TESIS - ciatej.repositorioinstitucional.mx · NEJAYOTE PARA LA OBTENCIÓN Y RECUPERACIÓN ... Este...
102
TESIS MAESTRO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA EN LA ESPECIALIDAD DE BIOTECNOLOGÍA PRODUCTIVA PRESENTA GUADALAJARA, JAL. FEBRERO, 2016. CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE FRACCIONES DE NEJAYOTE PARA LA OBTENCIÓN Y RECUPERACIÓN DE OLIGÓMEROS DE ARABINOXILANOS Y OTRAS MOLÉCULAS DE ALTO VALOR AGREGADO QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE I.Q. HIRAM YAVÉ GUERRERO ELIAS
Transcript of TESIS - ciatej.repositorioinstitucional.mx · NEJAYOTE PARA LA OBTENCIÓN Y RECUPERACIÓN ... Este...
TESIS
MAESTRO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA
EN LA ESPECIALIDAD DE BIOTECNOLOGÍA PRODUCTIVA
PRESENTA
GUADALAJARA, JAL. FEBRERO, 2016.
CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C.
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE FRACCIONES DE NEJAYOTE PARA LA OBTENCIÓN Y RECUPERACIÓN
DE OLIGÓMEROS DE ARABINOXILANOS Y OTRAS MOLÉCULAS DE ALTO VALOR AGREGADO
QUE PARA OBTENER EL GRADO
ACADÉMICO DE
I.Q. HIRAM YAVÉ GUERRERO ELIAS
Agradecimientos
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por el financiamiento de mi beca de
maestría.
A mis padres Fausto y Soledad, por su amor, cariño y compresión durante ésta y todas las
etapas de mi vida. A mis hermanas Isis y Kassandra, por estar siempre conmigo y por
soportarme.
A la Dra. Rosy Camacho por compartirme su experiencia en la investigación y cuya guía fue
de especial ayuda en el desarrollo del presente trabajo.
Al Dr. Jorge Rodríguez y Juan Carlos Mateos por su tiempo, sus consejos y apoyo en el
desarrollo de mi formación académica y científica.
Al Dr. Ali Assaf, del Centro de Investigación en Alimentos y Desarrollo, por sus
recomendaciones y apoyo en el desarrollo de este proyecto.
A mis compañeros de laboratorio de la unidad de Biotecnología Industrial, y de otras
unidades, con quienes aprendí mucho y viví agradables experiencias dentro y fuera del
laboratorio.
A Luisa por ser parte de mi vida en esta etapa y apoyarme en todo momento que necesitaba.
Y agradezco a Dios por permitirme vivir esta experiencia.
Resumen
Este trabajo tuvo como objetivo estudiar el efecto de enzimas sacaridasas y accesorio para
ser empleadas en la liberación de oligómeros de arabinoxilanos obtenidos del nejayote.
Como primera actividad se empleó un sistema de ultrafiltración con membranas de distintos
cortes, para generar diversas fracciones que fueron caracterizadas mediante cromatografía de
capa fina de alta resolución.
Se diseñó un medio de cultivo que contenía arabinoxilanos obtenidos del precipitado
etanólico del retenido de la membrana de 5 kDa como fuente de carbono, con la finalidad de
seleccionar hongos filamentosos aislados de residuos industriales que tuvieran la capacidad
de utilizar los arabinoxilanos del nejayote como sustrato con el fin de producir enzimas que
permitieran la liberación de oligómeros de arabinoxilanos y otras moléculas de alto valor
agregado.
Por otro lado, se utilizaron cocteles de enzimas, (los cuales se caracterizan por su uso
comercial en la sacarificación de residuos lignocelulósicos para la producción de bioetanol),
para establecer cuales y en que proporción es posible utilizarlos para la obtención de
oligómeros de arabinoxilanos y otras moléculas de alto valor agregado.
Con la finalidad de conocer el efecto de enzimas involucradas en la hidrólisis de
arabinoxilanos, se obtuvieron enzimas recombinantes que fueron utilizadas junto con
xilanasas comerciales para conocer los distintos productos que se obtienen durante la
hidrólisis de los arabinoxilanos, dichas enzimas recombinantes fueron la acetilxilanesterasa,
arabinofuranosidasa y feruloilesterasa A de Aspergillus niger.
Se realizó una cinética de hidrólisis de una fracción de arabinoxilanos de cadena larga
utilizando las enzimas recombinantes obtenidas así como también una xilanasa comercial de
Thermomyces lanuginosus (SIGMA) y un coctel comercial (CTEC-2) en distintas
combinaciones, obteniéndose diversos oligómeros de arabinoxilanos de cadena corta donde
su mayoría consistió en moléculas cuyo peso molecular fue inferior a los 1000 g/mol los
cuales posiblemente puedan ser utilizados como prebióticos. Por otro lado se generaron
también fracciones de oligómeros de cadenas medianas entre 5511 y 6091 g/mol que
puedieran tener algunas otras aplicaciones interesantes.
ii
Índice de contenido
Resumen ........................................................................................................................... i
Índice de tablas .............................................................................................................. vi
Índice de figuras ........................................................................................................... vii
1 Introducción ................................................................................................................ 1
2 Revisión bibliográfica ................................................................................................. 3
2.1 Biotecnología ........................................................................................................ 3
2.2 Microorganismos .................................................................................................. 3
2.2.1 Clasificación de los microorganismos ............................................................ 3
2.2.2 Hongos ............................................................................................................ 4
2.3 Enzimas ................................................................................................................. 6
2.3.1 Clasificación de enzimas ................................................................................. 7
2.4 Enzimas sacarificantes ......................................................................................... 8
2.4.1 Xilanasas ......................................................................................................... 9
2.4.2 Celulasas ....................................................................................................... 11
2.4.3 Enzimas “accesorio” ..................................................................................... 13
2.4.3.1 Pectinasas ................................................................................................... 13
2.4.3.2 Feruloil esterasas (FAEs) ........................................................................... 14
2.4.3.3 Acetilxilan esterasas (AXEs) ..................................................................... 17
2.4.3.4 Arabinofuranosidasas (ABFs) .................................................................... 17
2.5 Arabinoxilanos ................................................................................................... 18
2.5.1 Composición de los arabinoxilanos .............................................................. 18
2.5.2 Fuentes de arabinoxilanos ............................................................................. 20
2.5.3 Aplicaciones de arabinoxilanos .................................................................... 21
iii
3 Justificación ............................................................................................................... 22
3.1 Hipótesis .............................................................................................................. 22
3.2 Objetivos ............................................................................................................. 22
3.2.1 Objetivo general ............................................................................................ 22
3.2.2 Objetivos particulares ................................................................................... 23
4 Materiales y Métodos ................................................................................................ 24
4.1 Obtención de arabinoxilanos ............................................................................ 24
4.1.1 Generación de fracciones de nejayote ........................................................... 24
4.1.2 Caracterización cromatográfica de fracciones del nejayote .......................... 25
4.2 Microorganismos ................................................................................................ 25
4.2.1 Microorganismos utilizados para la hidrólisis de arabinoxilanos ................ 25
4.2.2 Microorganismos utilizados para la producción de enzimas recombinantes 25
4.3 Medios de cultivo ................................................................................................ 26
4.3.1 Medios de propagación de microorganismos ............................................... 26
4.3.2 Medio para la selección de hongos capaces de hidrolizar arabinoxilanos .... 26
4.3.3 Medios empleados para organismos genéticamente modificados ............... 26
4.4 Preparación de inóculos .................................................................................... 27
4.4.1 Inóculos de hongos ....................................................................................... 27
4.4.2 Inóculos de bacterias recombinantes ............................................................ 27
4.4.3 Inóculos de levaduras recombinantes ........................................................... 27
4.5 Producción de enzimas recombinantes ............................................................ 27
4.5.1 Construcción y transformación del vector de expresión pGAPZαA y pPICZαB
......................................................................................................................................... 27
4.5.2 Linealización del ADN plasmídico para transformar Pichia pastoris. ......... 28
4.5.3 Transformación de Pichia pastoris. .............................................................. 28
iv
4.5.4 Selección de clonas de Pichia pastoris ......................................................... 29
4.5.5 Producción de enzimas recombinantes ......................................................... 29
4.5.6 Producción de Feruloilesterasa tipo A de Aspergillus niger ......................... 29
4.6 Métodos analíticos .............................................................................................. 30
4.6.1 Cuantificación de la actividad sacaridasa. .................................................... 30
4.6.2 Cuantificación de la actividad esterasa (enzimas accesorio) ........................ 33
4.6.3 Cuantificación de ácido ferúlico ................................................................... 41
4.6.4 Determinación del peso molecular por cromatografía de exclusión de alta
resolución (HP-SEC) ..................................................................................................... 42
4.7 Hidrólisis enzimática de los arabinoxilanos .................................................... 42
5 Resultados y discusiones ........................................................................................... 44
5.1 Caracterización de arabinoxilanos de fracciones del nejayote ...................... 44
5.2 Selección de hongos capaces de hidrolizar arabinoxilanos ............................ 45
5.3 Selección de cocteles comerciales ...................................................................... 47
5.3.1 Liberación de ácido ferúlico ......................................................................... 47
5.3.2 Liberación de oligómeros de arabinoxilanos ................................................ 50
5.3.3 Caracterización de los cocteles enzimáticos comerciales ............................. 51
5.4 Obtención de enzimas recombinantes .............................................................. 53
5.4.1 Construcción y transformación de un vector de expresión para los genes AnAXE
y AnABF en E. coli DH10B. ......................................................................................... 53
5.4.2 Transformación y selección de clonas de Pichia pastoris ............................ 54
5.4.3 Producción de enzimas recombinantes ......................................................... 56
5.5 Hidrólisis enzimática de arabinoxilanos .......................................................... 56
6 Conclusiones .............................................................................................................. 63
7 Perspectivas ............................................................................................................... 64
v
8 Referencias bibliográficas ........................................................................................ 65
A. Anexo A ............................................................................................................. 80
A. Anexo B ............................................................................................................. 83
vi
Índice de tablas
Tabla 2.1. Hongos productores de enzimas de interés industrial .................................... 6
Tabla 2.2. Clasificación de las feruloil esterasas propuesta por Crepin y col. (2004) .. 15
Tabla 4.1. Curva estándar de ácido ferúlico para actividad feruloilesterasa ... 35
Tabla 4.2. Curva estándar de p-nitrofenol para actividad acetilxilanesterasa .. 37
Tabla 4.3. Curva estándar de p-nitrofenol para actividad arabinofuranosidasa 40
Tabla 4.4. Diseño de hidrólisis de arabinoxilanos de xilanasas y enzimas accesorio ... 43 Tabla 5.1. Hongos candidatos de la colección CIAD-CIATEJ capaces de hidrolizar los
oligómeros de arabinoxilanos presentes en el nejayote ................................................. 47
Tabla 5.2. Cocteles enzimáticos comerciales empleados para la liberación de oligómeros
de FAXX 48
Tabla 5.3. Actividades enzimáticas de mayor interés en cocteles comerciales ............ 52
vii
Índice de figruras
Figura 2.1 Clasificación de los microorganismos (Woese y Fox, 1977) ........................ 4
Figura 2.2 Principales estructuras de hongos filamentosos ............................................ 5
Figura 2.3. Diagrama de la posible estructura de un arabinoxilano de cascarilla de maíz. Las
líneas rojas son enlaces β, las líneas verdes son enlaces α y las líneas azules indican enlaces
éster ................................................................................................................................ 19
Figura 2.4. Estructura del arabinoxilano y los sitios de hidrolisis por las diferentes enzimas
......................................................................................................................................... 20
Figura 4.1. Proceso de filtración. Diagrama de tratamiento y proceso de filtración del
nejayote crudo y obtención de las fracciones del mismo ............................................... 24
Figura 4.2. Reducción del DNS con glucosa ................................................................ 30
FIGURA 4.3. Cambio de coloración del p-nitrofenol por la liberación del protón (h+) durante
la reacción de hidrólisis ................................................................................................. 33
Figura 4.4. Lector de microplacas espectrofotométrico xMarkTM (Bio-Rad) con incubadora
de temperatura y un rango de longitud de onda 200-1000 nm ...................................... 35
Figura 5.1. Caracterización cromatográfica de fracciones del nejayote. Cromatografía en
capa fina de alto rendimiento (HPTLC) de distintas fracciones de nejayote. AF: Ácido
ferúlico, G: Glucosa, X: Xilosa, A: Arabinosa, NC: Nejayote Clarificado, NCL: Nejayote
Clarificado Liofilizado, R5: Rechazo de 5kDa FAXX: Arabinoxilanos ferulados del retenido
de la membrana de 5 kDa precipitados con etanol, ETOH: Fracción etanólica del precipitado,
P5: Permeado de 5kDa ................................................................................................... 45
Figura 5.2. Cultivo en placa Petri al octavo día de crecimiento, a) Aspergillus terreus (At
17), b) Aspergillus ochraceus (Aoc), c) Trichoderma sp. (B) y d) Aspergillus sp. (N)
......................................................................................................................................... 46
Figura 5.3. Placa de HPTLC, de izquierda a derecha se muestran los estándares de glucosa
(G), xilosa (X), arabinosa (A), ácido ferúlico (AF), ácido p-cumárico (APC), ácido sinapínico
(AS), medio de cultivo a tiempo cero (to), cinética de SPBL 310 (días 2,4,6,8), cinética de
Aspergillus terreus 102 (días 2,4,6,8) y cinética de Aspergillus terreus 17 (días 2,4,6,8)
viii
......................................................................................................................................... 46
Figura 5.4. Ensayos de hidrólisis sobre fracciones de nejayote para la liberación de
ácido ferúlico. a) Nejayote clarificado, b) fracción del retenido de 5 kDa, c) fracción del
permeado de 5 kDa. A: Shearzyme, B: Viscozyme, C: Ultrazyme, D: Pectinex, E: Celluclast,
F: Filtrase NLC, G: Cellubrix, H: Rapidase UF, I: Rapidase TF, J: Celluzyme BL, K:
Celluzyme XB, L: Depol 740, M: HTEC 2, N: CTEC 2, HQ: hidrólisis química ........ 49
Figura 5.5 Cromatografía en capa fina de alto rendimiento de distintas fracciones e
hidrolizados de nejayote. F: Ácido ferúlico, S: Ácido sinapínico, pC: Ácido p-cumárico,
1:Blanco 25 °C, 2:Blanco 40 °C, 3:Muestra tratada con Pectinex, 4:Muestra tratada con
Depol 740L, 5:FAXX (sin CTEC 2), 6:Fracción etanólica de precipitación de FAXX (sin
CTEC 2), 7:FAXX (con CTEC 2), 8:Fracción etanólica de precipitación de FAXX (con
CTEC 2), G: Glucosa, X: Xilosa, A: Arabinosa. ‘Duplicado de la muestra .................. 51
Figura 5.6. Gel de electroforesis de los cocteles más interesantes. Gel SDS-PAGE de
poliacrilamida al 12% que contiene 30 µg de proteína en cada carril, revelado con una
solución de azul de Coomasie al 0.25% y decolorado con una solución 5X de ácido acético.
MP: marcador de peso molecular, C: Ultrazyme, D: Pectinex, J: Celluzyme BL, L: Depol
740L, M: HTEC 2, N: CTEC 2 ...................................................................................... 52
Figura 5.7. Digestión de las construcciones para la arabinofuranosidasa y
acetilxilanesterasa de Aspergillus niger en los vectores pGAPZαA y pPICZαB. Gel de
agarosa al 1% en buffer TAE utilizando Gel Red como agente revelador a 25 nL/mL de gel
que contiene, aproximadamente en cada carril excepto el primero, 100 ng de la digestión de
las construcciones de AnAXE y AnABF en los vectores pGAPZαA y pPICZαB utilizando
las enzimas de restricción EcoRI y KpnI. MP: marcador de peso molecular, 1: construcción
AnAXE+ pGAPZαA, 2: construcción AnAXE+ pPICZαB, 3: construcción AnABF+
pGAPZαA, 4: construcción AnABF+ pPICZαB. La escala señala el tamaño en pares de bases
......................................................................................................................................... 54
Figura 5.8. Linearización de las construcciones para la arabinofuranosidasa y
acetilxilanesterasa de Aspergillus niger en los vectores pGAPZαA y pPICZαB. Gel de
agarosa al 1% en buffer TAE utilizando Gel Red como agente revelador a 25 nL/mL de gel
que contiene, aproximadamente en cada carril excepto el primero, 100 ng de la digestión de
ix
las construcciones de AnAXE y AnABF utilizando las enzimas de restricción BspHI para los
que tienen el vector pGAPZαA y PmeI para los que tienen el pPICZαB. MP: marcador de
peso molecular,1: construcción AnAXE+ pGAPZαA, 2: construcción AnAXE+ pPICZαB,
3: construcción AnABF+ pGAPZαA, 4: construcción AnABF+ pPICZαB. La escala señala
el tamaño en pares de bases ........................................................................................... 55
Figura 5.9 Cinética de actividad enzimática para las enzimas acetilxilanesterasa y
arabinofuranosidasa recombinantes de Aspergillus niger. a) Cinética de actividad
acetilxilanesterasa, las líneas azules representan AnAXE en pGAPZαA y las líneas rojas
AnAXE en pPICZαB, b) Cinética de actividad arabinofuranosidasa las líneas verdes
representan AnABF en pGAPZαA y las líneas naranjas AnABF en pPICZαB ............ 56
Figura 5.10 Distribución de tamaños de los FAXX sometidos a hidrólisis espontánea
por efecto de la temperatura. Las barras azules corresponden al tiempo inicial y las rojas a
las 48 horas de incubación a 40 °C ................................................................................ 57
Figura 5.11 Distribución de tamaños de muestras sometidas a tratamiento de hidrólisis
con CTEC y arabinofuranosidasa. Las barras azules indican la distribución a tiempo
inicial, las rojas a las 24 horas y las verdes a las 48 horas ............................................. 57
Figura 5.12 Distribución de tamaños de muestras sometidas a tratamiento de hidrólisis
con CTEC, arabinofuranosidasa y acetilxilanesterasa. Las barras azules indican la
distribución de tamaños a tiempo inicial, las rojas a las 24 horas y las verdes a las 48 horas
de hidrólisis .................................................................................................................... 58
Figura 5.13 Distribución de tamaños de muestras con tratamiento de hidrólisis con
xilanasa de Thermomyces lanuginosus y arabinofuranosidasa. Las barras azules indican
la distribución de tamaños a tiempo inicial, las rojas a las 24 horas y las verdes a las 48 horas
......................................................................................................................................... 59
Figura 5.14 Distribución de tamaños de muestras con tratamiento de hidrólisis con
CTEC y arabinofuranosidasa desfasada. Las barras azules indican la distribución de
tamaños de los carbohidratos a tiempo inicial, las rojas indican la distribución de tamaños de
los carbohidratos después de una hidrolisis de 24 horas y las verdes a las 48 horas
......................................................................................................................................... 59
x
Figura 5.15 Distribución de tamaños de los polisacáridos de muestras sometidas a
tratamiento de hidrólisis con CTEC y feruloilesterasa desfasada. Las barras azules
indican la distribución a tiempo inicial, las rojas a las 24 horas y las verdes a las 48 horas
......................................................................................................................................... 60
Figura 5.16 Distribución de tamaños de los polisacáridos contenidos en muestras
sometidas a tratamiento de hidrólisis con CTEC en conjunto con arabinofuranosidasa
y acetilxilanesterasa desfasada. Las barras azules indican la distribución a tiempo inicial,
las rojas a las 24 horas y las verdes a las 48 horas ......................................................... 61
Figura 5.17 Distribución de tamaños de los polisacáridos contenidos en muestras
sometidas a tratamiento de hidrólisis con CTEC en conjunto con acetilxilanesterasa y
feruloilesterasa desfasada. Las barras azules indican la distribución a tiempo inicial, las
rojas a las 24 horas y las verdes a las 48 horas .............................................................. 61
Figura 5.18 Distribución de tamaños de los polisacáridos contenidos en muestras
sometidas a tratamiento de hidrólisis desfasada con xilanasa de Thermomyces
lanuginosus, arabinofuranosidasa, acetilxilanesterasa y feruloilesterasa. Las barras
azules indican la distribución a tiempo inicial, las rojas a las 24 horas y las verdes a las 48
horas ............................................................................................................................... 62
xi
1
1 Introducción
En México, el maíz (Zea mays ssp. mays) forma parte de nuestra alimentación diaria, es el
cultivo de mayor presencia en el país, constituye un insumo para la ganadería y para la obtención
de numerosos productos industriales, por lo que, desde el punto de vista alimentario, económico,
político y social, es el cultivo agrícola más importante (Polanco y Flores 2008, SIAP 2008).
Una de las principales formas de consumo del maíz es como tortilla, un alimento producido a
nivel del hogar y a nivel industrial, utilizando una cocción del grano de maíz con hidróxido de
calcio en forma de cal. Este proceso se conoce en la actualidad como proceso de nixtamalización
(Bressani, 1990; Serna-Saldívar et al., 1990) y consiste básicamente en una operación de
cocción alcalina y una de remojo y lavado del grano cocido.
Del proceso de nixtamalización se obtienen dos fracciones, una es el grano ya lavado que
continuara su procesamiento hasta la producción de una masa que se convertirá en tortillas, y la
otra que es el agua alcalina de desecho llamada nejayote, que proviene del náhuatl nextli que
significa “cenizas de cal” y áyoh “caldo o cosa aguada”.
El nejayote es un subproducto altamente contaminante debido a que tiene las siguientes
características:
• Contiene altas concentraciones de materia orgánica en suspensión y disuelta (5 a 50 g/L) lo
que ocasiona una alta demanda bioquímica de oxígeno (DBO) de 7000 a 10000 mg O2/L.
• Sale del proceso a temperaturas entre 60 a 80 º C.
• Tiene un pH cercano al límite máximo de alcalinidad (10 a 14).
Teniendo en cuenta que se generan entre 16 y 22 millones de m3 al año de este residuo se le
considera un grave problema para el medio ambiente (Domínguez et al., 2003).
Por las características de su proceso de obtención es un recurso que, se considera, tiene una
composición compleja formada por carbohidratos solubles, proteínas, cal, vitaminas y
fitoquímicos ricos en carotenoides y compuestos fenólicos como el ácido ferúlico y el p-
2
cumárico, los cuales pueden ser aprovechados generando productos de interés con alto valor
agregado. El ácido ferúlico, tiene numerosas aplicaciones en las industrias cosmética,
alimentaria y de complementos alimenticios. Por ejemplo: como precursor de la vainillina (un
saborizante ampliamente utilizado y de alto valor comercial), como matriz para el análisis de
proteínas por espectrometría de masas, antiinflamatorio, antimicrobiano y antioxidante. El ácido
ferúlico puede ser recuperado del nejayote por diversos procesos, entre los que se encuentra la
hidrólisis química. Sin embargo el uso de álcalis o ácidos ha demostrado que se puede llegar a
degradar parte del ácido ferúlico, además los polisacáridos y oligosacáridos se hidrolizan hasta
monómeros de xilosa, arabinosa, entre otros en menor proporción. Una estrategia alterna puede
ser el uso de enzimas como las sacaridasas (celulasas, endoxilanasas, exo-xilanasas y
arabinofuranosidasas) y las carbohidrato-esterasas (como son las feruloilesterasas y
acetilxilanesterasas), para poder recuperar no solo el ácido ferúlico, sino también otras
moléculas que pueden tener aplicaciones tecnológicas y/o funcionales interesantes; como los
oligómeros de arabinoxilanos los cuales consisten en cadenas de xilosa que pueden ser utilizados
como aditivos en matrices alimenticias actuando como agentes gelificantes, emulsificantes, etc.;
además de que pueden tener uso farmacéutico ya que se ha encontrado que son útiles en el
tratamiento de diversos padecimientos tales como desórdenes alimenticios, la hipertensión,
diabetes tipo II, hipercolesterolemia e incluso en casos de cáncer (Grant, 1979; Hadjivassiliou,
2003; Reddy, 2000; Gebruers, 2008, Cao, 2010).
Podemos encontrar cocteles comerciales con las actividades hidrolasas deseadas. Sin embargo,
es importante explorar enzimas que lleven a cabo la hidrólisis del nejayote, por lo que tal vez
los cocteles comerciales por sí solos no sean suficientes y deban ser enriquecidos con aquellas
enzimas que permitan recuperar de manera más eficiente las moléculas interesantes como los
oligómeros de arabinoxilanos.
3
2 Revisión bibliográfica
2.1 Biotecnología
La biotecnología consiste en el uso de microorganismos o pate de ellos para la obtención de
productos de gran interés haciendo uso de diversas herramientas como la ingeniería de proteínas,
la manipulación genética, etc.
En las últimas décadas la biotecnología se ha convertido en una herramienta importante debido
a su amplió campo de aplicación y al hecho de que se pueden obtener productos que no se podían
de manera convencional, todo esto ha traído beneficios económicos y ambientales, lo que se ha
visto reflejado en el mejoramiento de la calidad de productos, así como procesos con costos
reducidos y ambientalmente sustentables, ya que algunos de ellos utilizan recursos renovables
para producir una amplia gama de compuestos mediante procesos de baja energía (Ulber y Sell,
2007).
2.2 Microorganismos
Desde la antigüedad, los seres humanos han aprovechado los productos metabólicos de algunos
microorganismos. El aprovechamiento de los microorganismos ha sido bastante amplio desde
la elaboración de alimentos como el pan, vino, cerveza, vinagre, quesos, entre otros, hasta la
producción de solventes, ácidos orgánicos, vitaminas, enzimas, antibióticos y otros productos.
Con los avances logrados en la ingeniería genética se ha logrado el mejoramiento de cepas así
como también la manipulación genética para mejorar la obtención de ciertos productos mediante
la sobreexpresión de ciertos genes mediante la tecnología del ADN recombinante.
2.2.1 Clasificación de los microorganismos
En 1977 Carl Woese ideó un sistema de clasificación basado en la organización celular de los
organismos. En este sistema todos los organismos se clasifican en tres dominios: Archaea,
Bacteria y Eukarya (Woese y Fox, 1977) (Figura 2.1). Archaea y Bacteria se componen de
células procariotas pequeñísimas que carecen de orgánulos como núcleos, mitocondrias y
cloroplastos. Eukarya contiene organismos con células eucarióticas que poseen la colección
completa de orgánulos (Audesirk y col., 2003).
4
Figura 2.1 Clasificación de los microorganismos (Woese y Fox, 1977).
2.2.2 Hongos
Los hongos presentan un conjunto de características propias que permiten su diferenciación de
las plantas: no sintetizan clorofila, no tienen celulosa en su pared celular, excepto algunos
hongos acuáticos y no almacenan almidón como sustancia de reserva. Los hongos son seres
vivos eucarióticos, con un solo núcleo, como las levaduras, o multinucleados, como se observa
entre los hongos filamentosos.
Pueden desarrollarse formando colonias de tipo levaduriformes o filamentosas. Los hongos
filamentosos son pluricelulares, forman estructuras con un elevado nivel de complejidad y
organización de sus hifas y presentan una morfología característica; constituyen las
denominadas setas (Pastor, 2006); sus células son alargadas, con una anchura de 3 a 15 µm de
diámetro y de longitud variable. Crecen por extensión apical, tabicándose para formar nuevas
células que no se desprenden. Los filamentos celulares así constituidos se denominan hifas y
van ramificándose con frecuencia hasta formar un conjunto entrelazado de hifas que se
denomina micelio.
Los hongos filamentosos pueden clasificarse en superiores e inferiores. En los superiores, las
hifas son delgadas (2-5 µm) y las células fúngicas que las forman están separadas entre sí por
tabiques provistos de un poro que permiten el intercambio de material citoplasmático entre
5
células contiguas. Forman esporas (conidias) directamente en las hifas o en estructuras
específicas llamadas conidióforos, constituyendo esporas externas (ver Figura 2.2). En los
hongos inferiores las hifas son más anchas (10-15 µm) y no están tabicadas, por lo que las
células forman un conjunto cenocítico con múltiples núcleos y un citoplasma único; las esporas,
denominadas esporangioesporas, se forman en el interior de estructuras saculares, llamadas
esporangios (esporas internas).
Figura 2.2 Principales estructuras de hongos filamentosos
Cuando los hongos filamentosos crecen en un medio de cultivo sólido, una parte del micelio
penetra en el medio para absorber nutrientes (micelio vegetativo), mientras que el micelio aéreo
se proyecta hacia el exterior, dando lugar a matas de apariencia tenaz, algodonosa o
pulverulenta, características de las colonias de los hongos filamentosos, que son fácilmente
diferenciables de las colonias de las levaduras (Pastor, 2006).
Los hongos tienen un rol importante en la biotecnología. Este tipo de microorganismos pueden
producir una gran variedad de compuestos orgánicos complejos con altos rendimientos, como
los antibióticos, los alcoholes, los ácidos orgánicos, los pigmentos, las enzimas, entre otros (Punt
y col., 2002).
En particular, el uso de enzimas fúngicas comenzó en el año de 1900, con el desarrollo de un
proceso para producir, a partir de Aspergillus oryzae, la takadiasa, que es una mezcla de amilasas
y proteasas utilizada como ayuda digestiva. Posteriormente, en 1955, se llevó a cabo el primer
6
escalamiento industrial, con la producción de glucoamilasa a partir de Aspergillus oryzae o
Rhizopus sp. El principal desarrollo con enzimas fúngicas se dio en los años sesentas con la
incorporación de proteasas en los detergentes (Hernández y col., 2003). De ahí en adelante, se
ha profundizado más en los estudios de las etapas de producción, recuperación y purificación
de las enzimas de hongos filamentosos. Algunos ejemplos de hongos productores de enzimas se
muestran en la Tabla 2.1.
Tabla 2.1. Hongos productores de enzimas de interés industrial
Hongo Enzima Referencia
Rhizopus oligosporus Proteasa (Ikasari y Mitchell, 1996)
Aspergillus parasiticus Proteasa (Tunga y col., 2003)
Aspergillus niger Lipasa (Kamini y col., 1998)
Rhizopus homothallicus Lipasa (Mateos Diaz y col., 2006)
Aspergillus ficcum Fitasa (Ebune y col., 1995)
Aspergillus niger Fitasa (Mandviwala y Khire, 2000)
Aspergillus oryzae Amilasa (Ramachandran y col., 2004)
Aspergillus niger Feruloilesterasa (Donaghy y McKay, 1995)
Aspergillus carbonarius Pectinasa (Singh y col., 1999)
Aspergillus fumigatus Xilanasa (Soni y col., 2010)
Neurospora crassa Celulasa (Romero y col., 1999)
2.3 Enzimas
Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica o ribonucleica que funcionan como
catalizadores biológicos y que tienen diversas aplicaciones desde el metabolismo para la
supervivencia de los seres vivos hasta fines médicos y comerciales, actúan acelerando la
formación del equilibrio químico en una reacción pero sin afectar las concentraciones finales de
las especies químicas involucradas. Se dice que las enzimas son específicas para cada sustrato
sobre el que actúan, sin embargo se ha observado que no siempre es así y que pueden actuar
sobre distintos sustratos.
7
2.3.1 Clasificación de las enzimas
Las enzimas se clasifican en seis grupos diferentes, dependiendo del tipo de reacción que pueden
catalizar (Mathews y col., 2002):
• EC 1. Oxidorreductasas: catalizan reacciones de oxidorreducción. Precisan la
colaboración de las coenzimas de oxidorreducción (NAD+, NADP+, FAD) que aceptan
o ceden electrones correspondientes.
• EC 2. Transferasas: promueven transferencias de distintos grupos químicos. Suelen
actuar en procesos de interconversión de monosacáridos, aminoácidos, etc.
• EC 3. Hidrolasas: llevan a cabo la ruptura de enlaces químicos con la introducción de
una molécula de agua.
• EC 4. Liasas: catalizan eliminaciones de un grupo o adiciones de un grupo a un doble
enlace, u otras rupturas que implican un reordenamiento electrónico.
• EC 5. Isomerasas: catalizan las isomerizaciones de distintos compuestos. Suelen actuar
en procesos de interconversión.
• EC 6. Ligasas: promueven la unión de dos moléculas por mediación de ATP o de un
compuesto similar.
De estas enzimas, las hidrolasas son de las de mayor aplicación en la industria, pues en la
actualidad, representan casi el 80% de las ventas generadas en el mercado mundial de enzimas,
las cuales son empleadas principalmente como enzimas de grado técnico, o como enzimas para
alimentos (Thakore, 2005). El grupo de las hidrolasas está constituido por una amplia gama de
enzimas, algunas de ellas, son capaces de romper los enlaces principales que constituyen a los
residuos agroindustriales.
La producción de enzimas ha tenido mucho auge en las últimas décadas. Se ha estudiado la
producción de diversas enzimas de interés biotecnológico haciendo uso de residuos
agroindustriales tales como (Bhargav, 2008; Topakas y col., 2007):
• Proteasas, utilizando salvado de arroz y de trigo, cascarilla de arroz, de frijol y de lentejas,
pasta de coco y de ajonjolí, etc.
8
• Lipasas, utilizando pasta de ajonjolí y de oliva, harina de almendra, de mostaza y de coco,
cascarilla de arroz, bagazo de caña, salvado de trigo y de arroz, etc.
• Fitasas, utilizando residuos de canola, pasta de coco, de ajonjolí, de maní y de oliva, torta
de algodón, de palma y de mostaza, salvado de trigo, harina de frijol negro, etc.
• Amilasas, utilizando salvado de trigo, de maíz y de arroz, cascarilla de frijol, harina de
cebada, etc.
• Celulasas, utilizando residuos de plátano, paja de arroz y de trigo, residuos de maíz,
cascarilla de arroz, etc.
• Xilanasas, utilizando paja y salvado de diferentes cereales, bagazo de caña y de yuca,
residuos del procesamiento de diversas frutas, etc.
• Pectinasas, utilizando salvado de trigo, de soja, pulpa de manzana y de remolacha, orujo de
oliva y de fresa, pulpa de café, cascarilla de cacao, cáscara de limón y naranja, etc.
• Feruloil esterasas, utilizando salvado de trigo y de maíz, pulpa de remolacha azucarera, paja
de trigo, bagazo de caña, mazorcas de maíz, etc.
2.4 Enzimas sacarificantes
Las sacaridasas son un conjunto de enzimas hidrolasas que se encargan de hidrolizar cadenas
de oligosacáridos y polisacáridos para convertirlos en carbohidratos más simples por lo cual han
sido utilizadas para la sacarificación de distintos residuos como cascarilla de maíz, residuos de
café, desechos de plátano, bagazo de naranja, rastrojo de maíz, entre otros (Faulds et al., 1995,
Fan et al., 2000, Reddy et al., 2003, Martins et al., 2002, Panagiotou et al 2003) para así obtener
productos de interés biotecnológico.
9
2.4.1 Xilanasas
La hemicelulosa es el segundo biopolímero más abundante en la naturaleza (Terrasan y col.,
2010). Debido a su compleja estructura se requiere de la acción de varias enzimas, como son las
endo-1,4-β- xilanasas y β-D-xilosidasas que hidrolizan la cadena de xilano, además de un
conjunto de enzimas accesorio.
Endo-1,4-β-xilanasas:
Las endo-1,4-β-xilanasas (1,4-β-D-xilan xilanohidrolasa, EC 3.2.1.8) rompen los enlaces
glucosídicos del xilano, logrando una reducción en el grado de polimerización del sustrato. El
xilano es hidrolizado de acuerdo con la naturaleza molecular del sustrato; es decir, la longitud
de la cadena, el grado de ramificación, y la presencia de sustituyentes. Inicialmente, el principal
producto de la hidrólisis son oligómeros de β-D-xilopiranosa, los cuales pueden ser llevados a
pequeñas moléculas como mono-, di- y trisacáridos de β-D-xilopiranosa (Polizeli y col., 2005).
Las endoxilanasas han sido clasificadas de muchas maneras. Wong y col. (1988) las clasificaron
en dos tipos, de acuerdo a los productos finales de la reacción: las que no actúan en las
ramificaciones, es decir no hidrolizan el 1-3-α-L-arabinofuranosil de los arabinoxilanos y por
tanto no liberan arabinosa; y las enzimas que actúan en las ramificaciones, liberando arabinosas.
En general las endoxilanasas muestran actividades óptimas entre temperaturas de 40 y 80 °C, y
entre pH de 4.0 y 6.5, pero se han encontrado xilanasas con condiciones óptimas fuera de estos
rangos (Polizeli y col., 2005).
β-D-xilosidasas:
Las β-D-xilosidasas (1,4-β-D-xilan xilohidrolasa, EC 3.2.1.37) pueden ser clasificadas de
acuerdo a su afinidad relativa por la xilobiosa y los xilo-oligosacáridos (Polizeli y col., 2005).
Las xilobiasas y las exo-1,4-β-xilanasas pueden ser reconocidas como enzimas diferentes, según
lo propuesto por Biely (1985), pero son comúnmente clasificadas como xilosidasas, que
hidrolizan pequeños xilo-oligosacáridos y xilobiosa, liberando los residuos de β-D-xilopiranosa
10
de la terminal no reductora. Las β-xilosidasas purificadas usualmente no son capaces de
hidrolizar xilano, su mejor sustrato es la xilobiosa y su afinidad por los xilo-oligosacáridos es
inversamente proporcional a su grado de polimerización. Estas enzimas son capaces de
hidrolizar sustratos sintéticos como el p-nitrofenil-β-D-xilopiranosido. Un importante papel que
se ha atribuido a las β-xilosidasas es que entran en juego después de que el xilano ha sufrido
una serie de hidrólisis sucesivas por las endoxilanasas. Esta reacción conduce a la acumulación
de pequeños oligómeros de β-D-xilopiranosa, los cuales pueden inhibir a la endoxilanasa. La β-
xilosidasa entonces hidroliza esos productos, removiendo la causa de la inhibición, e
incrementando la eficiencia de la hidrólisis del xilano (Andrade y col., 2004; Zanoelo y col.,
2004). Generalmente, estas proteínas tienen un PM entre 60 y 360 kDa; y actúan en un rango de
pH óptimo entre 4.0 y 5.0. Los óptimos de temperatura pueden variar desde los 40 hasta los 80
ºC, aunque la mayoría de las β-xilosidasas presentan su actividad óptima alrededor de 60 ºC
(Polizeli y col., 2005).
En general, las xilanasas son producidas principalmente por los microorganismos que forman
parte de la biodegradación de la estructura celular de las plantas, en sinergia con otras enzimas
que hidrolizan polisacáridos (Polizeli y col., 2005). Entre las fuentes microbianas, los hongos
filamentosos son especialmente interesantes ya que secretan estas enzimas en el medio y sus
niveles de xilanasas son mucho más altos que los encontrados en levaduras y bacterias (Polizeli
y col., 2005).
Las xilanasas tienen importantes aplicaciones en la industria debido a su enorme potencial para
modificar y transformar la hemicelulosa contenida en la estructura celular vegetal de la biomasa
utilizada como materia prima en un gran número de procesos industriales. El xilano está presente
en grandes cantidades en los desechos de las industrias agroalimentarias, por lo que las xilanasas
juegan un papel importante en la bioconversión de estos residuos (ricos en hemicelulosa) a
xilosa y otros azúcares fermentables para la producción de etanol (Lee, 1997; St John y col.,
2006; Sun y Cheng, 2002).
11
2.4.2 Celulasas
Las celulasas son enzimas que hidrolizan los enlaces β-1,4-glicosidicos de la celulosa cuyos
productos principales son la glucosa, celobiosa y los celo-oligosacáridos. Estas enzimas son
comúnmente estudiadas como un complejo multi-enzimático, que comprende a las endo-
glucanasas, celobiohidrolasas y β-glucosidasas (Singhania y col., 2010).
Endo-1,4-β-glucanasas:
Las endo-1,4-β-glucanasas (EC 3.1.2.4) rompen los enlaces glicosídicos internos de la celulosa
en forma aleatoria, lo que provoca una rápida disminución en la longitud de la cadena de los β-
glucanos con un incremento lento de los grupos reductores (Wood T y Mc, 1979). Las
endoglucanasas son clasificadas en familias de acuerdo a sus propiedades hidrofóbicas
(Henrissat y col., 1989) y su dominio catalítico (Gilkes y col., 1991). Sus sustratos incluyen a
la carboximetilcelulosa y a la celulosa amorfa tratada con H3PO4 o álcali. La celulosa cristalina,
así como las fibras de algodón o el avicel no son atacados de manera efectiva por esta enzima.
El porcentaje de hidrólisis de celo-oligosacáridos de cadenas largas es alto y se incrementa con
el grado de polimerización, siendo la celobiosa el principal producto de la reacción (Wood y
Bhat, 1988).
β-glucosidasas:
Las β-glucosidasas (EC 3.2.1.21) completan la hidrólisis de cadenas pequeñas de celo-
oligosacáridos y de celobiosa, liberados por otras enzimas, hasta glucosa. Los sistemas
celulolíticos con niveles bajos de β-glucosidasa tienen una baja actividad, debido a la inhibición
de endoglucanasas y las celobiohidrolasas por la celobiosa. Estas enzimas hidrolizan
únicamente celo-oligosacáridos a una razón decreciente con el grado de polimerización y no son
específicas para enlaces β-1,4 (Felix y Ljungdahl, 1993; Wood y Bhat, 1988).
12
Exo-1,4-β-glucanasas:
Las exo-1,4-β-glucanasas (EC 3.1.2.91), también llamadas celobiohidrolasas, actúan cortando
la celobiosa del extremo no reductor de la cadena y en algunas ocasiones liberan pequeñas
cantidades de glucosa. El porcentaje de hidrólisis de la celobiosa y de celo-oligosacáridos de
cadenas largas se incrementa con el grado de polimerización de las mismas (Felix y Ljungdahl,
1993; Warren, 1996; Wood y Bhat, 1988).
Las celulasas tienen importantes aplicaciones en la industria debido a su enorme potencial para
llevar a cabo la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica, en sinergia con otras enzimas
lignocelulolíticas.
Las celulasas se han convertido en el tercer grupo más importante de enzimas usadas en la
industria textil en las últimas décadas; juegan un papel muy importante en el desteñido de
mezclilla ya que se usan para remover el color azul índigo y dar una apariencia de
desteñido/deslavado que anteriormente se hacía con piedras pómez. Por otra parte, se utilizan
como aditivos en detergentes quita pelusas, las enzimas degradan las microfibrillas que se
separan parcialmente de las fibras principales, restituyendo a las fibras una superficie suave y a
la prenda su color original (Belghith y col., 2001).
Dentro de la industria alimentaria, las celulasas se usan para favorecer la extracción y filtración
de jugos de frutas o verduras, en la producción de néctares y purés, en la filtración de mostos,
en la extracción de aceites comestibles, etc. Son utilizadas también para mejorar los procesos
de extracción de pigmentos naturales utilizados en alimentos. Asimismo, se usan en la hidrólisis
parcial de materiales lignocelulósicos para mejorar la digestión de rumiantes (Beauchemin y
col., 1995; Cinar, 2005; Galante y col., 1998; Graham y Balnave, 1995; Pajunen, 1986).
En la industria papelera, las celulasas se han empleado junto con xilanasas durante el biopulpeo
de fibras, en la eliminación de toner, tintas y recubrimientos de las fibras recicladas, así como
en la fabricación de papel suave como toallas de papel y papel sanitario (Akhtar, 1994; Franks
y col., 1996; Pere y col., 1996; Yang y col., 2004).
Una aplicación potencial de las celulasas es la conversión de materiales celulósicos, como los
13
residuos agroindustriales, en glucosa y otros azúcares fermentables, que puedan ser utilizados
como sustratos microbianos para la producción de una gran variedad de productos de
fermentación, como el etanol (Singhania y col., 2010; Sukumaran y col., 2005).
2.4.3 Enzimas “accesorio”
Además de las sacaridasas existen otras enzimas que se pueden usar como enzimas “accesorio”
las cuales pueden venir incluidas en cantidades pequeñas en cocteles enzimáticos comerciales y
que ayudan a las sacaridasas a hidrolizar de manera más eficiente un sustrato de interés.
2.4.3.1 Pectinasas
La pectina es una fina capa de material extracelular adhesivo que se encuentra entre las paredes
de las células vegetales. Las enzimas que hidrolizan la pectina son ampliamente conocidas como
pectinasas; y son auxiliares en la hidrólisis de biomasa lignocelulósica (Blanco y col., 1999).
Las enzimas que hidrolizan las sustancias pécticas son conocidas como pectinasas, enzimas
pécticas o enzimas pectinolíticas. Estas se clasifican en tres grupos principales (Kashyap y col.,
2001), como se describe a continuación:
Pectin esterasas:
Las pectin esterasas (EC 3.1.1.11), también conocidas como pectinmetil hidrolasas catalizan la
desesterificación de los grupos metoxilo de los residuos de ácido galacturónico de las pectinas,
dando lugar a pectatos y a metanol.
Depolimerasas:
Las depolimerasas actúan sobre la cadena principal de la pectina. Se dividen en
poligalacturonasas, enzimas que hidrolizan los enlaces β-1,4-glicosídicos en el ácido péctico; y
liasas, enzimas que rompen los enlaces β-1,4-glicosídicos por transeliminación produciendo
14
galacturónidos con un enlace insaturado entre el C4 y el C5 del extremo no reductor del ácido
galacturónico formado. Además, estas enzimas se clasifican de acuerdo a su modo de acción: si
es al azar (endo-) o terminal (exo-).
Protopectinasas:
Protopectina es el término utilizado para describir las sustancias pécticas insolubles en agua
encontradas en los tejidos vegetales y de las cuales se forman las sustancias pécticas solubles.
Las protopectinasas son enzimas que solubilizan la protopectina. Se clasifican en dos tipos. El
tipo A degrada el ácido poligalacturónico de la protopectina mientras que el tipo B degrada las
cadenas de polisacáridos que conectan el ácido poligalacturónico con otros constituyentes de la
pared celular (Soriano, 2004).
Las pectinasas tienen importantes aplicaciones en los procesos industriales, tales como el
procesamiento de fibras textiles, en la fermentación del café y del té, en el tratamiento de aguas
residuales que contienen materiales pectinolíticos (Hoondal y col., 2002). Con el incremento en
el conocimiento del mecanismo de microorganismos degradadores de pectina y sus enzimas
pectinolíticas, las pectinasas se abrieron paso en varios otros procesos biotecnológicos, tales
como la purificación de virus de las plantas (Salazar y Jayasinghe, 1999), y la fabricación de
papel (Reid y Ricard, 2000; Viikari y col., 2001).
2.4.3.2 Feruloil esterasas (FAEs)
Las feruloil esterasas (FAEs) (EC 3.1.1.73), también conocidas como ácido ferúlico esterasas,
ácido cinámico esterasas, o cinamoil esterasas, actúan en sinergia con xilanasas para hidrolizar
el enlace éster de ácidos ferúlico, diferúlico y otros ácidos cinámicos de la estructura celular de
las plantas, por lo tanto, tienen un papel importante en la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica
(Benoit y col., 2008; Benoit y col., 2006; Topakas y col., 2007).
Las feruloil esterasas fueron clasificadas inicialmente en dos grupos de acuerdo a su mecanismo
15
de inducción y su especificidad por sustrato (Kroon y col., 1996): las FAE Tipo-A, aquellas que
son inducibles por xilano y prefieren los grupos metoxi del anillo fenólico; y las FAE Tipo-B,
aquellas que son inducibles por la pulpa de remolacha y prefieren los grupos hidroxilo. Faulds
y col. (2003) propusieron una nomenclatura en la cual asignan las primeras dos letras al nombre
de los microorganismos productores de esa esterasa, seguida de “FAE” para indicar que es una
enzima con actividad feruloil esterasa, y luego una letra para designar el sub-tipo propuesto,
basado en su actividad frente a los ésteres metílicos de ácido ferúlico (MFA), sinápico (MSA),
cafeico (MCA) y p-cumárico (MpCA). Posteriormente, con la publicación de las secuencias
genómicas de las proteínas, Crepin y col. (2004) clasificaron a las FAEs en cuatro tipos putativos
(A-D) propuestos en base a su homología de secuencia, su especificidad por los ésteres metílicos
de ácidos hidroxicinámicos (MFA, MSA, MCA y MpCA), su capacidad para liberar el ácido
5,5- diferúlico de sustratos complejos, y su inducción por diferentes materiales de la pared
celular de las plantas (Tabla 2.2). Recientemente, Benoit y col. (2008) propusieron una nueva
clasificación basada en el análisis filogenético de los genomas conocidos de hongos, con siete
subfamilias propuestas, pero que contiene sólo tres tipos caracterizados bioquímicamente (A, B
y C), excluyendo las esterasas clasificadas como de Tipo D (Crepin y col., 2004).
Tabla 2.2. Clasificación de las feruloil esterasas propuesta por Crepin y col. (2004).
Parámetro Tipo A Tipo B Tipo C Tipo D
Ejemplo Aspergillus
niger FAEA
Penicillium funiculosum FAEB, Neurospora crassa
FAE-1
Aspergillus niger FAEB,
Talaromyces stipitatus FaeC
Pen. Equi EstA, Pseudomonas Fluorescens
XYLD
Medio preferencial de inducción
Salvado de trigo Pulpa de remolacha Pulpa de remolacha-
salvado de trigo
Salvado de trigo
Hidrólisis de metil ésteres
MFA, MSA, MpCA MFA, MpCA, MCA MFA, MSA,
MpCA, MCA MFA, MSA, MpCA, MCA
Liberación de ácido ferúlico Si (5-5’ ) No No Si (5-5’ )
Similitud de secuencia Lipasa Acetilxilanesterasa Clorogenatoesterasa,
tanasa Xilanasa
MFA: metil ferulato; MSA: metil sinapato; MpCA: metil p-cumarato; MCA: metil cafeato.
Las FAEs actúan como enzimas accesorio en la hidrólisis de biomasa lignocelulósica, debido a
16
su capacidad para hidrolizar los enlaces éster existentes entre los compuestos fenólicos y los
polisacáridos, facilitando el acceso de otras hidrolasas a la estructura principal de la pared
celular de las plantas. Esta característica hace que tengan un alto potencial para ser utilizadas en
diversos procesos industriales, tales como la obtención de fibras de alta calidad, proceso en el
cual se utilizan en sinergia con otras enzimas para desprender la lignina de la matriz de celulosa
y hemicelulosa proporcionando un efecto de brillo a las fibras y permitiendo además recuperar
compuestos fenólicos de interés (Record y col., 2003; Sigoillot y col., 2005; Tapin y col., 2006).
Estos compuestos fenólicos como el ácido ferúlico, p-cumárico, cafeico y sinapico, poseen
diversas aplicaciones en la industria alimentaria, cosmetológica y farmacéutica (Kroon y
Williamson, 1999).
Particularmente, el ácido ferúlico posee diversas propiedades biológicas, como protector de
rayos UV, agente anti-oxidante (Kikuzaki y col., 2002) y anti-inflamatorio (Murakami y col.,
2002). Además, el ácido ferúlico es también de gran interés económico, ya que es un precursor
de vainillina (Negishi y col., 2009), el componente principal del sabor de la vainilla.
Otra de las aplicaciones de las FAEs que se ha venido estudiando en las últimas décadas es su
uso como enzima accesorio en la sacarificación de la biomasa lignocelulósica para la producción
de bioetanol a partir de residuos lignocelulósicos (Tabka y col., 2006).
Por otra parte, el uso de las FAEs en biocatálisis es muy interesante, puesto que estas enzimas
son capaces de modificar ácidos hidroxicinámicos para su uso en productos con propiedades
antioxidantes, ya que estos compuestos son parcialmente solubles en medios acuosos, lo que
hace necesario esterificarlos para formar derivados lipofílicos. Se han reportado el uso de
mezclas orgánicas-acuosas (Topakas y col., 2003; Topakas y col., 2005; Vafiadi y col., 2006) o
microemulsiones de aceite en agua (Giuliani y col., 2001) como sistemas de reacción para la
esterificación o transesterificación de varios ácidos cinámicos catalizados por FAEs.
2.4.3.3 Acetilxilan esterasas (AXEs)
17
Las acetilxilanesterasas (EC 3.1.1.72), remueven los grupos o-acetilo de las posiciones 2 y/o 3
en los residuos de β-D-xilopiranosa del xilano acetilado. Estas enzimas desempeñan un
importante rol en la hidrólisis del xilano, ya que los grupos acetilo pueden interferir en el acceso
de las enzimas a la estructura principal de la molécula, por impedimento estérico, y su
eliminación facilita la acción de las endoxilanasas (Polizeli y col., 2005).
2.4.3.4 Arabinofuranosidasas (ABFs)
Las arabinasas remueven los residuos de L-arabinosa que están unidos en la posición 2 y 3 a los
residuos de β-D-xilopiranosa de la cadena de xilano, éstas al igual que las acetilxilanesterasas
tienen su importancia en la liberación de arabinosa que puede ser un impedimento para que
actúen las endo-xilanasas al momento de hidrolizar la estructura principal (Polizeli y col., 2005).
Las arabinasas pueden ser clasificadas como:
α-L-Arabinofuranosidasas:
Éstas son más bien inespecíficas y remueven residuos de arabinosa unidos por enlaces α-1,2-,
α-1,3- y α-1,5- de diversos sustratos, entre ellos los arabinanos laterales de las pectinas, es decir,
es capaz de hidrolizar arabinanos ramificados. La mayoría de las arabinasas encontradas
pertenecen a éste tipo (Polizeli y col., 2005).
Endo-arabinasas:
Hidrolizan en forma aleatoria las uniones α-1,5 de los arabinanos, potenciando la acción de las
arabinofuranosidasas, éstas enzimas tienen una preferencia por los arabinanos lineales (de Vries
y col., 2000; Kaneko y col., 1993).
Arabinoxilanohidrolasa:
18
Se encargan de liberar los residuos de arabinosa que se encuentran unidos a xilosa, es una
enzima involucrada en la degradación de la hemicelulosa.
Las arabinofuranosidasas se utilizan en la industria vitivinícola para la liberación de terpenos,
que son una serie de componentes que le dan su aroma característico a los vinos.
2.5 Arabinoxilanos
Los arabinoxilanos (AX) son el polisacárido no almidonoso más abundante de la pared celular
de algunos cereales, constituyendo de un 65 al 70% en las paredes del endospermo y en una
menor concentración en algunas harinas de hasta un aproximado de 1.5-2.5%. Son clasificados
en dos grupos según sus propiedades fisicoquímicas: 20-30% de los arabinoxilanos son
extraíbles con agua (WE-AX), mientras los restantes 70-80% son no extraíbles en agua (WU-
AX), pero una fracción de estos puede ser después solubilizada por trabajo mecánico o
tratamiento enzimático. A pesar de que los arabinoxilanos son un constituyente menor de los
cereales, por sus propiedades fisicoquímicas únicas, afectan en gran medida las características
de los productos donde se les puede encontrar como en los de panificación (Dornez y col., 2007).
Cuando los arabinoxilanos no extraíbles en agua son tratados con bases, los enlaces entre las
moléculas de arabinoxilano se rompen. Una gran parte de las moléculas de los WU-AX se libera
de la pared celular y se convierte en AX solubles en agua (AS-AX), a esto se le conoce como
solubilización alcalina. Un tratamiento de los WU-AX con endoxilanasas también resulta en la
solubilización, con la generación de AX solubilizados por enzimas (ES-AX). Mientras que el
peso molecular de cada AX de los AS-AX permanece inalterado, los ES-AX tienen pesos
moleculares menores por la hidrólisis del esqueleto de xilano.
2.5.1 Composición de los arabinoxilanos
A pesar de que los AX pueden ser divididos en dos fracciones, poseen una estructura general.
Los AX están formados por una cadena principal de residuos de D-xilopiranosil unido por
enlaces β-1,4. Cada residuo de xilosa puede estar sustituido en la posición C (O)-2 y/o en la
19
posición C (O)-3 con residuos de α-L-arabinofuranosil, así como también puede contener
residuos D-glucopiranosil, D-galactopiranosil y grupos acetilo. La mayoría de las cadenas
laterales consisten en un solo residuo de arabinofuranosil. El ácido ferúlico, es otra molécula
que puede estar presente, sin embargo, ésta no se une directamente a la estructura principal de
xilano sino que se une mediante un enlace éster al C(O)5 de los residuos de arabinosa, puede
formar enlaces éster y éter, siendo clave en la unión de los AX con otras macromoléculas de la
pared celular (Dornez, 2007; Courtin y Delcour, 2002). Se sabe que las unidades de ácido
ferúlico pueden formar dehidrodimeros con los ferúlicos adyacentes y en ese sentido puede
entrecruzar las moléculas de arabinoxilanos (Figura 2.3) (Ralph et al., 1994)
Figura 2.3. Diagrama de la posible estructura de un arabinoxilano de cascarilla de maíz. Las líneas rojas
son enlaces β, las líneas verdes son enlaces α y las líneas azules indican enlaces éster.
Un parámetro importante para el comportamiento de los AX es la relación arabinosa/xilosa
(A/X), cuyo valor típico ronda de 0.5 a 0.6 para la población general de WE-AX en el trigo pero
valores de 0.31 a 1.06 para las subfracciones WE-AX. En algunas ocasiones se han reportado
arabinosas poliméricas como cadenas laterales y la posibilidad de cadenas laterales de xilosas
también ha sido mencionada. Los sustituyentes no se encuentran siempre distribuidos de la
misma manera sobre la cadena de xilano. Se considera que los WE-AX poseen dos regiones
alternantes. En las regiones fuertemente ramificadas, que constituye cerca de tres cuartas partes
de las moléculas del AX, 3 de 7 residuos de xilosa son sustituidos, con un alto nivel de
20
disustitución. Cada 20 o 25 residuos las regiones fuertemente ramificadas son alternadas con
regiones abiertas, pudiendo contener arriba de cinco o más residuos de xilosa no sustituidos
consecutivamente (Courtin y Delcour, 2002).
Los arabinoxilanos pueden ser hidrolizados a distintos oligómeros dependiendo de las enzimas
que actúen sobre ellos como se muestra en la figura 2.4, lo cual puede repercutir en la actividad
o aplicación que pueden tener como se detalla en el apartado 2.5.3.
Figura 2.4. Estructura del arabinoxilano y los sitios de hidrolisis por las diferentes enzimas.
2.5.2 Fuentes de arabinoxilanos
Los arabinoxilanos son considerados como uno de los mayores componentes de la fibra dietética
de muchos cereales incluidos el trigo, arroz, avena, cebada, centeno y sorgo (Ebringerova et al,
2005; Fincher and Stone, 1986). Entre estos diferentes cereales se pueden encontrar los
arabinoxilanos los cuales han sido cuantificados en el grano entero, alcanzando hasta 12% del
peso total, y en la cascarilla, hasta 30%, (Izydorczyk & Biliaderis, 2007).
Un ejemplo de fuente es el salvado de maíz éste consiste principalmente de aleurona y capas de
pericarpio del grano del maíz. El almidón residual tras la producción de harina de maíz puede
contribuir un 20-25% de la materia seca del salvado de maíz después de haber sido molido
(Saha and Bothast, 1999). El salvado de maíz tiene relativamente poco contenido de lignina y
21
un alto contenido de arabinoxilanos (Saha et al., 1998, Lapierre et al., 2001, Agger et al., 2010)
comparado con otras partes del maíz. Además del almidón residual, se puede tener proteína la
cual está asociada al endospermo presente durante el procesamiento industrial del salvado
(Agger et al., 2010).
Debido a la creciente popularidad del aprovechamiento de residuos agroindustriales, otra fuente
de arabinoxilanos proviene de un subproducto de la industria de la nixtamalización conocido
como nejayote, que consiste en la solución alcalina residual de dicho proceso, la cual debido al
tratamiento dado al maíz permite una mayor solubilización de los polisacáridos presentes en el
pericarpio permitiendo una mayor recuperación de los mismos (Niño-Medina et al., 2009).
2.5.3 Aplicaciones de arabinoxilanos
Los arabinoxilanos al ser parte de la fibra dietética han sido aplicados para el tratamiento de
desórdenes alimenticios (Lu et al, 2004), también pueden ser utilizados como aditivos
alimenticios adicionando características como la capacidad antioxidante (Reis, 2013; Fuentes-
Alventosa 2009) así como propiedades tecnológicas como espesantes, gelificantes y
emulsificantes en diversas matrices alimenticias (Yadav, 2007; Carvajal-Millan 2006).
Dentro de sus aplicaciones en el campo farmacéutico se ha reportado que reducen el riesgo de
hipercolesterolemia e hipertensión, así como también el riesgo de cáncer de pecho,
enfermedades de la vesícula, diabetes tipo II y también como antitumoral e inmunoregulador
(Grant, 1979; Hadjivassiliou, 2003; Reddy, 2000; Gebruers, 2008, Cao, 2010).
22
3 Justificación
En México se generan, anualmente, entre 16 y 22 millones de m3 al año de nejayote al cual se
le considera un grave problema para el medio ambiente (Domínguez et al., 2003) debido a las
condiciones extremas (alta temperatura y pH así como DBO) a las cuales es desechado por la
industria de la nixtamalización.
Sin embargo, se ha encontrado que en la composición de éste subproducto existen diversas
moléculas, entre los que destacan oligómeros de arabinoxilanos y compuestos fenólicos, que
pueden ser recuperadas y generadas a partir de la hidrólisis de los polisacáridos presentes en el
nejayote y que, a su vez, es posible aprovecharlas para distintos fines ya que presentan diversas
propiedades tanto tecnológicas como funcionales.
Es debido a lo anterior, que la contribución de éste trabajo consistirá en explorar enzimas que
permitan el aprovechamiento del nejayote para la recuperación de moléculas que puedan tener
alto valor agregado a partir de la hidrólisis de los polisacáridos presentes en este subproducto.
3.1 Hipótesis
El uso racional de sacaridasas como las celulasas, xilanasas y arabinofuranosidasas combinado
con carbohidrato-esterasas, como las feruloilesterasas y las acetilxilanesterasas; permitirá la
hidrólisis de fracciones de nejayote, que incrementará la generación de oligómeros de
arabinoxilanos y otras moléculas de alto valor agregado.
3.2 Objetivos
3.2.1 Objetivo general
Explorar enzimas comerciales y de hongos filamentosos, nativos de residuos lignocelulósicos,
que permitan la hidrólisis de arabinoxilanos de nejayote para la generación de moléculas de
alto valor agregado.
23
3.2.2 Objetivos particulares
1) Conocer la composición de diferentes fracciones de nejayote obtenidas por filtración, para
identificar cual de ellas puede utilizarse para la producción de moléculas de alto valor agregado.
2) Buscar y seleccionar carbohidrato-esterasas empleando hongos filamentosos aislados de
residuos lignocelulósicos de la industria.
3) Caracterizar cocteles enzimáticos capaces de generar oligómeros de arabinoxilanos de nejayote
4) Estudiar la capacidad hidrolítica de los cocteles enzimáticos para incrementar la
generación de oligómeros de arabinoxilanos y otras moléculas de alto valor agregado
5) Conocer los perfiles de los hidrolizados de arabinoxilanos.
24
4 Materiales y Métodos
En esta sección se detallan los materiales y las metodologías que se proponen para cumplir con
los objetivos propuestos en este trabajo. En primer lugar, se aborda la obtención de los
arabinoxilanos provenientes del nejayote el cual es separado en distintas fracciones.
Posteriormente, la búsqueda de hongos capaces de hidrolizar los arabinoxilanos los cuales
cuentan con actividad enzimática reportada en trabajos anteriores que puede estar involucrada
en dicha hidrólisis. Y finalmente, se hará énfasis en la hidrólisis racional de arabinoxilanos
utilizando distintas enzimas para tratar de entender cuál es su impacto en la hidrólisis de los
arabinoxilanos. Así mismo se detallan los métodos analíticos correspondientes a la
cuantificación de actividad y caracterización de hidrolizados.
4.1 Obtención de arabinoxilanos
4.1.1 Generación de fracciones de nejayote
Las distintas fracciones de nejayote con que se puede trabajar son obtenidas mediante un sistema
de filtración (Assaf 2014) que implica membranas de ultrafiltración (5kDa), nanofiltración (200
Da) y osmosis inversa (Figura 4.1).
Figura 4.1. Proceso de filtración. Diagrama de tratamiento y proceso de filtración del nejayote crudo y
obtención de las fracciones del mismo.
25
4.1.2 Caracterización cromatográfica de fracciones del nejayote
La caracterización de los arabinoxilanos presentes en el nejayote se llevó a cabo mediante
cromatografía en capa fina de alto rendimiento realizada en placas aminadas migradas con una
fase móvil compuesta de n-butanol/metanol/agua/ácido acético (50:25:20:1), fijada a 180º C
durante 20 min y revelada con una solución de etanol/ácido sulfúrico/anisaldehido (18:1:1) y
calentamiento a 120º C por 10 min.
4.2 Microorganismos
4.2.1 Microorganismos utilizados para la hidrólisis de arabinoxilanos
Para la selección de hongos capaces de hidrolizar los arabinoxilanos se emplearon 35 cepas de
hongos filamentosos provenientes de una colección conjunta del Dr. Juan Carlos Mateos Díaz
y Dr. Jorge Alberto Rodríguez González (Laboratorio de Biotecnología Industrial, CIATEJ) y
Dr. Jesús Alí Assaf Torres (Laboratorio de Biotecnología Industrial, CIAD), los cuales han sido
previamente aislados de diversos materiales lignocelulósicos como bagazo de caña, pulpa de
café, jugo de agave, entre otros, y que pudieran estar provistos de las herramientas enzimáticas
que lleven a cabo la hidrólisis de los arabinoxilanos. Las cepas fueron conservadas en medio
PDA a 4 ºC.
4.2.2 Microorganismos utilizados para la producción de enzimas recombinantes
La cepa DH10B de Escherichia coli se utilizó para la generación de plásmidos recombinantes
conteniendo los genes de interés. Para la generación de grandes volúmenes de los plásmidos de
expresión para P. pastoris (pGAPZαA y pPICZαB), se empleó el resguardo en la línea celular
DH10B a partir de crioviales almacenados a -82 °C con 15% de glicerol. Las cepas se
conservaron en glicerol al 15% a -82 °C.
La cepa SMD1168H de Pichia pastoris fue empleada como sistema de expresión de las enzimas
recombinantes, la cual fue transformada por electroporación con las construcciones con los
genes de las enzimas acetilxilanesterasa (AnAXE) y arabinofuranosidasa (AnABF) de A. niger.
Las cepas fueron conservadas en agar inclinado con medio YPD a 4 ºC, y en glicerol al 50 %.
26
4.3 Medios de cultivo
4.3.1 Medios de propagación de microorganismos
Medio de propagación de bacterias: El medio de propagación de bacterias utilizado fue el medio
LB-LS (bajo en sales), que se compone de (g/L): triptona (DIFCO), 10; extracto de levadura
(DIFCO), 5; NaCl (SIGMA), 10; pH 7.5.
Medio de propagación de levaduras: El medio de propagación de levaduras utilizado fue el
medio YPD, que se compone de (g/L): extracto de levadura (DIFCO), 10; peptona (DIFCO),
20; dextrosa (SIGMA), 20; pH 6.8.
Medio de propagación de hongos: El medio de propagación para hongos empleado fue PDA
(BIOXON), el cual fue preparado a 39 g/L con 100 mg/L de cloranfenicol (SIGMA), pH 6.5.
4.3.2 Medio para la selección de hongos capaces de hidrolizar arabinoxilanos
El medio utilizado consiste en un medio mínimo mineral cuya composición es (g/L): fosfato
dibásico de potasio (SIGMA), 5; sulfato de magnesio (SIGMA), 1; urea (SIGMA), 4; agar
(SIGMA), 20; como fuente de carbono se empleará el precipitado etanólico (arabinoxilanos)
liofilizado de la fracción de nejayote del retenido de la membrana de 5 kDa a 20 g/L, pH 6.5.
4.3.3 Medios empleados para organismos genéticamente modificados
Medio selectivo de bacterias transformadas: la selección de transformantes se realizó en medio
LB-LS-Zeocina conteniendo (g/L): Triptona (DIFCO), 10; extracto de levadura (DIFCO), 5;
NaCl (SIGMA), 5; pH 7.5 y 25 µg/mL de zeocina
Medio selectivo de levaduras transformadas: la selección de transformantes se realizó en medio
YPDS-Zeocina conteniendo (g/L): Bacto peptona (DIFCO), 20; Extracto de levadura (DIFCO),
10; Glucosa (SIGMA), 20; Sorbitol (SIGMA), 128; Agar (BIOXON), 20; y Zeocina
(INVITROGEN) 100 µg/mL.
27
4.4 Preparación de inóculos
4.4.1 Inóculos de hongos
Se inocularon cajas Petri que contenían PDA por picadura, a partir de los cultivos conservados
en viales. Se incubaron las cajas durante 5-7 días.
4.4.2 Inóculos de bacterias recombinntes
La cepa DH10B de Escherichia coli fue empleada para la generación de plásmidos
recombinantes con los genes de interés, la cual fue crecida en medio LB-LS con zeocina a 37
°C de 14 a 24 horas.
4.4.3 Inóculos de levaduras recombinantes
La cepas SMD1168H de Pichia pastoris transformadas con el gen de interés se cultivaron en
medio YPD con zeocina a 30 °C de 24-36 horas.
4.5 Producción de enzimas recombinantes
4.5.1 Construcción y transformación del vector de expresión pGAPZαA y pPICZαB
Los genes de las AnAXE y AnABF (sintetizados en plásmido pUC57 por Genscript) fueron
aislados por PCR empleando la polimerasa Q5 Hot Start (New Englans Biolabs) usando los
iniciadores hacia adelante f3AnAXE (5´- GGT GAA TTC GCC TCC GGT TCA TTG C-3´) y
f4AnAXE (5’- GGT GAA TTC GCC TCC GGT TCA TTG CAA CAG GTT ACA G -3’) con
los iniciadores reverso r2AnAXE (3’- CCG GGT ACC TTA GGC GAA ACC GAA CCA CTC
CAT GTC -5’) para construcciones en los vectores pGAPZαA y pPICZαB. Por otra parte se
empleó el iniciador hacia adelante f3AnABF (5´-GGT GAA TTC GCC ATT TCC CTT AAA
GT-3´) y el iniciador reverso r2AnABF(3´-CCG GGT ACC TTA GTT GGC GGC AAG GAC
GGC GAC A-5´) para construcciones en los vectores pGAPZαA y pPICZαB, todos ellos
incluyendo los sitios de restricción de acuerdo al mapa de clonación EcoR1 y Kpn1 en el
extremo 5´y 3´, respectivamente. El producto de PCR fue extraído con una solución de fenol-
cloroformo y precipitado con etanol (SIGMA) a -20 ºC y acetato de sodio (SIGMA) 3M pH 5.7;
28
posteriormente se realizó un lavado con etanol al 70% (V/V) para su concentración. Los vectores
pGAPZαA y pPICZαB previamente purificados (kit Promega miniprep) y los productos de
amplificación fueron sometidos a doble digestión con las enzimas EcoR1 y Kpn1 (New England
Biolabs); los productos digeridos fueron purificados a partir de gel de agarosa al 0.9%
empleando el kit SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). La ligación se llevó a cabo
empleando la ligasa T4 DNA (New England Biolabs) durante toda la noche a 16 °C. El producto
de ligación fue empleado para transformar E. coli DH10B por electroporación y las
transformantes fueron seleccionadas a partir de placas de agar LB-LS-Zeocina. Durante todo el
proceso los productos de PCR y transformaciones fueron verificados en geles de agarosa al 0.8%
empleando Gel Red como agente revelador.
4.5.2 Linealización del ADN plasmídico para transformar Pichia pastoris.
Se tomaron de 5-10 µg del ADN conteniendo el inserto en el vector pGAPZαA o pPICZαB, los
cuales fueron linealizados empleando la enzima de restricción BspHI (New England Biolabs)
en el caso de aquellos que contenían el plásmido pGAPZαA y PmeI (New England Bioabs) en
el caso de pPICZαB; posteriormente se concentraron hasta 0.9-1 µg/µL mediante SpeedVac
(Thermo Scientific) a una temperatura media durante 10 min.
4.5.3 Transformación de Pichia pastoris.
Se tomaron 10 µg del ADN linealizado y concentrado conteniendo el inserto que fueron
mezclados con 80 µL de células competentes y transferidas a una celda de electroporación
(BioRad) de 0.2 cm previamente reposada en baño de hielo. La mezcla fue reposada durante 5
min en la celda en hielo y posteriormente se pulsó en un electroporador (Bio Rad MicroPulser)
e inmediatamente después se agregó 1 mL de Sorbitol 1M estéril frio a la celda y se incubó
durante una hora a 30 °C para recuperación de las células. Finalmente, se extendieron 200 µL
de la mezcla de células y sorbitol en placas de YPDS+Zeocina, las cuales se incubaron a 30 °C
durante 5 Días. Las trasformaciones fueron corroboradas mediante amplificación del inserto por
PCR (verity) empleando los iniciadores hacia adelante fpGAP (5´-GTC CCT ATT TCA ATC
AAT TGA A-3´), que se emplea para el plásmido pGAP, y fAOX1 (5´-GAC TGG TTC CAA
TTG ACA AGC-3´), que se emplea para el plásmido pPIC, y el iniciador reverso rAOXI (5´-
GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCC-3´) que se emplean para ambos plásmidos.
29
4.5.4 Selección de clonas de Pichia pastoris
La selección de clonas se llevó a cabo una vez que se obtuvieron colonias aisladas en el medio
YPDS+Zeocina, se tomaron de 3-5 colonias y se cultivaron durante 48 h a 30 °C y 250 rpm
(New Brunswick) en 5 mL de medio líquido YPD+Zeocina. Posteriormente, se analizó la
actividad enzimática en microplaca empleando el sustrato indicado para la actividad a
cuantificar; la colonia con mayor hidrólisis detectada fue seleccionada para su resguardo en
glicerol a 50% a -82 °C e identificación de expresión a pequeña escala.
4.5.5 Producción de enzimas recombinantes
Se siguió una cinética de fermentación para la producción de enzimas en matraces de 250 mL
con bafles conteniendo 50 mL de medio YPD, para el caso de las cepas que contenían el
plásmido pGAPZαA, y 50 mL de medio YP con metanol al 0.8%, para el caso de las cepas que
contenían el plásmido pPICZαB.
Posteriormente se realizó la producción de enzimas en matraces de 1 L con bafles conteniendo
200 mL del medio correspondiente a la expresión constitutiva (pGAP) o por inducción (pPIC)
en el cual se expresaron con mayor actividad.
4.5.6 Producción de Feruloilesterasa tipo A de Aspergillus niger
La obtención de la feruloilesterasa A de Aspergillus niger se realizó, en el equipo de trabajo de
CIAETJ, basándose en el método de Record et. al 2003 con ligeras modificaciones. La
transformación de A. niger permitió la sobreexpresión de ésta enzima obteniendo la mayor
actividad a las 48 horas.
30
4.6 Métodos analíticos
4.6.1 Cuantificación de la actividad sacaridasa.
En cuanto a la actividad sacaridasa se midieron tres actividades: celulasa, xilanasa y pectinasa,
se utilizó un ensayo indirecto en el que los productos de reacción fueron detectados
espectrofotométricamente mediante el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), el cual se
basa en la reducción del DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azúcar reductor al ácido
3-amino-5-nitrosalicílico (de color rojo marrón) (Chaplin y Kennedy, 1986), cuya presencia
puede detectarse por lectura de la absorbancia en la zona de 540-570 nm (Figura 4.2).
Figura 4.2. Reducción del DNS con glucosa
Preparación de reactivos:
Solución A: Tampón de acetatos 100 mM, pH 4.6: Se prepararon 500 mL de solución de acetato
de sodio (SIGMA) 100 mM en agua destilada. Se ajustó el pH a 4.6 con una solución de ácido
acético (SIGMA) 100 mM y se conservó en refrigeración a 4 ºC.
Solución B: Reactivo DNS (Miller, 1959): Se diluyeron en 250 mL de agua destilada 500 mg
de fenol (SIGMA), 125 mg de Na2SO3 (SIGMA) y 2.5 g de NaOH (SIGMA) a 40 ºC. Los
reactivos fueron agregados poco a poco manteniendo una agitación constante, 2.5 g de ácido
3,5-dinitrosalicílico (SIGMA), hasta que el reactivo se disolvió completamente. Se conservó en
un recipiente ámbar a 4 ºC.
31
Sustrato:
a) Solución de carboximetilcelulosa (CMC) al 1%: 500 mg de carboximetilcelulosa de baja
viscosidad (SIGMA) fueron disueltos en 50 mL de tampón de acetatos 100 mM (pH 4.6)
a 80 ºC. Esta solución se utilizó como sustrato en las reacciones enzimáticas para la
determinación de actividad celulasa. La solución se conservó en refrigeración a 4 ºC.
b) Solución de xilano al 1%: 500 mg de xilano de haya (SIGMA) fueron disueltos en 50
mL de tampón de acetatos 100 mM (pH 4.6) a 80 ºC. Esta solución se utilizó como
sustrato en las reacciones enzimáticas para la determinación de actividad xilanasa. La
solución se conservó en refrigeración a 4 ºC.
c) Solución de pectina cítrica al 1%: 500 mg de pectina cítrica (SIGMA) fueron disueltos
en 50 mL de tampón de acetatos 100 mM (pH 4.6) a 80 ºC. Esta solución se utilizó como
sustrato en las reacciones enzimáticas para la determinación de actividad pectinasa. La
solución se conservó en refrigeración a 4 ºC
Soluciones estándar:
a) Solución de glucosa al 2%: 200 mg de glucosa (SIGMA) fueron disueltos en un volumen
de 10 mL con tampón de acetatos 100 mM (pH 4.6). Esta solución se utilizó para realizar
la curva estándar que relaciona la concentración de glucosa con la absorbancia, para la
determinación de actividad celulasa y actividad pectinasa. Se hicieron alícuotas de 1 mL
y se almacenaron en congelación a -20 °C.
b) Solución de xilosa al 2%: 200 mg de xilosa (SIGMA) fueron disueltos en un volumen de
10 mL con tampón de acetatos 100 mM (pH 4.6). Esta solución se utilizó para realizar
la curva estándar que relaciona la concentración de xilosa con la absorbancia, para la
determinación de actividad xilanasa. Se hicieron alícuotas de 1 mL y se almacenaron en
congelación a -20 °C.
32
Hidrólisis enzimática:
En microtubos Eppendorf de 1.5 mL se colocaron 50 µL de la solución sustrato correspondiente
para cada actividad (CMC para actividad celulasa, xilano para actividad xilanasa y pectina para
actividad pectinasa), y se adicionaron 50 µL de extracto enzimático diluido convenientemente
en tampón de acetatos 100mM (pH 4.6). La mezcla se incubó durante 30 min en un baño a
temperatura controlada de 50 °C, después se le añadieron 100 µL de reactivo de DNS, se colocó
en agua en ebullición durante cinco min y se colocó en hielo por otros cinco min, se agregaron
300 µL de agua destilada y se colocaron 200 µL de la mezcla final en una microplaca de 96
pozos y se leyó a 540 nm en un lector para microplacas xMarkTM (Bio-Rad). El ensayo se realizó
por duplicado y se colocó un blanco para cada muestra, el cual consistió en incubar la solución
sustrato por 30 min, y posteriormente le fueron añadidos 100 µL de reactivo DNS y 50 µL del
extracto enzimático para cuantificar los azúcares reductores iniciales presentes en los sustratos.
Preparación de las curvas estándar de glucosa y xilosa:
Se prepararon diluciones a partir de la solución estándar de glucosa, en tampón de acetatos 100
mM (pH 4.6), correspondientes a concentraciones de 0 a 2 g/L, en microtubos Eppendorf de 1.5
mL. Se hizo lo mismo con la solución estándar de xilosa. Para el desarrollo de color se siguió el
mismo procedimiento que en el caso de los ensayos de hidrólisis enzimática. Las curvas se
hicieron por triplicado cada vez que se realizó la cuantificación de actividad enzimática de las
muestras.
Cálculo de la actividad enzimática:
Para calcular la actividad enzimática se obtuvo una ecuación que relaciona la concentración con
la absorbancia, (Figura A.1 y A.2, Anexo A), a partir de las curva estándar de glucosa para la
actividad celulasa y pectinasa, y a partir de la curva estándar de xilosa para la actividad xilanasa.
Para determinar la actividad enzimática en Unidades por mL de enzima (U/mL), se aplicó la
siguiente ecuación:
33
Uml =
(∆DO/m)(0.1)(FD)(30)(0.05)
En donde:
∆DO = Absorbanciadelareacciónenzimáticamenoslaabsorbanciadelblanco
m = Pendiente de la curva estándar (DO ∙ 𝜇𝑚𝑜𝑙FG ∙ 𝑚𝐿FG)
FD = Factor de dilución de la enzima
0.1 = Volumen de reacción (mL)
30 = Tiempo del ensayo (min)
0.05 = Volumen del extracto enzimático (mL)
4.6.2 Cuantificación de la actividad esterasa (enzimas accesorio)
Cuantificación de la actividad feruloil esterasa
La actividad feruloil esterasa fue determinada de acuerdo a un método rápido de búsqueda y
selección reportado por Ramírez y col. (2008) con ligeras modificaciones, este método consiste
en la medición de la liberación del ácido hidroxicinámico proveniente de la hidrólisis enzimática
de ésteres de ácidos hidroxicinámicos, utilizando p-nitrofenol como indicador de pH. La
desaparición de color de amarillo puede medirse por lectura de la absorbancia a una longitud
de onda de 410 nm (Figura 4.3).
Figura 4.3. Cambio de coloración del p-nitrofenol por la liberación del protón (H+) durante la
reacción de hidrólisis.
34
Preparación de reactivos:
a) Tampón MOPS 2.5 mM, pH 7.2: Se pesaron 289 mg de MOPS (SIGMA) y se agregaron
450 mL de agua destilada. Se ajustó el pH a 7.2, con NaOH 100 mM, y finalmente se
ajustó el volumen a 500 mL con agua destilada. El tampón se conservó en refrigeración
a 4 ºC.
b) Solución de p-nitrofenol 10 mM: Se pesaron 13.9 mg de p-nitrofenol (SIGMA) que
fueron disueltos en 10 mL de tert-butanol, el cual se conservó en un frasco ámbar y en
congelación a -20 ºC.
c) Solución estándar de ácido ferúlico 100 mM: Se pesaron 194.18 mg de ácido ferúlico
(SIGMA) que fueron disueltos en 10 mL de tert-butanol, la solución fue conservada en
un frasco ámbar y en congelación a -20 ºC.
d) Solución sustrato: Se prepararon 10 mL de una solución de metil ferulato a una
concentración de 100 mM, para lo que se pesaron 208.21 mg de metil ferulato (SIGMA),
que se disolvió en tert-butanol (SIGMA). La solución fue conservada en frascos ámbar
y en congelación a -20 ºC.
Hidrólisis enzimática:
Al momento de realizar el ensayo, se preparó una solución sustrato-indicador disolviendo, en
vortex, 500 µL de sustrato 100 mM y 500 µL de p-nitrofenol 10 mM, en 9 mL de tampón
MOPS 2.5 mM, pH 7.2. En una microplaca de 96 pozos se colocaron 20 µL de extracto
enzimático, diluido convenientemente en tampón MOPS 2.5 mM (pH 7.2). Se agregaron 100
µL de la solución sustrato-indicador, utilizando una pipeta multicanal, y se incubó
inmediatamente en un lector para microplacas xMarkTM (Bio-Rad) (Figura 4.4) a 35 °C,
tomando lecturas de absorbancia cada 30 segundos a una longitud de onda de 410 nm, con
agitación orbital (intensidad media) de 5 segundos antes de cada lectura. Se agregó un blanco
para cada muestra con el extracto enzimático desnaturalizado.
35
Figura 4.4. Lector de microplacas espectrofotométrico xMarkTM (Bio-Rad) con incubadora de temperatura y un rango de longitud de onda 200-1000 nm.
Preparación de la curva estándar de ácido ferúlico:
Se prepararon dos mezclas, en vortex, agregando 100 µL de la solución de ácido ferúlico y 100
µL de p-nitrofenol 10 mM separadamente, en 900 µL de tampón MOPS 2.5 mM, pH 7.2. 120
µL de cada dilución fueron colocados cada pozo de la microplaca de 96 pozos y se leyó a una
longitud de onda de 410 nm en el lector de microplacas xMarkTM (Bio-Rad). Cada punto de la
curva se realizó por triplicado utilizando las proporciones mostradas en la tabla 4.1.
Tabla 4.1. Curva estándar de ácido ferúlico para actividad feruloilesterasa
Ácido ferúlico 100 mM p-nitrofenol 10 mM
0 120
5 115 10 110
15 105 20 100
30 90
40 80 50 70
40 60
36
Expresión de los resultados en unidades de actividad feruloil esterasa:
Se obtuvo la ecuación que relaciona la concentración con la absorbancia, a partir de la curva
estándar de ácido ferúlico (Figura A.3, Anexo). Para determinar la actividad enzimática en
Unidades por mL de enzima (U/mL), se aplicó la siguiente ecuación:
UmL =
mJ −mL m (0.00012) FD0.02
en donde:
mJ= Pendiente de la reacción enzimática (DO/min).
mL= Pendiente del blanco (DO/min).
m = Pendiente de la curva estándar (DO/µM).
FD = Factor de dilución.
0.00012 = Volumen de reacción (L).
0.02 = Volumen del extracto enzimático (mL).
Cuantificación de la actividad acetilxilanesterasa
La actividad acetilxilanesterasa se llevó a cabo mediante la cuantificación de p-nitrofenol que
se libera a partir del p-nitrofenil acetato (pNPA) basado en el método de Biely et. al. 1985.
Preparación de reactivos:
a) Tampón MOPS 50 mM, pH 7.2: Se pesaron 2.89 g de MOPS (SIGMA) y se agregaron
200 mL de agua destilada. Se ajustó el pH a 7.2, con NaOH 1 M, y finalmente se ajustó
el volumen a 250 mL con agua destilada. El tampón se conservó en refrigeración a 4 ºC.
b) Solución estándar de p-nitrofenol 10 mM: Se pesaron 13.9 mg de p-nitrofenol (SIGMA)
que fueron disueltos en 10 mL de tert-butanol, el cual se conservó en un frasco ámbar y
en congelación a -20 ºC.
c) Solución sustrato: Se preparó 10 mL de pNPA a una concentración de 10 mM. Se
pesaron 18.11 mg de pNPA (SIGMA) y se disolvieron en tert-butanol (SIGMA); la
solución fue conservada en frasco ámbar y en congelación a -20 ºC.
37
Hidrólisis enzimática:
Al momento de realizar el ensayo, se preparó una solución de sustrato disolviendo, en vortex, 1
mL de sustrato 10 mM en 9 mL de tampón MOPS 50 mM, pH 7.2. En una microplaca de 96
pozos se colocaron 20 µL de extracto enzimático, diluido convenientemente en tampón MOPS
2.5 mM (pH 7.2). Se agregaron 100 µL de la solución sustrato-indicador, utilizando una pipeta
multicanal, y se incubó inmediatamente en un lector para microplacas xMarkTM (Bio-Rad)
(Figura 4.4) a 35 °C, tomando lecturas de absorbancia cada 15 segundos a una longitud de onda
de 410 nm, con agitación orbital (intensidad media) de 5 segundos antes de cada lectura. Se
agregó un blanco para cada muestra con el extracto enzimático desnaturalizado.
Preparación de la curva estándar de p-nitrofenol:
Se prepararon dos mezclas, en vortex, agregando 100 µL de la solución de p-nitrofenol 10 mM
y 100 µL de tert-butanol separadamente, en 900 µL de tampón MOPS 50 mM, pH 7.2. 120 µL
de cada dilución fueron colocados cada pozo de la microplaca de 96 pozos y se leyó a una
longitud de onda de 410 nm en el lector de microplacas xMarkTM (Bio-Rad). Cada punto de la
curva se realizó por triplicado utilizando las proporciones mostradas en la tabla 4.2.
Tabla 4.2. Curva estándar de p-nitrofenol para actividad acetilxilanesterasa
p-nitrofenol 10 mM Tert-butanol
0 120
5 115
10 110
20 100
30 90
40 80
50 70
60 60
38
Expresión de los resultados en unidades de actividad acetilxilanesterasa:
Se obtuvo la ecuación que relaciona la concentración con la absorbancia, a partir de la curva
estándar de p-nitrofenol (Figura A.2, Anexo). Para determinar la actividad enzimática en
Unidades por mL de enzima (U/mL), se aplicó la siguiente ecuación:
UmL =
mJ −mL m (0.00012) FD0.02
en donde:
mJ= Pendiente de la reacción enzimática (DO/min).
mL= Pendiente del blanco (DO/min).
m = Pendiente de la curva estándar (DO/µM).
FD = Factor de dilución.
0.00012 = Volumen de reacción (L).
0.02 = Volumen del extracto enzimático (mL).
Cuantificación de la actividad arabinofuranosidasa
La actividad arabinofuranosidasa se llevó a cabo cuantificando el p-nitrofenol que se liberó del
p-nitrofenil-α-L-arabinofuranosido (pNPAF) basado en el método de Tagawa y Kaji 1988.
Preparación de reactivos:
a) Tampón citrato-fosfato (200 y 100 mM), pH 5.6: Se pesaron 7.69 g de ácido (SIGMA)
y, por separado, 3.48 g de fosfato dibásico de potasio (SIGMA) y se agregaron 200 mL
de agua destilada a cada reactivo. Se mezclaron las soluciones a un pH final de 5.6. El
tampón se conservó en refrigeración a 4 ºC.
39
b) Solución estándar de p-nitrofenol 10 mM: Se pesaron 13.9 mg de p-nitrofenol (SIGMA)
que fueron disueltos en 10 mL de DMSO, el cual se conservó en un frasco ámbar y en
congelación a -20 ºC.
c) Solución sustrato: Se preparó 10 mL de pNPAF a una concentración de 4 mM. Se
pesaron 10.85 mg de pNPAF (SIGMA) y se disolvieron en DMSO (SIGMA); la solución
fue conservada en frasco ámbar y en congelación a -20 ºC.
d) Solución de carbonato de sodio 100 mM: se pesaron 106 mg de carbonato de sodio
(SIGMA) que fueron disueltos en 10 ml de tampón citratos-fosfatos (200 y 100 mM,
pH 5.6), el cual se conservó en refrigeración a 4 ºC.
Hidrólisis enzimática:
En microtubos Eppendorf de 1.5 mL se colocaron 100 µL de la solución sustrato, y se
adicionaron 100 µL de extracto enzimático diluido convenientemente en tampón de citratos-
fosfatos (200 y 100 mM, pH 5.6). La mezcla se incubó durante 30 min en un baño a temperatura
controlada de 50 °C, después se le añadieron 600 µL de la solución de carbonato de sodio 100
mM para detener la reacción. Se colocaron 200 µL de la mezcla final en una microplaca de 96
pozos y se leyó a 400 nm en un lector para microplacas xMarkTM (Bio-Rad). El ensayo se realizó
por duplicado y se colocó un blanco para cada muestra utilizando el extracto enzimático
desnaturalizado.
Preparación de la curva estándar de p-nitrofenol:
Se prepararon dos mezclas, en vortex, una con 100 µL de p-nitrofenol y 100 µL de DMSO,
separadamente, en 900 µL de tampón citratos-fosfatos 100 mM (pH 5.6), las cuales se
mezclaron utilizando las proporciones mostradas en la tabla 4.3 en microtubos Eppendorf de 1.5
mL a los que se agregaron 600 µL de la solución de carbonato de sodio 100 mM. Se tomaron
200 µL de cada dilución que fueron colocados en microplaca de 96 pozos y se leyó a una
longitud de onda de 400 nm en el lector de microplacas xMarkTM (Bio-Rad). Cada punto de la
curva se realizó por triplicado.
40
Tabla 4.3. Curva estándar de p-nitrofenol para actividad arabinofuranosidasa
p-nitrofenol 10 mM DMSO
0 200
5 195
10 190
20 180
30 170
40 160
50 150
60 140
Cálculo de la actividad enzimática:
Para calcular la actividad enzimática se obtuvo una ecuación que relaciona la concentración con
la absorbancia, (Figura A.5), a partir de la curva estándar de glucosa para la actividad celulasa
y pectinasa, y a partir de la curva estándar de xilosa para la actividad xilanasa. Para determinar
la actividad enzimática en Unidades por mL de enzima (U/mL), se aplicó la siguiente ecuación:
Uml =
(∆DO/m)(0.1)(FD)(30)(0.05)
En donde:
∆DO = Absorbanciadelareacciónenzimáticamenoslaabsorbanciadelblanco
m = Pendiente de la curva estándar (DO ∙ 𝜇𝑚𝑜𝑙FG ∙ 𝑚𝐿FG)
FD = Factor de dilución de la enzima
0.2 = Volumen de reacción (mL)
30 = Tiempo del ensayo (min)
0.05 = Volumen del extracto enzimático (mL)
41
4.6.3 Cuantificación de ácido ferúlico
El ácido ferúlico se cuantificó mediante cromatografía de capa fina (TLC) basándose en el
método de Tee-ngam et. al 2013 con algunas modificaciones.
Las muestras se someten a hidrólisis a 40 ºC durante 16 horas tomando 500 µl de la fracción de
nejayote, que se encuentra en fase acuosa, y se les agrega el coctel enzimático a 0.5% v/v.
Posteriormente se realiza una extracción con acetato de etilo en proporción 2:1 (acetato de
etilo/muestra de hidrólisis) realizándose la operación 3 veces para procurar recuperar la mayor
cantidad de ácido ferúlico en la muestra, se realiza una evaporación del solvente mediante
SpeedVac (Thermo Scientific) a una temperatura media durante 10 min y se resuspende en 100
µL de metanol para ser inyectada en las placas de cromatografía.
Se emplearon placas de cromatografía de silica con indicador de UV (SIGMA) las cuales fueron
convenientemente cortadas a un tamaño de 20*10 cm. Las muestras fueron depositadas con el
equipo LINOMAT 5 de CAMAG para obtener una banda de depósito homogénea y del mismo
tamaño a una distancia aproximada de 1.0 cm de la base, inyectando en cada carril 1 µL de cada
una de las muestras de hidrólisis.
El desarrollo de la cromatografía se llevo a cabo en una cámara de migración de 27.0*26.5*7.0
cm empleando una fase móvil que consistió en cloroformo/metanol/ácido fórmico en una
relación volumétrica 85:15:1, respectivamente. La fase móvil fue puesta en equilibrio durante
15 min previos a la inmersión de la placa. Posteriormente, la placa fue colocada dentro de la
cámara y se dejó migrar hasta 0.5 cm antes del borde superior. Finalmente se sacó la placa de la
cámara y se dejó evaporar el solvente para realizar la cuantificación.
Empleando un SCANNER III de CAMAG se realizó la cuantificación del ácido ferúlico al medir
la absorbancia a 295 nm obteniéndose los cromatogramas los cuales fueron integrados mediante
42
el software Wincats para cromatografía planar. La curva estándar fue realizada inyectando
volúmenes ascendentes de una solución madre a 0.5 mg/mL de ácido ferúlico en metanol. Cabe
señalar que para poder cuantificar se debe de depositar una nueva curva estándar en cada placa
que se vaya a utilizar.
4.6.4 Determinación del peso molecular por cromatografía de exclusión de alta resolución
(HP-SEC)
Se utilizó un equipo HPLC 1220 Infinity LC System (Agilent, USA) con detector de índice de
refracción. Como fase estacionaria, se utilizaron 1 o 2 columnas de exclusión de tamaño
acopladas con un guarda-columna y conectadas en serie Ultrahydrogel DP y Ultrahydrogel 250
(7.8 x 300 mm, Waters). Como fase móvil, se utilizó agua grado HPLC con un flujo de 0.3
ml/min. El volumen de muestra inyectada fue de 20 µl (con el inyector completamente lleno).
La temperatura de la columna se mantuvo a 50 °C. Se utilizaron dextranos de distinto peso
molecular (Sigma-Aldrich) para la curva de calibración (Figura A.6).
4.7 Hidrólisis enzimática de los arabinoxilanos
Para la hidrólisis enzimática se utilizaron dos xilanasas, una presente en el coctel comercial
CTEC 2® y otra pura de Thermomyces lanuginosus (SIGMA), las cuales se combinaron con
acetilxilanesterasa, arabinofuranosidasa y/o feruloilesterasa de Aspergillus niger, obtenidas de
manera recombinante como se indica en la sección 5.4, realizándose las mezclas como se indica
en la tabla No. 4.4. La hidrólisis se llevó a cabo, en el caso de las combinaciones, de dos
maneras: agregando desde el inicio la mezcla de enzimas y también de manera secuencial
agregando primero la actividad accesorio y a las 24 horas la actividad xilanasa correspondiente,
esto con la finalidad de observar cómo impacta el uso de las enzimas accesorio para la obtención
posterior de oligómeros por medio de las xilanasas tras haber removido las ramificaciones de
los FAXX. La hidrólisis se llevó a cabo a 40 ºC en agitación constante durante 48 horas
muestreando cada 24 horas utilizando 1000 unidades de actividad xilanasa por gramo de FAXX
y 100 unidades de cada una de las enzimas accesorio por gramo de FAXX. Las muestras de los
43
hidrolizados se analizaron por medio de cromatografía de exclusión de tamaño por HPLC para
apreciar la distribución de tamaños de los oligómeros obtenidos como se indica en la sección
4.6.4.
Tabla 4.4. Diseño de hidrólisis de arabinoxilanos de xilanasas y enzimas accesorio
*Estas combinaciones se realizaron agregando desde el inicio la mezcla de enzimas y también de manera
secuencial añadiendo las enzimas accesorio al inicio y a las 24 horas la xilanasa. TLX: xilanasa de Thermomyces
lanuginosus, AnAXE: acetilxilanesterasa recombinante de Aspergillus niger, AnABF: arabinofuranosidasa
recombinante de Aspergillus niger, AnFAE: feruloilesterasa recombinante de Aspergillus niger.
Combinación Xilanasa AnAXE AnABF AnFAE 1 CTEC 2 TLX 3* CTEC X 4* CTEC X 5* CTEC X 6* CTEC X X 7* CTEC X X 8* CTEC X X 9* CTEC X X X 10* TLX X 11* TLX X 12* TLX X 13* TLX X X 14* TLX X X 15* TLX X X 16* TLX X X X
44
5 Resultados y discusiones
En este apartado se presentan los resultados de los estudios experimentales que fueron realizados
para cumplir con los objetivos planteados para el presente trabajo. Cabe mencionar que los
estudios se enfocaron hacia la presencia de arabinoxilanos en distintas fracciones de nejayote y
a la liberación de oligómeros de cadena corta a través del uso de distintas enzimas. Primero, se
presenta una caracterización cromatográfica de los arabinoxilanos que se encuentran en cada
fracción que se obtiene mediante el uso de membranas de ultrafiltración. Enseguida, se muestra
la búsqueda y selección de hongos provenientes de la colección CIAD-CIATEJ con la finalidad
de encontrar cuales de éstos son capaces de hidrolizar los arabinoxilanos de cadena larga
provenientes del liofilizado del precipitado etanólico del retenido de la membrana de 5 kDa.
Posteriormente se relacionaron las actividades enzimáticas reportadas para los hongos, que
podrían ser responsables de la hidrólisis de los arabinoxilanos. Entre los microorganismos que
fueron capaces de realizar la hidrólisis de arabinoxilanos destacaron hongos del género
Aspergillus y Trichoderma los cuales han sido identificados previamente en el equipo de trabajo
como productores de xilanasas, celulasas y otras actividades de interés. En esta sección también
se presenta el estudio comparativo de cocteles enzimáticos comerciales para la liberación de
ácido ferúlico que es un compuesto de gran interés comercial, sin embargo en algunos casos no
se observa la liberación de éste pero se presenta la liberación de oligómeros que es lo que se
persigue en el trabajo. Finalmente, se llevó a cabo un ensayo de hidrólisis donde se emplearon
dos enzimas comerciales, una de ellas un coctel y la otra una enzima pura, las cuales fueron
combinadas con enzimas recombinantes obtenidas en el equipo de trabajo con la finalidad de
entender la manera en que éstas interactúan y efectúan la liberación de oligómeros de
arabinoxilanos los cuales fueron caracterizados mediante cromatografía de exclusión de tamaño
(SEC).
5.1 Caracterización de arabinoxilanos de fracciones del nejayote
Para conocer la composición de las fracciones del nejayote se realizó una caracterización
cromatográfica donde se buscó la presencia de ácido ferúlico libre, así como monosacáridos de
glucosa, xilosa y arabinosa y cadenas de arabinoxilanos de distintos grados de polimerización
(DP) (Figura 5.1), aunque no se cuenta con estándares de los oligómeros y polímeros de
45
arabinoxilanos esta técnica nos permite estimar la complejidad de la mezcla de carbohidratos
que compone a las diferentes fracciones del nejayote.
Figura 5.1. Caracterización cromatográfica de fracciones del nejayote. Cromatografía en capa fina de alto
rendimiento (HPTLC) de distintas fracciones de nejayote. AF: Ácido ferúlico, G: Glucosa, X: Xilosa, A: Arabinosa, NC: Nejayote Clarificado, NCL: Nejayote Clarificado Liofilizado, R5: Rechazo de 5kDa FAXX:
Arabinoxilanos ferulados del retenido de la membrana de 5 kDa precipitados con etanol, ETOH: Fracción etanólica del precipitado, P5: Permeado de 5kDa
Podemos observar que en las fracciones del retenido y permeado de 5 kDa así como en el
nejayote clarificado y clarificado liofilizado, se tiene ácido ferúlico presente, el cual se considera
como una molécula de alto valor agregado, así como también una mezcla de oligómeros de
distinto peso molecular. Cabe destacar que en el caso del precipitado etanólico solo aparece una
banda la cual se queda en el depósito indicando que esta fracción contiene moléculas de alto
peso molecular, las cuales pueden ser interesantes. Sin embargo, el presente trabajo pretende
explorar enzimas que permitan la recuperación de moléculas de alto valor agregado a partir de
la hidrólisis de FAXX por lo cual ésta fracción será utilizada para la obtención de oligómeros
de arabinoxilanos.
5.2 Selección de hongos capaces de hidrolizar arabinoxilanos
Durante 8 días se realizó una cinética de crecimiento del cultivo de hongos filamentosos sobre
arabinoxilanos de cadena larga (FAXX) como fuente de carbono (Figura 5.2) se tomaron
muestras de los cultivos cada dos días con lo cual fue posible identificar por HPTLC la
liberación de oligómeros de FAXX generados por el cultivo de hongos filamentosos, como
Aspergillus terreus, sobre arabinoxilanos de cadena larga. En la Figura 5.3 se muestra una
46
cromatografía de capa fina en donde se puede apreciar a los FAXX de cadena larga como una
banda intensa en el depósito de la placa (t0) y, durante el transcurso de la fermentación, la
liberación de monosacáridos así como también bandas intermedias que indican la liberación de
oligómeros de arabinoxilanos los cuales no existían al inicio de la cinética.
Figura 5.2. Cultivo en placa Petri al octavo día de crecimiento, a) Aspergillus terreus (At 17), b) Aspergillus
ochraceus (Aoc), c) Trichoderma sp. (B) y d) Aspergillus sp. (N).
Figura 5.3. Placa de HPTLC, de izquierda a derecha se muestran los estándares de glucosa (G), xilosa (X),
arabinosa (A), ácido ferúlico (AF), ácido p-cumárico (APC), ácido sinapínico (AS), medio de cultivo a tiempo cero (to), cinética de SPBL 310 (días 2,4,6,8), cinética de Aspergillus terreus 102 (días 2,4,6,8) y cinética de
Aspergillus terreus 17 (días 2,4,6,8). En la Tabla 5.1 se enlistan los hongos que presentaron mayor intensidad en las bandas que
aparecen en las placas de HPTLC, lo cual nos sugiere que son aquellos que generaron la
maquinaria enzimática necesaria para aprovechar los oligómeros de arabinoxilanos presentes en
el medio de cultivo. Algunos de éstos hongos ya han sido identificados molecularmente
determinándose así su género, además la mayoría de los hongos pertenecientes a éstos géneros
identificados ya han sido reportados como productores de celulasas y xilanasas (Adsul 2004,
Belghith 2001 y Murashima 2002) y feruloilesterasas (Benoit 2008).
a) b) c) d)
47
Tabla 5.1. Hongos candidatos de la colección CIAD-CIATEJ capaces de hidrolizar los oligómeros de arabinoxilanos presentes en el nejayote.
CLAVE CEPA ACTIVIDAD
REPORTADA IDENTIFICACIÓN
MOLECULAR B Hongo verde Xilanasa Trichoderma E CHJ-1b-III Celulasa N.D. K Jojo 3 verde Xilanasa N.D. N MIII-11f-1g Xilanasa Aspergillus O MIII-II-ZL - N.D. P Jojo-1-café - N.D. R C2 - N.D. T MIII-IIf-2g Xilanasa N.D. V Jojo-1-gris Xilanasa Aspergillus W MIVIM-2b amarillo - N.D. Y II5-2c-blanco - N.D.
AD MIII-O-2b Celulasa Penicillium Aoc Aspergillus ochraceus Feruloil esterasa Aspergillus ochraceus
At 17 Aspergillus terreus Xilanasa
Feruloil esterasa Aspergillus terreus
5.3 Selección de cocteles comerciales
Con la finalidad de conseguir la liberación de oligómeros de arabinoxilanos ferulados se
seleccionaron algunos cocteles enzimáticos comerciales (Tabla 5.2) caracterizados por su
empleo en la sacarificación de residuos agroindustriales para la producción de bioetanol.
5.3.1 Liberación de ácido ferúlico
Con el objetivo de apreciar el efecto hidrolítico de las enzimas sobre los compuestos presentes
en las distintas fracciones del nejayote se realizó una serie de ensayos donde se utilizaron las
fracciones: nejayote clarificado, rechazo de 5 kDa y permeado de 5 kDa, a los que se les incubó
con distintos cocteles enzimáticos comerciales, que posteriormente podrían ser empleados como
control positivo.
Una de las variables que se decidió cuantificar para observar el impacto de los cocteles sobre
las fracciones de nejayote fue el ácido ferúlico liberado por tratamiento enzimático debido a que
48
éste es una molécula de alto valor agregado que pudiera recuperarse. El ensayo fue realizado a
40 ºC durante 16 horas tomando 500 µl de las fracciones de nejayote, que estaban en fase acuosa,
a las que se les agregó el coctel enzimático a 0.5% v/v, cuantificando el ácido ferúlico mediante
cromatografía de capa fina (TLC) como se describe en la sección 4.6.3. Para apreciar cual sería
la mayor cantidad de ácido ferúlico liberado que se podría obtener, se realizó una hidrólisis
química con NaOH 1 N final que se incubó por una hora a 70 ºC y como referencia un blanco
sin incubar, obteniéndose los resultados mostrados en la Figura 5.4.
Tabla 5.2. Cocteles enzimáticos comerciales empleados para la liberación de oligómeros de FAXX.
CLAVE COCTEL ENZIMÁTICO
A Shearzyme
B Viscozyme
C Ultrazyme
D Pectinex
E Celluclast
F Filtrase NLC
G Cellubrix
H Rapidase UF
I Rapidase TF
J Celluzyme BL
K Celluzyme XB
L Depol 740
M HTEC 2
N CTEC 2
49
Figura 5.4. Ensayos de hidrólisis sobre fracciones de nejayote para la liberación de ácido ferúlico. a)
Nejayote clarificado, b) fracción del retenido de 5 kDa, c) fracción del permeado de 5 kDa. A: Shearzyme, B:
Viscozyme, C: Ultrazyme, D: Pectinex, E: Celluclast, F: Filtrase NLC, G: Cellubrix, H: Rapidase UF, I: Rapidase
TF, J: Celluzyme BL, K: Celluzyme XB, L: Depol 740, M: HTEC 2, N: CTEC 2, HQ: hidrólisis química.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
Áci
do fe
rúlic
o (g
/L)
Tratamientos
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
Áci
do fe
rúlic
o (g
/L)
Tratamientos
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
Áci
do fe
rúlic
o (g
/L)
Tratamientos
a)
b)
c)
50
Como podemos darnos cuenta, los cocteles tienen diferente efecto sobre las fracciones del
nejayote utilizadas. La liberación de ácido ferúlico se aprecia mayormente en los cocteles
Ultrazyme y Pectinex aunque no parece ser significativa con respecto a la cantidad que se tenía
originalmente en la fracción, sin embargo se presenta principalmente en el nejayote clarificado
y en el rechazo de 5 kDa, esto pudo deberse a que en ambas fracciones hay presentes
arabinoxilanos ferulados de cadena larga donde habría más ácido ferúlico para liberar, mientras
que en el producto de 5 kDa ya hay ácido ferúlico libre y por eso no se ve el efecto de las enzimas
como en las otras dos. En algunos casos se puede apreciar una disminución de la concentración
de ácido ferúlico, esto pudo deberse al hecho de que se utilizó cocteles comerciales, las cuales
pueden contener alguna enzima oxidasa que oxida al ácido ferúlico y por eso se aprecia su
disminución.
5.3.2 Liberación de oligómeros de arabinoxilanos
Además del ácido ferúlico, otros compuestos de interés presentes en el nejayote son los
polímeros y oligómeros de arabinoxilanos, que consisten en cadenas de xilosa que tienen unidas
monómeros de glucosa, arabinosa, galactosa, ácido ferúlico, entre otros, los cuales se obtienen
mediante precipitación etanólica usando una relación etanol:nejayote (2:1 v/v). Con el fin de
conocer el impacto de los dos cocteles más interesantes, respecto a la mayor liberación de ácido
ferúlico (Pectinex y Depol 740L), se obtuvieron muestras del retenido de la membrana de 5 kDa
provenientes de dos nejayotes diferentes para evaluar la liberación de oligómeros de
arabinoxilanos con ambos cocteles, uno tratado con el coctel comercial CTEC 2 y el otro sin
éste tratamiento, dichos precipitados etanólicos, a los cuales denominaremos FAXX haciendo
referencia a los arabinoxilanos ferulados que pueden estar presentes en el nejayote, se “lavaron”
cuatro veces con etanol:agua (2:1 v/v) y se liofilizaron; una vez liofilizados se tomaron 25 mg
de éstos y se trataron de manera similar a como se hizo en ensayos previos utilizando los cocteles
seleccionados.
En la Figura 5.5 se puede apreciar, con respecto a los controles sin incubar (1 y 1’), que al
incubar el nejayote a 40 °C se liberaron oligómeros pero no se degradan a azúcares
monoméricos, en el tratamiento realizado con Pectinex (3) presenta una mayor degradación de
oligómeros ya que podemos apreciar la aparición de monómeros mientras que el Depol 740 (4)
51
tiene una menor hidrólisis permitiendo la generación de oligómeros sin llevarlos hasta
monómeros, además vemos que la ausencia del uso de CTEC 2 (5) permite que solo se tengan
FAXX de cadena larga los cuales se quedan en el depósito de la inyección por lo cual se decidió
trabajar con los FAXX provenientes del proceso libre de CTEC 2.
Figura 5.5 Cromatografía en capa fina de alto rendimiento de distintas fracciones e hidrolizados de nejayote. F: Ácido ferúlico, S: Ácido sinapínico, pC: Ácido p-cumárico, 1:Blanco 25 °C, 2:Blanco 40 °C,
3:Muestra tratada con Pectinex, 4:Muestra tratada con Depol 740L, 5:FAXX (sin CTEC 2), 6:Fracción etanólica de precipitación de FAXX (sin CTEC 2), 7:FAXX (con CTEC 2), 8:Fracción etanólica de precipitación de FAXX
(con CTEC 2), G: Glucosa, X: Xilosa, A: Arabinosa. ‘Duplicado de la muestra.
5.3.3 Caracterización de los cocteles enzimáticos comerciales
Muchas enzimas comerciales son buscadas por el hecho de tener una cierta actividad de interés,
sin embargo en ocasiones éstos cocteles pueden tener varias enzimas que trabajen en sinergia
para llevar a cabo la hidrólisis que buscamos de una manera más eficiente aunque por otro lado
podemos encontrarnos con algunas otras que pueden entorpecer la generación de moléculas de
interés. Se realizó una electroforesis (Figura 5.6) para conocer la complejidad de los cocteles
enzimáticos que resultaron más interesantes para la hidrolisis de arabinoxilanos de cadena larga
a los cuales se les determinaron las actividades enzimáticas que se consideraron de mayor interés
para hidrolizar el sustrato: xilanasa, celulasa, pectinasa, acetilxilanesterasa y feruloilesterasa
(Tabla 5.3) con la finalidad de conocer si éstos cocteles debían ser enriquecidos en actividades
que propicien la generación de oligómeros de arabinoxilanos.
52
Con base en los resultados obtenidos en la cuantificación de las diversas actividades enzimáticas
de los cocteles, podemos darnos cuenta que los cocteles con mayor valor para las distintas
actividades fueron Pectinex para la pectinasa, Depol 740 para la feruloilesterasa y CTEC 2 para
la xilanasa y acetilxilanesterasa por lo cual, éste último es el que mejores resultados podría tener
para la liberación de oligómeros de arabinoxilanos.
Tabla 5.3. Actividades enzimáticas de mayor interés en cocteles comerciales.
*N.D. No determinada
En el gel se presentan distintas bandas, las cuales corresponden a proteínas que probablemente posean distintas actividades enzimáticas, provocando que el ácido ferúlico se degrade.
Figura 5.6. Gel de electroforesis de los cocteles más interesantes. Gel SDS-PAGE de poliacrilamida al 12% que contiene 30 µg de proteína en cada carril, revelado con una solución de azul de Coomasie al 0.25% y
decolorado con una solución 5X de ácido acético. MP: marcador de peso molecular, C: Ultrazyme, D: Pectinex, J: Celluzyme BL, L: Depol 740L, M: HTEC 2, N: CTEC 2.
Actividad enzimática (U/ml) Coctel Xilanasa Celulasa Pectinasa Acetilxilan
esterasa Feruloil esterasa
Ultrazyme 35 14 82 8.3 N.D. Pectinex 4 14 122 8.7 N.D. HTEC 2 CTEC 2
DEPOL 740
130 130 12
15 20 0.8
0.8 0.8 0.5
1 50 7
0.3 0.3 12
MPCDJLMNkDa
97.466.245.0
31.0
21.5
14.4
53
5.4 Obtención de enzimas recombinantes
Con el propósito de llevar a cabo una hidrólisis racional donde se pueda apreciar el efecto de
enzimas accesorio (acetilxilanesterasa, arabinofuranosidasa y feruloilesterasa) que estén
presentes a bajas concentraciones en cocteles comerciales, se decidió su obtención y expresión
en Pichia pastoris en lo que se refiere a las enzimas acetilxilanesterasa y arabinofuranosidasa
las cuales pertenecen a Aspergillus niger. La feruloilesterasa A, también de Aspergillus niger,
fue expresada por él mismo y producida por el equipo de trabajo.
5.4.1 Construcción y transformación de un vector de expresión para los genes AnAXE y
AnABF en E. coli DH10B.
La clonación, expresión y purificación de las enzimas acetilxilanesterasa (AnAXE) y
arabinofuranosidasa (AnABF) ya ha sido reportada con anterioridad (Koseki et. al. 2006, Alias
et. al 2011), por lo que no constituye un objetivo original de este trabajo, sino un método de
obtención de enzimas. Los vectores pGAPZ incluyen el promotor para el gen GAP constitutivo
que ha mostrado expresar proteínas en altos niveles en Pichia pastoris, además el nivel de
expresión con el promotor pGAP puede ser comparado con el obtenido con el promotor AOXI
cuya diferencia es el requerimiento de metanol como inductor. El vector pGAPZα, además
incluye el factor de secreción unido a un péptido N-terminal codificando para una señal de
secreción α de Saccharomyces cerevisiae. La estrategia de clonación planteada en este trabajo
para expresar ambas proteínas incluye las dos opciones, el empleo de la señal α de
Saccharomyces cerevisiae (plásmido pGAPZαA) y la expresión mediante el uso de metanol
como inductor al utilizar el plásmido pPICZαB.
En primer lugar, se llevó a cabo la construcción y transformación de los vectores de expresión
conteniendo los genes AnAXE y AnABF. Una vez calculadas las Tm mediante el software CLC,
se realizaron PCR con resultados exitosos. Se logró amplificar los genes en todos los casos y
posteriormente se propagó y purificó a los vectores de clonación pGAPZαA y pPICZαB; luego
se realizó la digestión de los productos amplificados, los cuales fueron purificados para llevar a
cabo la ligación y transformación en E. coli DH10B. Se preparó un gel de agarosa para confirmar
la construcción de las enzimas en el cual se presentan los vectores digeridos pGAPZαA, que se
54
presentan en el carril 1 y 3 con un tamaño de 3147 pares de bases (pb), y pPICZαB, en el carril
2 y 4 con un tamaño de 3597 pb, así como también se muestra la liberación del inserto para el
caso se la AnAXE en los carriles 1 y 2 con un tamaño de 915 pb y para la AnABF en los carriles
3 y 4 con un tamaño de 1887 pb (Figura 5.7).
Figura 5.7. Digestión de las construcciones para la arabinofuranosidasa y acetilxilanesterasa de Aspergillus
niger en los vectores pGAPZαA y pPICZαB. Gel de agarosa al 1% en buffer TAE utilizando Gel Red como
agente revelador a 25 nL/mL de gel que contiene, aproximadamente en cada carril excepto el primero, 100 ng de
la digestión de las construcciones de AnAXE y AnABF en los vectores pGAPZαA y pPICZαB utilizando las
enzimas de restricción EcoRI y KpnI. MP: marcador de peso molecular, 1: construcción AnAXE+ pGAPZαA, 2:
construcción AnAXE+ pPICZαB, 3: construcción AnABF+ pGAPZαA, 4: construcción AnABF+ pPICZαB. La
escala señala el tamaño en pares de bases.
Finalmente, fueron obtenidas y resguardadas las construcciones para ambas enzimas en ambos
vectores para la posterior transformación de Pichia pastoris.
5.4.2 Transformación y selección de clonas de Pichia pastoris
Una vez que se obtuvieron las construcciones correctas para AnAXE y AnABF, se procedió a
linearizar el plásmido recombinante y transformar Pichia pastoris, para ello se contó con la cepa
SMD1168H deficiente en proteasas.
55
En primer lugar, se linealizó el ADN y mediante un análisis en gel de agarosa se verificó la
digestión de linealización (Figura 5.8). Una vez obtenidas las construcciones linealizadas, se
concentró el producto y se prepararon células competentes para la cepa DSM1168H de acuerdo
a protocolos estándar (Invitrogen). Se procedió a realizar la transformación por electroporación
y se cultivó por extensión en placas con YPDS+ Zeocina las células electroporadas incubando
a 30 °C.
Figura 5.8. Linearización de las construcciones para la arabinofuranosidasa y acetilxilanesterasa de
Aspergillus niger en los vectores pGAPZαA y pPICZαB. Gel de agarosa al 1% en buffer TAE utilizando Gel
Red como agente revelador a 25 nL/mL de gel que contiene, aproximadamente en cada carril excepto el primero,
100 ng de la digestión de las construcciones de AnAXE y AnABF utilizando las enzimas de restricción BspHI
para los que tienen el vector pGAPZαA y PmeI para los que tienen el pPICZαB. MP: marcador de peso
molecular,1: construcción AnAXE+ pGAPZαA, 2: construcción AnAXE+ pPICZαB, 3: construcción AnABF+
pGAPZαA, 4: construcción AnABF+ pPICZαB. La escala señala el tamaño en pares de bases.
Después de 5 días se analizó el crecimiento y se seleccionaron de 2-4 colonias aisladas para
realizar un cultivo a pequeña escala 5 mL y determinar la actividad secretada.
56
5.4.3 Producción de enzimas recombinantes
Se realizó una cinética para determinar la actividad acetilxilanesterasa y arabinofuranosidasa a
partir de las colonias aisladas con el fin de determinar cuál plásmido (pGAPZαA o pPICZαB)
resultó con mayor actividad lo cual se muestra en la figura 5.9 donde podemos apreciar que en
el caso de AnAXE fue la a las 72 horas con el plásmido pGAPZαA mientras que para la AnABF
el máximo se encontró a las 96 horas en el plásmido pPICZαB.
Figura 5.9 Cinética de actividad enzimática para las enzimas acetilxilanesterasa y arabinofuranosidasa
recombinantes de Aspergillus niger. a) Cinética de actividad acetilxilanesterasa, las líneas azules representan
AnAXE en pGAPZαA y las líneas rojas AnAXE en pPICZαB, b) Cinética de actividad arabinofuranosidasa las
líneas verdes representan AnABF en pGAPZαA y las líneas naranjas AnABF en pPICZαB.
En base al resultado anterior se realizaron dos cinéticas para la producción de las enzimas, las
cuales consistieron en un volumen total de 2 L para cada una. El extracto obtenido se concentró
hasta 150 veces utilizando membranas de 10 kDa y se conservó a 4 ºC.
5.5 Hidrólisis enzimática de arabinoxilanos
Los ensayos de hidrólisis se llevaron a cabo y se analizaron como se menciona en el apartado
4.7. Como podemos apreciar en la Figura 5.10 los experimentos control se vieron afectados tras
ser incubados durante 48 horas a 40 ºC, disminuyendo los porcentajes de concentración de
aquellos oligómeros de peso molecular mayor, se observa una disminución significativa en las
moléculas con pesos de 6491 y 6810 g/mol; por otro lado se observa aparición de oligómeros
en la muestra incubada con un rango de pesos moleculares entre 2767 y 3901 g/mol.
0123456789
10
0 24 48 72 96 120
Act
ivid
ad (U
/ml)
Tiempo (h)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 24 48 72 96 120
Act
ivid
ad (
U/m
l)
Tiempo (h)
a) b)
57
Figura 5.10 Distribución de tamaños de los FAXX sometidos a hidrólisis espontánea por efecto de la
temperatura. Las barras azules corresponden al tiempo inicial y las rojas a las 48 horas de incubación a 40 °C.
En cuanto a los hidrolizados obtenidos, podemos apreciar en la Figura 5.11 que en el caso del
tratamiento con CTEC y arabinofuranosidasa, comparado con el tiempo inicial (barras azules),
conforme transcurre la reacción el perfil de los hidrolizados cambió, a las 24 horas (barras rojas)
se aprecia la generación de oligómeros principalmente, cuyos pesos moleculares son de 1125.15
a 117.04 g/mol mientras que a las 48 horas (barras verdes) se observó incluso, que los
oligómeros generados a las 24 horas disminuyeron su concentración, generándose oligómeros
de pesos moleculares más pequeños de 528.43 a 117. 04 g/mol.
Figura 5.11 Distribución de tamaños de muestras sometidas a tratamiento de hidrólisis con CTEC y
arabinofuranosidasa. Las barras azules indican la distribución a tiempo inicial, las rojas a las 24 horas y las verdes a las 48 horas.
0246810121416
7947.37
7787.12
7630.10
7458.55
7290.87
7126.95
6966.72
6810.09
6656.98
6491.92
6330.96
6174.95
6009.50
5847.55
5676.50
5511.33
5350.97
5195.27
5032.96
4864.19
4711.48
4553.49
4391.08
4224.44
4064.13
3901.26
3736.06
3577.86
3411.24
3252.38
3093.59
2929.10
2767.23
Abundanciarelativa(%)
Pesomolecular(g/mol)
0
4
8
12
16
7947
.37
7787
.12
7630
.10
7458
.55
7290
.87
7126
.95
6966
.72
6810
.09
6656
.98
6491
.92
6330
.96
6174
.95
6009
.50
5847
.55
5676
.50
5511
.33
5350
.97
5195
.27
5032
.96
4864
.19
4711
.48
4553
.49
4391
.08
4224
.44
4064
.13
3901
.26
3736
.06
3577
.86
3411
.24
3252
.38
3093
.59
2929
.10
2767
.23
2602
.36
2441
.91
2280
.89
1643
.88
1207
.25
1125
.15
843.
8452
8.43
258.
1811
7.04
Abu
ndan
cia r
elat
iva (
%)
Peso molecular (g/mol)
58
En la Figura 5.12 el tratamiento con CTEC y arabinofuranosidasa en conjunto con la
acetilxilanesterasa comparado con el tiempo inicial se observó que el perfil de los hidrolizados
a las 24 horas y a las 48 horas fue bastante similar obteniendo oligómeros con pesos moleculares
que van de 528.43 a 117.04 g/mol principalmente.
Figura 5.12 Distribución de tamaños de muestras sometidas a tratamiento de hidrólisis con CTEC,
arabinofuranosidasa y acetilxilanesterasa. Las barras azules indican la distribución de tamaños a tiempo inicial, las rojas a las 24 horas y las verdes a las 48 horas de hidrólisis.
En la Figura 5.13 el tratamiento con la xilanasa de Thermomyces lanuginosus y arabinofuranosidasa muestra que, comparado con el tiempo inicial (barras azules), el perfil de los hidrolizados a las 24 horas (barras rojas) y a las 48 horas (barras verdes) son similares entre sí obteniendo oligómeros, principalmente, con pesos moleculares de 117.04 g/mol lo que nos indica que probablemente lo que se está liberando corresponda a monómeros de los carbohidratos que componen a los arabinoxilanos, tomando en cuenta que el peso molecular de una pentosa como la xilosa es de 150 g/mol, la diferencia de peso se puede deber a un error del método. Sin embargo se observa también la disminución de polímeros de cadena larga (barras azules) entre 5676 y 7787 g/mol y la aparición de oligómeros entre 680 y 3577 g/mol aunque en pequeña cantidad y con menor polidispersión que en el caso de CTEC con arabinofuranosidasa.
0
5
10
15
20
7947
.37
7787
.12
7630
.10
7458
.55
7290
.87
7126
.95
6966
.72
6810
.09
6656
.98
6491
.92
6330
.96
6174
.95
6009
.50
5847
.55
5676
.50
5511
.33
5350
.97
5195
.27
5032
.96
4864
.19
4711
.48
4553
.49
4391
.08
4224
.44
4064
.13
3901
.26
3736
.06
3577
.86
3411
.24
3252
.38
3093
.59
2929
.10
2767
.23
2602
.36
2441
.91
2280
.89
1643
.88
1125
.15
843.
8452
8.43
258.
1811
7.04
Abu
ndan
cia r
elat
iva (
%)
Peso molecular (g/mol)
59
Figura 5.13 Distribución de tamaños de muestras con tratamiento de hidrólisis con xilanasa de
Thermomyces lanuginosus y arabinofuranosidasa. Las barras azules indican la distribución de tamaños a tiempo inicial, las rojas a las 24 horas y las verdes a las 48 horas.
En cuanto al tratamiento de CTEC y arabinofuranosidasa mostrado en la Figura 5.14, que en este caso consistió en incubar primeramente la arabinofuranosidasa 24 horas con el sustrato (FAXX) y después agregar el coctel de CTEC, se muestra que el perfil de los hidrolizados a las 24 horas (barras naranjas) muestran una alta concentración de monómeros probablemente debido a la arabinosa liberada y quizás algún dímero de ésta, mientras que a las 48 horas se presentan otros oligómeros cuyos pesos van de 843.84 a 258.18 g/mol principalmente y por supuesto aumentando también la concentración de los monómeros.
Figura 5.14 Distribución de tamaños de muestras con tratamiento de hidrólisis con CTEC y
arabinofuranosidasa desfasada. Las barras azules indican la distribución de tamaños de los carbohidratos a tiempo inicial, las rojas indican la distribución de tamaños de los carbohidratos después de una hidrolisis de 24
horas y las verdes a las 48 horas.
0
4
8
12
16
7947
.37
7787
.12
7630
.10
7458
.55
7290
.87
7126
.95
6966
.72
6810
.09
6656
.98
6491
.92
6245
.56
6009
.50
5847
.55
5676
.50
5511
.33
5350
.97
5195
.27
5032
.96
4864
.19
4711
.48
4553
.49
4391
.08
4224
.44
4064
.13
3901
.26
3736
.06
3577
.86
3411
.24
3252
.38
3093
.59
2929
.10
680.
4311
7.04
Abu
ndan
cia r
elat
iva (
%)
Peso molecular (g/mol)
0
5
10
15
20
7947
.37
7787
.12
7630
.10
7458
.55
7290
.87
7126
.95
6966
.72
6810
.09
6656
.98
6491
.92
6330
.96
6174
.95
6009
.50
5847
.55
5676
.50
5511
.33
5350
.97
5195
.27
5032
.96
4864
.19
4711
.48
4553
.49
4391
.08
4224
.44
4064
.13
3901
.26
3736
.06
3577
.86
3411
.24
3252
.38
3093
.59
2929
.10
2767
.23
2602
.36
2441
.91
2280
.89
1643
.88
1125
.15
843.
8452
8.43
258.
1811
7.04
Abu
ndan
cia r
elat
iva (
%)
Peso molecular (g/mol)
60
En la Figura 5.15 se muestra el tratamiento desfasado de CTEC y feruloilesterasa en donde podemos apreciar que tras 24 horas de incubar, primeramente, la feruloilesterasa con los FAXX no se ve liberación de oligómeros ni monómeros lo que nos hace pensar que probablemente no había gran concentración de ácido ferúlico liberable lo cual se había observado en los resultados del apartado 5.3.1 sin embargo es posible que la feruloilesterasa permita la hidrólisis de los diferulatos que unen a las cadenas de xilano entre sí. En cuanto a los resultados a las 48 horas de hidrólisis se observa que hay liberación de distintos oligómeros principalmente aquellos de peso molecular entre 781.75 y 117.04 g/mol. Además se observa una importante disminución en los FAXX de cadena larga entre 6174 y 7947 g/mol.
Figura 5.15 Distribución de tamaños de los polisacáridos de muestras sometidas a tratamiento de hidrólisis con CTEC y feruloilesterasa desfasada. Las barras azules indican la distribución a tiempo inicial, las rojas a las
24 horas y las verdes a las 48 horas. La Figura 5.16 muestra el tratamiento desfasado de CTEC con acetilxilanesterasa y arabinofuranosidasa donde nuevamente se agregó en primer lugar las enzimas accesorio y a las 24 horas el coctel de CTEC, cabe mencionar que en las combinaciones desfasadas de arabinofuranosidasa y feruloilesterasa así como las tres enzimas accesorio juntas se dieron perfiles similares en los productos de hidrólisis (imagen no mostrada). En este caso se observó un comportamiento similar al mostrado por la Figura 5.14 donde el caso consiste en una hidrólisis desfasada pero donde la única enzima accesorio es la arabinofuranosidasa, sabemos de antemano que las acetilxilanesterasa se encargan de remover los grupos acetilo de las xilosas que componen la cadena principal de xilano y debido a su bajo peso tal vez no son detectadas y no se ve la influencia de ellas en cuanto a la liberación de oligómeros de arabinoxilanos. En lo que respecta a los resultados a las 48 horas de hidrólisis se observó que hay liberación de distintos oligómeros principalmente aquellos de peso molecular entre 843.84 a 354 g/mol así como en un aumento en aquellos de 117.04 g/mol.
0
4
8
12
16
7947
.37
7787
.12
7630
.10
7458
.55
7290
.87
7126
.95
6966
.72
6810
.09
6656
.98
6330
.96
6174
.95
6009
.50
5847
.55
5676
.50
5511
.33
5350
.97
5195
.27
5032
.96
4864
.19
4711
.48
4553
.49
4391
.08
4224
.44
4064
.13
3901
.26
3736
.06
3577
.86
3411
.24
3252
.38
3093
.59
2929
.10
2767
.23
1843
.28
1224
.53
1036
.29
781.
7552
9.60
294.
2417
9.95
117.
04
Abu
ndan
cia r
elat
iva (
%)
Peso molecular (g/mol)
61
Figura 5.16 Distribución de tamaños de los polisacáridos contenidos en muestras sometidas a tratamiento de hidrólisis con CTEC en conjunto con arabinofuranosidasa y acetilxilanesterasa desfasada. Las barras
azules indican la distribución a tiempo inicial, las rojas a las 24 horas y las verdes a las 48 horas. En la Figura 5.17 se muestra los resultados de la hidrólisis desfasada de CTEC con acetilxilanesterasa y feruloilesterasa, como podemos darnos cuenta a las 24 horas de reacción no se vió una formación de oligómeros a diferencia de a las 48 horas donde se comienza a apreciar la liberación de éstos principalmente aquellos con pesos de 531.87 y 295.78 g/mol.
Figura 5.17 Distribución de tamaños de los polisacáridos contenidos en muestras sometidas a tratamiento de hidrólisis con CTEC en conjunto con acetilxilanesterasa y feruloilesterasa desfasada. Las barras azules
indican la distribución a tiempo inicial, las rojas a las 24 horas y las verdes a las 48 horas.
0
5
10
15
20
25
7947
.37
7787
.12
7630
.10
7458
.55
7290
.87
7126
.95
6966
.72
6810
.09
6656
.98
6491
.92
6330
.96
6174
.95
6009
.50
5847
.55
5676
.50
5511
.33
5350
.97
5195
.27
5032
.96
4864
.19
4711
.48
4553
.49
4391
.08
4224
.44
4064
.13
3901
.26
3736
.06
3577
.86
3411
.24
3252
.38
3093
.59
2929
.10
2767
.23
2602
.36
2441
.91
1643
.88
1125
.15
843.
8452
8.43
354.
0025
8.18
117.
04
Con
cent
raci
ón (%
p/p)
Peso molecular (g/mol)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
7947
.37
7787
.12
7630
.10
7458
.55
7290
.87
7126
.95
6966
.72
6810
.09
6656
.98
6491
.92
6330
.96
6174
.95
6009
.50
5847
.55
5676
.50
5511
.33
5350
.97
5195
.27
5032
.96
4864
.19
4711
.48
4553
.49
4391
.08
4224
.44
4064
.13
3901
.26
3736
.06
3577
.86
3411
.24
3252
.38
3093
.59
2929
.10
2767
.23
1795
.59
900.
4253
1.87
295.
7818
1.29
Con
cent
raci
ón (%
p/p)
Peso molecular (g/mol)
62
En el caso de la Figura 5.18 podemos apreciar que el tratamiento desfasado con las tres enzimas accesorio seleccionadas y la xilanasa de Thermomyces lanuginosus no tuvo un gran impacto en cuanto a la producción de oligómeros puesto que mayoritariamente observamos la presencia de lo que correspondería a monómeros.
Figura 5.18 Distribución de tamaños de los polisacáridos contenidos en muestras sometidas a tratamiento
de hidrólisis desfasada con xilanasa de Thermomyces lanuginosus, arabinofuranosidasa, acetilxilanesterasa y feruloilesterasa. Las barras azules indican la distribución a tiempo inicial, las rojas a las 24 horas y las verdes a
las 48 horas. De manera general, las hidrólisis de los arabinoxilanos permitieron apreciar el impacto que
tienen las diversas enzimas utilizadas obteniéndose oligómeros de distinto peso molecular. El
empleo de la arabinofuranosidasa se vio ampliamente reflejado en todos los casos debido a la
presencia de monómeros probablemente correspondientes a la arabinosa liberada mientras que
el efecto de la acetilxilanesterasa y feruloilesterasa no fue tan apreciable. Cabe destacar que al
momento no sería posible decidir cuáles son las mejores combinaciones de enzimas debido a
que no se ha impuesto que característica debe de tener el producto obtenido, sin embargo se
puede determinar que combinación utilizar para obtener los oligómeros de los tamaños
identificados mediante la cromatografía de exclusión de tamaño. En general se observó que al
utilizar la xilanasa de Thermomyces lanuginosus se producen principalmente monómeros así
como oligómeros de cadenas medianas entre 5511 y 6091 g/mol.
0
5
10
15
20
25
7947
.37
7787
.12
7630
.10
7458
.55
7290
.87
7126
.95
6966
.72
6810
.09
6656
.98
6491
.92
6330
.96
6091
.66
5847
.55
5676
.50
5511
.33
5350
.97
5195
.27
5032
.96
4864
.19
4711
.48
4553
.49
4391
.08
4224
.44
4064
.13
3901
.26
3736
.06
3577
.86
3411
.24
3252
.38
3093
.59
2843
.87
1635
.08
815.
9361
6.88
491.
9539
5.13
333.
7522
2.32
117.
04
Con
cent
raci
ón (%
p/p)
Peso molecular (g/mol)
63
6 Conclusiones
Acorde a los resultados obtenidos y los objetivos propuestos en el presente trabajo se formulan
las siguientes conclusiones:
Al utilizar el coctel de CTEC en conjunto con la arabinofuranosidasa, de manera simultanea, se
obtuvieron oligómeros de arabinoxilanos de cadena corta, donde su mayoría consistió en
compuestos cuyo peso molecular fue inferior a los 1000 g/mol, al detener la reacción a las 24
horas. Por otro lado, también se generaron fracciones de oligómeros de cadenas medianas entre
5511 y 6091 g/mol.
El uso de cocteles enzimáticos para la recuperación de ácido ferúlico, como una molécula de
alto valor agregado, no fue significativo en las fracciones del nejayote debido, probablemente,
a que la mayor parte del ácido ferúlico ya había sido liberado durante el proceso de
nixtamalización.
El uso de la cromatografía de capa fina de alta resolución (HPTLC) permitió caracterizar las
distintas fracciones del nejayote. Se encontró que el precipitado etanólico cuenta con una mayor
pureza en compuestos de alto peso molecular, mientras que las demás fracciones presentan una
mezcla compleja de arabinoxilanos de distintos pesos moleculares.
El empleo de arabinoxilanos en el medio de cultivo como fuente de carbono permitió encontrar
hongos que fueron capaces de hidrolizar arabinoxilanos, sin embargo la maquinaria enzimática
que presentaron no fue eficiente en la obtención de oligómeros de arabinoxilanos.
64
7 Perspectivas
Evaluar las propiedades funcionales y/o tecnológicas de los productos de hidrólisis.
Explorar métodos de separación que permitan la recuperación de los oligómeros de cadena corta
generados en la hidrólisis.
Diseño e implementación de un sistema que permita la recuperación de los oligómeros de
arabinoxilanos a escala piloto.
65
8 Referencias bibliográficas
1. Adsul, M. G., J. E. Ghule, Singh, R. Shaikh, H. Bastawde, K. B. Gokhale, D. V., and
Varma, A. J. (2004), Polysaccharides from bagasse: applications in cellulase and
xylanase production. Carbohydrate Polymers No. 57, p. 67-72.
2. Agger J., Viksø-Nielsen A., Meyer AS., 2010 Enzymatic xylose release from pretreated
corn bran arabinoxylan: Differential effects of deacetylation and deferuloylation on
insoluble and soluble substrate fractions. J Agric Food Chem 58, 6141-6148.
3. Akhtar, M. (1994) Biomechanical Pulping of Aspen Wood Chips with Three Strains of
Ceriporiopsis subvermispora . Holzforschung . 48 , 199-202.
4. Alias, N. I., Mahadi, N. M., Munir, A., Murad, A., Abu, F. D., Rabu, A., & Illias, R. M.
(2011). Expression optimisation of recombinant α-L-arabinofuranosidase from
Aspergillus niger ATCC 120120 in Pichia pastoris and its biochemical characterisation,
10 (35), 6700–6710.
5. Andrade, S. D., M. Polizeli, H. F. Terenzi and J. A. Jorge (2004) Effect of carbon source
on the biochemical properties of beta-xylosidases produced by Aspergillus versicolor .
Process Biochem . 39 , 1931-1938.
6. Assaf A., Reyes M., Method and system for the integral treatment of wastewater from
the maize industry, WO2014119990, 2014.
7. Audesirk, T., G. Audesirk and B. E. Byers (2003) Biología: la vida en la tierra , 6 ed.,
Pearson Educación
8. Beauchemin, K. A., L. M. Rode and V. J. H. Sewalt (1995) Fibrolytic enzymes increase
fiber digestibility and growth rate of steers fed dry forages. Can. J. Anim. Sci. 75 , 641-
644.
66
9. Belghith, H., S. Ellouz-Chaabouni and A. Gargouri (2001) Biostoning of denims by
Penicillium occitanis (Po16) cellulases. J. Biotechnol. 89 , 257-262.
10. Benoit, I., D. Navarro, N. Marnet, N. Rakotomanomana, L. Lesage-Meessen, J. C.
Sigoillot, M. Asther and M. Asther (2006) Feruloyl esterases as a tool for the release of
phenolic compounds from agro-industrial by-products. Carbohydrates Research. 341 ,
1820-1827.
11. Benoit, I., E. G. J. Danchin, R. J. Bleichrodt and R. P. de Vries (2008) Biotechnological
applications and potential of fungal feruloyl esterases based on prevalence, classification
and biochemical diversity. Biotech Lett . 30 , 387-396.
12. Bhargav, S., Panda, B. P., Ali, M., Javed, S. (2008) Solid-state Fermentation: An
Overview. Chem. Biochem. Eng. 22 , 49-70.
13. Biely, P. (1985) Microbial xylanolytic systems. Trends in Biotechnology. 3 , 286- 290.
14. Biely, P., J. Puls, and H. Schneider, Acetyl xylan esterases in fungal cellulolytic systems
FEBS Letters, 1985. 186(1): p. 80-84.
15. Blanco, P., C. Sieiro and T. G. Villa (1999) Production of pectic enzymes in yeasts.
FEMS Microbiology Letters . 175 , 1-9.
16. Bressani, R. (1990). Chemistry, technology and nutritive value of maize tortillas. Food
Reviews International, 6: 225-264
17. Cao, L., Liu, X., Qian, T., Sun, G., Guo, Y., Chang, F., et al. (2010). Anti-tumor and
immunomodulatory activity of arabinoxylans: A major constituent of wheat bran.
International Journal of Biological Macromolecules, 48, 160–164.
67
18. Carvajal-Millan, E., Guilbert, S., Doublier, J.-L., & Micard, V. (2006).
Arabinoxylan/protein gels: Structural, rheological and controlled release properties.
Food Hydrocolloids, 20(1), 53–61.
19. Chaplin, M. F. and J. F. Kennedy (1986) Carbohydrate analysis a practical approach ,
Oxford Univ Pr
20. Cinar, I. (2005) Effects of cellulase and pectinase concentrations on the colour yield of
enzyme extracted plant carotenoids. Process Biochem . 40 , 945-949.
21. Courtin CM, Delcour JA. Arabinoxylans and endoxylanase in wheat flour bread making.
J Cereal Sci. 2002; 35: 225-243.
22. Crepin, V. F., C. B. Faulds and I. F. Connerton (2004) Functional classification of the
microbial feruloyl esterases. Appl. Microbiol. Biotechnol. 63 , 647-652.
23. de Vries, R. P., H. C. M. Kester, C. H. Poulsen, J. A. E. Benen and J. Visser (2000)
Synergy between enzymes from Aspergillus involved in the degradation of plant cell
wall polysaccharides. Carbohydr Res . 327 , 401-410.
24. Domínguez R., Pacho D. (2003). Efluentes de la industrialización del maíz:
contaminante o recurso valioso. Revista de la Universidad Autónoma de Yucatán.
25. Donaghy, J. A. and A. M. McKay (1995) Production of feruloyl/ p-coumaroyl esterase
activity by Penicillium expansum, Penicillium brevicompactum and Aspergillus niger.
Journal of Applied Microbiology . 79 , 657-662.
26. Dornez E, Gebruers K, Cuyvers S, Dekcour JA, Courtin CM. Impact of wheat
flourassociated endoxylanases on arabinoxylan in dough after mixing and resting. J.
Agric Food Chem. 2007; 55: 7149-7155.
68
27. Dornez E. Insight into the distribution and variability of endoxylanases in wheat and
their functionality during bread making. Tesis de doctorado. 2007. Facultad de
Ingeniería en Biociencias. Universidad Católica de Lovaina.
28. Ebringerova, A., Hromadkova, Z., & Heinze, T. H. (2005). Hemicellulose. Advances in
Polymer Science, 128, 1-68.
29. Ebune, A., S. Alasheh and Z. Duvnjak (1995) Production of phytase during Solid-State
Fermentation using Aspergillus ficuum NRRL-3135 in canola meal. Bioresource
Technology. 53, 7-12.
30. Fan L, Pandey A, Mohan R, Soccol CR (2000) Use of various coffee industry residues
for the cultivation of Pleurotus ostreatus in solid state fermentation. Acta Biotechnol
20:41–52
31. Faulds, C. B., D. Zanichelli, V. F. Crepin, I. F. Connerton, N. Juge, M. K. Bhat and K.
W. Waldron (2003) Specificity of feruloyl esterases for water-extractable and
waterunextractable feruloylated polysaccharides: influence of xylanase. Journal of
Cereal Science . 38 , 281-288.
32. Faulds, C. B., M. C. Ralet, G. Williamson, G. P. Hazlewood and H. J. Gilbert (1995)
Specificity of an esterase (Xyld) from Pseudomonas fluorescens Subsp cellulosa.
Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects . 1243 , 265-269.
33. Felix, C. R. and L. G. Ljungdahl (1993) The cellulosome - The exocellular organelle of
Clostridium . Annu. Rev. Microbiol. 47 , 791-819.
34. Fincher, G. B., & Stone, B. A. (1986). Cell walls and their components in cereal grain
technology. Advances in Cereal Science and Technology, 8, 207-295.
69
35. Franks, N. E., S. E. Bazewicz and H. C. Holm (1996) Use of monocomponent cellulase
for removing inks, coatings, and toners from printed paper Novo Nordisk A/S, Denmark
36. Fuentes-Alventosa, J. M., Jaramillo-Carmona, S., Rodríguez-Gutiérrez, G., Rodríguez-
Arcos, R., Fernández-Bolaños, J., Guillén-Bejarano, R.,Jiménez-Araujo, a. (2009).
Effect of the extraction method on phytochemical composition and antioxidant activity
of high dietary fibre powders obtained from asparagus by-products. Food Chemistry,
116(2), 484–490.
37. Galante, Y. M., A. De Conti and R. Monteverdi (1998) Application of Trichoderma
enzymes in food and feed industries. Trichoderma & Gliocladium Enzymes, Biological
Control and Comercial Applications . Harman, G. F. and Kubicek, C. P. (eds.), pp 327-
342 London
38. Gebruers K, Domez E, Boros D, Fras A, Dynkowska W, Bed Z, Rakszegi M, Delcour
JA, Courtin CM, 2008. Variation in the content of dietary fiber and components thereof
in wheats in the HEALTHGRAIN diversity screen. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 56: 9740–9749.
39. Gilkes, N. R., R. C. Miller, D. G. Kilburn and R. A. J. Warren (1991) The structural and
functional organization of cellulomonas-fimi cellulases. Abstracts of Papers of the
American Chemical Society . 202 , 207-BIOT.
40. Giuliani, S., C. Piana, L. Setti, A. Hochkoeppler, P. G. Pifferi, G. Williamson and C. B.
Faulds (2001) Synthesis of pentylferulate by a feruloyl esterase from Aspergillus niger
using water-in-oil microemulsions. Biotech Lett . 23 , 325-330.
41. Graham, H. and D. Balnave (1995) Dietary enzymes for increasing energy availability.
Biotechnology in Animal Feeds and Animal Feeding . Chesson, R. J. W. a. A. (ed.), pp
296-309 Weinheim, Germany
70
42. Grant EC, 1979. Food allergies and migraine. Lancet, 1: 66–69.
43. Hadjivassiliou M, Grunewald RA, Sharrack B, Sanders D, Lobo A, Williamson C,
Woodroofe N, Wood N, Davies-Jones A, 2003. Gluten ataxia in perspective:
epidemiology, genetic susceptibility and clinical characteristics. Brain, 126: 685–691.
44. Henrissat, B., M. Claeyssens, P. Tomme, L. Lemesle and J. P. Mornon (1989) Cellulase
families revealed by hydrophobic cluster-analysis. Gene . 81 , 83-95.
45. Hernández, A., I. Alfaro and R. Arrieta (2003) Microbiología Industrial , 1 ed., Euned,
Costa Rica
46. Hoondal, G. S., R. P. Tiwari, R. Tewari, N. Dahiya and Q. K. Beg (2002) Microbial
alkaline pectinases and their industrial applications: a review. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 59 , 409-418.
47. Ikasari, L. and D. A. Mitchell (1996) Leaching and characterization of Rhizopus
oligosporus acid protease from solid-state fermentation. Enzyme and Microbial
Technology . 19 , 171- 175.
48. Izydorczyk, M. S., & Biliaderis, C. G. (2007). Arabinoxylans: Technologically and
nutritionally functional plant polysaccharides. In C. G. Biliaderis, & M. S. Izydorczyk
(Eds.),Functional food carbohydrates (pp. 249–290). Boca Raton: CRC Press.
49. Kamini, N. R., J. G. S. Mala and R. Puvanakrishnan (1998) Lipase production from
Aspergillus niger by solid-state fermentation using gingelly oil cake. Process Biochem.
33 , 505-511.
50. Kaneko, S., T. Shimasaki and I. Kusakabe (1993) Purification and some properties of
intracelular alpha-l-arabinofuranosidase from Aspergillus-niger 5-16. Bioscience
Biotechnology and Biochemistry . 57 , 1161-1165.
71
51. Kashyap, D. R., P. K. Vohra, S. Chopra and R. Tewari (2001) Applications of pectinases
in the commercial sector: a review. Bioresource Technology . 77 , 215-227.
52. Kikuzaki, H., M. Hisamoto, K. Hirose, K. Akiyama and H. Taniguchi (2002)
Antioxidant properties of ferulic acid and its related compounds. J Agric Food Chem .
50 , 2161-2168.
53. Koseki T., Miwa Y., Akao T., Akita O., Hashizume K. 2006. An Aspergillus oryzae
acetyl xylan esterase: molecular cloning and characteristics of recombinant enzyme
expressed in Pichia pastoris. Journal of Biotechnology, 121(3):381-9.
54. Kroon, P. A. and G. Williamson (1999) Hydroxycinnamates in plants and food: current
and future perspectives. Journal of the Science of Food and Agriculture . 79 , 355-361.
55. Kroon, P. A., C. B. Faulds and G. Williamson (1996) Purification and characterization
of a novel esterase induced by growth of Aspergillus niger on sugar-beet pulp.
Biotechnology and Applied Biochemistry. 23, 255-262.
56. Lapierre C., Pollet B., Ralet M.C., Sauliner L., 2001 The phenolic fraction of maize bran:
evidence for lignin-heteroxylan association. Phytochemistry 57, 765-72.
57. Lee, J. (1997) Biological conversion of lignocellulosic biomass to ethanol. J. Biotechnol.
56, 1-24.
58. Mandviwala, T. N. and J. M. Khire (2000) Production of high activity thermostable
phytase from thermotolerant Aspergillus niger in solid state fermentation. Journal of
Industrial Microbiology & Biotechnology. 24, 237-243.
59. Martins ES, Silva D, da Silva R, Gomes E (2002) Solid state production of thermostable
pectinase from thermophilic Thermoascus aurantiacus. Process Biochem 37:949–954
72
60. Mateos Diaz, J. C., J. A. Rodríguez, S. Roussos, J. Cordova, A. Abousalham, F. Carriere
and J. Baratti (2006) Lipase from the thermotolerant fungus Rhizopus homothallicus is
more thermostable when produced in solid state fermentation compared to liquid
fermentation. Enzyme Microb. Tech. 39 , 1042-1050.
61. Mathews, C. K., K. E. Van Holde and K. G. Ahern (2002) Bioquímica, 3 ed.
62. Miller, G. L. (1959) Use of Dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing
sugar. Anal. Chem. 31, 426-428.
63. Murakami, A., Y. Nakamura, K. Koshimizu, D. Takahashi, K. Matsumoto, K. Hagihara,
H. Taniguchi, E. Nomura, A. Hosoda, T. Tsuno, Y. Maruta, H. W. Kim, K. Kawabata
and H. Ohigashi (2002) FA15, a hydrophobic derivative of ferulic acid, suppresses
inflammatory responses and skin tumor promotion: comparison with ferulic acid.
Cancer. Lett. 180, 121-129.
64. Murashima, K., T. Nishimura, T., Nakamura, Y., Koga, J., Moriya, T., Sumida, N.,
Yaguchi, T. and Kono, T. (2002), Purification and characterization of new endo-1,4-β-
glucanases from Rhizopus oryzae. Enzyme and Microbial Technology No. 30, p. 319-
326.
65. Negishi, O., K. Sugiura and Y. Negishi (2009) Biosynthesis of Vanillin via Ferulic Acid
in Vanilla planifolia. J Agric Food Chem. 57, 9956-9961.
66. Niño-medina, G., Carvajal-millán, E., Lizardi, J., Rascon-chu, A., Marquez-escalante, J. A., Gardea, A., Guerrero, V. (2009). Maize processing waste water arabinoxylans : Gelling capability and cross-linking content. Food Chemistry, 115(4), 1286–1290.
73
67. Pajunen, E. (1986) Optimal use of β-glucanases in wort production. EBC-Symposium
on Wort Production, pp 137-148 Maffliers, France
68. Panagiotou G, Kekos D, Macris BJ, Christakopoulos P (2003) Production of cellulolytic
enzymes by Fusarium oxysporum grown on corn stover in solid state fermentation. Ind
Crops Prod 18:37–45
69. Pastor, G. P. (2006) Microbiología Clínica , Editorial Médica Panamericana
70. Pere, J., L. Paavilainen, M. Siika-aho and L. Viikari (1996) Potential use of enzymes in
drainage control of nonwood pulps. Proc 3rd Int Non-wood Fibre Pulping and Paper
Making Conf , pp 421-430 Beijing, China
71. Polanco-Jaime, Alejandro y Trinidad Flores Méndez (2008), Bases para una política de
I&D e innovación de la cadena de valor del maíz, Foro Consultivo y Científico, A.C.,
México
72. Polizeli, M. L. T. M., A. C. S. Rizzatti, R. Monti, H. F. Terenzi, J. A. Jorge and D. S.
Amorim (2005) Xylanases from fungi: properties and industrial applications. Appl.
Microbiol. Biotechnol. 67, 577-591
73. Punt, P. J., N. van Biezen, A. Conesa, A. Albers, J. Mangnus and C. van den Hondel
(2002) Filamentous fungi as cell factories for heterologous protein production. Trends
in Biotechnology. 20, 200-206.
74. Ralph J., Quideau S., Grabber J.H., Hatfield R.D., (1994) Identification and synthesis of
new ferulic acid dehydrodimers present in grass cell walls. J Chem Soc Perkin Trans 1,
3485-3498.
74
75. Ramachandran, S., A. K. Patel, K. M. Nampoothiri, S. Chandran, G. Szakacs, C. R.
Soccol and A. Pandey (2004) Alpha amylase from a fungal culture grown on oil cakes
and its properties. Braz arch. biol. technol. 47, 309-317.
76. Ramirez, L., et al., A New Microplate Screening Method for the Simultaneous Activity
Quantification of Feruloyl Esterases, Tannases, and Chlorogenate Esterases. Applied
Biochemistry and Biotechnology, 2008. 151(2-3): p. 711-723.
77. Record, E., M. Asther, C. Sigoillot, S. Pages, P. J. Punt, M. Delattre, M. Haon, C. van
den Hondel, J. C. Sigoillot, L. Lesage-Meessen and M. Asther (2003) Overproduction
of the Aspergillus niger feruloyl esterase for pulp bleaching application. Appl.
Microbiol. Biotechnol. 62, 349-355.
78. Reddy BS, Hirose Y, Cohen LA, Simi B, Cooma I, Rao CV, (2000). Preventive potential
of wheat bran fractions against experimental colon carcinogenesis: implications for
human colon cancer prevention. Cancer Research, 60: 4792–4797.
79. Reddy GV, Babu PR, Komaraiah P, Roya KRRM, Kothari IL (2003) Utilization of
banana waste for the production of ligninolytic and cellulolytic enzymes by solid
substrate fermentation using two Pleurotus species (P. ostreatus and P. sajor-caju).
Process Biochem 38:1457–1462
80. Reid, I. and M. Ricard (2000) Pectinase in papermaking: solving retention problems in
mechanical pulps bleached with hydrogen peroxide. Enzyme and Microbial Technology.
26 , 115-123.
81. Reis, S. F., & Abu-Ghannam, N. (2014). Antioxidant capacity, arabinoxylans content
and in vitro glycaemic index of cereal-based snacks incorporated with brewer’s spent
grain. LWT - Food Science and Technology, 55(1), 269–277.
75
82. Romero, M. D., J. Aguado, L. Gonzalez and M. Ladero (1999) Cellulase production by
Neurospora crassa on wheat straw. Enzyme and Microbial Technology. 25, 244-250.
83. Saha B.C., Dien B.S., Bothast R.J., 1998 Fuel ethanol production from corn fiber.
Current status and technical prospects. Appl Biochem Biotechnol 70-72, 115-125.
84. Salazar, L. and U. Jayasinghe (1999) Fundamentals of Purification of Plant Viruses.
Techniques in plant virology. , , pp 1-10, International potato center Peru
85. Serna-Saldívar, S.O., Gómez, M. H. and Rooney, L. W. 1990. The chemistry,
technology and nutritional value of alkaline-cooked corn products. Advances in Cereal
Chemistry and Technology, 10: 243-307.
86. Sigoillot, C., S. Camarero, T. Vidal, E. Record, M. Asther, M. Perez-Boada, M. J.
Martinez, J. C. Sigoillot, J. F. Colom and A. T. Martinez (2005) Comparison of different
fungal enzymes for bleaching high-quality paper pulps. J. Biotechnol. 115 , 333-343.
87. Singh, S. A., M. Ramakrishna and A. G. Appu Rao (1999) Optimisation of downstream
processing parameters for the recovery of pectinase from the fermented bran of
Aspergillus carbonarius. Process Biochem . 35 , 411-417.
88. Singhania, R. R., R. K. Sukumarana, A. K. Patelb, C. Larrocheb and A. Pandey (2010)
Advancement and comparative profiles in the production technologies using solid-state
and submerged fermentation for microbial cellulases. Enzyme and Microbial
Technology . 46 , 541-549.
89. Sistema de Información Agropecuaria (SIAP). 2008. Sistema de Información
Agropecuaria de Consulta. SAGARPA. México. URL: http://
www.siap.sagarpa.gob.mx/ar_comanuar. html.
76
90. Soni, R., A. Nazir and B. S. Chadha (2010) Optimization of cellulase production by a
versatile Aspergillus fumigatus fresenius strain (AMA) capable of efficient deinking and
enzymatic hydrolysis of Solka floc and bagasse. Industrial Crops and Products. 31, 277-
283.
91. Soriano, M. (2004) Análisis de sistemas pectinolíticos bacterianos. Aislamiento y
caracterización de las pectinasas PelA de Paenibacillus sp. BP-23 e YvpA de Bacillus
subtilis. Departamento de microbiología , pp 95, Facultad de Biología de la Universidad
de Barcelona Barcelona
92. St John, F. J., J. D. Rice and J. F. Preston (2006) Paenibacillus sp strain JDR-2 and
XynA(1): a novel system for methylglucuronoxylan utilization. Applied and
Environmental Microbiology. 72, 1496-1506.
93. Sukumaran, R. K., R. R. Singhania and A. Pandey (2005) Microbial cellulases -
Production, applications and challenges. J. Sci. Ind. Res. 64, 832-844.
94. Sun, Y. and J. Cheng (2002) Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol
production: a review. Bioresour Technol. 83, 1-11.
95. Tabka, M. G., I. Herpoel-Gimbert, F. Monod, M. Asther and J. C. Sigoillot (2006)
Enzymatic saccharification of wheat straw for bioethanol production by a combined
cellulase, xylanase and feruloyl esterase treatment. Enzyme and Microbial Technology.
39 , 897-902.
96. Tagawa, K. and Kaji, A. (1988). α-LArabinofuranosidase from Aspergillus niger.
Methods in Enzymology, 160, 707-712.
97. Tapin, S., J. C. Sigoillot, M. Asther and M. Petit-Conil (2006) Feruloyl esterase
utilization for simultaneous processing of nonwood plants into phenolic compounds and
pulp fibers. J Agric Food Chem. 54, 3697-3703.
77
98. Tee-ngam, P. (2013). Simple and Rapid Determination of Ferulic Acid Levels in Food and Cosmetic Samples Using Paper-Based Platforms, 1, 13039–13053.
99. Terrasan, C. R. F., B. Temer, M. C. T. Duarte and E. C. Carmona (2010) Production of
xylanolytic enzymes by Penicillium janczewskii. Bioresource Technology. 101, 4139-
4143.
100. Thakore, Y. B. (2005) Enzymes for industrial applications. Market Research Report
BIO030E, BCC Research: 241
101. Topakas, E., C. Vafiadi and P. Christakopoulos (2007) Microbial production,
characterization and applications of feruloyl esterases. Process Biochem . 42 , 497-509.
102. Topakas, E., C. Vafiadi, H. Stamatis and P. Christakopoulos (2005) Sporotrichum
thermophile type C feruloyl esterase (StFaeC): purification, characterization, and its use
for phenolic acid (sugar) ester synthesis. Enzyme and Microbial Technology. 36, 729-
736.
103. Topakas, E., H. Stamatis, P. Biely, D. Kekos, B. J. Macris and P. Christakopoulos (2003)
Purification and characterization of a feruloyl esterase from Fusarium oxysporum
catalyzing esterification of phenolic acids in ternary water-organic solvent mixtures. J.
Biotechnol. 102, 33-44.
104. Tunga, R., B. Shrivastava and R. Banerjee (2003) Purification and characterization of a
protease from solid state cultures of Aspergillus parasiticus. Process Biochem. 38, 1553-
1558.
105. Ulber, R. and D. Sell (2007) White biotechnology, Springer
78
106. Vafiadi, C., E. Topakas and P. Christakopoulos (2006) Regioselective esterase-catalyzed
feruloylation of L-arabinobiose. Carbohydr Res. 341, 1992-1997.
107. Viikari, L., M. Tenkanen and A. Suurnäkki (2001) Biotechnology in the pulp and paper
industry. Biotechnology Rehm, H. J. (ed.), pp 523-546, VCH-Wiley Takagishi, Japan
108. Warren, R. A. J. (1996) Microbial hydrolysis of polysaccharides. Annu. Rev. Microbiol.
50, 183-212.
109. Woese, C. R. and G. E. Fox (1977) Phylogenetic structure of prokaryotic domain –
primary kingdoms. Proc Natl Acad Sci U S A. 74, 5088-5090.
110. Wong, K. K. Y., L. U. L. Tan and J. N. Saddler (1988) Multiplicity of beta-1,4-xylanase
in microorganisms - Functions and applications. Microbiol. Rev. 52, 305-317.
111. Wood T, M. and C. S. I. Mc (1979) Synergism Between Enzymes Involved in the
Solubilization of Native Cellulose. Hydrolysis of Cellulose: Mechanisms of Enzymatic
and Acid Catalysis, pp 181-209, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY
112. Wood, T. M. and M. Bhat (1988) Methods for measuring cellulase activities. Methods
in Enzymology. Wood, W. A. (ed.), pp 87-112, Academic Press New York
113. Yadav, M. P., Johnston, D. B., Hotchkiss, A. T., & Hicks, K. B. (2007). Corn fiber gum:
A potential gum arabic replacer for beverage flavor emulsification. Food Hydrocolloids,
21(7), 1022–1030. http://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2006.07.009
114. Yang, J. L., J. M. Pierce and K. E. L. Eriksson (2004) Composition for enzymatic
deinking of waste paper. Foundation, U. o. G. R. (ed.) Athens, USA
115. Zanoelo, F. F., M. Polizeli, H. F. Terenzi and J. A. Jorge (2004) Purification and
biochemical properties of a thermostable xylose-tolerant beta-D-xylosidase from
79
Scytalidium thermophilum. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 31 ,
170-176.
80
A. Anexo A
A.1 Curva estándar de glucosa
Figura A.1 Curva estándar de glucosa (µM). Cuantificado por el método de Miller (1959) con algunas
modificaciones A.2 Curva estándar de xilosa
Figura A.2 Curva estándar de xilosa (µM). Cuantificado por el método de Miller (1959) con algunas
modificaciones
y = 0.1737x + 0.1181R² = 0.99637
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 2 4 6 8 10 12
Abs
orba
ncia
(410
nm)
µM de glucosa
y = 0.1787x + 0.0917R² = 0.99012
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 2 4 6 8 10 12 14
Abs
orba
ncia
(410
nm)
µM de xilosa
81
A.3 Curva estándar de Ácido Ferúlico
Figura A.3. Curva estándar de ácido ferúlico. Cuantificado por el método de Ramírez y col. (2008) con
algunas modificaciones.
A.4 Curva estándar de p-nitrofenol para actividad acetilxilanesterasa
Figura A.4 Curva estándar de p-nitrofenol (µM). Cuantificado por el método de Biely y col.
(1985) con algunas modificaciones.
y = -0.0007x + 1.428 R² = 0.9941
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
0 300 600 900 1200 1500
Abs
orba
ncia
a 4
10nm
µM de Ácido Ferúlico
y = 0.0027x + 0.049R² = 0.99997
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 50 100 150 200 250 300 350
Abs
orba
ncia
(410
nm)
µM de p-nitrofenol
82
A.5 Curva estándar de p-nitrofenol para actividad arabinofuranosidasa
Figura A.5 Curva estándar de p-nitrofenol (µM). Cuantificado por el método de TagawayKaji (1988) con algunas modificaciones.
A.6 Curva estándar de dextrano
Figura A.6 Curva estándar de dextrano. Cuantificada con el método descrito en la sección 4.6.4
y = 0.0017x + 0.0697R² = 0.99886
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 100 200 300 400 500
Abs
orba
ncia
(410
nm
)
µM de p-nitrofenol
y = -0.4642x + 1.8135R² = 0.99541
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0.700
0.800
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
Kav
Log PM
BÚSQUEDA Y SELECCIÓN DE HONGOS FILAMENTOSOS CAPACES DE HIDROLIZAR ARABINOXILANOS PRESENTES EN EL NEJAYOTE
H. Y. Guerrero Elias a, J. A. Rodríguez González
a, J. A Assaf Torres
b, J. C. Mateos Díaz
a, R. M. Camacho Ruiz
a* a Unidad de biotecnología industrial, Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco A.C.,
Av. Normalistas No. 800 Colonia Colinas de la Normal, Guadalajara, Jalisco, CP 44270 MÉXICO. [email protected] b Laboratorio de Biotecnología Industrial, Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C. (CIAD), Carretera a la
Victoria Km. 0.6, Hermosillo, Sonora, 83304, MÉXICO.
Resumen
El nejayote es un subproducto de la industria de la nixtamalización, el cual contiene moléculas disueltas que pueden ser recuperadas y aprovechadas, entre las cuales destacan los arabinoxilanos ferulados que son polisacáridos complejos que tienen diversas propiedades tecnológicas y funcionales de interés biotecnológico. Los hongos filamentosos son microorganismos capaces de adaptarse de manera exitosa a distintos sustratos, es por esto que se consideraron para la búsqueda de enzimas que permitan la hidrólisis parcial y recuperación de oligomeros de arabinoxilanos que pueden tener un alto valor agregado. Se estudiaron 35 hongos de las colecciones CIAD-CIATEJ, los cuales se inocularon en un medio que contenía arabinoxilanos ferulados (FAXX) de cadena larga como fuente de carbono, los extractos generados a partir de los cultivos fueron analizados por cromatografía en capa fina de alto rendimiento (HPTLC) buscando perfiles de hidrólisis de FAXX, donde se observó la liberación de oligomeros de arabinoxilanos, encontrando 14 cepas candidatas de interés.
Introducción
Los arabinoxilanos son cadenas de xilano las cuales contienen residuos de otros carbohidratos como glucosa, arabinosa, galactosa e incluso algunos compuestos fenólicos como el ácido ferúlico y p-cumárico, estos están presentes en diversas fuentes [1,2,3] y se han convertido en moléculas de alto interés biotecnológico debido a que presentan propiedades tecnológicas como emulsificantes y gelificantes [3] y también algunas propiedades funcionales tales como antioxidantes, prebióticos, fortalecedores del sistema inmune [4] entre otras. El nejayote es la fracción acuosa obtenida como subproducto del proceso de la nixtamalización, éste se considera un agente altamente contaminante debido a las condiciones a las cuales es desechado del proceso (pH 10-14, temperatura 60-80º C, DBO 7000-10000 mg O2/L) además que se generan entre 16 y 22 millones de m3 al año de este residuo por lo que se le considera un grave problema para el medio ambiente [5].
Las sacaridasas como las amilasas, celulasas y xilanasas en conjunto con las carbohidrato-esterasas como las feruloilesterasas y acetilxilanesterasas, son un grupo de enzimas capaces de hidrolizar cadenas de oligosacáridos y polisacáridos que permiten la recuperación de moléculas que pueden ser aprovechadas y a las que se les puede dar valor agregado por lo cual han sido utilizadas para la sacarificación de distintos residuos como cascarilla de maíz, residuos de café, desechos de plátano, bagazo de naranja, rastrojo de maíz, entre otros [6,7,8,9,10], es por esta razón que este trabajo esta enfocado a la selección de microorganismos que sean capaces de producir esta clase de herramientas biotecnológicas para la liberación y posterior recuperación de oligomeros de arabinoxilanos de alto valor agregado a partir de fracciones de nejayote.
Memorias del XXXVI Encuentro Nacional de la AMIDIQ
5 al 8 de Mayo de 2015, Cancún, Quintana Roo, México
1120
© 2015 Academia Mexicana de Investigación y Docencia en Ingeniería Química
ISBN 978-607-95593-3-5
Metodología Obtención de arabinoxilanos. Los arabinoxilanos (FAXX) utilizados en el presente trabajo se obtuvieron mediante un sistema de filtración de membranas [11], y utilizando etanol para precipitar los arabinoxilanos, de cadena larga, retenidos en la membrana de 200 Da, los cuales fueron liofilizados para su mejor manejo y conservación. Crecimiento de hongos. Se emplearon 35 hongos, 33 de la colección de CIATEJ y dos de la colección de CIAD, los cuales fueron cultivados por picadura en cajas Petri de (30x15mm) en un medio de cultivo formulado con un medio mínimo mineral [12] compuesto de: 5 g/L fosfato dibásico de potasio (K2HPO4), 1 g/L de sulfato de magnesio (MgSO4) y 4 g/L de urea (CO(NH2)2), al cual se le agregó como fuente de carbono 0.5 g/L glucosa, para propiciar el crecimiento del hongo, y, además, 20 g/L de los FAXX obtenidos por liofilizado del precipitado etanólico y agar a 15 g/L ajustando el pH a 6.5 con ácido fosfórico (H3PO4). HPTLC de carbohidratos. El medio de cultivo fue recuperado y homogeneizado mediante un homogeneizador de tejido, posteriormente se centrifugó a 13,000 rpm por 10 minutos tomándose el sobrenadante para ser inyectado, utilizando el equipo de inyección CAMAG, en placas aminadas (MACHEREY-NAGEL). Se utilizaron estándares de glucosa, xilosa, arabinosa, ácido ferúlico, ácido p-cumárico y ácido sinapínico. Las placas fueron colocadas en cámaras de migración que contenían una fase móvil compuesta de n-butanol/metanol/agua/ácido acético (50/25/20/1, v/v/v/v) durante cuatro horas, posteriormente la placa fue fijada a 180º C durante 20 minutos y revelada con una solución de etanol/ácido sulfúrico/anisaldehido (18/1/1, v/v/v) y calentamiento a 120º C por 10 minutos. Resultados Durante 8 días se realizó una cinética de crecimiento de los 35 hongos cultivados, se observó crecimiento en 14 cepas demostrando la capacidad de estos hongos de utilizar a los FAXX como fuente de carbono (Figura 1). Se tomaron muestras de los cultivos cada dos días con lo cual fue posible identificar por HPTLC la liberación de oligomeros de FAXX generados por el cultivo de hongos filamentosos, como Aspergillus terreus, sobre arabinoxilanos de cadena larga. En la Figura 2 se presenta la cinética de cuatro de los hongos estudiados, se observan los FAXX de cadena larga como una banda intensa en el depósito de la placa (t0). Conforme la fermentación fue transcurriendo se observa la liberación de monosacáridos (G, X, A) así como la presencia de bandas intermedias con Rf de: 0.07, 0.13 0.16, 0.24 correspondientes al perfil que tienen los oligómeros de arabinoxilanos los cuales no existían al inicio de la cinética, siendo dichos oligómeros de gran interés.
Figura 1. Cultivo en placa Petri al octavo día de crecimiento, a) Aspergillus terreus (At 17), b) Aspergillus ochraceus (Aoc),
c) Trichoderma sp (B) y d) Aspergillus sp (N).
a) b) c) d)
Memorias del XXXVI Encuentro Nacional de la AMIDIQ
5 al 8 de Mayo de 2015, Cancún, Quintana Roo, México
1121
© 2015 Academia Mexicana de Investigación y Docencia en Ingeniería Química
ISBN 978-607-95593-3-5
Figura 2. Placa de HPTLC, de izquierda a derecha se muestran los estandares de glucosa (G), xilosa (X), arabinosa (A),
ácido ferúlico (AF), ácido p-cumárico (APC), ácido sinapínico (AS), medio de cultivo a tiempo cero (to), cinética de SPBL
310 (días 2,4,6,8), cinética de Aspergillus terreus 102 (días 2,4,6,8) y cinética de Aspergillus terreus 17 (días 2,4,6,8). En la Tabla 1 se muestran los hongos que presentaron mayor intensidad en las bandas que aparecen en las placas de HPTLC, lo cual nos sugiere que son aquellos que generaron la maquinaria enzimática necesaria para aprovechar los oligomeros de arabinoxilanos presentes en el medio de cultivo. Algunos de éstos hongos ya han sido identificados molecularmente determinandose así su genero, además la mayoria de los hongos pertenecientes a éstos generos identificados ya han sido reportados como productores de celulasas, xilanasas [13,14,15] y feruloilesterasas [16]. Tabla 1. Hongos candidatos de la colección CIAD-CIATEJ capaces de hidrolizar los oligomeros de arabinoxilanos presentes
en el nejayote. CLAVE CEPA ACTIVIDAD REPORTADA IDENTIFICACIÓN MOLECULAR
B Hongo verde Xilanasa Trichoderma E CHJ-1b-III Celulasa N.D. K Jojo 3 verde Xilanasa N.D. N MIII-11f-1g Xilanasa Aspergillus O MIII-II-ZL - N.D. P Jojo-1-café - N.D. R C2 - N.D. T MIII-IIf-2g Xilanasa N.D. V Jojo-1-gris Xilanasa Aspergillus W MIVIM-2b amarillo - N.D. Y II5-2c-blanco - N.D.
AD MIII-O-2b Celulasa Penicillium Aoc Aspergillus ochraceus Feruloilesterasa Aspergillus ochraceus
At 17 Aspergillus terreus Xilanasa
Feruloilesterasa Aspergillus terreus
Conclusiones El empleo de un medio de cultivo cuya fuente de carbono mayoritaria son los arabinoxilanos de cadena larga, provenientes del nejayote, permitió encontrar 14 hongos que fueron capaces de hidrolizar los FAXX de cadena larga y producir oligómeros de cadena corta que son de gran interés biotecnológico.
Memorias del XXXVI Encuentro Nacional de la AMIDIQ
5 al 8 de Mayo de 2015, Cancún, Quintana Roo, México
1122
© 2015 Academia Mexicana de Investigación y Docencia en Ingeniería Química
ISBN 978-607-95593-3-5
Para conocer que enzimas son las que llevan a cabo la hidrólisis durante el cultivo, se plantea realizar una cinética para monitorear la actividad de las enzimas presentes en cada etapa de la hidrólisis utilizando a los candidatos encontrados así como la identificación de los oligómeros generados. Agradecimientos H. Guerrero agradece el financiamiento de beca de maestria y del proyecto PEI 2013-200209 otorgado por el CONACyT. Referencias 1. Mandalari G., Faulds C., Sancho A., Saija A., Bisignano G., LoCurto R., Waldron K., Fractionation and characterisation
of arabinoxylans from brewers’ spent grain and wheat bran. Journal of Cereal Science, No. 42, p 205–212, 2005 2. Saulnier L., Vigouroux J., Thibault J., Isolation and partial characterization of feruloylated oligossacharides from maize
bran, Carbouhydrate research, No. 272, p. 241-253, 1995. 3. Niño-Medina, G., Carvajal-Millán, E., Rascón-Chu, A., & Márquez-Escalante, J., Ferulated arabinoxylans and
arabinoxylans gels: structure, sources and applications, Phytochemistry Reviews, No.9, p. 111-120, 2010 4. Saeed, F., Pasha, I., Anjum, F. M., & Sultan, M. T., Arabinoxylans and arabinogalactans: a comprehensive treatise,
Journal of Food Science and Nutrition, No. 51, p. 467-476, 2011. 5. Domínguez R., Pacho D., Efluentes de la industrialización del maíz: contaminante o recurso valioso, Revista de la
Universidad Autónoma de Yucatán, No. 227, p. 54-63, 2003. 6. Faulds, C.B., Kroon, P.A., Saulnier, L., Thibault, J.F., Williamson, G., Release of ferulic acid from maize bran and
derived oligosacharides by Aspergillus niger esterases. Carbohydrate Polymers No. 27, p. 187-190, 1995. 7. Fan L., Pandey A., Mohan R., Soccol C., Use of various coffee industry residues for the cultivation of Pleurotus ostreatus
in solid state fermentation. Acta Biotechnol No. 20, p. 41–52 2000. 8. Reddy G., Babu P., Komaraiah P., Roya K., Kothari I., Utilization of banana waste for the production of ligninolytic and
cellulolytic enzymes by solid substrate fermentation using two Pleurotus species (P. ostreatus and P. sajor-caju). Process
Biochem No. 38, p. 1457–1462, 2003. 9. Martins E., Silva D., da Silva R., Gomes E., Solid state production of thermostable pectinase from thermophilic
Thermoascus aurantiacus. Process Biochem No. 37, p.949–954, 2002. 10. Panagiotou G., Kekos D., Macris B., Christakopoulos P. Production of cellulolytic enzymes by Fusarium oxysporum
grown on corn stover in solid state fermentation. Ind Crops Prod No.18, p.37–45, 2003. 11. Assaf A., Reyes M., Method and system for the integral treatment of wastewater from the maize industry,
WO2014119990, 2014. 12. Rodriguez, J. A., Mateos J., Nungaray J., González V., Bhagnagar T., Roussos S., Cordova J. and Baratti J., Improving
lipases production by nutrient source modification using Rhizopus homothallicus cultured in solid state fermentation. Process Biochem No. 41, p. 2264-2269, 2006.
13. Adsul, M. G., J. E. Ghule, Singh, R. Shaikh, H. Bastawde, K. B. Gokhale, D. V., and Varma, A. J., Polysaccharides from bagasse: applications in cellulase and xylanase production. Carbohydrate Polymers No. 57, p. 67-72, 2004.
14. Belghith, H., Ellouz-Chaabouni, S. and Gargouri, A., Biostoning of denims by Penicillium occitanis (Po16) cellulases. Journal of Biotechnology No. 89, p. 257-262, 2001.
15. Murashima, K., T. Nishimura, T., Nakamura, Y., Koga, J., Moriya, T., Sumida, N., Yaguchi, T. and Kono, T., Purification and characterization of new endo-1,4-β-glucanases from Rhizopus oryzae. Enzyme and Microbial Technology No. 30, p. 319-326, 2002.
16. Benoit, I., Danchin, E. G. J., Bleichrodt, R. J. and de Vries, R. P., Biotechnological applications and potential of fungal feruloyl esterases based on prevalence, classification and biochemical diversity. Biotechnology Letters No. 30, p. 387-396, 2008.
Memorias del XXXVI Encuentro Nacional de la AMIDIQ
5 al 8 de Mayo de 2015, Cancún, Quintana Roo, México
1123
© 2015 Academia Mexicana de Investigación y Docencia en Ingeniería Química
ISBN 978-607-95593-3-5
