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TESIS DOCTORAL

Funciones biológicas de la fosfolipasa A2 independiente de calcio de grupo VIA en las células humanas U937*

Rebeca Pérez Fernández

Instituto de Biología y Genética Molecular, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Universidad de Valladolid, 47003 Valladolid, España

Fecha de defensa: 13 julio 2006

*Esta es una versión condensada y sin gráficos de la tesis doctoral presentada por Rebeca Pérez Fernández para la obtención

del título de doctor por la Universidad de Valladolid.

1. INTRODUCCION

1.1. La familia de las fosfolipasas A2

Las fosfolipasas A2 (PLA2) hidrolizan los ácidos grasos de la posición 2 de los fosfolípidos (PL), liberándose un ácido graso y formándose un lisofosfolípido (lisoPL). Esta reacción es de particular importancia cuando el ácido graso que se libera es el ácido araquidónico (AA), porque este ácido puede convertirse en compuestos biológicamente activos llamados eicosanoides. Entre los principales eicosanoides están las prostaglandinas (PG), los leucotrienos y las lipoxinas. El otro producto de la reacción, el lisoPL sirve de precursor para la biosíntesis de compuestos biológicamente activos como el factor activador de plaquetas (PAF) y puede que tenga actividad biológica por sí mismo. El AA y los lisoPL participan en muchas rutas de señalización provocadas por estímulos extracelulares, para entender estos procesos es necesario conocer los mecanismos de acción y regulación celular de las diferentes formas de la PLA2 que están en las células.

Hasta el momento, 22 proteínas diferentes que poseen actividad PLA2 se han identificado y clonado en mamíferos. Según el criterio establecido por Six y Dennis (1), las PLA2 se clasifican en 14 grupos según la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la enzima, en algunos de estos grupos hay varios miembros. La tabla 1 muestra las PLA2 que tienen una histidina en su sitio catalítico y se conocen como PLA2 secretadas (sPLA2) (2,3); en la tabla 2 aparecen las PLA2 con una

serina en el sitio catalítico, son las PLA2 citosólicas dependientes de calcio (cPLA2), las PLA2 citosólicas independientes de calcio (iPLA2) y las acetilhidrolasas del factor activador de plaquetas (PAF-AH) (2,3); la clasificación de las PLA2 están continuamente cambiando porque aparecen nuevas proteínas, la última ha sido la PLA2 de grupo IVD (4).

Sin embargo se usa una clasificación más cómoda para agrupar las PLA2 basándose en sus similitudes bioquímicas. Según esta clasificación, hay cuatro familias importantes: las sPLA2, las cPLA2, las PAF-AH y las iPLA2. Aunque esta clasificación tiene algún que otro pero, es la más clásica por su comodidad para generalizar en cuanto a las propiedades bioquímicas y también para incluir las PLA2 que no están definidas claramente.

Hasta el momento en mamíferos la familia de las iPLA2 tiene sólo dos miembros. La mejor estudiada es la iPLA2-VIA que es la primera iPLA2 para la que se han visto dos papeles, uno en la homeostasis y otro en la activación. En esta introducción primero se verá el papel de la iPLA2-VIA en la homeostasis (5-8); y después los recientes avances en la regulación de la actividad enzimática durante la estimulación.

La otra enzima de la familia de las iPLA2 mamíferas (9-11) fue identificada en el año 2000 y se la denominó iPLA2-VIB (1-3); es una enzima con múltiples tamaños según los distintos tipos celulares en donde está presente, además su actividad se inhibe con la

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bromoenol lactona (BEL) (12). Esta enzima está presumiblemente unida a la membrana y muestra muy poca homología con la iPLA2-VIA en el extremo N-terminal. Sin embargo, hay varias secuencias altamente conservadas en las dos enzimas en la mitad del extremo C-terminal, esta última región es responsable de la actividad enzimática (11). Se conoce muy poco sobre esta enzima y su función celular (12,13); aunque se sabe que es capaz de hidrolizar una gran variedad de ácidos grasos en la posición 2 de la fosfatidilcolina (PC), lo que indica que posee actividad PLA2. Murakami et al. transfectando esta enzima en células HCA-7 han visto que aumenta la hidrólisis de la membrana celular y la producción de PG (13).

Recientemente en las bases de datos se han encontrado tres nuevas proteínas que contenían el nucleótido y la secuencia consenso de las lipasas igual a la de la iPLA2-VIA. Las tres poseen actividad PLA2, pero también poseen actividades triacilglicerol lipasa y acilglicerol transacilasa (14). No se ha determinado, si estas tres proteínas pueden considerarse verdaderas enzimas PLA2, o son lipasas generales con amplia especificidad.

1.2. Estructura y características de la iPLA2-VIA

La iPLA2-VIA fue purificada y clonada en diferentes mamíferos (15-19) y se ha clasificado como iPLA2 de grupo VIA (1). Aunque esta enzima no tiene una secuencia homóloga con la cPLA2α las dos enzimas comparten características bioquímicas, como son la localización citosólica en células sin activar, una masa molecular en torno a 85 kDa y la presencia de una serina catalítica. Pero se diferencian en que la cPLA2α hidroliza los PL que contienen AA, mientras que la iPLA2-VIA no muestra preferencia por el ácido graso sobre el que se produce la hidrólisis. En algunos artículos se refieren a la iPLA2-VIA como iPLA2β (20) o, simplemente iPLA2.

La iPLA2-VIA tiene al menos 5 diferentes variantes de procesamiento (Fig. 1). Dos de ellas se ha demostrado que poseen actividad enzimática y son la VIA-1 y VIA-2. La iPLA2-VIA-1 es una enzima de 85 kDa con 8 dominios de anquirina en la mitad del extremo N-terminal seguidos de la secuencia GXSXG común a muchas lipasas que contiene a la Ser465, que es el aminoácido catalítico del sitio activo. La iPLA2-VIA-2 es casi idéntica a la iPLA2-VIA-1 excepto porque el dominio de la octava anquirina se ve interrumpido por

una inserción de 54 aminoácidos ricos en prolina. Debido a esta inserción, la serina catalítica cambia a la posición 519. Las dos isoformas tienen un dominio rico en glicina antes de la serina catalítica, y es un posible sitio de unión para la calmodulina que puede contribuir a la regulación enzimática de la iPLA2-VIA en las células (ver sección 5.1 y 5.3).

Dos de las variantes de la iPLA2, la anquirina-1 y la anquirina-2, poseen los dominios repetidos de anquirina, pero carecen de actividad enzimática ya que no poseen el sitio activo. Se piensa que estas proteínas actúan como inhibidores de las variantes activas (ver sección 5.4). La quinta variante de la iPLA2-VIA es la iPLA2-VIA-3 que es idéntica a la iPLA2-VIA-2 excepto en el extremo C-terminal que está truncado por la presencia de un codón de terminación prematuro. La iPLA2-VIA-3 contiene la secuencia lipasa y probablemente posea actividad enzimática, aunque esta actividad no se ha comprobado experimentalmente.

Además de la actividad fosfolipasa, la iPLA2-VIA tiene otras actividades como la actividad lisofosfolipasa y la actividad fosfolipídica transacilasa. Si se miden las tres actividades en condiciones similares la actividad fosfolipasa es significativamente mayor que las otras dos (21). La iPLA2-VIA no muestra especificidad por el ácido graso que está presente en la posición 2 del PL ni por el grupo de cabeza polar presente en la posición 3 del PL. Otra característica de esta enzima es que puede hidrolizar PAF y PLs oxidados imitando la acción de las PAF-AH (15).

1.3. Inhibición de la iPLA2-VIA

La iPLA2-VIA se inhibe por compuestos como BEL (15,22), metil araquidonil fluorofosfonato (MAFP) (16,23), trifluorometil cetona y tricarbonilo (22,24). De entre todos, sólo el BEL es selectivo para las iPLA2 frente a las otras PLA2s (25,26), y esta selectividad ha permitido definir los posibles papeles de la iPLA2 en el funcionamiento celular. Hay que señalar sin embargo, que cuando se utiliza el BEL sobre las células, éste interacciona con otras muchas enzimas celulares además de la iPLA2-VIA (6,15), y esto se debe tener en cuenta cuando se interpreten resultados basados únicamente en la inhibición por BEL. Además de la iPLA2-VIA se inhiben por BEL la quimotripsina y otras proteasas (27), la fosfatidato fosfohidrolasa dependiente de magnesio

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(PAP-1) (28-31), la anandamida hidrolasa (32) y la iPLA2-VIB (10).

Para distinguir los efectos que provoca el BEL sobre la iPLA2-VIA frente a los que provoca sobre las PAP-1, se ha usado con cierto éxito el propranolol (33). El propranolol a concentraciones relativamente altas (e 150 µM) inhibe la fosfohidrolasa pero no la iPLA2-VIA, es decir, si un proceso se inhibe por BEL, pero no por concentraciones elevadas de propranolol se puede descartar la participación de la PAP-1. Aunque descartemos la participación de la PAP-1 no confirma que el efecto se deba a la iPLA2-VIA.

Recientemente, Jenkins et al. (34) separaron el BEL en dos enantiómeros y vieron que el isómero S es más potente sobre la iPLA2-VIA que sobre la iPLA2-VIB. Por el contrario, el isómero R inhibe a la iPLA2-VIB más que a la iPLA2-VIA (34). Por lo tanto el uso de enantiómeros podría ser una importante herramienta para diferenciar las contribuciones de la iPLA2-VIA y la iPLA2-VIB sobre un determinado proceso celular (34). El uso combinado de BEL y de otros inhibidores de la serina catalítica, como el MAFP y la trifluorometil cetona sirve para determinar si en un proceso participa la iPLA2-VIA. Si una reacción es inhibida por el BEL y no por el MAFP o por la trifluorometil cetona, implica que no está envuelta la iPLA2-VIA y es otra actividad iPLA2 desconocida la responsable de estos efectos. Una actividad iPLA2 sensible al BEL y no al MAFP se detectó en las células del túbulo proximal del riñón (35). Resultados negativos con el MAFP y con la trifluorometil cetona se interpretan como una falta de participación de la cPLA2α.

Como el uso de inhibidores químicos no da respuestas definitivas al papel de la iPLA2-VIA en procesos celulares, se han buscado otras técnicas más selectivas para inhibir la iPLA2-VIA. Se han empleado técnicas de oligonucleótidos antisentido (36-39) y de RNA de interferencia (40,41), con ellas se ha visto que en ciertas condiciones son técnicas útiles para bloquear específicamente la iPLA2-VIA. Además se ha usado con éxito células que sobreexpresan la iPLA2-VIA (42-44). Recientemente, se han diseñado ratones con una interrupción del gen que codifica para la iPLA2-VIA (45). Los estudios con estos ratones serían de gran ayuda para confirmar la importancia de la iPLA2-VIA en condiciones fisiopatológicas. Es importante indicar que hasta ahora, el único defecto fenotípico que se ha

observado en estos animales es que los machos producen espermatozoides con menor movilidad, lo que disminuye de forma importante su fertilidad (45).

1.4. Funciones homeostáticas

El AA es un ácido graso importante a nivel fisiológico que no entra en los PL celulares por acilación de glicerol fosfato/dihidroxiacetona fosfato o ácido lisofosfatídico (es decir, por la ruta de novo); lo hace en una etapa posterior por acilación de aceptores lisofosfolipídicos preexistentes (ciclo de Lands). Los lisoPL se producen por la acción de las PLA2 sobre los PL, esta clase de enzimas juega un papel clave en la incorporación de AA dentro de los PL. La incorporación inicial de AA dentro de los PL tiene lugar principalmente en la PC; lo que señala a la lisofosfatidilcolina (lisoPC) como el aceptor lisofosfolipídico (46). En muchas células, los niveles basales de lisoPC se mantienen por la acción de la iPLA2 sobre los fosfolípidos celulares (6); esto se vio porque una disminución en la actividad de la iPLA2 provocaba una disminución de la producción de lisoPC y como consecuencia se inhibía la incorporación de AA dentro de los PL.

Cuando el AA se ha incorporado dentro de la PC por la acción de la aciltransferasa dependiente de CoA hay una remodelación de dicho ácido hacía otros lisoPL, principalmente a la lisofosfatidiletanolamina (lisoPE), en un proceso que tarda varias horas, y está dirigido por la transacilasa independiente de coenzima A (CoA-IT) (46). Para la eficiente incorporación de AA dentro de los PL, deben de estar disponibles en las células al menos dos clases de aceptores lisofosfolipídicos.

Estudios de la incorporación de AA dentro de los PL en macrófagos de ratón han demostrado que este proceso es independiente de calcio (47), y se pensó que la actividad PLA2 responsable de la producción de aceptores lisofosfolipídicos para la incorporación de AA podría deberse a la enzima iPLA2 (47). Estudios posteriores en macrófagos de ratón P388D1 demostraron que esta actividad pertenecía a la iPLA2-VIA (36,48). En diferentes sistemas celulares, como neutrófilos humanos (49), células ductales de submandibula de rata (50), y células estromales uterinas de rata (51); se llegó a la misma conclusión.

La contribución de la iPLA2-VIA en el mantenimiento de las reservas de lisoPL para facilitar la incorporación

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de AA parece depender del tipo celular. En estudios de inhibición de iPLA2 con BEL, la contribución de la enzima va desde el 90 % en células ductales de submandibular de rata (50), al 50-60 % en células fagocíticas (36,48,49), y sólo al 20-25 % en células estromales uterinas de rata (51). Las células deben poseer otros mecanismos, además de la iPLA2-VIA, para generar y mantener los niveles apropiados de aceptores lisofosfolipídicos.

En islotes pancreáticos de rata (30), la inhibición de la iPLA2 con BEL no disminuye la incorporación de AA dentro de los PL; sin embargo en estas células la iPLA2-VIA contribuye al menos en un 20 % en los niveles basales de lisoPL, por lo que en los islotes la enzima tiene una importante actividad housekeeping. Recientes estudios de incorporación de AA en células que sobreexpresan la iPLA2-VIA demuestran que el exceso de lisoPL producido en estas condiciones, no incrementa la tasa de incorporación de ácidos grasos (52). Con estos datos se llega a la conclusión de que es necesario un nivel umbral de lisoPL para mantener la incorporación de AA dentro de los PL. El incremento de los lisoPL celulares por encima de este nivel umbral no aumenta la incorporación de AA, por lo que la incorporación de AA dentro de los PL en estas células depende de otros factores además del de la disponibilidad de lisoPL.

En células U937 sin activar, así como en los macrófagos P388D1 y neutrófilos (36,48,49), la incorporación de AA dentro de los PL es independiente de calcio e inhibible por BEL. Pero el BEL inhibe parcialmente la incorporación de AA, por lo que debe existir otro camino independiente de calcio en el que no participe la iPLA2-VIA sensible a BEL.

En muchos tipos celulares, después de la incorporación de AA principalmente en PC, hay una lenta transferencia del ácido graso hacía fosfatidiletanolamina (PE) gracias a la acción de la CoA-IT sobre los PL celulares (46). Una PLA2 es la responsable de proveer aceptores lisofosfolipídicos para las reacciones de remodelación conducidas por la CoA-IT (46). La naturaleza de esta PLA2 se ha investigado en macrófagos P388D1 (53) y en linfocitos T (54) midiendo la transferencia de AA de PC a PE en presencia de distintos inhibidores de las PLA2. Se usaron los inhibidores de la cPLA2 (MAPF), de la iPLA2 (BEL) y de la sPLA2 (LY311727); ninguno de ellos provocó cambios en la transferencia de AA de PE a PC. Por lo tanto la PLA2 envuelta en este proceso no es

ninguna de las PLA2s identificadas previamente; aunque como la respuesta es independiente de calcio se piensa en la participación de una iPLA2 diferente a la de grupo VI. Todos estos experimentos se hacen con concentraciones de inhibidores que inhiben completamente la correspondiente actividad PLA2 (53,54), y así se evita que exista alguna actividad PLA2 residual que pueda proveer de lisoPE a la CoA-IT.

1.5. Mecanismos de regulación de la actividad iPLA2

Durante la señalización celular poco se sabe de como las células controlan y regulan la actividad iPLA2-VIA, mientras que hay mucha información disponible de los mecanismos de activación de la cPLA2a por ejemplo por calcio o por fosforilación mediada por MAP quinasas (55). Debido a que las células poseen diferentes variantes de procesamiento de la iPLA2-VIA (6), es posible que la enzima esté regulada por múltiples mecanismos que serán distintos según el tipo celular y las condiciones de estimulación (56).

En diferentes estudios se ha visto que en las células activadas hay un aumento de la actividad iPLA2 tanto en las fracciones subcelulares como en los homogeneizados (38,57-61). Estos estudios vislumbran la posibilidad de que en ciertas condiciones la iPLA2 sufra cambios que modifiquen su actividad específica y/o su localización subcelular. Se han propuesto varios mecanismos para explicar la activación de la iPLA2 en diferentes condiciones, y los mejores descritos se discuten a continuación:

1.5.1. Ca2+/calmodulina - Se ha sugerido que la iPLA2-VIA interacciona in vitro con la calmodulina si hay Ca2+ (62). En presencia de Ca2+, la calmodulina se une a la iPLA2-VIA e inhibe su actividad enzimática. En ausencia de Ca2+, la calmodulina se separa y no inhibe a la iPLA2-VIA (62). Se ha identificado cerca del extremo C-terminal de la iPLA2-VIA una región de 15 kDa (aminoácidos 694-705) que participa en la unión de la calmodulina a la iPLA2-VIA en presencia de Ca2+ (62). Aunque no se puede descartar que existan otros sitios de unión para la calmodulina dentro de la iPLA2-VIA.

1.5.2 Fosforilación - Aunque no se han descrito secuencias consenso de fosforilación en la iPLA2-VIA (15-18), existen varios estudios que señalan que en la regulación de la actividad enzimática de la iPLA2-VIA

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participan reacciones de fosforilación. Es posible que no ocurra una fosforilación directa de la iPLA2-VIA, sino una fosforilación de una proteína reguladora asociada a la iPLA2-VIA. Se puede pensar que una quinasa actúe como cofactor, independientemente de su actividad quinasa intrínseca, para la activación de la iPLA2-VIA (esto ya se describió con la proteína quinasa C que regula la fosfolipasa D (PLD)) (63). Recientemente se ha visto en las células β de los islotes pancreáticos que la proteína quinasa IIβ dependiente de Ca2+/calmodulina interacciona con la iPLA2-VIA y el resultado de esta asociación es que las actividades de las dos enzimas aumentan (64). Como se sabe que la iPLA2-VIA interacciona directamente con la calmodulina (ver sección 5.1) parece interesante descifrar los mecanismos de regulación de la interacción de estas tres proteínas.

En un estudio en los promonocitos U937 estimulados con interferon-γ (65) se activa la iPLA2-VIA gracias a la proteína quinasa C. Ya se había descrito que en los macrófagos P388D1 estimulados con zimosan la proteína quinasa C regula a la iPLA2-VIA (39), y se piensa que la traslocación de la iPLA2-VIA a fracciones de membrana se debe a la isoforma α de la quinasa (66). También la isoforma ε de la proteína quinasa C participa en la asociación de la iPLA2 a las fracciones de membrana (57). Pero no se sabe si la actividad iPLA2 de este estudio pertenece a la iPLA2-VIA o a otra enzima.

En células vasculares del músculo liso estimuladas con trombina hay evidencias de que la p38 MAP quinasa participa en la regulación celular de la iPLA2-VIA. En estas células la iPLA2-VIA participa en los procesos de liberación de ácidos grasos y de síntesis de DNA (58), estos procesos se bloquean cuando se usan inhibidores de p38 MAP quinasa. La trombina incrementa la actividad de la iPLA2 en los extractos celulares, y este aumento también se inhibe si los extractos se preparan con células tratadas con inhibidores de MAP quinasa (58).

1.5.3 ATP - En ciertas condiciones en ensayos in vitro (18), la actividad específica de la iPLA2-VIA es mayor en presencia de ATP. La secuencia GXGSXG rica en glicinas se encontró en dos variantes activas de la iPLA2-VIA. Los efectos del ATP no siempre se han podido demostrar (15), y otros autores afirman que el ATP no activa directamente la iPLA2 sino que evita que la enzima pierda su actividad (21).

1.5.4 Oligomerización mediada por dominios de anquirina - Una característica importante de la iPLA2-VIA es la presencia en la mitad del extremo N-terminal de la proteína, de siete u ocho dominios idénticos de anquirina (siete en la variante VIA-2 y 8 en la variante VIA-1); esta repetición de anquirinas facilita la interacción proteína-proteína (67). En experimentos de inactivación por radiación se demuestra que las especies activas de iPLA2-VIA son tetrámeros (68); si se eliminan las anquirinas eliminando los 150 primeros aminoácidos de la iPLA2-VIA, la enzima se inactiva (15). Probablemente la repetición de anquirinas permita la oligomerización y la expresión total de la actividad iPLA2-VIA. Hay muchas células que expresan fragmentos de la proteína iPLA2 truncada y aún teniendo las anquirinas repetidas no tienen actividad, estos fragmentos actúan como reguladores de la iPLA2-VIA y lo que hacen es impedir la oligomerización de los fragmentos activos a través de las anquirinas (17,69). Se ha comprobado que al transfectar uno de estos fragmentos inactivos en la iPLA2-VIA se reduce de manera importante la actividad de la enzima activa (17,69). Con los últimos estudios de Manguikian y Barbour se reafirma este modelo de regulación de la actividad de la iPLA2-VIA (70), estos estudios demuestran por inmunoprecipitación la asociación de los fragmentos inactivos de la iPLA2-VIA a la iPLA2-VIA activa (ver sección 6.1).

1.5.5 Procesamiento proteolítico - Otra característica importante de la iPLA2-VIA es la presencia de varias secuencias de ruptura por caspasas (DXXD), al menos las células usan tres de esas secuencias, formándose fragmentos de la iPLA2-VIA con mayor actividad biológica. Atsumi et al. (71,72) demuestran que una ruptura dentro de la primera anquirina cerca del extremo N-terminal, por el Asp183 de la iPLA2-VIA (ver figura 2), produce una proteína de 70 kDa con mayor funcionalidad biológica.

Lauber et al. han identificado los otros dos sitios de ruptura por caspasas que producen proteínas activas (73). El primero de ellos está muy cerca de la serina catalítica, y el segundo está próximo al extremo C-terminal de la molécula (ver Fig. 2). La ruptura por caspasa de los dos sitios produce un fragmento de 24-26 kDa, y la ruptura sólo del primer sitio produce un fragmento de 32 kDa. Estos fragmentos se corresponden a los aminoácidos 514-806 y 514-733 de la secuencia de la iPLA2-VIA-2 representada en la figura 2 y a los aminoácidos 459-752 y 459-679 en la secuencia de la

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iPLA-VIA-1. La sobreexpresión de los dos fragmentos aumenta la producción de lisoPC mediada por la iPLA2-VIA (73), esto último llama la atención debido a que los dos fragmentos carecen de anquirinas y estudios recientes de mutagénesis han establecido que para que exista actividad enzimática son necesarias las anquirinas (15).

Otros estudios señalan que pueden existir otras rupturas de la iPLA2-VIA a través de otras proteasas que no sean caspasas. En las células INS-1 832/13 sensibles a glucosa, en las células INS-1 y en los islotes pancreáticos, la forma predominante de iPLA2 es una forma de 70 kDa y no la clásica iPLA2-VIA de 85 kDa (74). Si se analiza el mapa tríptico de la forma de 70 kDa aparecen fragmentos idénticos a los que se obtienen después de realizar una digestión tríptica de la clásica enzima de 85 kDa, lo que indica que las dos enzimas deben de estar relacionadas. Como la proteína de 70 kDa no parece que proceda de un mecanismo de procesamiento alternativo, podemos pensar que deriva de un mecanismo de procesamiento proteolítico aún desconocido que tiene lugar en la mitad del extremo C-terminal de la molécula (74). Esta variante de 70 kDa es activa y se piensa que en las células β nativas los papeles biológicos que se atribuyen a la clásica iPLA2-VIA de 85 kDa (ver sección 6.4) podrían deberse a la forma de 70 kDa (74).

1.6. Funciones de señalización celular

La iPLA2-VIA es una enzima que participa en la regulación homeostática de las reacciones de desacilación/reacilación, pero hay muchas evidencias de la participación de la enzima en la señalización celular. Para conocer los papeles de señalización en los que interviene la iPLA2-VIA, además del BEL, se utilizan otras herramientas como la inhibición de la expresión de la iPLA2-VIA por oligonucleótidos antisentido, el RNA de interferencia, y la sobreexpresión estable y transitoria de la enzima. Los resultados que implican a la iPLA2-VIA no se justifican sólo con el BEL sino también con alguna otra de las otras herramientas citadas.

1.6.1 Crecimiento celular - En las membranas celulares de los mamíferos la PC es el PL más abundante y juega un importante papel estructural. Para mantener la homeostasis de la PC se necesita regular distintas rutas catabólicas y biosintéticas. En algunas células, los niveles de PC se mantienen gracias a la iPLA2-VIA (11)

y a la CTP: fosfocolina citidilil transferasa (CT) que es la enzima que regula la síntesis de PC. Cuando en distintos tipos celulares se ha sobreexpresado la CT se ha visto un incremento en la síntesis de PC, pero la masa de PC no aumenta si hay un incremento de la desacilación vía iPLA2 (75,76).

Barbour et al. (75) destacaron que tanto la actividad como la masa de la iPLA2-VIA se regulan por el incremento de la síntesis de PC al sobreexpresar la CT. En trabajos posteriores se vio que la iPLA2-VIA participa en la regulación del ciclo celular (70,77), y se estudió el mecanismo que regula a la enzima en estas circunstancias (70). Durante la proliferación de las células T, la actividad iPLA2-VIA es más alta en la fase G2/M; cuando se tratan las células con BEL o con un oligonucleótido antisentido específico para la iPLA2-VIA se reduce la división celular (77). Esto se comprobó en las células CHO-K1 (70); en estas células, la actividad iPLA2 máxima se da durante la fase G2/M y durante la fase S tardía, mientras que la actividad es menor en la transición de G1/S a la fase S temprana (70). Como se esperaba, cuanto mayor es la acumulación de PC menor es la actividad iPLA2. Los cambios en la actividad de la iPLA2-VIA durante el ciclo celular pueden deberse a la expresión de las variantes de procesamiento inactivas de la iPLA2-VIA que interfieren en la oligomerización normal de la iPLA2-VIA (70).

Con estos datos se piensa que las alteraciones en la actividad y/o en la expresión de la iPLA2-VIA pueden tener importantes efectos sobre el metabolismo fosfolipídico y afectar al crecimiento celular. Este papel de la iPLA2-VIA en la regulación del metabolismo de la membrana fosfolipídica no se observa en todos los tipos celulares; debido a que en algunas células la iPLA2-VIA no parece que controle la desacilación de la PC (30,52); y puede que este papel lo cumplan otras enzimas PLA2.

1.6.2 Biosíntesis de eicosanoides - Los eicosanoides son una familia de compuestos que derivan de la oxigenación del AA y participan en la reacción inflamatoria. Para buscar las rutas bioquímicas que durante la inflamación producen eicosanoides ha sido de gran utilidad el diseño de ratones knockout sin cPLA2α (78,79). Estos animales sin cPLA2α no muestran respuesta inflamatoria, lo que demuestra que esta enzima tiene un importante papel en la biosíntesis de eicosanoides durante la inflamación (55,79,80).

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Las células fagocíticas participan en las reacciones inflamatorias. En estas células la movilización de AA provoca la biosíntesis de eicosanoides a través de receptor o por agonistas solubles sobre los que el BEL no tiene ningún efecto; en este proceso la iPLA2-VIA no jugaría ningún papel. Entre estas células están los macrófagos P388D1 estimulados con PAF y zimosan (26,81), las células mesangiales estimuladas con peróxido de hidrógeno (H2O2) (82), los macrófagos peritoneales estimulados con lipoproteína oxidada (83), los neutrófilos humanos estimulados con péptido formilo (84) y los promonocitos U937 estimulados con ionóforo de calcio o con concanavalina A (Con A) (31,53).

Otros trabajos señalan que en ciertas condiciones, la movilización de AA y la producción de eicosanoides si que podrían estar controladas por la iPLA2-VIA. Por ejemplo, si los macrófagos RAW 264.7 estimulados con óxido nítrico (85) o los neutrófilos estimulados con ionóforo de calcio (86) se tratan con BEL, disminuye la movilización de AA, lo que induce a pensar en la participación de una iPLA2 sensible a BEL; pero debido a que el BEL no es específico para la iPLA2-VIA (6,15) estos datos se deben comprobar por otros mecanismos.

En dos estudios recientes, con macrófagos P388D1 estimulados con zimosan (38) y con promonocitos U937 estimulados con interferon-γ a través del receptor Fcγ-RI (65), se han encontrado indicios de la participación de la iPLA2-VIA en la movilización de AA y en producción de PG debido a que la inhibición de la iPLA2-VIA por BEL o por oligonucléotidos antisentido específicos para la iPLA2-VIA, disminuye la movilización de AA y la producción de PG.

En los promonocitos U937 tratados con PAF los mecanismos de regulación del AA se deben a la cPLA2α (65), lo que indica que en un mismo tipo celular pueden existir distintas PLA2 que regulen la movilización de AA. Atsumi et al. (71,72) fueron los primeros en señalar que podría existir una colaboración entre las dos enzimas. La activación de estas PLA2 podría depender del tipo celular y de los estímulos. Otra posibilidad sería que en ciertas condiciones de estimulación existan interferencias entre la iPLA2-VIA y la cPLA2α, y la inhibición de la iPLA2-VIA afectaría a la actividad de la cPLA2α.

En células de origen no leucocitario se ha estudiado la participación de la iPLA2-VIA en la producción de PG.

Se ha visto que la enzima no muestra preferencia hacia el ácido graso que hidroliza en la posición 2 del PL; y es capaz de hidrolizar prácticamente a cualquier ácido graso, incluso el ácido acético y ácidos grasos oxidados (15), al activarse la iPLA2-VIA además del AA se liberarán otros ácidos grasos (58,71,72,87).

En las células HEK293 transfectadas con la iPLA2-VIA, el ionóforo de calcio aumenta la liberación de AA, y este AA se transforma en PG gracias a la ciclooxigenasa-1 (COX-1) (42,88); sin embargo, en respuesta a interleuquina-1β no se produce el mismo aumento en la liberación de AA; lo que indica que dentro de la misma célula pueden existir múltiples mecanismos que liberan AA (42). Un resultado llamativo es que el ionóforo de calcio aumente la liberación de ácidos grasos y la producción de PG cuando las células se transfectan con la iPLA2-VIA, esto hace pensar que en algunas condiciones la enzima se podría regular por calcio o por factores dependientes de calcio (ver sección 5.1 y 6.8). La sobreexpresión de la iPLA2-VIA en cultivos celulares es posible que no refleje la verdadera regulación in vivo de esta enzima, ya que en células con niveles normales de iPLA2-VIA tratadas con ionóforo de calcio la liberación de AA no varía en presencia de BEL (31,53,89).

La iPLA2-VIA en las células pancreáticas tratadas con D-glucosa más carbacol regula la liberación de AA y la producción de prostaglandina E2 (PGE2) (90). Si se sobreexpresa la iPLA2-VIA aumenta la liberación de AA, el tratamiento de las células con BEL inhibe dicha liberación (43,90,91).

1.6.3. Apoptosis - Atsumi et al. (71,72) pensaron que la iPLA2-VIA podría jugar algún papel durante la apoptosis. El tratamiento de los promonocitos U937 con ligando de fas o con factor de necrosis tumoral α (TNFα) más cicloheximida, produce la apoptosis de las células y demuestra la participación de la iPLA2-VIA en la liberación de distintos ácidos grasos (71,72). En las células U937 la apoptosis se asocia con la ruptura de la iPLA2-VIA por la caspasa-3, una proteasa que actúa en algunas rutas de la apoptosis. El resultado de esta ruptura es que la iPLA2-VIA pierde su región N-terminal, lo que provoca que la enzima sea más activa y se acelere así la destrucción de la membrana fosfolipídica (72). Si se inhibe la iPLA2-VIA con MAFP disminuye la apoptosis temprana, aunque el MAFP no tiene efecto a tiempos largos (72). Se piensa que la iPLA2-VIA participa en la producción de las

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señales accesorias (llamadas señales de atracción) que aparecen con el propio proceso apoptótico (92).

Recientemente Lauber et al. (73) han demostrado que la iPLA2-VIA tiene un papel clave en la emisión de señales que atraen a los fagocitos hacía las células muertas. En este estudio han encontrado un potente quimioatractor para los fagocitos, la lisoPC secretada por las células apoptóticas.

Existen otros datos que apoyan la hipótesis de la participación de la iPLA2 en la producción de señales accesorias que permiten la separación de las células apoptóticas por los fagocitos (93). La lisoPC obtenida de la hidrólisis de la iPLA2 se expone en la superficie de las células T apoptóticas y así facilita la unión de IgM y factores de complemento que permiten el reconocimiento y separación de las células apoptóticas por parte de los fagocitos (93). Este estudio, que implica a la iPLA2, se basa únicamente en el uso del BEL, y no está claro por tanto si es la iPLA2-VIA, la iPLA2-VIB o ambas, o incluso otra fosfolipasa sin identificar la que participa en este proceso.

Un trabajo reciente en células de insulinoma INS-1 describe la participación de la iPLA2-VIA en la apoptosis inducida por tapsigargina (74). Cuando se sobreexpresa la iPLA2-VIA aumenta la tasa de apoptosis y si se usa BEL este aumento desaparece (74). En estas condiciones la apoptosis se debe a la ruptura de la iPLA2-VIA por la caspasa 3, y de dicha ruptura se obtiene un fragmento de 62 kDa que se asocia al núcleo (74).

En las células PC12, experimentos con el RNA de interferencia muestran la traslocación de la iPLA2-VIA al núcleo durante la muerte celular por hipoxia, provocando la contracción nuclear sin que se produzca la ruptura por caspasas (42).

1.6.4. Secreción - Las enzimas PLA2 intervienen en la reorganización de la membrana de dos maneras distintas. Por un lado, estimulan o inhiben las vías de transducción de señales generando moléculas de señalización; por otro lado, las PLA2s afectan de forma directa a la estructura de la membrana debido a la acumulación de lisoPL y de ácidos grasos. En los últimos años, se han llevado a cabo distintos estudios que proponen que la iPLA2-VIA está relacionada con la secreción de las proteínas que participan en alguno de estos mecanismos.

La secreción de insulina estimulada por glucosa en células pancreáticas β y en otras líneas celulares relacionadas, aumenta la hidrólisis de PL (30,74). Se cree que en este proceso participa la iPLA2-VIA, ya que si se tratan las células con BEL se inhibe tanto la hidrólisis de PL como la secreción de insulina (74). En las células INS-1 transfectadas con la iPLA2-VIA (43,91) el tratamiento con agentes que aumentan el AMPc aumenta la receptividad a glucosa, y sobre todo aumenta la secreción de insulina (43). Estos agentes inducen la traslocación de la enzima a la región nuclear (43,91), el AA va a ser la molécula de señalización que produzca la secreción de la insulina mediada por la iPLA2-VIA. Un trabajo posterior señala que es posible que en este proceso no participe la clásica enzima iPLA2-VIA de 85 kDa sino una forma de 70 kDa que deriva del procesamiento proteolítico de la de 85 kDa (74).

El tratamiento de las células U937 con el oligonucleótido antisentido específico para la iPLA2-VIA disminuye los niveles de lisoPC y disminuye la secreción de lisozima (94); además la movilización de AA (proceso mediado por la cPLA2α) no cambia (94). Experimentos de reconstitución, demuestran que la lisoPC es el lisoPL capaz de restaurar la secreción de lisozima (94), y no otros lisoPL como lisofosfatidilserina (lisoPS) o lisoPE. Por lo tanto, la iPLA2-VIA es la enzima encargada de la reincorporación de los ácidos grasos dentro de los PL de las membranas y de generar la lisoPC necesaria para la secreción total de la lisozima. La cPLA2α no tiene ningún papel en este proceso (94).

1.6.5 Quimiotaxis - Se piensa que tanto la cPLA2α como la iPLA2-VIA participan en la respuesta quimiotáctica de los monocitos frente a la proteína-1 quimioatrayente de monocitos (MPC-1) (37) La inhibición de las dos enzimas con oligonucleótidos antisentido inhibe la respuesta (37). El ácido lisofosfatídico es capaz de restaurar la respuesta en las células deficientes en iPLA2-VIA, pero no en las deficientes en cPLA2α. Mientras que el AA restaura la respuesta de los monocitos deficientes en cPLA2α, y no lo hace en los monocitos deficientes en iPLA2-VIA. Otros estudios muestran que ambas enzimas, la iPLA2-VIA y la cPLA2α siguen caminos de regulación paralelos (38).

1.6.6. Regulación de la expresión génica – Algunos autores señalan que la iPLA2 participa en la regulación

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transcripcional de ciertos genes (61,95,96). Se cree que una iPLA2 participa en la acumulación del RNA de doble cadena tras varias etapas de replicación viral, este RNA activa la respuesta antiviral en células infectadas. En macrófagos de ratón y en células RAW 264.7 esta respuesta provoca la expresión de varias citoquinas proinflamatorias cómo la interleuquina 1α o 1β y la producción de la óxido nítrico sintasa (NOS) (61). El BEL es capaz de inhibir el RNA de doble cadena y de inhibir la expresión de NOS (61), pero no provoca ningún cambio ni en las proteasas ni en PAP-1. Si se usa la metil lisoplasmenil colina, un análogo de lisoPC, se restaura parcialmente la expresión de NOS (61). En un artículo reciente (97) se ha identificado a la iPLA2-VIA como la enzima capaz de expresar NOS cuando los macrófagos se tratan con el virus de la encefalomiocarditis (EMCV), además el isómero S del BEL inhibe la inducción de NOS, la producción de óxido nítrico y la actividad de la iPLA2-VIA. En macrófagos de ratón sin iPLA2-VIA el EMCV no es capaz de inducir la expresión de NOS (97).

En otro estudio en miocitos cardiacos tratados a tiempos largos con interleuquina 1β se originan una serie de respuestas como son: la producción de nitrito, la inducción de NOS, la liberación de AA y la producción de PGE2; todas estas respuestas se inhiben con BEL (96). Pero la interleuquina 1β provoca una disminución de aproximadamente un 50 % en la expresión de la iPLA2-VIA; por lo que los efectos del BEL puede que no sean sobre la iPLA2-VIA.

En monocitos humanos una iPLA2 es la enzima responsable de controlar el procesamiento de la pro-interleuquina 1β (96). En estas células la nigericina inducida por potasio provoca que madure antes la interleuquina 1β y así se forma la glicerofosfocolina, tanto la maduración interleuquina 1β como la formación de glicerofosfocolina se inhiben con BEL. Se puede descartar que el BEL tenga algún efecto sobre PAP-1, además la adición de lisoPC exógena no impide la inhibición por BEL (96).

1.6.7 Isquemia cardiaca – Cuando comienza una isquemia miocárdica se acelera el catabolismo de PL. McHowat et al. (98) han visto en miocitos ventriculares aislados que en una situación de hipoxia aumenta la actividad iPLA2 sensible a BEL provocando una liberación de AA y una acumulación de lisoPL. Tanto el AA como los lisoPL pueden contribuir a la enfermedad

isquémica, lo que no se ha podido es identificar a la enzima iPLA2 responsable (98) .

Mancuso et al. (99) han demostrado que en ratones transgénicos tratados con una iPLA2-VIA de corazón hay indicios de que en un miocardio sano la isquemia es capaz de activar a la iPLA2-VIA y como consecuencia ocurre una hidrólisis fosfolipídica que puede provocar taquiarritmias ventriculares letales. En las zonas isquémicas de estos ratones la obstrucción de las arterias coronarias de los corazones perfundidos con el sistema de Langendorff provoca la liberación de ácidos grasos y la acumulación de lisoPC, esta liberación y acumulación de lisoPC no ocurre si se adiciona BEL unos minutos antes de inducir la isquemia (99).

1.6.8. Entrada de calcio - Cuando disminuyen las reservas de Ca2+ intracelular debido a distintos agonistas se activan los canales que lo almacenan y comienza la entrada de Ca2+ (100), lo que no se sabe es como la membrana plasmática puede conocer el estado de estas reservas. Una posibilidad es que se genere un mediador debido a la pérdida de Ca2+ y que este mediador difunda de los compartimentos intracelulares hacia la membrana plasmática, la naturaleza de este mediador conocido como factor de entrada de calcio se desconoce (100).

Los grupos de Gross (101) y Turk (102) fueron los primeros en sugerir una posible relación entre la iPLA2-VIA y las señales de calcio, ambos demuestran que en las células del músculo liso de rata y en los islotes pancreáticos, al disminuir las reservas de Ca2+ intracelular se observa un aumento de la hidrólisis fosfolipídica debida a la iPLA2, lo que provoca que se acumulen distintos ácidos grasos, entre ellos el AA. La posible participación de la iPLA2 se basa únicamente en el uso del BEL, por lo que estos resultados hay que corroborarlos con otras técnicas.

Bolotina et al. usando distintas técnicas de inhibición de la iPLA2-VIA han visto que esta enzima es necesaria para que se activen los canales que almacenan Ca2+ y permitir su entrada; los tipos celulares que usaron fueron: células vasculares del músculo liso, Jurkat, plaquetas y células leucémicas basófilas de rata (39).

En un trabajo posterior, se propone un mecanismo distinto para activar las reservas de Ca2+ en el que la iPLA2-VIA juega un papel central (103). Según sus autores, cuando disminuyen las reservas de Ca2+ se produce un factor de entrada de calcio intracelular que

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desplaza a la calmodulina de la iPLA2-VIA, activando la enzima y produciendo lisoPL. Con ello se activan los canales que almacenan Ca2+ y comienza su entrada. Cuando se han llenado las reservas, cesa la producción del factor de entrada de calcio, la calmodulina se reasocia a la iPLA2-VIA y ésta queda nuevamente inhibida, se inactivan los canales que almacenan Ca2+ y ya no entra más Ca2+ (103).

2. MATERIALES Y METODOS

2.1. Cultivo celular – Las células U937 son células promonocíticas humanas que crecen en suspensión; se mantienen en medio RPMI 1640 suplementado con 10 % (v/v) de suero fetal bovino, 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina, y 100 µg/ml de estreptomicina. Las células se incuban a 37º C en una atmósfera humidificada de CO2/O2 (1:19). Las células Jurkat, THP-1, y RAW264.7 se mantienen en las mismas condiciones de cultivo. Las células Mono-Mac se mantienen además con el suplemento OPI. Las células de pituitaria GH3 se cultivan en medio RPMI 1640 suplementado con 15 % de suero de caballo y con 2,5 % de suero fetal bovino. Los macrófagos P388D1-GFP se mantienen con un 5 % (v/v) de suero fetal bovino, 2 mM de glutamina, 50 U/ml de penicilina, y 50 µg/ml de estreptomicina. En algunos experimentos se necesita trabajar con células con los niveles de AA disminuidos, para conseguirlo se mantienen las células al menos 7 días en medio libre de suero (107,108).

2.2. Extracción de RNA total – La extracción del RNA total de las células se llevo a cabo siguiendo el protocolo descrito por Chomezynski y Sacchi (109), utilizando Trizol (una solución monofásica de fenol y tiocianato). 5 x 106 células se resuspenden en 1 ml de Trizol hasta conseguir una solución homogénea. Se añaden 200 µl de cloroformo, y tras agitar vigorosamente se centrifuga a 12000 x g durante 10 min. a 4º C. De esta forma se separan las fases acuosa y orgánica. En la fase acuosa, en la que se encuentra el RNA, se añade 0,5 ml de isopropanol para precipitarle. Se centrifuga dicha fase y se decanta el sobrenadante, el precipitado se lava con 1 ml de etanol al 70 % en H2O DEPC. Una vez lavado, se deja secar a temperatura ambiente y se resuspende en 25 µl de H2O DEPC. El RNA se mantiene a -80º C en esta solución acuosa. La cantidad de RNA se determinó por espectrofotometría midiendo las absorbancias a 260 y 280 nm, longitudes a las que los ácidos nucleicos y las

proteínas respectivamente, presentan la máxima absorbancia. El cociente A260/A280 indica la pureza del RNA. Se considera que las muestras son adecuadas cuando los valores de este cociente están comprendidos entre 1,8 y 2. La concentración de RNA en µg/µl se calcula con la siguiente fórmula: [RNA] µg/µl = A260 x factor de dilución x 40 (factor de absorbancia del RNA) x 1/ 1000

2.3. Síntesis del DNA complementario (cDNA) – Se diluye 1 µg de RNA hasta un volumen de 40 µl en H2O DEPC en presencia de primers aleatorios, se calienta a 65º C durante 5 min. Las muestras se dejan 10 min. a temperatura ambiente y se añade: tampón de RT, dNTPs, inhibidor de RNasa, y RT; hasta un volumen final de 50 µl y se incuba a 37º C durante 1 h. Después se calienta a 90º C durante 5 min. Las muestras se guardan a – 20º C.

2.4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) – Al cDNA de cada muestra se le añade la siguiente mezcla: tampón de la DNA polimerasa, dNTPs, primers, DNA polimerasa y H2O estéril hasta un volumen final de 50 µl. El programa que se uso para la iPLA2-VIA fue: 35 ciclos, desnaturalización a 94º C durante 1 min., anillamiento a 59º C durante 1 min. y extensión a 72º C durante 1 min. Para la cPLA2α: 45 ciclos, desnaturalización a 94º C durante 30 seg., anillamiento a 58º C durante 30 seg. y extensión a 72º C durante 1 min. Para la sPLA2 de grupo XII: 45 ciclos, desnaturalización a 94º C durante 30 seg., anillamiento a 60º C durante 30 seg. y extensión a 72º C durante 1 min. Cada programa comienza con un calentamiento a 94º C durante 2 min. y termina con una extensión adicional a 72º C durante 10 min. La amplificación del DNA se analizó en un gel de agarosa al 2 % y se visualizó con bromuro de etidio.

2.5. Liberación de AA – Se utilizan placas de 12 pocillos, en las que se han distribuido 0,5 x 106 células por pocillo. Las células se incuban en medio RPMI con suero y se marcan con 0,5 µCi/ml de [3H]AA durante 18 horas. Pasado este tiempo se lavan dos veces con medio RPMI sin suero y en presencia de 0,5 mg/ml de albúmina, se mantienen en este medio durante 1 h y después se añaden los estímulos. Transcurrido el tiempo de estimulación se recogen las células, se precipitan por centrifugación y se toma el sobrenadante. Se determina la radiactividad de los sobrenadantes con líquido de centelleo.

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2.6. Tratamiento con el oligonucleótido antisentido para la iPLA2-VIA y la cPLA2α – Aproximadamente un millón de células se lavan dos veces con medio sin suero y se mantienen en estas condiciones aproximadamente 3 h. Los oligonucleótidos sentido y antisentido se mezclan con lipofectamina y los complejos que se forman se mantienen a temperatura ambiente durante 10-15 min., después se añaden a las células. Las concentraciones finales de oligonucleótidos y de lipofectamina son 1 µM (iPLA2-VIA), 10 µM (cPLA2α) y 10 µg/ml respectivamente. Los oligonucleótidos fueron modificados para que fueran fosforotioatos y así limitar su degradación. Pasadas 4 h se añade 5 % suero fetal bovino, las células se crecen 48 h antes de usarse para los experimentos. El tratamiento con los oligonucleótidos y las condiciones de cultivo no fueron tóxicos para las células como se vio con un ensayo de exclusión con azul de tripan.

La secuencia del antisentido de la iPLA2 se corresponde con los nucleótidos 59-78 de la secuencia de la iPLA2 de grupo VIA de ratón, esta secuencia se conserva en la iPLA2 de grupo VIA humana (15,16). El antisentido usado fue 5’-CTC CTT CAC CCG GAA TGG GT-3’. Como control se usa la secuencia sentido 5’-ACC CAT TCC GGG TGA AGG AG-3’. Los oligonucleótidos antisentido de la cPLA2α humana que se usan en este trabajo fueron: antisentido es: 5’-GTA AGG ATC TAT AAA TGA CAT-3’; y el sentido: 5’-GAT GAT CAG ATA TAC GAT ATT-3’.

2.7. Medida de la concentración de proteína – La proteína total de los extractos celulares se cuantifica según el método de Bradford (110), que se basa en un desplazamiento del máximo de absorción (de 465 a 595 nm) del colorante azul de Coomasie en presencia de proteína. Se utiliza una solución de colorante comercial y la curva patrón se construye con albúmina.

2.8. Inmunodetección (Western Blot) – Las células se lavan con tampón fosfato salino (PBS) frío y se recogen en un tampón de lisis frío (150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,4, Triton X-100 al 0,5 %, 1 mM PMSF, 100 µM ortovanadato sódico y una mezcla de inhibidores de proteasas 1X). Tras una incubación en hielo durante 30 min., el lisado celular se centrifuga a 4º C a 12000 rpm durante 10 min. Se descarta el precipitado y se mide la proteína del sobrenadante mediante el método Bradford. Las muestras se mezclan con el tampón de Laemmli [60 mM Tris, 10 % glicerol (v/v), 2 % SDS (p/v), 0,002 %

azul de bromofenol (p/v), pH 6,8] y 2,5 % β- mercaptoetanol, se hierven 5 min.

Para separar las proteínas, las muestras se someten a electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE). La electroforesis se lleva a cabo en tampón de electroforesis (25 mM Tris, 0,2 mM Glicina, 1 % SDS) durante 90 min. a 150 V. A continuación se transfieren las proteínas a una membrana de nitrocelulosa con una transferencia húmeda durante 1 h a 200 mA en un tampón de transferencia (CAPS). La membrana transferida se bloquea en PBS con 5 % de leche en polvo desnatada durante 1 h a temperatura ambiente. Después se incuba durante 1 h con el anticuerpo primario y se lava 3 veces durante 10 min. con PBS más Tween 20 al 0,1 %. A continuación la membrana se incuba con el anticuerpo secundario correspondiente durante 1 h y se hacen 3 lavados durante 10 min. con PBS más Tween 20 al 0,1%. Las diluciones de los anticuerpos primario y secundario se hacen en PBS con leche desnatada en polvo al 5 % y Tween 20 al 0,1 %. La detección de la proteína se realiza con el sistema de aumento de quimioluminiscencia ECL.

2.9. Preparación de los homogeneizados para los ensayos de actividad – Se lavan las células con PBS y se resuspenden en el tampón HEPES 100 mM a pH 7,5 con inhibidor de proteasas. Después de sonicar las células durante 1 min., se centrifugan a 4º C a 12000 rpm durante 10 min. Se descarta el precipitado y se mide la proteína del sobrenadante mediante el método Bradford. Los homogeneizados se conservan a - 80º C.

2.10. Ensayo de actividad de PLA2 – Los homogeneizados (100 µg) de las células U937 se incuban durante 2 h a 37º C en el tampón HEPES 100 mM a pH 7,5 en presencia de 5 mM de EDTA y 100 µM del sustrato fosfolipídico en un volumen final de 150 µl. Se utilizan diferentes sustratos: micelas mixtas (68), vesículas (53) y membranas (111). En algunos experimentos el EDTA se reemplaza por 1,3 mM CaCl2. Cuando se usan inhibidores, estos se preincuban 30 min. antes de añadir el sustrato. La extracción de lípidos se hizo por el método de Bligh & Dyer (112), y la separación de estos se hace por cromatografía en capa fina (TLC) usando como fase móvil hexano/dietil éter/ácido acético (70:30:1); se raspan los fosfolípidos y los ácidos grasos libres y se mide la radiactividad.

2.11. Preparación de los sustratos para medir actividad PLA2 – Micelas mixtas: 100.000 cpm de L-α-

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dipalmitoil [2-palmitoil-9,10-3H(N)] glicerofosfocolina se combinan con el mismo compuesto sin marcar para tener una concentración final de 100 µM en un volumen final de 150 µl. Se evaporan con N2. Se añade Triton X-100, cuya concentración final debe ser 400 µM y se usa como tampón HEPES 100 mM a pH 7,5. Se agitan y se calientan 1 min. a 40º C, después se ponen en un baño de ultrasonidos durante 5 min.

Vesículas: 100.000 cpm de L-α-dipalmitoil [2-palmitoil-9,10-3H(N)] glicerofosfocolina se combinan con el mismo compuesto sin marcar para tener una concentración final de 100 µM en un volumen final de 150 µl. Se evaporan con N2. Se utiliza como tampón HEPES 100 mM pH 7,5 y se sonica durante un minuto.

Membranas: Las células U937 a una densidad de 1,5 x 106 cel/ml se marcan con 0,75 µCi/ml de [3H]AA durante 18 h. Las membranas celulares totales se preparan por centrifugación como describieron Diez et al. (111). Las células se lavan 3 veces con PBS, se resuspenden a 4º C en 10 mM Tris pH 8 que contenga 0,02 mM de EGTA e inhibidores de proteasas, se sonican durante 1 min. y se centrifugan 10 min. a 12.000 rpm. El sobrenadante se centrifuga a 30.000 rpm durante 1 h; el pellet obtenido de esta última centrifugación se lava con PBS que contenga 1 mM de EGTA y se resuspende en PBS. Se cuenta la radiactividad de las membranas y se guardan a – 80º C hasta su uso.

2.12. Ensayo de proliferación celular – Para medir la proliferación celular se usa el kit CellTiter96 Aqueous One Solution (Promega): las células (10.000 células/pocillo) se plaquean en placas de 96 pocillos en condiciones normales de cultivo y se tratan con diferentes concentraciones de BEL. Después de 24 h, el producto que se ha formado, el formazan, se ensaya midiendo su absorbancia a 492 nm en un lector de placas.

2.13. Análisis del ciclo celular – Se plaquea un millón de células en presencia de suero al 2 % y se estimulan con BEL durante los tiempos indicados, se lavan dos veces con PBS frío y se resuspenden en etanol frío al 70 %, manteniéndose a 4º C durante 18 h. Pasado este tiempo, se centrifugan a 4º C a 3000 rpm durante 5 min., y se resuspenden en el tampón de marcaje (PBS, 300 µg/ml de Ribonucleasa A y 20 µg/ml de PrI). Las células se incuban durante 1 h a temperatura ambiente y en oscuridad antes de ser analizadas en el citómetro de flujo Coulter Epics XL-MCL.

2.14. Marcaje nuclear con DAPI – Se plaquea un millón de células en medio con suero al 2 % y se estimulan a 37º C con los agonistas durante los tiempos deseados, se lavan dos veces con PBS frío y se fijan con 0,5 ml de paraformaldehído al 4 % durante 15 min. Después se lavan con PBS, se incuban con 1 µg/ml de DAPI en PBS durante 25 min. a temperatura ambiente y en oscuridad. Tras varios lavados con PBS, las células se resuspenden en 10 µl de Vectashield. Se coloca la muestra en el porta y se analiza la fluorescencia con un microscopio invertido Nikon TE-2000U con un filtro de luz ultravioleta.

2.15. Detección de la externalización de la PS en las membranas de las células apoptóticas – Un millón de células se mantienen con suero al 2 % y se estimulan a 37º C con los agonistas durante los tiempos deseados, se lavan dos veces con PBS frío y se resuspenden en 100 µl de tampón binding con 2 µl de Anexina V-FITC según indica la ficha del producto. Se mantienen 10 min. incubando en oscuridad y a temperatura ambiente, después se diluyen en 400 µl de tampón binding y las muestras se analizan por citometría de flujo usando el Coulter-Epics XL-MLC.

2.16. Incorporación de colina dentro de PC – Durante los tiempos deseados 0,5 x 106 células en medio con suero se mantienen con los agonistas, durante la última hora de incubación se añaden 2 µCi/ml de [3H]colina. Las células se lavan con medio sin suero y se extraen los lípidos con un Bligh & Dyer (112), los lípidos se separan por TLC usando como fase móvil cloroformo/metanol/ácido acético/H2O (50:40:6:0,6 en volumen). Se raspan las manchas que corresponden a PC y se mide la radiactividad añadiendo líquido de centelleo.

2.17. Incorporación de AA en PL – Se planquean 0,5 x 106 de células en presencia de suero y se estimulan con los agonistas durante los tiempos deseados, después se dejan en reposo en medio libre de suero durante 1 h y se exponen a 0,5 µCi/ml [3H]AA (1 µM). A los tiempos predeterminados se recogen los sobrenadantes y sobre el sedimento celular se añade 0,1 % de Triton X-100. Los lípidos totales se extraen con un Bligh & Dyer (112) y se separan por TLC usando como fase móvil hexano/dietil éter/ácido acético (70:30:1). Para separar las distintas clases de fosfolípidos se hace una extracción con n-butanol frío y se separan por TLC usando como fase móvil cloroformo/metanol/ácido acético/agua (50:40:6:0.6). Se raspan las manchas

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adecuadas y se mide la radiactividad después de añadir líquido de centelleo.

2.18. Producción de transfectantes estables que expresan la iPLA2-VIA – El vector pcDNA3.1 que contiene la iPLA2 Grupo VIA fue amablemente cedido por la Dr. Suzanne Jackowski (St. Jude Children’s Research Hospital, Memphis, TN). Aproximadamente 2 µg por 106 células se transfectan por electroporación a 270 V (975 µF) usando un Gene Pulser II electroporador (Bio-rad). Para seleccionar las células transfectadas, se incuban en medio con 1 mg/ml de geneticina. Para obtener las células transfectantes estables que expresan la iPLA2 Grupo VIA, las células se clonan por dilución límite en medio con 300 µg/ml de geneticina. A las dos semanas, los pocillos que contienen una sola colonia se seleccionan y la expresión de iPLA2 se analiza por inmunodetección y por medida de la actividad iPLA2. Los clones se mantienen en medio con 300 µg/ml de geneticina.

2.19. Medida de lisofosfolípidos – Se marcan 0,5 x 106 células durante dos días con 0,5 µCi/ml de [3H]colina o [14C]etanolamina. La extracción de los lípidos se hace con n-butanol frío y su separación con una TLC usando como fase móvil cloroformo/metanol/ácido acético/agua (50:40:6:0.6). Se raspan las manchas que corresponden a lisoPC o lisoPE y se introducen en viales de centelleo para medir su radiactividad (113).

2.20. Ensayo de fagocitosis – La fagocitosis de las células apoptóticas por macrófagos se determina con un citómetro de flujo. Como células fagocíticas se emplean los macrófagos P388D1-EGFP. Un millón de células P388D1 se plaquean en placas de 24 pocillos en medio con 5 % de suero. Como células diana se usan las células U937 apoptóticas. La muerte celular apoptótica en estas células se induce tratándolas con 500 µM H2O2 durante 20 h (44). Después las células U937 se marcan con 20 µg/ml de PrI durante 20 min. En algunos experimentos, las células apoptóticas se marcan con Cy3-anexina durante 5 min. Después de lavar dos veces las células U937 con PBS se añaden a los macrófagos P388D1 que están en una monocapa en un volumen final de 1,5 ml de RPMI sin suero. Las placas se centrifugan a 300 x g (1200 rpm) durante 3 min. para poner las células diana en contacto directo con los macrófagos. La proporción de células diana frente a macrófagos es 3:1. La reacción de fagocitosis se lleva a cabo durante 2 h en un incubador humidificado de CO2 a 37º C, después los macrófagos se tripsinizan con una

solución 0,25 % de tripsina/EDTA durante 5 min. Este paso adicional ayuda a despegar las células U937 sin digerir, de los macrófagos. Los macrófagos se raspan de los pocillos usando un raspador, se lavan dos veces con PBS, y se analizan con el citómetro de flujo Coulter EpicsXL-MCL citofluorómetro. La fluorescencia verde de las EGFP se analiza en FL1 (505-545 nm), mientras que la fluorescencia roja del PrI o de la Cy3-Anexina V se analiza en FL2 (555-600 nm). Para cuantificar la fagocitosis, la fluorescencia roja se analiza sólo en las poblaciones celulares con una gran fluorescencia verde (células positivas a EGFP, es decir, macrófagos). Los macrófagos que contienen EGFP sólo son positivos a la fluorescencia roja si han digerido células U937 marcadas con PrI. La fagocitosis se confirma con un microscopio confocal usando el sistema de escaneado con laser Radiance 2100 de Bio-Rad acoplado a un microscopio invertido de Nikon con una cámara termostatizada. Se usa un objetivo de 60X, con una apertura numérica de 1,4 y aceite de inmersión. La fluorescencia verde se monitoriza con un láser de argón excitando a 488 nm usando una combinación de HQ500LP y de HQ560SP. La fluorescencia roja se monitoriza secuencialmente con un láser de HeNe excitando a 543 nm usando un HQ590/570.

2.21. Medida del remodelado fosfolípidico con [3H]AA – Para estos experimentos, un millón de células se marcan con un pulso de [3H]AA (0,5 µCi/ml, 1 µM) durante 30 min. a 37º C. Las células se lavan tres veces con medio que contenga 0,5 mg/ml de albúmina para eliminar la marca que no se ha incorporado. Después, las células se mantienen en un medio libre de suero y se incuban a 37º C durante los tiempos indicados. Los lípidos se extraen y se separan como hemos indicado más arriba.

3. RESULTADOS

3.1. Papel de la iPLA2 en la acumulación de ácidos grasos libres en las células U937 tratadas con H2O2

3.1.1. Fosfolipasas A2 presentes en las células U937

3.1.2. Movilización de AA en las células U937 tratadas con H2O2

3.1.3. Estudios de inhibición de PLA2

3.1.4. Estudios de la regulación de la actividad de la iPLA2

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3.2. El BEL provoca la muerte celular a través de la PAP-1 y no de la iPLA2

3.2.1. Efectos del BEL sobre el crecimiento celular

3.2.2. Efectos del BEL sobre el ciclo celular y el DNA

3.2.3. Marcaje con Anexina V-FITC en las células tratadas con BEL

3.2.4. Efecto del BEL sobre la proteolisis de caspasas

3.2.5. Efectos del BEL sobre otros tipos celulares

3.2.6. Efecto de la inhibición de la iPLA2 sobre el marcaje con anexina V-FITC y sobre la actividad iPLA2

3.2.7. Papel de PAP-1

3.3. Papel de la iPLA2 en la liberación de AA, incorporación de ácidos grasos en los fosfolípidos y apoptosis en las células U937 expuestas al H2O2

3.3.1. Liberación de AA en las células sobreexpresadas con la iPLA2 y tratadas con H2O2

3.3.2. Papel de la iPLA2 en la incorporación de AA en los PL

3.3.3. Papel de la iPLA2 en la apoptosis inducida por H2O2

3.4. Papel de la iPLA2-VIA en la fagocitosis por macrófagos de las células U937 tratadas con H2O2

3.4.1. Fagocitosis de las células apoptóticas U937 por los macrófagos P388D1

3.4.2. La lisoPC es el metabolito responsable de facilitar la fagocitosis

3.5. El bloqueo de la incorporación de AA en los fosfolípidos provoca la apoptosis de las células U937

3.5.1. Efecto del AA sobre la apoptosis en las células U937

3.5.2. Inhibidores de la esterificación de AA inducen apoptosis en las células U937

3.5.3. Efecto de los inhibidores de ciclooxigenasa y lipoxigenasa sobre la apoptosis de las células U937

4. DISCUSION

4.1. Papel de la iPLA2 en la acumulación de ácidos grasos libres en las células U937 tratadas con H2O2

Las células fagocíticas en respuesta a diferentes agonistas producen especies reactivas de oxígeno entre las que destacan el anión superóxido y el H2O2 (171). El daño oxidativo que producen estos metabolitos se asocia a la movilización de AA en las células del sistema vascular: células endoteliales, células del músculo liso, plaquetas o fagocitos. Aunque la producción de estas especies juega un papel importante en la señalización celular y en la defensa inmune, una producción incontrolada puede ser un factor grave en los desórdenes vasculares (171). Conocer las interacciones entre las especies reactivas de oxígeno y los metabolitos de AA es importante para el estudio de estos desórdenes.

En este trabajo se emplea el H2O2 para provocar una situación de estrés oxidativo y estudiar los mecanismos de movilización de AA en células fagocíticas como son las células U937. Los datos del capítulo 1 sugieren que en las células U937 la movilización de ácidos grasos provocada por el H2O2 no depende de la cPLA2α y si de la iPLA2. Estos resultados se obtienen después de emplear distintas técnicas como inhibidores químicos y oligonucleótidos antisentido. Debido a que la movilización de AA en respuesta al H2O2 no necesita calcio, es consistente la participación de la iPLA2 (enzima independiente de calcio) (87). Otro dato que confirma la participación de la iPLA2 en este proceso es que las células U937 tratadas con H2O2 liberan otros ácidos grasos además del AA (87), es decir no muestran preferencia por el ácido graso que hidroliza; característica que distingue a la enzima iPLA2 de la cPLA2.

La figura 3B mide la movilización de AA debida al H2O2 en función del tiempo, demostrando que hay una respuesta lineal a tiempos cortos y una saturación después de 2 h de tratamiento con el oxidante. Esta cinética contrasta con la respuesta de las células a la Con A (estímulo que libera AA debido a la acción de la cPLA2) que satura la respuesta a la hora del tratamiento, característica de una respuesta celular regulada.

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Si se mide la actividad de la iPLA2, tanto en las células tratadas con H2O2 como en las no tratadas, no hay diferencia en la actividad. Estos ensayos se hacen con tres condiciones experimentales diferentes variando el tipo de sustrato: vesículas, micelas mixtas y membranas naturales. El resultado con los tres sustratos fue que la actividad intrínseca de la iPLA2 no cambia después de la exposición de las células a H2O2. El mecanismo que libera AA en las células U937 tratadas con H2O2 no implica la activación de la iPLA2.

Cuando en este ensayo se usan membranas de células tratadas con H2O2, la actividad iPLA2 es más alta que la de las membranas de las células sin estimular, lo que demuestra que el tratamiento de las células con H2O2 facilita la interacción de la iPLA2 sobre la membrana fosfolipídica. Se ha visto que las membranas de las células tratadas con H2O2 tienen cantidades altas de peróxidos lipídicos en comparación con las membranas sin tratar, dato que sugiere que en las células tratadas con H2O2 la hidrólisis lipídica ocurre más deprisa. Lo que se desconoce es cómo esta acumulación de peróxidos lipídicos puede facilitar la catálisis, aunque si se sabe que existen distintos factores que alteran el empaquetamiento lipídico de la membrana aumentando la liberación de ácidos grasos tanto in vivo como in vitro (172).

Con estos resultados se puede sugerir un modelo de movilización de ácidos grasos, en este modelo el oxidante induce la oxidación lipídica provocando la acumulación de peróxidos lipídicos en la membrana. Estos peróxidos lipídicos desestabilizan la membrana y hacen que sea más susceptible para ser atacada por la iPLA2, aumentando la liberación de ácidos grasos. Un aspecto importante de este modelo es que la liberación de ácidos grasos ocurre sin la activación de la cPLA2α. Esta falta de activación probablemente indique que la liberación de ácidos grasos sea un proceso no regulado.

4.2. El BEL provoca la muerte celular a través de la PAP-1 y no de la iPLA2

En este capítulo se ha demostrado que el BEL, un inhibidor de la iPLA2, produce la muerte celular por apoptosis en una gran variedad de tipos celulares. La tinción del núcleo con DAPI en células tratadas con BEL provoca la condensación de la cromatina, un signo evidente de apoptosis. Experimentos de citometría usando como marcador PrI demuestran la muerte celular

por apoptosis en células U937 tratadas con BEL. El marcaje con Anexina-V FITC confirma que el BEL aumenta la exposición de la PS al exterior a la superficie celular.

El BEL es capaz de activar la caspasa-3 y la caspasa-9; esta activación se confirmó usando el inhibidor de caspasas Z-VAD-FMK y con la ruptura del sustrato para caspasa-3 PARP. Debido a la implicación de la caspasa-9 se puede pensar que la apoptosis provocada por BEL ocurre a través de la mitocondria.

Ninguno de los efectos provocados por el BEL, se reproduce tratando las células con MAFP o con un oligonucleótido antisentido específico para la iPLA2; descartándose la participación de la iPLA2 en la apoptosis inducida por BEL. Trabajos anteriores en las células U937 tratadas con ligando de fas apuntan a la iPLA2 como la enzima responsable de la liberación de ácidos grasos y por lo tanto, responsable de la destrucción de la membrana fosfolipídica durante la apoptosis (71,72), pero los datos de este capítulo sugieren que la apoptosis a través de la mitocondria puede ocurrir sin la actividad iPLA2.

La apoptosis provocada por el BEL disminuye en presencia de propranolol (inhibidor de PAP-1) (33); parece que los efectos del BEL van encaminados a inhibir PAP-1. PAP-1 desfosforila el ácido fosfatídico para producir DAG, esta reacción es necesaria para mantener la biosíntesis de PC en las células. Si se inhibe PAP-1 deberían disminuir los niveles celulares de PC, la figura 16 demuestra que esto ocurre en las células tratadas con BEL.

La alteración de la homeostasis de PC causa la disminución del crecimiento celular y provoca la muerte celular por apoptosis (146). En la línea celular MT-58 con una mutación de la CT, la disminución de la síntesis de PC provoca la apoptosis de la célula (173). Si se usan análogos sintéticos de lisoPC que funcionan como inhibidores de la síntesis de PC, en células como los fibroblastos se produce apoptosis (174). La ausencia de actividad PAP-1 podría explicar la apoptosis inducida por BEL debido a la disminución de la síntesis de lípidos.

Durante el proceso de apoptosis inducida por BEL la ceramida se puede ver afectada debido a que en las células la disminución de la síntesis de DAG y de PC afecta a la síntesis de esfingomielina a través de la ruta de la esfingomielina sintasa; la ceramida se acumularía

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dentro de la célula. No hay un consenso acerca del mecanismo por el cuál la ceramida provoca apoptosis, aunque se sabe que aumenta durante la fase inicial de ésta (175,176). Las ceramidas naturales son capaces de aumentar la permeabilidad de la membrana externa de la mitocondria y provocar la liberación al citosol del citocromo c y de otras pequeñas proteínas (177).

Durante este capítulo con distintos experimentos se ha visto que el BEL provoca apoptosis en las células U937 a través de la enzima PAP-1 y no de la iPLA2. Este aspecto debe tenerse en cuenta cuando se use la droga para estudiar los distintos papeles de la iPLA2 en la apoptosis y en otras respuestas celulares. El BEL, si se utiliza durante tiempos largos, puede servir como control positivo pero no para conocer el papel de la iPLA2 durante la apoptosis. Serán otros inhibidores y otras técnicas alternativas que inhiban la iPLA2 las que se usen en estos estudios. Los efectos del BEL sobre el metabolismo lipídico se detectan a la hora de exposición con la droga, en este tiempo tanto la síntesis de PC como de TAG están alteradas, además la célula sufre una serie de alteraciones morfológicas y distintos sucesos bioquímicos como la despolarización mitocondrial y la liberación y activación de efectores de muerte celular.

4.3. Papel de la iPLA2 en la liberación de AA, incorporación de ácidos grasos en los fosfolípidos y apoptosis en las células U937 expuestas al H2O2

Para conocer que ocurre en las células U937 en situaciones de estrés oxidativo se ha usado como oxidante H2O2. Se han descrito mecanismos moleculares para explicar la movilización de ácidos grasos producida por el H2O2 en las células U937, en el capítulo 1 se encontró que la enzima que participa en este proceso es la iPLA2-VIA. Probablemente debido al aumento de peróxidos lipídicos en la membrana producidos por el H2O2, la iPLA2 tendrá mayor accesibilidad sobre su sustrato incrementándose la liberación de ácidos grasos (87). Este papel de la iPLA2 es bastante sorprendente desde el punto de vista bioquímico, ya que en condiciones de activación (a través de receptor o a través de cascadas de señalización intracelulares) se sabe que es la cPLA2 y no la iPLA2 la fosfolipasa necesaria para la movilización de AA en células fagocíticas. En los fagocitos si se inhibe la cPLA2α se bloquea la movilización de AA a través de

receptor, esto no ocurre con la inhibición de la iPLA2 por BEL (26,31,83,178,179).

También se comprobó la participación de la iPLA2 en la hidrólisis de los PL inducida por un oxidante, en células estromales del útero (59) y más recientemente en astrocitos (180). En células cómo macrófagos alveolares (120) y células vasculares del músculo liso (121), la movilización de AA producida por oxidantes se produce por la falta de incorporación de ácidos grasos en los PL.

Como la iPLA2 participa en las reacciones de desacilación y reacilación del AA en células inmunoinflamatorias (5,6), parece interesante estudiar los efectos del H2O2 en la incorporación de AA en células como las U937. Para conocer el papel de la iPLA2 en la incorporación se empezó estudiando el efecto del timerosal, un compuesto organometálico que bloquea la reacilación del AA y disminuye la desacilación vía iPLA2 (151,152). Este compuesto aumenta la liberación de AA que provoca el H2O2. La causa de este aumento puede deberse a que el H2O2 inhiba la reacilación del AA y en este caso el timerosal tendría un efecto sinérgico, como demuestran en sus estudios Sporn et al. (120), y Cane et al. (121), o bien a que el H2O2 estimule la desacilación mediada por las PLA2 y en este caso el efecto del timerosal será aditivo. Esto último es lo que se ha observado en los experimentos descritos en el capítulo 4.3.

Analizando los efectos del H2O2 sobre la capacidad de las células de incorporar AA, se ha encontrado que los oxidantes no bloquean la esterificación del AA dentro de los PL sino que la aumentan. Una posible explicación es que la rápida hidrólisis de los PL por la iPLA2 en presencia de H2O2 provoca la acumulación de aceptores lisoPL intracelulares que causan un incremento en la incorporación de AA dentro de los PL. Señalar que el H2O2 no afecta a las actividades de las enzimas de reacilación del AA, la acil-CoA sintetasa de ácidos grasos de cadena larga y la aciltransferasa dependiente de CoA (120).

Aunque se produzca un aumento en la incorporación de ácidos grasos dentro de los PL, el resultado neto de la acción del H2O2 es un aumento de la movilización del AA debido a los fuertes efectos del H2O2 sobre la iPLA2. La importancia bioquímica del AA en las células tratadas con H2O2 radica en que no todo el AA liberado de los PL por la iPLA2 está disponible para su metabolismo, una parte del AA libre será reincorporado dentro de los PL limitando de esta forma la cantidad de

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AA libre disponible para las futuras reacciones metabólicas.

El control de los niveles intracelulares de aceptores lisoPL necesarios para la incorporación de AA dentro de los PL es una de las funciones de la iPLA2 en las células fagocíticas. Este papel se ha demostrado en estudios en los que la actividad de la iPLA2 disminuye en las células, bien vía farmacológica o bien por oligonucleótidos antisentido (5,6,36,48). En este capítulo se ha empleado una tercera vía, diferente a las ya empleadas, la sobreexpresión de la iPLA2. Esta nueva estrategia ha sido útil para confirmar papeles ya descritos de esta enzima y estudiar otros nuevos. Se ha encontrado que las células que sobreexpresan la iPLA2 tienen mayor capacidad para incorporar AA en los PL que las células control. Además, las células que sobrexpresan la enzima movilizan mayor cantidad de AA libre en respuesta a H2O2. Estos resultados destacan el papel clave de la iPLA2 en la mediación de la hidrólisis fosfolipídica durante el estrés oxidativo causado por el H2O2 y el importante papel de la enzima en la regulación de los niveles intracelulares de lisoPC.

En las células de los islotes pancreáticos después de la inhibición de la iPLA2 con BEL se mantienen los niveles de lisoPC (30) permitiendo la incorporación de AA. En las células COS cuando se sobrexpresa de forma transitoria la iPLA2 aumentan los niveles de lisoPC pero no aumenta la incorporación del AA dentro de los PL; en estas células los niveles de lisoPC no limitan la incorporación de AA (52). Como la sobreexpresión fue transitoria, es posible que se haya alterado el metabolismo fosfolipídico (8). Parece que las células COS tienen una capacidad limitada para incorporar AA dentro de los PL, no se necesitan los lisoPL obtenidos con la sobreexpresión.

Con los resultados en COS (52), en los islotes pancreáticos (30,43) y en las células U937 (capítulo 3), se piensa que el tipo de enzima PLA2 que participa en los mecanismos de producción de lisoPL y en la remodelación de los ácidos grasos depende del tipo celular. Unos niveles mínimos de lisoPL intracelulares parece que son necesarios para mantener la incorporación de AA dentro de los PL. En células con una capacidad limitada para incorporar AA o en células con niveles excesivamente altos de lisoPL, el incremento en los niveles intracelulares de lisoPC por la sobreexpresión de la iPLA2 (43,52) o la disminución de dichos niveles por el uso de inhibidores farmacológicos (30), tendrá poco o ningún efecto en la incorporación de

AA. Al contrario, en células especializadas en el metabolismo del AA como fagocitos, la disminución (36,48) o el incremento (como en este trabajo) de los niveles de lisoPC intracelulares modificaran de forma significativa la incorporación de AA. La regulación de la incorporación de AA a través de lisoPC debe ser característica de algunos tipos de células. En algunos tipos de células existirán otros factores, además de la disponibilidad de lisoPL, que limiten la incorporación de AA.

Además del papel en las reacciones de desacilación/reacilación de ácidos grasos de los PL y en la liberación de ácidos grasos, parece que durante el daño oxidativo la iPLA2 tiene un nuevo papel. En las células U937 sobreexpresadas con la iPLA2 el porcentaje de apoptosis inducida por H2O2 es mayor que el porcentaje en las células control, también aumenta la destrucción de la membrana fosfolípidica y la liberación de ácidos grasos al medio extracelular. Estos datos parecen confirman que durante la apoptosis hay una hidrólisis de PL mediada por la iPLA2.

Si se tratan las células con MAFP, en condiciones en que la iPLA2 está completamente inhibida sigue produciéndose apoptosis inducida por H2O2; lo que indica que la actividad de la iPLA2 no es necesaria para que tenga lugar la apoptosis. En el capítulo 2 se ha visto que en un gran número de células el BEL induce apoptosis a través de una ruta mediada por la caspasa-3 sin que participe la iPLA2 (29). Un estudio de Atsumi (72) demuestra que el MAFP no impide que haya apoptosis en células tratadas con ligando de fas o con TNFα más cicloheximida, aunque el MAFP si que disminuye la apoptosis a tiempos cortos. En las células MCF7 transfectadas con caspasa-3 (73) el tratamiento con araquidonil trifluorometil cetona (inhibidor de la iPLA2) no disminuye la apoptosis causada por la luz UV (22,24).

Con los estudios mencionados se llega a la conclusión de que en ciertas condiciones la iPLA2 participa en la fase temprana de la apoptosis, aunque se puede prescindir de la enzima para que se desarrolle el proceso apoptótico. Más que un papel destructivo, la iPLA2 tiene un papel durante la hidrólisis fosfolipídica que causa el H2O2; esta hidrólisis podría servir para producir señales accesorias que se dan durante el proceso apoptótico (181,182).

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4.4. Papel de la iPLA2-VIA en la fagocitosis por macrófagos de las células U937 tratadas con H2O2

Hay evidencias de que las células fagocíticas eliminan las células apoptóticas, un proceso crítico de la homeostasis de los tejidos que comienza por la manifestación de señales de atracción sobre la superficie de las células muertas. Estas señales van a servir como marcadores para que los fagocitos puedan identificar y engullir a las células muertas gracias a otro tipo de señales, las señales eat me. Se han identificado diferentes tipos de señales eat me: moléculas que traslocan a la superficie (como PS o anexina I) (129,131,133,183,184), moléculas de la superficie que sufren modificaciones (como ICAM-3 o CD31) (185,186) y señales indirectas generadas por la interacción de componentes del suero con la superficie de las células apoptóticas (93).

En este estudio se ha encontrado que la enzima iPLA2-VIA es necesaria en las células U937 tratadas con el H2O2 (células apoptóticas) para ser reconocidas y fagocitadas por los macrófagos. Tanto la disminución como el aumento de los niveles de la iPLA2-VIA en las células apoptóticas demuestran la correlación entre la actividad de la iPLA2-VIA y el grado de fagocitosis de las células apoptóticas por los macrófagos, por eso se piensa que un producto metabólico de la iPLA2-VIA participa en este proceso. Se ha identificado este metabolito, es la lisoPC que actúa como una señal eat me para los fagocitos. Se ha descartado la posibilidad de que otra PLA2 presente en las células U937, como la cPLA2α, tenga algún efecto; además distintos trabajos sugieren que durante la apoptosis en las células U937 inducida por ligando de fas o TNFα, la cPLA2α está inactiva (71,72,182).

Pero el papel de la lisoPC como señal eat me durante la apoptosis depende de las condiciones de actividad de la iPLA2-VIA. Este papel no se aprecia en las células Jurkat ni en las células U937 cuando se usa como inductor de apoptosis TNFα, en estos casos la hidrólisis fosfolípidica es menor que si las células U937 se tratan con H2O2 (44,87). Así que parece que el papel de la lisoPC como señal eat me es importante durante la apoptosis sólo cuando la iPLA2-VIA participa en la degradación fosfolípidica. Estudios de Kim et al. (93) apoyan estos datos, ellos han demostrado que las células apoptóticas generan un epítopo de superficie que es reconocido por anticuerpos naturales IgM que provocan una activación complementaria que produce la

fagocitosis. El epítopo reconocido fue la cabeza polar de lisoPC (fosfocolina) (93). Como la unión de IgM se inhibe usando BEL, se piensa que la lisoPC es generada por una iPLA2, aunque no se determinó la identidad molecular esta enzima (93).

En células U937 apoptóticas debido al tratamiento con H2O2, como no se expresa la isoforma iPLA2 de grupo VIB, parece que es la isoforma iPLA2 de grupo VIA la encargada de la producción de lisoPC. Los estudios de fagocitosis se hicieron en ausencia total de suero eliminando la posibilidad de que algún componente del suero participe en el reconocimiento de las células apoptóticas por los macrófagos. Como la fagocitosis de las células muertas se inhibe por preincubación de los macrófagos con lisoPC parece probable que los macrófagos pueden reconocer directamente a la lisoPC. La capacidad de la lisoPC para actuar como un señal eat me directa (este estudio) o indirecta (93) depende del tipo celular y del estímulo usado.

Se puede especular sobre el mecanismo por el que la lisoPC, producida por el ataque de la iPLA2-VIA sobre la membrana fosfolipídica, consigue exponerse a la superficie celular y como los fagocitos reconocen a los lípidos. Este punto ya se ha discutido (187), y es probable que la pérdida de asimetría de la bicapa sea el principal mecanismo que provoque la exposición de la lisoPC. Esta pérdida de asimetría es un evento temprano de la apoptosis y provoca la exposición externa de los aminofosfolípidos cargados negativamente como la PS. La exposición de PS sería una primera señal eat me para los fagocitos. Se cree que un receptor de la superficie de los fagocitos reconoce a la PS que actuarían en la fagocitosis de las células muertas (129,131,133,183), este receptor se ha clonado recientemente y cuando se bloquea se suprime la fagocitosis de la célula apoptótica (129,131,133,183). Estudios más recientes han cuestionado el hecho de que el receptor de PS participe en la identificación de las células apoptóticas (188,189), Mitchell et al. (189) han demuestrado que células deficientes en dicho receptor son capaces de reconocer y fagocitar a las células apoptóticas. Un artículo reciente de Kenis et al. (190) señala que además de la PS son necesarias otras señales eat me para que ocurra la fagocitosis de las células apoptóticas.

Es posible que los receptores de los macrófagos que específicamente reconocen la lisoPC de la superficie de las células muertas actúen en la fagocitosis de dichas células o bien actúen indirectamente para promover su unión y reclutar otros receptores de señalización que

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participen en la fagocitosis. Uno de estos receptores podría ser un receptor acoplado a proteína G que está presente en los macrófagos y en otras células, el receptor G2A, que se uniría a la lisoPC con alta afinidad (191). Un trabajo más reciente en las células Jurkat no demuestra la unión de la lisoPC al G2A (192), aunque estas células sí migran cuando se expresa G2A en respuesta a lisoPC (193,194); el G2A sería capaz de responder frente a lisoPC gracias a un mecanismo indirecto en el que la lisoPC modifica un receptor u otro proceso que regula alternativamente al receptor G2A.

Aún se desconocen los mecanismos de regulación de la actividad iPLA2-VIA durante la apoptosis inducida por H2O2. Se sabe que la iPLA2-VIA controla los niveles basales de lisoPC (5,6,158); que en las células sin activar, la inhibición de la actividad iPLA2 disminuye los niveles de lisoPC (5,6,158) y que la ruptura de la iPLA2-VIA por la caspasa-3 durante la apoptosis no provoca cambios en actividad de la enzima (71,72). Teniendo en cuenta esto se puede pensar que ciertas señales apoptóticas podrían provocar que la membrana sea más susceptible al ataque de la iPLA2-VIA (87), o que una supuesta proteína reguladora de iPLA2-VIA pueda ser modificada in vivo, lo que provocaría un incremento de la hidrólisis fosfolipídica y la acumulación de lisoPC.

4.5. El bloqueo de la incorporación de AA en los fosfolípidos provoca la apoptosis de las células U937

Usando diferentes estrategias que aumentan los niveles de AA en las U937 se ha demostrado que el AA es inductor de apoptosis. Pequeñas cantidades de AA y de otros ácidos grasos en células sin activar se están continuamente generando durante el ciclo de desacilación/reacilación de los PL de membrana. En el paso de desacilación participan las PLA2 y en el caso de los fagocitos la enzima que mantiene esta actividad basal es la iPLA2-VIA (36,158,161). Se ha demostrado en otros capítulos que la transfección estable en las células U937 con el plásmido que contiene la iPLA2-VIA provoca importantes alteraciones en el metabolismo del AA.

Cuando las células transfectadas con la iPLA2-VIA se exponen al H2O2 los valores de apoptosis son más altos que en las células control sin transfectar, concretamente la población celular que sufre apoptosis es el doble. En

estas mismas condiciones, la cantidad de AA sin esterificar también aumenta.

En el capítulo 3 se comprobó que como en la mayoría de las células fagocíticas, las células U937 son capaces de incorporan AA dentro de los PL celulares. El porcentaje de apoptosis en las células U937 sobreexpresadas con la iPLA2-VIA es mínimo debido a la capacidad de las células para incorporar AA y mantener bajos los niveles del ácido. En presencia de H2O2, el AA libre se acumula ya que el oxidante activa la desacilación mediada por la PLA2 y este paso domina sobre el paso de reacilación de ácidos grasos (44,87).

La reacilación del AA en las U937 también puede explicar por qué el AA exógeno a concentraciones micromolares no es capaz de producir apoptosis. En el capítulo 5 se inhibe la reacilación de AA inhibiendo la acil-CoA sintetasa de ácidos grasos de cadena larga usando dos inhibidores, el timerosal y la triacsina C. A dosis no tóxicas para las células los dos compuestos disminuyen la incorporación de AA en los PL. Si en presencia de los inhibidores se tratan las células con AA exógeno, éstas sufren muerte por apoptosis.

Otro mecanismo para manipular los niveles de AA en las células es tratarlas con el IHP que inhibe la CoA-IT, es decir, bloquea la remodelación fosfolipídica del AA (la transferencia directa de AA de la PC a la PE), el AA se va a acumular en la PC que es el sustrato preferido de la iPLA2-VIA (36,48,53); además aumenta la hidrólisis basal de los PL aumentando el AA libre. El bloqueo de la CoA-IT disminuye los niveles de lisoPC, y provoca que la reacilación del AA se reduzca (108).

El IHP, igual que el timerosal y la triacsina C, promueve la muerte celular en presencia de AA exógeno. El porcentaje de apoptosis que provoca el IHP por sí mismo, es decir, sin AA exógeno, es mínimo probablemente porque en estas condiciones existen otras rutas metabólicas alternativas para disminuir los niveles de ácidos grasos sin esterificar. El tratamiento con IHP aumenta la acilación del AA en el TAG si se compara con las células sin tratar, parece que una parte importante del AA libre producido después de la inhibición de la CoA-IT es desviado a la ruta de novo para la biosíntesis del TAG, ruta que rara vez se usa en condiciones normales en las líneas celulares fagocíticas (46,48,147).

La concentración de AA que es capaz de inducir apoptosis al combinarse con drogas que inhiben la

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incorporación de ácidos grasos y la remodelación, es del orden micromolar (10 µM). Esta concentración probablemente se alcanza localmente in vivo durante un proceso inflamatorio y de ahí su importancia fisiopatológica. Si se usa otro ácido graso, como el ácido palmítico, éste no es capaz de producir apoptosis por sí mismo ni cuando se combina con timerosal, triacsina C o IHP (195) lo que indica que el efecto proapoptótico descrito en este estudio para el AA no es un efecto detergente.

Ninguno de los inhibidores de COX y LO son capaces de inhibir la apoptosis provocada por el AA más timerosal, demostrando que los efectos descritos anteriormente se deben al AA y no a sus metabolitos oxidados.

Aún es necesario definir los pasos moleculares que envuelven la apoptosis inducida por AA, destacar que el AA a concentraciones micromolares altera a efectores celulares y a rutas de señalización, entre ellas la producción de ceramidas que producen apoptosis (196-199). Sería interesante pensar en los mecanismos enzimáticos que producen AA libre en las células, como posibles candidatos para el diseño de drogas con potencial antitumoral (200,201).

5. CONCLUSIONES

5.1. En las células U937 tratadas con H2O2 ocurre una movilización de AA por un mecanismo independiente

de calcio en el que no participa la cPLA2 y sí la iPLA2-VIA.

5.2. El BEL provoca la muerte celular de las células U937 a través de la PAP-1 y no de la iPLA2.

5.3. La iPLA2-VIA tiene un papel importante en la incorporación del AA en los PL de las células U937 sin tratar o tratadas con H2O2.

5.4. La iPLA2-VIA participa en la hidrólisis fosfolipídica que ocurre durante la apoptosis provocada por el H2O2 pero no es necesaria para que ocurra el proceso apoptótico.

5.5. La formación de lisoPC gracias a la iPLA2-VIA en las células U937 tratadas con H2O2 para inducir apoptosis, contribuye directamente al eficiente reconocimiento por los macrófagos y su posterior fagocitosis.

5.6. Los niveles de AA libre dentro de las células podrían ser una importante señal celular para la apoptosis, y las alteraciones de los mecanismos que controlan la reacilación del AA y también la disponibilidad de AA libre, podrían ser decisivos en la supervivencia de la célula.

Esta tesis doctoral ha sido realizada gracias a la concesión de una beca de Formación de Personal Investigador del Ministerio de Ciencia y Tecnología. El trabajo realizado ha dado lugar a las publicaciones científicas indicadas en las referencias 29, 44, 195, 202-205.

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