información para su consulta. Dicho documento no puede ser copiado en ninguna modalidad sin autorización por escrito del Titular del Centro de información o del Director General del CIQA.

Saltillo, Coahuila, a 26 de Febrero - de 2007

Sello de la Institución Drandez NoneH Firma del Director General del CIQA

Centro de Investigación en Química Aplicada

TESIS

Preparación y caracterización de membranas poliméricas permeables obtenidas por deposición

alternada de polielectrolitos sobre células de Saccharomyces cerevisiae

Presentada por:

MÓNICA AIMEÉ CENICEROS REYES

Para obtener el grado de:

MAESTRO EN TECNOLOGÍA DE POLÍMEROS

Asesores

Dr. Sergio Moya M. C. Antonio S. Ledezma Pérez

Saltillo, Coahuila Febrero 2007

CENTRO DE INVESTIGACION EN QUIMICA APLICADA Programa de Maestría en Tecnología de Polímeros

TESIS Preparación y caracterización de membranas poliméricas permeables obtenidas por

deposición alternada de polielectrolitos sobre células de Saccharomyces cerevisiae

Presentada por:

MÓNICA AIMEÉ CENICEROS REYES

Para obtener el grado de:

Maestro en Tecnología de Polímeros

Asesorada por:

Dr. Sergio Moya M.C. Antonio S. Ledczma Pérez

SINODALES

Vi

Dr. iorgejUol,ero García Dr. Dámaso Navarro Rodríguez sidente Secretario

Dr. Luis Alto García Cerda Vocal

Saltillo, Coahuila Febrero, 2007

DECLARACIÓN

Declaro que la información contenida en la Parte Experimental así como

en la Parte de Resultados y Discusiones de este documento y que forman

parte de las actividades de investigación y desarrollo realizadas durante el

período que se me asignó para llevar a cabo mi trabajo de tesis, será

propiedad del Centro de Investigación en Química Aplicada.

Saltillo, Coahuila a 26 de Febrero de 2006

MÓNICA AIMEÉ CENICEROS REYES Nombre y Firma

Dedicatoria

A Dios y a mi familia.

Agradecimientos

A Dios por permitirme llegar hasta aquí.....

A mis papás Humberto y Martha por todo su apoyo y a mis hermanas

Melissa y Daniela por su cariño.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por el apoyo financiero en el

proyecto 47350 para la realización de este proyecto de maestría.

Al Centro de Investigación en Química Aplicada por haberme permitido

realizar este trabajo de maestría en sus instalaciones.

Al Profesor Edwin Donath del Instituto de Biofísica y Física Médica de la

Universidad de Leipzig en Alemania por haberme permitido trabajar con su

equipo de investigación.

A mis asesores, el Doctor Sergio Moya y al M. C. Antonio Ledezma (Sr.

Tony) por el apoyo y dedicación para la realización de este trabajo.

- A mis evaluadores Dr. Luis Alfonso García Cerda, Dr. Dámaso Navarro

Rodríguez y Dr. Jorge Romero García por su valiosa aportación y tiempo dedicado

en la revisión de este trabajo.

A Esmeralda Saucedo, Miriam Lozano, M. C. Silvia Solís por su apoyo para

la caracterización de los materiales y a la L. C. Q. Gabriela Padrón por el apoyo

técnico otorgado en la manipulación de material biológico.

Especialmente a Ramiro Guedea y Layza Arizmendi por esos días y noches

de estudio compartido (ja), así también a Edgar Vergara, Maria Concepción García,

Migdaliz Garza, Araceli G., Selene Guzmán, Sofía Vazquez y Maricela García,

además con mucho cariño a Miguel Ángel M. y Deifilia Sánchez por el tiempo

compartido en el cubículo (se les extraña!). Esas fiestas estuvieron geniales!!!!

ÍNDICE

Página

Resumen i

1. Introducción 1

1.1. Nanofabricación 1

1.2. Polielectrolitos 2

1.3. Técnica capa a capa 4

1.4. Células utilizadas como plantillas 8

1.4.1. Características principales de Saccharomyces cerevisiae 9

1.5. Fabricación de Cápsulas 13

1.5.1. Influencia del núcleo sobre las propiedades de la cápsula 14

1.5.1.1. Núcleos orgánicos compuestos de polímeros

degradables 15

1.5.1.2. Núcleos que pueden ser disueltos a nivel de moléculas

de bajo peso molecular y iones 17

1.5.1.3. Núcleos que se disuelven por una oxidación fuerte 17

1.5.2. Determinación de la permeabilidad de las cápsulas 19

2. Hipótesis 21

3. Objetivo general 21

3.1. Objetivos particulares 21

4. Parte Experimental 22

4.1. Material y reactivos 22

4.1.1. Microorganismo 22

4.1.2. Reactivos 22

4.2. Preparación de soluciones 23

4.2.1. NaC1 0.5M 23

4.2.2. PSS 23

4.2.3. PAH 23

4.2.4. PDADMAC 23

4.3. Preparación de polielectrolitos marcados con Rodamina 23

4.4. Propagación de células de levadura Saccharomyces cerevisíae 24

4.4.1. Medio de cultivo 24

4.4.2. Preparación del preinóculo 25

4.4.3. Cinética de crecimiento de S. cerevisiae 25

4.4.4. Recuperación de la biomasa 26

4.5. Recubrimiento de células de levadura Sciccliaromyces cerevisiae 26

4.6. Crecimiento de células de Snccharomyces cerevisíae cubiertas con

diferente número de capas de polielectrolito 27

4.7. Preparación de cápsulas usando como plantilla células de la

levadura Saccharornyces cerevisiae 28

4.8. Instrumental 28

5. Resultados y Discusiones 32

5.1. Obtención de células de levadura Saccharoniyces cerevisiae 32

5.1.1. Propagación de células de Saccharornyces cerevisiae 32

5.1.2. Recubrimiento polimérico de células de S. cerevisiae 33

5.1.3. Efecto del recubrimiento polimérko preparado con diferente

número de capas sobre el crecimiento de S. cerevisiae 37

5.1.4. Fabricación de cápsulas 41

6. Conclusiones 51

7. Trabajo a futuro 52

Referencias 53

ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1. Algunas estructuras químicas de polielectrolitos. 2

Figura 2. Procedimiento de ensamblaje de multicapas en superficies

planas. 5

Figura 3. Procedimiento de ensamblaje de polielectrolitos por LBL sobre

partículas coloidales. 7

Figura 4. Ejemplo de una medición de potencial zeta de una deposición

de varios polielectrolitos: LI PDADMAC-PSS, • BSA-

• PDADMAC, O PSS-PAH, A DNA- PDADMAC. 7

Figura S. Mecanismo de reproducción de la levadura por gemación. 10

Figura 6. Modelo de la estructura de una célula de levadura. 11

Figura 7. Micrografía obtenida por SEM de un cultivo de Saccharornyces

cerevisine. 12

Figura 8. Micrografia obtenida por microscopia confocal de la disolución

de un núcleo de melamina. 16

Figura 9. Esquema de posibles reacciones de PAH y PSS durante el

tratamiento con NaOCl. 18

Figura 10. a) Microscopia confocal (transmisión) de cápsulas fabricadas a

partir de discositos; b) Imagen TEM de cápsulas fabricadas con

equinocitos. 19

Figura 11. Cinética de crecimiento de S. cerevisiae en medio YM. 33

Figura 12. Micrografías de microscopia laser confocal de células de S.

cerevisiae recubiertas con 15 capas de PSS/PAH con una

penultima capa de PAH-rodamina: a) micrografía en modo de

fluorescencia y b) micrografía en modo de reflexión. 34

Figura 13. Micrografía de microscopia laser confocal en el modo de

fluorescencia de una sola célula de S. cerevisiae cubierta con 15

capas de PSS/PAH con una penúltima capa de PAH-

rodamina. 35

Figura 14. Micrografía TEM del recubrimiento de una célula de levadura

• con 15 capas de polielectrolito PSS/PDADMAC. 36

Figura 15. Cinética de crecimiento para levaduras cubiertas con 10 capas

de polielectrolito: a) células sin recubrimiento, b) células

recubiertas con el sistema PSS/PAH y c) células recubiertas

con el sistema PSS/PDADMAC. 38

Figura 16. Cinética de crecimiento para levaduras cubiertas con 15 capas

de polielectrolito: a) células sin recubrimiento, b) células

• recubiertas con el sistema PSS/PAH y c) células recubiertas

con el sistema PSS/PDADMAC. 39

Figura 17. Micrografía TEM de una cápsula recubierta con 15 capas de

polielectrolito utilizando como plantilla una célula de

levadura. 42

Figura 18. Micrografías SEM de la superficie de una cápsula de 5 capas de

polielectrolitos. a) 35 740 aumentos y b) 176 600 aumentos. 44

Figura 19. Espectro de FTIR de: a) PSS sin tratar y b) PSS tratado con

agente oxidante. 46

Figura 20. Espectro de FTIR de: a) PAH sin tratar y b) PAH tratado con

agente oxidante. 48

Figura 21. Espectro de FTIR de: a) PDADMAC sin tratar y b) tratado con

agente oxidante. 50

ÍNDICE DE TABLAS

Página

Tabla 1. Características de algunos polielectrolitos utilizados para

encapsulación celular. 3

Tabla 2. Componentes del medio de cultivo YM y sus cantidades en

g/L. 25

Tabla 3. Condiciones de fabricación de los sistemas PSS/PAH y

PSS/PDADMAC. 26

Resumen

En esta tésis se ha procedido a recubrir levaduras del género Saccharonzqces

cerevisiae con multicapas de polielectrolitos del tipo "capa a capa", fabricadas por

deposición alternada de polielectrolitos de carga positiva y polielectrolitos de carga

negativa. Como policationes se utilizaron PAH (Poli(hidrocloruro de (alil amina))

y PDADMAC (Poli(cloruro de dialil, dimetil amonio)) mientras que el PSS (Poli 4-

estireno sulfonado de sodio) fue utilizado como polianión.

El recubrimiento de polielectrolitos sobre las células se fabricó con espesor

variable utilizando 5, 10 y 15 capas de carga alternada. Se caracterizó la integridad

del recubrimiento de la pared celular por medio de microscopia electrónica y de

microscopia confocal utilizando polímeros marcados. Para comprobar que las

levaduras mantenían sus funciones fisiológicas a pesar de haber sido modificada

con la multicapa de polielectrolitos, se realizaron experimentos de cinética de

crecimiento en medio de cultivo YM. El crecimiento celular se registró por medio

de medidas de turbidimetría. Este tipo de experimentos se realizó tanto para

células recubiertas de PSS/PAH como para recubiertas con PSS/PDADMAC para

los espesores de 10 y 15 capas. Se observó que en el caso de PSS/PAH el

crecimiento mostraba un retrazo mayor (4 horas) que en el caso de

PSS/PDADMAC y que en ambos casos al pasar de 10 a 15 capas se incrementan

los tiempos de crecimiento pero no se observaron mayores diferencias al aumentar

de 10 a 15 capas.

Las células recubiertas fueron utilizadas como plantilla para la fabricación

de cápsulas. Después de proceder al recubrimiento con la película de

polielectrolitos se oxidó a las células con NaOC1. Se estudió también la integridad

de las cápsulas fabricadas y su morfología por medio de TEM y SEM. Así como, el

efecto del NaOCl en la estructura química de los polielectrolitos que forman la

película a través de experimentos de IR.

Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Antecedentes

1. Introducción

1.1. Nanofabricación

La combinación de elementos de materia blanda (soft matter) como

polímeros, surfactantes, cristales líquidos, etc. y moléculas de origen biológico en

la nano y micro fabricación es sin duda una de las direcciones más prometedoras

en la moderna ciencia de materiales, dirección que aún no ha sido explorada en

profundidad. La combinación de macromoléculas sintéticas con proteínas, lípidos

y ácido desoxirribonucleico (ADN) abre muchas posibilidades en la fabricación de

nuevos materiales y dispositivos inteligentes, los cuales se beneficiarían de la

especificidad y selectividad de las biomoléculas y de las propiedades físicas de los

polímeros sintéticos, como por ejemplo la conductividad, la resistencia mecánica

[1], elasticidad y las propiedades eléctricas y ópticas [2].

En los últimos años se han desarrollado diferentes técnicas de nano

fabricación empleando polímeros. Estas técnicas han permitido la fabricación de

superficies poliméricas con estructura a nivel nanométrico, buscando de esta

*

manera lograr topologías superficiales definidas, o adquirir la capacidad de

responder a estímulos externos tales como el pH, la concentración iónica, la

temperatura, o de cambiar el carácter hidrofóbico o hidrofílico, etc.

- Una aplicación muy interesante de la nanofabricación es el diseño de

dispositivos para la liberación controlada de fármacos [3, 4, 51 que pueden reducir

la toxicidad sistémica, así como también para proteger a las moléculas que son

vulnerables a la degradación en el tracto digestivo entre otras [6].

En este trabajo se consideró la aplicación de la técnica de deposición de

polielectrolitos "capa a capa" para el recubrimiento de células de levadura para su

aplicación potencial como sistemas de liberación controlada.

1


1.2. Polielectrolitos

Los polielectrolitos (PE) son polímeros formados por monómeros

ionizables, que en solución acuosa se disocian resultando en una cadena

polirnérica con múltiples cargas y sus respectivos contraiones. Algunos ejemplos

de polielectrolitos se esquematizan en la figura 1.

Poli 4-estireno sulfonado de sodio (PSS) Poli (ácido nietacrilico)

(PMA)

Figura 1. Algunas estructuras químicas de polielectrolitos.

Cuando las soluciones de dos polímeros de carga opuesta se mezclan, éstas

se unen por medio de interacciones electrostáticas, dando lugar a un sólido, al

compensarse las cargas, que muchas veces precipita ante la falta de estabilidad

coloidal.

Los polielectrolitos se clasifican en débiles (PED) y fuertes (PEF) [I]. Un

polielectrolito fuerte es aquel que disocia completamente en una solución acuosa y

presenta constantes de disociación cercanas a 1 y a su vez ésta no se ve afectada

por el pH de la solución. Un polielectrolito débil, por el contrario, es aquel que

tiene una constante de disociación en el intervalo de 2 a 10. Estos polielectrolitos

no están completamente cargados en solución pero su carga puede ser modificada

2


variando el pH de la solución. La tabla 1 muestra algunos polielectrolitos y su

clasificación, como PED o PEF [8].

Tabla 1. Características de algunos polielectrolitos utilizados para encapsulación celular.

Sistema

Alginato Carragenina

PSS (Poli(estireno sulfonado)) Carboxymetil celulosa

Sulfato celulosa Heparina

Poli(metilen-co-guanidina) PDADMAC(Poli(cloruro de dialil

dimetil amionio)) Quitosan

PLL (Poli(L-Lisina))

PAH (Hidrocloruro de Poli(alil amina))

Hidrocloruro de poli(vinil amina)

Características

Poli anión fuerte Poli anión fuerte

Polielectrolito fuerte Poli anión Poli anión Poli anión Poli anión

Poli catión fuerte

Poli catión débil pKa de amina primaria 6.3-6.8

poli catión débil pKa de amina primaria -10.5

poli catión débil pKa grupo amina 8.5

Los PE tienen diversas y variadas aplicaciones tecnológicas. Se han utilizado

para estabilizar suspensiones coloidales o iniciar la floculación (precipitación),

también para otorgar carga a la superficie de partículas neutras, en tratamientos

de aguas y recuperación de aceites, y en otros casos se han incorporado en la

preparación de jabones, shampoo y cosméticos [7].

Entre algunos ejemplos de PEs utilizados en productos alimenticios

podemos citar la pectina, la carragenina, los alginatos, la polivinil pirrolidona y la

carboximetil celulosa.

3


Con el avance de las nuevas técnicas en nanotecnología los PE se han estado

utilizando en la fabricación de diferentes nanoestructuras y una de ellas es el

autoensamblaje mediante la técnica de "capa a capa".

1.3. Técnica capa a capa

Recientemente se ha desarrollado un nuevo concepto de nanofabricación a

partir del ensamblado de multicapas de polielectrolitos [9], utilizando la llamada

técnica "capa a capa" del ingles Layer bij Layer (LbL).

La técnica LbL fue introducida por Decher y col. [10] para ser utilizada en

superficies planas. Esta técnica consiste en la deposición alternada de

polielectrolitos de carga opuesta sobre una superficie cargada y desde el punto de

vista experimental es extremadamente sencilla. La técnica consiste en sumergir

alternadamente un sustrato cargado en soluciones de polielectrolitos con carga

opuesta. El proceso se inicia con una solución de carga diferente a la de la

superficie cargada que interactúa por atracción electrostática a su vez favorecida

por el proceso entrópico ocasionado por la liberación de contraiones. Durante el

proceso, la superficie del substrato adquiere la carga del polímero que se ha

depositado. Para eliminar el polímero en exceso, la superficie se lava con agua

después de cada deposición. Posteriormente el sustrato se vuelve a sumergir en

otra solución de polielectrolito pero ahora con carga opuesta al depositado sobre la

superficie. Este proceso se repite las veces necesarias hasta obtener una película de

espesor requerido (Figura 2).


Figura. 2. I'rocedimiento de ensamblaje de multicapas en superficies planas.

Por lo general, el espesor de una capa de polielectrolito en una película LBL

varía de uno a dos nanómetros y depende de las condiciones experimentales al

hacer la deposición, especialmente de la concentración salina de la solución de

polielectrolito, la cual va a definir la conformación con la que el polímero se

depositará en la superficie. Cuanto más baja sea la concentración de sal el

polímero estará más extendido y más delgada resultará la película. En general el

espesor de las películas fabricadas no sobrepasa los 15-20 nm aunque en principio

no hay un límite definido en el número de capas que se pueden depositar.

Además de los polielectrolitos es posible depositar otras especies cargadas tales

CO() nanopartículas, pellets de arcilla, células, lípidos, etc., incrementándose de

esta manera la complejidad y funcionalidad de la multicapa [101.

La composición de la multicapa puede ser variada con precisión a nivel

nanométrico y la composición en el interior de la multicapa no depende de la

composición en la capa más externa.


El par de polielectrolitos (policatión/polianión) más utilizado en la

fabricación de multicapas es sin duda el formado por poliestireno sulfonado de

sodio (PSS) que es un polianión fuerte y de alta estabilidad, y por poli(hidrocloruro

de alilamina) (PAH) [11, 121, un policatión relativamente débil. Es importante

mencionar que este polielectrolito esta completamente cargado en un rango de pH

de 2.5 a 4.5 [13]. Este par de polielectrolitos ha sido utilizado tanto en superficies

planas como coloidales [10]. Además forman multicapas muy estables en diversos

entornos químicos.

El poli(cloruro de dialil, dimetilamonio) (PDADMAC), constituye el

segundo polielectrolito más usado en multicapas LBL. A diferencia del PAH, éste

es un polielectrolito fuerte, completamente disociado y se puede depositar como

estructuras globulares [14].

La técnica de capa a capa ha sido extendida al plano coloidal por Donath y

Sukhorukov [1] donde ha servido para funcionalizar partículas coloidales

otorgándoles propiedades ópticas, magnéticas o una actividad biológica definida

[15, 161. El principio para el recubrimiento de partículas coloidales es el mismo

que para las superficies planas. La interacción electrostática entre los

polielectrolitos y en este caso la superficie del coloide debe estar totalmente

cubierto con un mismo tipo de carga, ya que si esto no ocurre algunas partículas

podrían tener cargas diferentes y el sistema floculará. En general este problema se

evita utilizando un exceso de polielectrolito en cada deposición. También se debe

mencionar que a diferencia de las superficies planas el lavado del polielectrolito en

exceso se realiza a través de centrifugación o diálisis [1] (Fig. 3).

Mónica Alineé Ceniceros Reyes Antecedentes

Niz-

(3 491

Figura 3. Procedimiento de ensamblado de polielectrolitos por LBL sobre partículas coloidales.

La deposición de polielectrolitos sobre coloides puede ser estudiada a través

de la determinación del cambio en el potencial zeta. Cada vez que se deposite una

capa de polielectrolito se va a inducir el cambio de la carga de los coloides, la cual

podrá ser apreciada por los cambios en el signo del potencial zeta (Figura 4).

También es posible cuantificar la deposición de polielectrolitos a través de la

técnica de dispersión de luz ya que a medida que aumenta el número de capas de

polielectrolitos, aumenta el tamaño del coloide y con ello la cantidad de luz

dispersada.

A

pi

0 2 4 6 8 Número de capas

Figura 4. Ejemplo de una medición de potencial zeta de una deposición de varios polielectrolitos:

LI PDADMAC-PSS,U BSA-PDADMAC,O PSS-PAH, A DNA- PDADMAC.

9


Otra técnica para estudiar el proceso de ensamblaje de polielectrolitos es a

través de citometría de flujo. Con esta técnica se determina en paralelo la

dispersión de luz y la intensidad de fluorescencia a nivel de cada partícula

individual en una dispersión coloidal o de células. El ensamblaje de

- polielectrolitos sobre coloides se ha cuantificado empleando polímeros marcados

con fluoróforos. La intensidad de la fluorescencia aumentará proporcionalmente al

número de capas marcadas que se depositen. Las mediciones de dispersión de luz

en paralelo permiten discriminar entre coloides individuales y agregados.

De entre las partículas coloidales que han sido cubiertas con polielectrolitos

empleando la técnica LbL se pueden citar: eritrocitos [4, 11, 17], plaquetas, látex de

melamina [18], levaduras [5], virus, cristales orgánicos e inorgánicos [19]. El

desarrollo y fabricación de partículas coloidales cuyas superficies presenten

funcionalidades definidas con control en escala nanométrica ha ganado notable

interés en diferentes áreas del conocimiento tales como la biotecnología, la

medicina y ecología, entre otras [20].

1.4. Células utilizadas como plantillas

El uso de células como soporte para el ensamblado de multicapas LbL se

debe fundamentalmente al interés en fabricar cápsulas a partir de ellas, como se

explicará en la próxima sección. Recientemente se ha demostrado que es posible

recubrir células de levadura [4, 5, 211 con filmes LbL sin destruir la pared celular,

es decir, la membrana ensamblada es biocompatible y carece de toxicidad respecto

a la actividad celular [5]. La célula en un medio de condiciones adecuadas es capaz

de reproducirse aún estando cubierta por la membrana polimérica [5].

Este descubrimiento sugiere una nueva manera de funcionalizar la

superficie celular ofreciendo así mismo la posibilidad de controlar el intercambio

rs]


la célula. Consiste básicamente de 3 elementos: í3-glucano, quitina y mananos, los

cuales están interconectados. En la figura 6 se describe su distribución.

El 1,3-3-glucano, el principal y más abundante polisacárido estructural, es

responsable de la forma y rigidez de la envoltura celular. Además forma la red

donde las manoproteínas (mananos) están ancladas. Esta proteína constituye uno

de los principales componentes celulares.

La quitina se presenta en pequeñas cantidades en células vegetativas y está

restringida casi enteramente al anillo que encierra la barrera en células germinando

o en la cicatriz en la célula madre [24].

- Mananos

. .. ( •

1,6glucano

1,3--gIucano Quitina

\ Membrana Plasmática

-

Quitina

Figura. 6. Modelo de la estructura de una célula de levadura.

Las levaduras necesitan los mismos elementos químicos que otras formas de

vida: carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, fósforo, potasio, azufre, magnesio,

11


hierro, zinc, manganeso, cobre y molibdeno. Crecen en límites amplios de pH,

muchas especies se multiplican en soluciones cuyo pH va desde 3 hasta 7.5.

En cuanto a la temperatura, las levaduras no presentan crecimiento celular a

temperaturas cercanas a la de congelamiento, ni tampoco a temperaturas

superiores a 47° C.

Saccliaromyces cerevisiae es una especie modelo, este organismo ha sido parte

de la biotecnología desde los comienzos de la historia ya que es el microorganismo

utilizado en la elaboración del pan, el vino y la cerveza entre otros [23]. De hecho,

las levaduras constituyen el grupo de microorganismos más íntimamente asociado

al progreso y bienestar de la humanidad (Figura 7).

Figura 7. Micrografía obtenida por SEM de un cultivo de SaccIlaronflJCL's cL'rcz'!SlIIL'

12


de las células con su medio a través de una pared artificial. Una membrana

polimérica a través de la cual se pudiera controlar la permeabilidad celular sería de

gran utilidad en el diseño de dispositivos para la liberación controlada [5]. El

diseño de una membrana polimérica con estas características representa un

verdadero reto ya que la estabilidad y propiedades ajustables de la cubierta celular

tienen que preservarse así como la difusión de nutrientes a través de la pared de la

cápsula.

Otra de las ventajas que ofrece el uso de levaduras y bacterias como

soportes para multicapas es que, también podrían ser utilizadas para fabricar

cápsulas tal como se ha hecho con eritrocitos, sin embargo en el caso del uso de

levaduras no se requiere una funcionalización previa tal como ocurre con

eritrocitos, dada la resistencia de la pared celular de las levaduras. Además, las

levaduras constituyen una fuente económica de partículas coloidales en relación

con los eritrocitos o las partículas de látex.

1.4.1. Características principales de Saccharomyces cerevisiae

Levadura es un nombre genérico que agrupa a una gran variedad de hongos

unicelulares, incluyendo tanto a especies patógenas para plantas y animales, como

a especies no solamente inocuas sino de gran utilidad [22].

Dentro del género Saccharomyces, la especie cerevisiae es el microorganismo

más estudiado. Se le conoce también como levadura de panificación. Este

microorganismo es ideal para estudios biológicos y genómicos, además ha

resultado ser una herramienta poderosa para la comprensión de los genes de

organismos eucariotes superiores, como el humano [23].

Mónica Airneé Ceniceros Reyes Antecedentes

Las células de levadura pueden tener forma esférica, elíptica y/o cilíndrica.

El diámetro de Sacclzaromyce cereisiae oscila de 2 a 8 micras, con una longitud entre

3 a 15 micras.

Las levaduras se multiplican en forma característica por gemación. En este

proceso aparece en la pared celular una pequeña prominencia que poco a poco

aumenta de tamaño (Figura 5) resultando luego en una célula hija. Los

citoplasmas de las células madre e hija continúan unidos durante cierto tiempo, al

cerrarse la conexión entre las dos células se forma una pared transversal doble, en

ese momento las dos células son fisiológicamente independientes y pueden

separarse. En el sitio de separación aparece una cicatriz.

Figura S. Mecanismo de reproducción de la levadura por gemación.

La pared celular es una estructura rígida, la cual provee a la célula de

protección, define la forma de la célula y modula la entrada selectiva de

macromoléculas; sin esta barrera la célula estaría desprotegida ante cambios en el

medio y ocurriría lisis celular debido a las diferencias osmóticas con el medio que

la rodea [24].

La pared celular de Saccharomjces cerevzsiae, así como la de otras levaduras

(por ejemplo Candida albicans) constituye aproximadamente el 30% de peso seco de

10

Mónica Airneé Ceniceros Reyes Antecedentes

1.5. Fabricación de cápsulas

Por una cápsula entendemos a una película delgada de polímero cerrada en

si misma y hueca. Es posible fabricar cápsulas de polielectrolitos a partir de

coloides modificados con multicapas LbL, si el coloide utilizado como soporte es

destruido después de la deposición de la multicapa [11, 25]. No todo coloide

puede ser utilizado para la fabricación de cápsulas; como se mencionó debe ser

posible destruirlo química o físicamente, como la melamina y los eritrocitos [4, 16,

17, 26]. Además la multicapa polimérica aunque resulte químicamente modificada

después de la disolución del coloide su base debe preservarse. Las partículas de

melamina y los eritrocitos constituyen los coloides más utilizados en la fabricación

de cápsulas aunque pueden utilizarse otras partículas (ejemplo; oxido de silicio,

-

carbonato de calcio). Cuando se utiliza células biológicas es necesario destruir

toda la célula para formar la cápsula y para ello se requiere de un tratamiento de

oxidación fuerte con una solución de hipoclorito de sodio que va a oxidar los

componentes celulares [17, 271. Los productos de bajo peso molecular resultantes

de la descomposición celular difunden fuera de la cápsula [28]. Por otro lado al

utilizar partículas de melamina-formaldehído (MF) estas pueden ser eliminadas

del interior de la cápsula a pH <1.6. La degradación del coloide de melamina se

lleva a cabo por hidrólisis, originando los respectivos oligómeros que se liberan a

través de las paredes de la membrana[11].

El tamaño de una cápsula de polielectrolito fabricada de la manera antes

descrita varía entre 0.1 y 10 pim, y está definido por el tamaño de la plantilla. El

espesor de la cápsula por otra parte dependerá del número de capas de

polielectrolito ensambladas [18].

Una característica muy importante de las cápsulas, es la posibilidad de

controlar a nivel nanométrico propiedades de la pared polimérica tales como el

13


espesor, la compatibilidad, la elasticidad y la estabilidad [29]. La aplicación más

probable de este tipo de sistemas se encuentra en la liberación controlada de

medicamentos para la cual es deseable que el sistema sea altamente biocompatible

[9].

Las propiedades físicas y químicas de las cápsulas pueden ser manipuladas

variando los polímeros usados e incorporando otros materiales en la estructura de

la capa incluyendo nanopartículas, lípidos y otras moléculas biológicas [6]. Una de

las propiedades más importantes de estas microcapsulas es la permeabilidad

selectiva que presentan para moléculas de diferente tamaño. La permeabilidad de

una cápsula va a depender de varios parámetros como el espesor de la capa,

porosidad, la estructura y composición química de las multicapas, así como del pH

[2].

La posibilidad de modificar y controlar la permeabilidad de una cápsula es

de gran importancia para muchas aplicaciones por ejemplo en medicina [8];

biotecnología, cosméticos, nutrición, donde la encapsulación selectiva y liberación

de sustancias sea requerida [30].

1.5.1. Influencia del núcleo sobre las propiedades de la cápsula

Muchas de las propiedades de la pared (espesor, permeabilidad,

homogeneidad, etc.) dependen del mecanismo de degradación empleado para

destruir el coloide base y en definitiva del coloide que se ha usado como plantilla.

Por ejemplo, las cápsulas construidas sobre partículas de látex melamina-

formaldehído (MF) entrecruzadas parcialmente pueden contener residuos de MF

(oligómeros) que se adhieren a las paredes de la cápsula durante la disolución (la

melamina tiene carga positiva y se pega a una capa negativa). El proceso de

disolución de la melamina genera una fuerte presión osmótica desde el interior de

la cápsula que se está formando, el cual en muchos casos conduce a la ruptura de

14


la misma y va a determinar la presencia de poros en el material [31]. En el caso de

las cápsulas templadas a partir de eritrocitos se producirá una notable

modificación química como consecuencia del uso del agente oxidante que se utiliza

en la destrucción de la célula [17].

De acuerdo al mecanismo de disolución se dividen en: núcleos orgánicos

compuestos de polímeros degradables, núcleos que pueden ser disueltos a nivel de

moléculas de bajo peso molecular y iones, y núcleos que se disuelven por una

oxidación fuerte. A continuación se describen cada una de estas principales clases.

1.5.1.1. Núcleos orgánicos compuestos de polímeros degradables

A esta clase corresponden los núcleos ampliamente estudiados de

melamina-formaldehido (MF) que se disuelven a bajo pH y en algunos solventes

orgánicos; los núcleos de poliestireno (PS) solubles en tetrahidrofurano (THF) y

ácido poliláctico/ ácido poliláctico-co-glicólico (PLA/ PLGA) soluble en una mezcla

de acetona/ N-metil-2-pirrolidinona.

Los núcleos de polímeros degradables poseen en general una buena

monodispersidad (con excepción de PLA/PLGA) y resultan de procesos de síntesis

bien establecidos. La desventaja de este tipo de sistemas es la adherencia del

material del núcleo a la pared de la cápsula durante la disolución ya que estos

núcleos están cargados. Los oligómeros cargados formados durante la

degradación pueden unirse fácilmente con la multicapa de polielectrolito, siendo

su eliminación en muchos casos imposible. El núcleo más estudiado de esta clase

son los coloides de melamina-formaldehído ligeramente polimerizado.

Los monómeros de melamina se encuentran unidos por grupos metileno y

éter. El grupo éter es hidrolizable a bajo pH, propiedad que se utiliza para

15


degradar estos coloides, normalmente dispersándolos en una solución de HC1 a

pH 1 (Figura 8) [311.

Los oligómeros de melamina que se generan durante la disolución difunden

progresivamente fuera de la cápsula. Sin embargo, la eliminación de los

oligómeros del interior de la cápsula ocurre a una velocidad diferente,

normalmente menor, que la del proceso de disolución en sf. Esto genera una

tensión osmótica desde el interior de la cápsula, la cual puede causar la ruptura de

la membrana polimérica. Se ha observado por esta razón que es conveniente

fabricar cápsulas cuyo espesor varíe entre 8 y 10 capas de polielectrolitos [31, 32].

Cápsulas de menor espesor se rompen fácilmente ante la presión ejercida por los

oligómeros de melamina durante la disolución, mientras que en el caso de cápsulas

con paredes de espesor superior a las 10 capas, la liberación de los residuos de

melamina procede tan lentamente que se genera una alta presión dentro de la

cápsula por acumulación de oligómeros, que resulta finalmente en la destrucción

de la pared.

Figura S. Miciografia po, nuclOSCOp1O conlocal Ck la (.Iisoliicioii de un núcleo de

melamina.

16


1.5.1.2. Núcleos que pueden ser disueltos a nivel de moléculas de bajo peso

molecular y iones

Estos pueden ser tanto cristales jónicos o moleculares solubles en

condiciones ácidas o básicas o en un solvente orgánico. Como ejemplos de este

tipo de plantillas podemos citar, diferentes partículas inorgánicas de carbonato

(CaCO3, CdCO3 y MnCO3) [31, 331 y partículas de silicio (Si02) [341. Para destruir

las partículas de MnCO3 se ha utilizado una solución de ácido cítrico 0.2M en O.1M

de HC1; las partículas de CaCO3 pueden ser disueltas usando una solución de

EDTA a pH 7 [35].

La ventaja principal de tales partículas es la ausencia de tensión osmótica

después de la dilución y completa eliminación del núcleo.

1.5.1.3. Núcleos que se disuelven por una oxidación fuerte

Una célula es un ejemplo típico de este tipo de núcleos. El ensamblaje de

polielectrolitos puede ser llevado a cabo usando como plantillas células de

eritrocitos previamente fijadas [4, 18, 271. Para fijar las células se utiliza

glutaraldehído que actúa como agente entrecruzante en las proteínas del

citoplasma. Se busca de esta manera evitar que los polielectrolitos que se

depositan causen la ruptura de la membrana celular. La eliminación de estos

núcleos se lleva a cabo mediante oxidación con una solución de hipoclorito de

sodio, NaOC1 (lejía).

El interior de los eritrocitos, compuesto fundamentalmente por

hemoglobina, es oxidado y degradado a oligopéptidos y aminoácidos, las cuales

son liberadas a través de la membrana polimérica resultando así una cápsula

hueca. La oxidación con NaOCl cambia además dramáticamente la composición

química de la cápsula [4]. Las cargas positivas de los grupos amino en el PAH se

17

N H2

PAH


pierden durante la oxidación dando lugar a grupos carboxilatos, nitrilos, aldehídos

y ciano. El PSS es parcialmente liberado o depolimerizado. El resultado final de

estas reacciones es una estructura polimérica con cargas negativas [17]. Se asume

que las capas, después de la disolución del núcleo se estabilizan mediante

entrecruzamiento y no a través de interacciones electrostáticas como en las

multicapas LbL iniciales [11, 4]. La figura 9 esquematiza las posibles reacciones del

PAH y el PSS durante el tratamiento con hipoclorito de sodio. Los eritrocitos como

coloides de base representan un sistema altamente monodisperso y muy

económico para la producción de cápsulas.

N H2

Entrecruzamiento l-C, n It-01 HC=N,,~, Aldehído

Azometino

COOH Ac. Carboxílico

NH2 . It-In

NO Entrecruzamiento N :op. Nitroso

Azo compuesto

NH2

NO2 Entrecruzamiento F 4 '~4n Nitro-compuesto o

Comp. Azoxy

CN Nitrilo

YR nk

SONa SO3 Na

PSS Ruptura, cadenas más pequeñas de PSS

Figura 9. Esquema de posibles reacciones de PAH y PSS durante el tratamiento con NaOC1.

Mónica Almeé Ceniceros Reyes Antecedentes

Las cápsulas fabricadas a partir de eritrocitos se caracterizan por una alta

estabilidad química y mecánica, y la ausencia de cargas positivas podría ser

utilizada para una adsorción selectiva de cationes [4] (Figura 10).

a) b)

1 J

.2 _1

J - 1

Fig. 10. a) Microscopia confocal (transmisión) de cápsulas fabricadas a partir de discocitos, h)

Imagen TEM de cápsulas fabricadas con equinocitos.

1.5.2 Determinación de la permeabilidad de las cápsulas

La permeabilidad de los distintos tipos de cápsulas ha sido estudiada en

extenso con microscopia confocal. La microscopia confocal permite hacer estudios

de permeabilidad a nivel de una cápsula individual. En un experimento típico, se

suspenden cápsulas en una solución de un fluoróforo o una macromolécula

marcada con un fluoróforo. Posteriormente se dejan incubar y finalmente se

observan en el microscopio confocal. Si las moléculas fluorescentes no difunden

hacia su interior a través de las paredes de la membrana, el interior de la cápsula se

observa oscuro, en tanto que la solución exterior fluoresce. Si la molécula

fluorescente logra atravesar la pared de la membrana, el interior fluorescerá

también. En este caso es posible realizar un experimento de "bleaching"

19


(blanqueo), en el que por aplicación de un pulso intenso del láser durante algunos

segundos en el interior de la cápsula provoca la oxidación de las moléculas

fluorescentes perdiendo su capacidad de fluorecer. Posteriormente estas

moléculas del interior de la cápsula se intercambian con las moléculas marcadas

que están en el exterior, restableciéndose la fluorescencia en el interior de la

cápsula. Se ha encontrado que las paredes de las cápsulas muestran permeabilidad

para pequeñas moléculas. La permeabilidad de las cápsulas para las

macromoléculas puede aumentar considerablemente en presencia de NaC1 [18, 361.

También se ha encontrado que las corazas multicapas de polielectrolito pueden

pasar de un estado abierto (permeable) a otro cerrado (impermeable) ajustando el

pH. Esto se atribuye a la variación de la carga superficial en la multicapa, que

modifica los defectos locales. Así por ejemplo a pH bajo las moléculas difundirán

con mayor facilidad hacia el interior de la cápsula y por el contrario a pH alto serán

excluidas.

En este trabajo se realizó un estudio del recubrimiento de la levadura

Sncc/iaromyces cerevisiae utilizando la técnica de ensamblaje molecular "capa a

capa" con polielectrolitos. Además de la posterior fabricación de cápsulas

mediante la oxidación de la célula.

20

Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Hipótesis y Objetivos

Hipótesis

Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo que posee una pared celular

resistente que puede ser utilizada como plantilla para el recubrimiento con

polielectrolitos mediante la técnica "capa a capa" y para la obtención de cápsulas a

partir de estas estructuras sin que haya pérdida de la viabilidad celular.

Objetivo general

Utilizar células de Saccharon7yces cerevisiae como plantillas para el

recubrimiento y obtención de cápsulas con polielectrlitos mediante la técnica "capa

a capa".

3.1 Objetivos particulares

Estudiar el efecto del número de capas de polielectrolito utilizadas en

el recubrimiento sobre el crecimiento de S. cerevisiae.

Realizar un estudio preliminar para caracterizar la morfología de las

cápsulas obtenidas mediante el recubrimiento de células de S.

cerevisiae con diferentes pares de polielectrolitos (PSS/PAH y

PSS/ PDADMAC).

Estudiar el efecto del agente oxidante sobre la química de los

polielectrolitos utilizados en la formación de cápsulas.

21

Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Parte Experimental

4. Parte Experimental

4.1. Material y reactivos

4.1.1 Microorganismo

El microorganismo utilizado en el estudio fue la cepa de S. cerevisiae

comercial de la marca Dr. Oetker.

4.1.2. Reactivos

- PSS (Poli 4-estireno sulfonado de sodio). FW= 206.2, Mw = 70 000, d =

0.801. ALDRICH

PAH (Poli(hidrocloruro de (alil amina)). Mw = -70 000. ALDRICH

PDADMAC (Poli(cloruro de dialil, dimetil amonio)), 20% peso en agua,

FW = 161.7, bp = 100 oc, mp = -2.8-0 °C, d = 1.04, Mw = 100 000 - 200

000. ALDRICH.

- Rodamina B Isotiocianato, mezcla de isómeros. Mw = 536.08 SIGMA

Extracto de Levadura. Extracto de células de levadura autolizada. REF

212750, LOT 3260842. Becton Dickinson.

Bacto Peptona. LOT 59673JB. DIFCO Laboratorios.

Extracto de Malta. REF 218630, LOT 4026813. Becton Dickinson.

D-(+)-Glucosa. Pureza 99.5%, FW 180.2. SIGMA

-

Agar Nutritivo. REF 213400, LOT 4027499. SIGMA

NaOC1 0.4% en agua. FW = 74.4, d = 1.097. SIGMA-ALDRICH

> Naci 99.0%, FW = 58.44, bp = 1.413 °C, mp =801 °c, d = 2.165. SIGMA

- NaclO.5M

NaC1O.1M

Solución Fisiológica (NaCl 0.85% pH 3.5)

Solución Fisiológica (NaC1 0.85%)

- PAH marcado con Rodamina

22

1


4.2. Preparación de soluciones

4.2.1. NaC1 0.5M. Con un peso molecular de 58.5g/gmol

4.2.2. PSS. Peso molecular del PSS es de 206.2 g/mol.

CH-CH2

0 SO3Na

4.2.3. PAH. El peso molecular corresponde a 107.8 g/mol.

HC1 CH2NH2

CH2CH

4.2.4. PDADMAC. PDADMAC es de 161.7 g/mo!

CI-

H3C CH3

4.3. Preparación de polielectrolitos marcados con rodamina

Para marcar PAH con rodamina se utilizó isotiocianato de rodamina [37]. El

isocianato forma con los grupos amina un enlace tiourea. Para que la mayoría de

las aminas del PAH se deprotonen (la reacción no procede si la amina está

cargada) se disolvió el polímero en una solución de NaOH de pH alto, por encima

de 11. La rodamina por su parte fue disuelta en DMSO; también puede usarse

DMF. En esta reacción es importante que la solución de rodamina se adicione

23


lentamente para evitar que se precipite con el polímero diluido. La reacción se

lleva a cabo en un matraz bola envuelto con aluminio para que la luz no oxide la

rodamina. La rodamina que no reaccionó con el polímero fue separada de la

solución del polímero mezclando ésta con pentanol, butanol u octanol en un

embudo de separación. La rodamina es soluble en agua pero su solubilidad es

mucho mayor en cualquiera de los solventes orgánicos mencionados. Se

recomienda hacer esto porque la rodamina puede quedar unida al polímero por

atracción electrostática, y no se le puede eliminar completamente en los lavados.

El polielectrolito no es soluble en pentanol de manera que la fase orgánica

arrastrará las moléculas pequeñas.

Posteriormente la solución de polielectrolitos se sometió a un tratamiento de

diálisis durante 36 h renovando los volúmenes de agua cada 12 h. Transcurrido

este tiempo se volvió a lavar la solución de polímero con octanol en un embudo de

separación. El lavado se realizó dos veces y se esperó cada vez 24 h para que la

fase agua y octanol se separaran. La solución de polímero se congeló con

nitrógeno líquido y se liofilizó.

4.4. Propagación de células de levadura Saccharomyces cerevisiae

4.4.1. Medio de cultivo

Para la propagación de S. cerevisiae así como para el desarrollo de estudios

de crecimiento con células cubiertas con polielectrolito, se utilizó como medio de

cultivo Caldo de levadura y extracto de malta (Medio YM). La composición base

en g/L se muestra en la tabla 2.

24


Tabla 2. Componentes del medio de cultivo YMy sus cantidades en g/L.

Componente Cantidad g/L

Extracto de Levadura 3.0

Extracto de Malta 3.0

Peptona 5.0

Dextrosa 10.0

Agar nutritivo 20.0

4.4.2. Preparación del preinóculo

Para preparar el preinoculo, se suspendieron 10 mg de levadura panadera

(Saccharomyces cerevisiae) en 10 mL de solución fisiológica. La suspensión celular se

vertió a un matraz erlenmeyer de 300 mL conteniendo 10 mL de caldo YM

previamente esterilizado. El preinoculo se incubó a 37 oc por espacio de 7 horas

en un agitador mecánico New Brunswick Scientific a 200 rpm. Al término de este

tiempo se hizo un conteo celular en una cámara de Neubauer para conocer la

concentración celular por mililitro de medio de cultivo.

4.4.3. Cinética de crecimiento de S. cerevisiae

Para el desarrollo del estudio cinético, se prepararon matraces erlenmeyer

de 500 mL, conteniendo 200 mL de caldo YM. cada uno de los matraces

previamente esterilizados, se inocularon con la suspensión celular del preinóculo.

Se utilizó el volumen requerido de esta suspensión para inocular cada matraz con

2.4x106 células. Los matraces se colocaron en el incubador/ agitador mecánico y se

incubaron a 37 c con una velocidad de agitación de 200 rpm. La cinética de

crecimiento se monitoreo por espacio de 18-20 h, efectuando un muestreo cada

hora. Para cada una de las muestras se determinó el crecimiento microbiano por

medición de la turbidez en un espectrofotómetro de luz UV-vis. A partir del

25


estudio cinético y de la obtención de la curva de crecimiento, se determinó la fase

de crecimiento y el tiempo requerido para la recuperación de las células y su

posterior tratamiento para recubrirlas con el polielectrolito aplicando la técnica de

"capa sobre capa".

4.4.4. Recuperación de la biomasa

Al término de la cinética, se recuperó la biomasa o paquete celular mediante

centrifugación. El contenido del cultivo de células en el matraz se yació en tubos

de 50 mL y se centrifugó a 18° C/10 mm /4000 rpm con el fin de separar las células

del caldo de cultivo, El paquete celular recibió un tratamiento de lavado (3 veces)

con una solución fisiológica de NaC1 al 0.85% p/v.

4.5. Recubrimiento de células de Saccharomyces cerevisiae

Una vez obtenidas las células fueron recubiertas con polielectrolitos

siguiendo la técnica "capa sobre capa". Se utilizaron dos partes de polication y

polianión para el recubrimiento como se muestra en la tabla 3.

Tabla 3. Condiciones de fabricación de los sistemas PSS/PAH y PSS/PDADMAC.

Susp. Muestra celular PE (-) PE (+) Solvente pH de la

solucion (mL)

A 0.5 PSS PAH Solución 35

Fisiologica

B 0.5 PSS PDADMAC Solucion Neutro Fisiologica

El recubrimiento de las células se realizó en base al siguiente protocolo; 0.5

mL de una suspensión celular de levadura se transfirieron a tubos eppendorff de 2

mL. Esta suspensión celular se lavó con agua bidestilada. El paquete celular se

recuperó por centrifugación a 2000 rpm durante 10 min y a 4 °C utilizando una

centrifuga BECKMAN c0uLTER. El tratamiento de lavado se repitió varias veces

26

Mónica Airneé Ceniceros Reyes Parte Experimental

a fin de retirar las sales de la solución fisiológica. Al paquete celular se le agregó 1

mL de la solución correspondiente de polielectrolito con carga negativa, PSS,

manteniendo la suspensión en agitación constante durante 15 minutos. Al término

de este periodo de tiempo, se retiró el exceso de polielectrolito mediante

centrifugado. El sobrenadante se retiró decantado o usando una micropipeta. Las

células recubiertas con el polielectrolito se lavaron con solución fisiológica para

eliminar PSS libre en solución. En seguida se adicionó 1 mL de la solución de

polielectrolito positivo correspondiente (PAH o PDADMAC, continuando con el

proceso de recubrimiento "capa a capa"). Este procedimiento se repitió hasta

completar el número de capas requerido.

4.6. Estudio cinético de células de Saccharomyces cerevisiae cubiertas con

diferente número de capas de polielectrolito.

A partir de una suspensión de células previamente cubiertas con el

polielctrolito, utilizando los sistemas PSS/PAH y PSS/PDADMAC se realizó un

conteo del número de células en una cámara de recuento u hematocitómetro. En

base a este conteo, se tomó el volumen requerido para inocular 2.4x106 células en

matraces erlenmeyer conteniendo 200 mL de caldo de Extracto de Levadura-

Extracto de Malta (YM). Los estudios cinéticos se desarrollaron con células de

levadura sin recubrimiento y cubiertas con 5, 10 y 15 capas de polielectrolito. El

monitoreo del crecimiento celular se determinó mediante el registro del cambio de

la densidad óptica del cultivo a diferentes intervalos de tiempo durante el

transcurso del ciclo de incubación. Las mediciones de densidad óptica se

efectuaron tomando una alícuota de 3.5 mL del cultivo desde el inicio del cultivo y

posteriormente a intervalos de 1 hora. Las lecturas de absorbancia se registraron a

una longitud de onda de 575 nm utilizando un espectrofotómetro UV-visible,

Shimazdu UV2401PC.

27


4.7. Preparación de cápsulas usando como plantilla células de la levadura

Saccharomyces cerevisiae.

Para la fabricación de las cápsulas se procedió a destruir las células de

levadura recubiertas con los polielectrolitos mediante el tratamiento con agente

oxidante (Hipoclorito de sodio al 4%). Para efectuar el tratamiento, se agregó en

un tipo eppendorff 0.2 mL de una suspensión de levaduras recubiertas, enseguida

se adicionó un volumen de hipoclorito de sodio y se mezcló. Posteriormente se

dejó que la reacción transcurriera por 20 minutos y en seguida se recuperaron las

células por centrifugación y se lavaron 3 veces con una solución de NaC1 0.1M y

finalmente con agua destilada para retirar totalmente el material celular oxidado.

4.8. Instrumental

Para caracterizar tanto células cubiertas como las cápsulas preparadas se

utilizaron las siguientes técnicas:

Microsco pía Láser Confocal (CLSM)

Primeramente para entender el funcionamiento del microscopio láser

confocal es necesario mencionar que la fluorescencia es la propiedad de una

sustancia de emitir luz cuando son expuestas a radiaciones de tipo UV, rayos

catódicos o rayos X. Las moléculas absorben luz de alta energf a (azul por ejemplo)

y son transformadas en luz visible, luz de diferente color (verde para este ejemplo)

[38,39].

Mediante esta técnica se pueden estudiar diferentes tipos de material

(células, coloides, etc.) marcados con un agente fluorescentes y obteniendo

secciones ópticas de los mismos. En principio, la muestra se excita punto a punto

por medio de un láser. La longitud de onda de emisión de esa muestra es mayor a

la


la de excitación, y es esta última la que al pasar por un pequeño diafragma

(pinhole) permite la detección de un sólo plano focal.

Para obtener las micrografías se utilizó un microscopio Leica Microsystems

Heidelberg GMBH equipado con un objetivo de aceite de inmersión lOOx. El

tratamiento del material para su observación en el microscopio consistió en la

deposición de una gota de la suspensión de células cubiertas sobre un portaobjetos

y se fijó por secado. Las observaciones del material se efectuaron utilizando la

configuración para rodamina con una longitud de onda de excitación de 525 nm.

Microsco pía Electrónica de Transmisión (TEM)

La microscopía TEM es una técnica para la obtención de imágenes por

medio de la cual un haz de electrones es enfocado a un espécimen provocando

una versión incrementada a aparecer en una película fotográfica [40]. El TEM es

utilizado en ciencias de los materiales/metalurgia y ciencias biológicas. En ambos

casos los especimenes deben ser muy delgados y capaces de soportar el alto vacío

presente dentro del instrumento. Para especimenes biológicos, el máximo grosor

es aproximadamente 1 tm. Mediante esta técnica se puede conocer la

ultraestructura de células y tejidos, tanto animales como vegetales. Cuando

además se aplican técnicas inmunocitoquímicas, es posible obtener información

acerca de la localización estructural de determinadas moléculas. Con materiales

inorgánicos se puede estudiar su morfología y realizar patrones de difracción de

rayos X. En este estudio, se utilizó un microscopio TEM JEOL 1200-EXII y para la

preparación del material se puso una gota de la suspensión celular recubierta con

polielectrolitos y una gota de la suspensión con cápsulas en una rejilla de Cu

metálico cubierta con una película de carbono.

29


Espectroscopía Ultravioleta visible

Se utilizó también espectroscopía UV-vis para determinar el cambio en la

densidad óptica celular (turbidez en el medio de cultivo) donde las longitudes de

onda que se utilizan van de 750-200 nm. La concentración del analito en solución

puede ser determinada midiendo la absorbancia en alguna longitud de onda y

aplicando la Ley de Lambert-Beer. Esta ley solo sirve para variaciones

monocromáticas [41, 421. Para la realización de esta prueba se utilizó un

espectrofotómetro UV-vis marca SHIMAZDU a una longitud de onda de 575 nm.

Microsco pía Electrónica de Barrido (SEM)

La microscopía electrónica de barrido (SEM) es un tipo de microscopia

electrónica capaz de producir imágenes de alta resolución de la superficie de una

muestra, donde una muestra es barrida con un haz electrónico de sección

transversal pequeño y de alta energía, generando una imagen punto a punto.

Debido a la manera en la que la imagen es creada, las imágenes SEM tienen la

característica de apariencia tridimensional y son útiles para describir la superficie

de la muestra [43]. En este caso la muestra requiere un recubrimiento previo con

oro-paladio para una mejor conducción del haz electrónico y al mismo tiempo

evitar su degradación. El microscopio utilizado en este estudio fue un microscopio

TOPCON SM 510.

Espectroscopía de Infrarrojo (FTIR)

La espectroscopía de infrarrojo permite el estudio de la interacción de la

radiación electromagnética en el rango de 4000 hasta 400 cm1 con la materia

(infrarrojo medio) [44]. Dependiendo de la región del espectro en la que se trabaje

y, por tanto de la energía de la radiación utilizada (caracterizada por su longitud o

número de onda), esta interacción será de diferente naturaleza. El infrarrojo medio

puede ser usado para estudiar las vibraciones fundamentales y la estructura

30


rotacional y vibracional ya que, la molécula, al absorber la radiación infrarroja,

cambiará su estado de energía vibracional y rotacional. En el caso del estudio de

muestras sólidas y líquidas sólo se tienen en cuenta los cambios entre estados de

energía vibracional, lo que hace posible la caracterización de los principales grupos

funcionales de la estructura molecular de un compuesto. Para llevar a cabo este

análisis se utilizó un equipo Nicolet modelo GEMINI MAGNA 550C, se utilizó KBr

para hacer las pastillas con los polí meros PSS y PAH (puros y oxidados) y para el

PDADMAC se utilizó una pastilla de Fluoruro de Bario.

31

Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Resultados y discusión

S. Resultados y Discusión

En este capitulo se presentan los resultados obtenidos en el estudio del

efecto del número de capas de los diferentes polielectrolitos utilizados en el

recubrimiento sobre el crecimiento de células de S. cerevisiae. También se describen

los estudios que se realizaron sobre el tipo de morfología de las cápsulas obtenidas

mediante el recubrimiento y oxidación de las células de S. cerevisiae. Finalmente se

muestran los resultados de la modificación de los polielectrolitos por efecto del

agente oxidante utilizado para la eliminación de la célula utilizada como plantilla.

El recubrimiento consistió de 0, 10 y 15 capas de polielectrolito con los

sistemas PSS/PAH y PSS/PDADMAC.

5.1. Obtención de células de levadura Saccharomyces cerevisiae

5.1.1. Propagación de células de Saccharomyces cerevisiae

La propagación celular de la levadura S. cerevisiae, se llevó a cabo a partir de

levadura comercial de la marca Dr. Oetker, en medio de cultivo de YM por un

espacio de 7 horas. Al término de este tiempo se tomó una muestra con una

concentración 2, 400 000 cel/mL, misma que se inoculó en 200 mL de medio de

cultivo. A partir de esta muestra se estudió la cinética de crecimiento de la

levadura en el medio YM utilizando glucosa como fuente de carbono y como

fuente de nitrógeno extracto de levadura y extracto de malta. El medio YM no

requiere de suplemento de sales minerales. La cinética de crecimiento se

monitoreo midiendo la turbidez de la solución celular en función del tiempo con

un equipo UV. Las medidas de turbidez se realizaron siempre a la misma longitud

de onda, de 575 nm. La curva de crecimiento se muestra en la figura 8, donde se

pueden apreciar las 3 fases de crecimiento: una primera fase de adaptación,

seguida por un crecimiento exponencial y finalmente la fase estacionaria. El valor

de crecimiento celular, en este caso densidad óptica, se incrementa paulatinamente

32


iniciando en cero. Este experimento sirve de base para estudiar el comportamiento

de las levaduras después de ser recubiertas con polielectrolitos.

Para la modificación superficial de las células con los polielectrolitos

mencionados previamente, se decidió utilizar las células en la mitad de la fase

exponencial, es decir, entre las 10 y 11 horas. En esta fase de crecimiento se

asegura que la población de células se encuentra en su máxima actividad

fisiológica y reproductiva.

3.

2.5

Lr

1.5

ç,J

'• 1

0.5 -

0- 1 u

0 5 10 15 20 25

Tiempo (h)

Figura 11. Cinética de crecimiento de S. cereviszae en medio YM.

5.1.2. Recubrimiento polimérico de células de S. cerevisiae.

En el recubrimiento de las células de S. cerevisicie se utilizaron los siguientes

pares de polielectrolitos: PSS (Poli 4-estireno sulfonado de sodio)/PAH

(poli(hidrocloruro de alilamina)) y PSS/PDADMAC (Poli(cloruro de dialil

dimetilamonio)). El recubrimiento se llevó a cabo mediante la técnica LBL descrita

33


en la sección 4.5 de la parte experimental. Una vez obtenido el recubrimiento de

las células, éstas se observaron utilizando microscopia confocal. Para determinar

la continuidad de la membrana polimérica sobre la superficie celular se utilizó el

polielectrolito PAH previamente marcado con rodamina.

En la figura 12a se muestra un estudio comparativo de las observaciones al

microscopio láser confocal donde se puede apreciar las imágenes obtenidas

utilizando el modo de fluorescencia y reflexión de un grupo de células recubiertas

con 15 capas del par polielectrolito (PSS/PAH), en donde la penúltima capa

ensamblada esta formada por PAH-rodamina. La figura 12a es la imagen

correspondiente al modo de fluorescencia en donde se muestra la continuidad del

perímetro de cada una de las células, indicando con esto que todas las paredes de

las células están uniformemente recubiertas con la membrana de los

polielectrolitos utilizados. Esta imagen fue obtenida realizando un barrido en un

sólo plano focal. En contraste en la figura 12b se muestra la imagen de las mismas

células en el modo de reflexión donde se aprecian las células completas (Fig. 12h).

a) b)

Figura 12. Micrografías de microscopia láser confocal de células de S. cerLPIs,ae recubiertas COn 17

capas de PSS/PAH con una penúltima capa de PAH-rodamina: a) micrografía en modo

de fluorescencia y b) micrografía en modo de reflexión.

34


En la figura 13 se puede apreciar una micrografía de láser confocal de un

acercamiento de una célula de levadura. En esta imagen se muestra que la célula

se encuentra totalmente cubierta con la membrana polimérica ya que no se

aprecian zonas en donde la capa de polielectrolito PAH marcado con rodamina no

este presente. En la imagen de esta figura se aprecia una zona con mayor

intensidad de fluorescencia, la mayor intensidad de esta zona podría ser atribuida

a una cicatriz del proceso de gemación o al inicio de un ciclo de división por

gemación.

Figura 13. Micrografía de microscopia láser confocal en el modo de fluorescencia de una sola célula

de S. cereoisiae cubierta con 15 capas de PSS/PAH con una penúltima capa de PAH-

rodamina.

Debido a que la microscopía láser conf ocal tiene una resolución limitada que

no va más allá de los 200 nm se utilizó la microscopía de transmisión electrónica

(TEM) para estudiar la organización con mayor detalle de las multicapas utilizadas

en el recubrimiento de las células de S. cerevisine.

35


La figura 14 muestra una micrografía donde se aprecia el detalle del

recubrimiento de las células de levadura con 15 capas de polielectrolito utilizando

el sistema PSS/PDADMAC. En esta micrografía se observa una morfología

granular en la superficie de la membrana polimérica que recubre la pared de la

células. Esta morfología es característica de uso del polielectrolito PDADMAC

utilizado en el recubrimiento como ha sido observada en otros sistemas [14]. Bajo

las condiciones de recubrimiento que se utilizaron (lmg/mL de PDADMAC en

- una solución salina 0.1M NaC1), las moléculas de polielectrolito presentan una

conformación característica de ovillo. Estas estructuras en forma de gránulos

tienen un diámetro que va de los 20 a los 30nm, consistente con determinaciones

- realizadas mediante microscopia AFM [18], las imágenes TEM confirman la

observación efectuada con microscopía confocal. La membrana polimérica

presenta continuidad en toda la superficie de la célula, no se distinguen zonas

libres de polímero.

Figura 14. Micrografía de una imagen TEM del recubrimiento de una célula de levadura con 15

capas de polielectrolito PSS/PDADMAC.

36


5.1.3. Efecto del recubrimiento polimérico preparado con diferente número de

capas sobre el crecimiento de S. cerevisiae.

Un primer aspecto a estudiar en relación a las propiedades de las levaduras

recubiertas con una membrana de polielectrolitos es determinar como esta

membrana afecta el crecimiento del microorganismo. La viabilidad celular se

estudió mediante el seguimiento de la cinética de crecimiento de células cubiertas

con diferente número de capas de polielectrolito. El análisis se siguió mediante el

cambio en la densidad óptica a 575 nm en función del tiempo. Las cinéticas se

desarrollaron por periodos de 18 a 24 horas. Como microorganismo referencia se

utilizaron células de levadura sin cubrir.

En la figura 15 se muestran las cinéticas de crecimiento para levaduras

cubiertas con O y 10 capas de polielectrolitos a base de PSS/PAH y

PSS/PDADMAC. En la figura se presentan las curvas para cada par de

polielectrolitos y el blanco correspondiente.

Como puede observarse, las células sin ningún recubrimiento muestran una

cinética con las fases típicas para este microorganismo en donde el crecimiento se

inicia alrededor de las 2 horas posterior a la incubación, seguida de la fase de

crecimiento exponencial que se prolonga hasta aproximadamente las 4 horas del

periodo de incubación, seguida de la fase de crecimiento desacelerado y termina

con el inicio de la fase estacionaria alrededor de las 9 horas de incubación (Figura

15a). Cuando las células de S. cerevisiae fueron recubiertas con 10 capas de

PSS/PDADMAC se observó un cambio notable en la cinética de crecimiento del

microorganismo. Por principio de cuentas se aprecia un retraso de 2 horas en el

inicio de la fase exponencial y la fase estacionaria se alcanza aproximadamente a

las 10 horas de haber iniciado el periodo de incubación (Figura 15b). Para el caso

de células cubiertas con 10 capas de PSS/PAH el cambio en la cinética de

37

Mónica Aimeé Ceniceros Reyes

Resultados y discusión

crecimiento es aún más drástico, en la curva se aprecia un retraso en el inicio de la

fase exponencial de más de 5 horas, la fase estacionaria se alcanza alrededor de 18

horas. En ambos sistemas de células recubiertas el crecimiento fue ligeramente

menor respecto al control.

2.5

2

E

it) 1.5 it)

._ Sin recubrimiento

-- PSS/PAH

0.5 —Á-- PSS/PDADMAC

0

0 5 10 15 20 25

Tiempo (h)

Figura 15. Cinética de crecimiento para levaduras cubiertas con 10 capas de polielectrolito: ---

células sin recubrimiento, 1- células recubiertas con el sistema PSS/PAH y —Á--

células recubiertas con el sistema PSS/PDADMAC.

En la figura 16 se muestran lo resultados de las cinéticas de crecimiento para

levaduras cubiertas con O y 15 capas de polielectrolito con los sistemas PSS/PAH y

PSS/PDADMAC. La imagen muestra una gráfica para células sin recubrimiento

en donde el crecimiento inicia cerca de las 2 horas posterior a la incubación,

seguida de la fase de crecimiento exponencial que se extiende hasta las 6 horas del

periodo de incubación e inicio de la fase de crecimiento desacelerado terminando

con el inicio de la fase estacionaria alrededor de las 11 horas de incubación (Figura

16a). Una vez que las células de S. cerevisiae fueron recubiertas con 15 capas de

[PI'].1 I


PSS/PAH observó que no hubo crecimiento celular, al menos en el periodo de

tiempo evaluado (Figura 16b). Para el caso de células cubiertas con 15 capas de

PSS/PDADMAC se observó un retraso de 5 h en el inicio de la fase de crecimiento

del microorganismo. Además bajo estas condiciones el crecimiento celular es

mucho menor con respecto al observado con células sin ningún recubrimiento.

2.5

2

1.5 -- Sin recubrimiento

-*-- PSS/PAH

PSS/PDADMAC

0.5

£

01. ---. --.

0 5 10 15 20

Tiempo (h)

- Figura 16. Cinética de crecimiento para levaduras cubiertas con 15 capas de polielectrolito:

células sin recubrimiento, -a- células recubiertas con el sistema PSS/PAH y células

recubiertas con el sistema PSS/PDADMAC.

El comportamiento observado en las células de levadura recubiertas con los

polielectrolitos evaluados respecto a lo observado con células sin recubrimiento es

notablemente diferente. Estas diferencias parecen estar determinadas básicamente

por dos parámetros: 1) Las propiedades mecánicas del recubrimiento ensamblado

y 2) la permeabilidad de la membrana. Estos factores no se excluyen mutuamente

y probablemente el comportamiento de las células recubiertas sea el resultado de la

combinación de ambos. Primeramente, la presencia de una membrana polimérica

39


densa puede mostrar una influencia notable en la permeabilidad y difusión de los

nutrientes hacia el interior de la célula. Este comportamiento se visualiza para los

recubrimientos efectuados con los sistemas PSS/PAH y PSS/PDADMAC y con

respecto al número de capas ensambladas. Indudablemente una disminución de la

permeabilidad debida al incremento en el número de capas puede limitar también

el crecimiento celular tal como se observa para las células cubiertas con 10 capas y

con 15 capas. Este comportamiento puede explicarse debido a que al aumentar el

número de capas ensambladas se reduce la velocidad de difusión de nutrientes

hacia el interior de la célula.

Las diferencias encontradas de los sistemas PSS/PAH y PSS/PDADMAC en

cuanto al comportamiento en el crecimiento celular que muestra diferencias

notables en las fases de crecimiento exponencial respecto a las células sin

recubrimiento como se menciona anteriormente no sólo puede atribuirse a una

disminución en la permeabilidad sino también puede estar influenciada por el

- número de capas ensambladas y la resistencia de este recubrimiento ya que para el

caso de células cubiertas con 10 capas la presencia de una fase exponencial indica

- que las células fueron capaces de romper la membrana y continuar

reproduciéndose mientras que en el caso de células cubiertas con 15 capas no

permite que esto ocurra.

Los polielectrolitos PAH y PDADMAC difieren en el empaquetamiento de

sus moléculas en la multicapa. El polielectrolito PDADMAC puede adquirir una

conformación de cadena en forma de ovillo por efecto de concentraciones bajas de

solución salina. Esta característica hace que las moléculas de PDADMAC se

ensamblen formando granos característicos durante el ensamblado [14]. El PAH

por su parte tiene mucha mayor capacidad de cambiar conformación y puede

unirse más íntimamente a PSS, dando lugar a una mayor interacción entre las

capas. Las propiedades elásticas del recubrimiento LbL pueden depender de la

Mónica Airneé Ceniceros Reyes Resultados y discusión

composición. La interacción entre los diferentes polieltrolitos explica las

diferencias en el comportamiento encontradas en las células recubiertas con uno u

otro sistema (Figura 15 y 16).

La interpretación a las diferencias encontradas entre el sistema PAH/PSS

respecto al sistema PSS/PDADMAC en cuanto al rompimiento de la membrana

observado se puede explicar debido a que el PAH es capaz de interaccionar más

íntimamente con el PSS resultando en una membrana más rígida y por lo tanto con

más resistencia al rompimiento de la membrana mientras que en el caso del

sistema PSS/PDADMAC no interactúan más íntimamente y por lo tanto su

resistencia es menor.

El módulo elástico de cápsulas fabricadas con PAH y PDADMAC ha sido

medido mediante experimentos de ósmosis [32, 451, encontrando que en el caso de

membranas PSS/ PAH registra un módulo elástico entre 500 y 750 MPa mientras

que para membranas de PSS/ PDADMAC el valor obtenido fue de 140 MPa.

Los valores de elasticidad mencionados implican que las membranas de

PSS/PDADMAC son más fáciles de romper que las compuestas de PSS/PAH y

por lo tanto durante el crecimiento de las células de levadura oponen menos

resistencia al crecimiento y por ende se rompen más fácilmente tal como se observa

en las figuras 15 y 16.

5.1.4. Fabricación de cápsulas

Otro de los aspectos a estudiar fue la fabricación de cápsulas de

polielectrolitos a partir de células de levadura. Para su preparación se siguió una

metodología similar a la reportada para la fabricación de cápsulas a partir de

eritrocitos [4, 11, 17, 181. Una vez efectuado el recubrimiento de las células con los

sistemas de polielectrolitos evaluados se procedió a la oxidación de las células

41


utilizando una solución de hipoclorito de sodio al 4 %. Posterior a la oxidación se

efectuaron una serie de lavados con una solución salina y luego agua.

Las cápsulas obtenidas mediante el procedimiento descrito se caracterizaron

aplicando técnicas de microscopía electrónica de barrido y microscopia electrónica

de transmisión.

En la figura 17 se observa una cápsula formada a partir de 15 capas de

polielectrolito utilizando el sistema PSS/PDADMAC. En esta imagen se puede

apreciar que la estructura está vacía, después de haber removido del interior el

material celular. También es posible observar un recubrimiento uniforme de la

cápsula. Las partes oscuras pueden ser atribuidas a posibles diferencias en

profundidad de campo o a una acumulación del material polimérico.

Figura. 17. Micrografía TEM de una cápsula recubierta con 15 capas de polielectrolito utilizando corno plantilla una célula de levadura.

42


Utilizando SEM se puede caracterizar la topografía de las cápsulas. A

manera de ejemplo en la figura 18 se muestra las micrografías obtenidas para

cápsulas preparadas con 5 capas de polielectrolito utilizando el sistema PSS/PAH.

Como se puede observar en la figura 18a, la estructura de la cápsula parece

completamente plana, y al igual que lo observado en la micrografía de TEM es

posible asumir que ha perdido su volumen debido a que el interior esta yació.

También es posible observar que la cápsula mantiene la forma de la célula

utilizada como plantilla. Sobre la superficie de la capsula se detectan dobleces o

"arrugas" generados por el tratamiento de secado durante la preparación del

material para su observación bajo el microscopio.

En la figura 18b se muestra la capsula a mayores aumentos. En esta

micrografía se aprecia que algunos de los poros de la membrana presentan un

máximo de 70 nm, sin embargo la mayoría de estos se encuentra entre los 20 y 40

ni-u. El tamaño de los poros tendrá muy probablemente influencia en la

-

permeabilidad de la cápsula y definirá el peso molecular de las moléculas que

pueden penetrar a través de las paredes. Además de los poros se pueden observar

cristales inorgánicos en la pared, los cuales se pueden atribuir a restos de cloruro

de sodio provenientes del tratamiento con hipoclorito de sodio y de los lavados

con solución salina.

43


a) b)

3574 5 -.j AS - 7 nr 30 - 027 - -, May = 17060 K 0 VD - O Pfld No = 1530

Figura 18. Micrografías SEM de cápsulas de 5 capas de polielectrolitos del sistema PSS/PAH. a) 35

740 aumentos y b) 176 600 aumentos.

A fin de explicar los cambios químicos que se pueden presentar en la

cápsula después de efectuar un tratamiento con el agente oxidante (NaOC1) se

trató a los polielectrolitos por separado y se efectuó su caracterización antes y

después del tratamiento mediante espectroscopia infrarroja (FTIR). Para realizar

este estudio, se prepararon soluciones de PSS, PAH y PDADMAC por separado y

posteriormente cada una de ellas se mezció con hipoclorito de sodio. Las

soluciones de los polielectrolitos puros y de los polielectrolitos oxidados se

congelaron con nitrógeno líquido y posteriormente se secaron mediante liofilizado.

En la figura 19a se muestra el espectro obtenido del PSS antes del

tratamiento con el agente oxidante. En el espectro se muestran bandas alrededor

de 2800 y 2900 cm 1, asignados a estiramientos de los enlaces C-H de metilos

metilenos, Las banda de absorción en 1639 cm-' se puede atribuir a estiramientos

del enlace CC. Las bandas de absorción en 1189, 1129 y 1040 cm' se asignan a las

vibraciones del enlace S-O. Las transiciones registradas 777 y 832 cm 1 pueden ser

asignadas a un anillo fenilo sustituido. Para el espectro del PSS tratado con el



agente oxidante (Figura 19b) se observaron las siguientes bandas de absorción,

aparece una banda en la región de 1731 cm1 atribuida a estiramientos del grupo

carbonilo (C=O). En la región de 1641 cm-1 se muestra una banda correspondiente

al estiramiento del enlace C=C del anillo aromático. A 965 cm1 se registra una

banda que puede ser atribuida al enlace C-Cl y que no esta presente en el espectro

correspondiente al material sin tratar. La presencia de esta banda en el espectro

del polielectrolito tratado puede ser un indicativo de una oxidación sobre el

polielectrolito con lo cual podemos inferir que con este tratamiento utilizado para

formar la cápsula mediante la destrucción del material celular también se ve

afectada la química del polielectrolito.

45


* a)

V V C

C)

CD

CD

CO

b) r1

CO

cn

C-CI Ln

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

-1 Numero de onda (cm )

Figura 19. Espectro de FTIR de: a) PSS sin tratar y b) PSS tratado con agente oxidante

me


En la figura 20 se presentan los espectros de infrarrojo del polielectrolito

PAH sin tratar y tratado con el agente oxidante. En el espectro de la figura 20a se

observan bandas de absorción a 1608 y 1508 cm1 correspondientes a vibraciones en

estiramientos del grupo -NH2, mientras que a 1000 cm1 aparece una banda

correspondiente a estiramientos del enlace C-N. La presencia de estas bandas son

características de la presencia de grupos amina en el PAH. En la figura 20b se

muestra el espectro de infrarrojo correspondiente al polielectrolito tratado con el

agente oxidante. En este espectro se observa una banda alrededor de 3500 cm1

correspondiente al estiramiento del enlace O-H. La presencia de esta banda en el

polielectrolito tratado es un indicativo de la formación de ácidos carboxílicos,

mientras que alrededor de 2720 cm-1 aparece otra banda que se atribuye a

estiramientos del enlace C-H correspondientes a la formación de grupos aldehído y

finalmente se detecta la presencia de una banda a 1730 correspondiente al

estiramiento del enlace C=O propio de los grupos funcionales aldehído y ácido

carboxílico. En este caso es posible inferir que este tratamiento puede tener un

efecto sobre la cápsula.

47


a)

-NH2

CD

b)

CN

_UH 00

CD

en

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

-1 Numero de onda (cm )

Figura 20. Espectro de FTIR de a) PAH sin tratar y b) PAH tratado con el agente oxidante.

48



El espectro de infrarrojo del polielctrolito PDADMAC sin tratar y tratado

con el agente oxidante se muestra en la figura 21. En el espectro de la figura 21a se

observa una banda amplia de absorción alrededor de 3300 cm1 correspondiente al

estiramiento del enlace N-H, la cual se confirma con la banda registrada alrededor

de 2000 cm-1. Las bandas registradas a 2900 cm1 corresponden a vibraciones de los

grupos metilos y metilenos, mientras las bandas registradas a 1637, 1475 y 1415

cm-1 corresponden a las vibraciones de las flexiones del tipo N-H [46]. En el

espectro de la figura 21b correspondiente al polielectrolito tratado con el agente

oxidante se aprecia una banda de absorción a 1381 cm1 correspondiente a

estiramientos del enlace N-O la presencia de esta banda puede ser atribuida a la

formación de grupos nitro durante el tratamiento. Finalmente se aprecia una

banda de absorción en 971 cm-1 la cual puede ser atribuida a la formación del

grupo C-Cl una vez que el material fue tratado con el agente oxidante.

Mónica Airneé Ceniceros Reyes Resultados y discusión

NH

O-H //

\ / r \ /.rn

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Número de onda (cm1)

Figura 21. Espectro de FTIR del polielectrolito PDADMAC a) sin tratar y b) tratado con el agente

oxidante.

50

Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Conclusiones

6. Conclusiones

» Mediante el uso de la técnica de "capa a capa" fue posible recubrir células

de levadura con diferente número de capas utilizando los sistemas de

polielectrolitos PSS/PAH y PSS/PDADMAC.

> La caracterización de los recubrimientos por microscopía láser confocal y

microscopía electrónica de barrido indica que el recubrimiento efectuado

utilizando los sistemas de polielectrolitos PSS/PAH y PSS/PDADMAC

confirma un recubrimiento homogéneo de la superficie celular.

> El incremento en el número de capas ensambladas con los sistemas

PSS/PAH y PSS/PDADMAC tiene un efecto sobre el crecimiento celular,

debido a una reducción en la velocidad de difusión de los nutrientes.

> La presencia de una fase exponencial en las células recubiertas con 10 capas

de polielectrolito indica que las células fueron capaces de romper la

membrana y continuar creciendo mientras que con un recubrimiento con 15

capas no permitieron que esto ocurriera.

Mediante el uso de la metodología de oxidación aplicada con eritrocitos fue

posible fabricar cápsulas con los sistemas PSS/PAH y PSS/PDADMAC

utilizando células de levadura (S. cerevisiae).

La caracterización por TEM y SEM de las cápsulas obtenidas con los

sistemas PSS/PAH y PSS/PDADMAC permite establecer una estructura

continua y vacía con poros con un diámetro de 20 a 40 nm.

La caracterización mediante espectroscopía infrarroja (FTIR) de los

polielectrolitos sin tratar y tratados con el agente oxidante indica que el

proceso de oxidación de la célula afecta la química de los polielectrolitos.

51

Mónica Aimeé Ceniceros Reyes Trabajo a futuro

7. Trabajo a Futuro

V Establecer las características diferenciales entre los sistemas PSS/PAH y

PSS/PDADMAC en base a estudios de permeabilidad, morfología y

elasticidad utilizando técnicas de blanqueado en el microscopio confocal

para estudios de permeabilidad de las cápsulas así como el uso de técnicas

de microscopia para los estudios morfológicos y de AFM para estudios de

elasticidad y topología de las cápsulas.

y" Utilizar estudios de caracterización de las cápsulas después del tratamiento

con el agente oxidante utilizando técnicas como XPS, espectroscopia de

masas y resonancia magnética nuclear para poder determinar los cambios

estructurales de la cápsula.

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