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UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
DOCTORADO EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS CON ESPECIALIDAD
EN FISIOLOGÍA
CARACTERÍSTICAS ELECTROFISIOLÓGICAS DE LAS CÉLULAS M
DEL VENTRÍCULO DE GATO
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS
FISIOLÓGICAS CON ESPECIALIDAD EN FISIOLOGÍA
PRESENTA
M. EN C. CARLOS ANTONIO ANELL MEDINA
DIRECTOR DE TESIS
DR. ALEJANDRO MANUEL ELIZALDE LOZANO
COLIMA COL. ENERO DEL 2007
II
A mi familia en especial a mi madre.
III
Agradezco al Dr. Alejandro M. Elizalde por su continua enseñanza, el
apoyo incondicional y su paciencia
Agradezco al Biol. Juan Fernando Fernández por su apoyo tencnico
durante el desarrollo de mi trabajo de tesis
Agradezco al CONACyT y al fondo Dr.Juan Garcia Ramos
IV
INDICE
Resumen 1
Introducción 3
La función del corazón 3
El Potencial de acción cardiaco 5
Fases de potencial de acción cardiaco 7
Mecanismos iónicos del potencial de acción cardiaco 9
Bases moleculares de las corrientes iónicas 18
Diferencias regionales en la forma y duración del potencial de acción 22
Diferencias regionales de la pared ventricular en otros mamíferos 25
Hipótesis 27
Objetivo General 27
Objetivos particulares 27
Método 28
Obtención de células aisladas 28
Composición de soluciones 29
Adquisición y análisis de datos 30
Resultados 33
Corriente ITO1 33
Corriente IK1 38
Corriente IK 39
Discusión 48
ITO1 en células aisladas del ventrículo izquierdo de gato 48
IK1 en células aisladas del ventrículo izquierdo de gato 50
IK en células aisladas del ventrículo izquierdo de gato 50
Participación de la corriente IK
en la repolarización del potencial de acción 53
Efecto de la frecuencia de estimulación sobre la
repolarización del PA cardiaco: participación de IKr e IKs 54
Conclusión 57
Bibliografía 59
V
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS
FIGURA PÁGINA
1. Esquema de corazón humano 4
2. Esquema del corazón y morfología de los potenciales de acción 6
3. Fases del potencial de acción 8
4. Representación esquemática de las corrientes iónicas cardiacas 11
5. Representación esquemática de canales iónicos cardiacos 19
6. Potenciales de acción registrados en la pared del ventrículo izquierdo de perro 23
7. Potenciales de acción registrados en la pared del ventrículo derecho de gato 26
8. Corriente ITO1 en células aisladas del ventrículo izquierdo de gato 33
9. Curva I-V para ITO1 34
10. Recuperación de la inactivación de ITO1 36
11. Inactivación en estado estable de ITO1 37
12. Corriente IK1 en células aisladas del ventrículo izquierdo de gato 39
13. Corriente IK en células aisladas del ventrículo izquierdo de gato 40
14. Curso temporal del decaimiento de la corriente IK 42
15. Curva I-V para la corriente de cola IKcola y sus componentes 44
16. Prueba de envoltura de colas 45
17. Curva concentración vs respuesta para cromanol 293 B 46
TABLA
1.- Corriente IK en células aisladas del ventrículo izquierdo 41
1
RESUMEN
En el presente trabajo se realizo un estudio comparativo de las corrientes de potasio
(ITO1, IK1 e IK) en células aisladas del ventrículo izquierdo de gato correspondientes a
las regiones del epicardio (EPI), endocardio (ENDO) y de la zona media de la pared
ventricular (células M). El objetivo fue determinar si existían diferencias en la
densidad de estas corrientes repolarizantes en las tres variedades celulares, que
pudieran explicar las diferencias observadas en un trabajo previo, en los potenciales
de acción (PA) registrados en preparaciones multicelulares del ventrículo con
microelectrodos intracelulares en estas zonas de la pared ventricular. En estos
experimentos se encontraron evidencias de la existencia en el ventrículo de gato de
células que no habían sido descritas previamente, con características semejantes a
las M (vrg: mayor duración del PA, mayor prolongación del PA a bajas frecuencias de
estimulación).
Para registrar las corrientes ITO1, IK e IK1, se usó la técnica convencional de fijación de
voltaje en célula completa (“whole cell”). La separación de los 2 componentes de la
corriente IK (IKs e IKr) se realizó con cromanol 293B, bloqueador selectivo de la
corriente IKs. Se observó que la corriente ITO1 fue mayor en las células de EPI y de la
zona M con respecto a las células de ENDO (a +20 mV: EPI: 7.9 ± 0.6; M: 7.6 ± 0.98;
ENDO: 0.35 ± 0.26 pA/pF). No se encontraron diferencias significativas en la
corriente IK1 entre los tres tipos celulares. La corriente IK fue menor en las células M
(a +50 mV: EPI: 5 ± 0.58; M: 2.6 ± 0.33; ENDO: 4.7 ± 0.28 pA/pF). Ambos
componentes de la corriente IK fueron menores en las células M, (IKs a +50 mV: EPI:
2.1 ± 0.17; M: 0.89 ± 0.07; ENDO: 1.3 ± 0.08 pA/pF), (IKr a +50 mV: EPI: 2.99 ± 0.59;
M: 1.75 ± 0.37; ENDO: 3.4 ± 0.28 pA/pF). Se concluye que la mayor duración del PA
que se registra en las células M, se debe en parte a que poseen una menor densidad
de corriente IK, con respecto a las células de EPI o ENDO.
2
SUMMARY
The present work is a comparative study of potassium currents (ITO1, IK1 and IK) in
isolated cat left ventricular cells corresponding to the epicardium (EPI) and
endocardium (ENDO) regions and to the middle zone of ventricular wall (M cells). The
objective of the study was to determine if there were differences in the density of
these repolarizing currents in the three cell types that could explain the action
potential (AP) differences observed among these cells in a previous study performed
in multicellular ventricular preparations. In those experiments, the intracellular
recording of the AP revealed the existence in cat ventricle of cells that had not been
previously described with similar characteristics to M cells of other species (longer AP
duration, longer AP prolongation to low frequency stimulation).
The conventional whole-cell voltage clamp technique was used to record the ITO1, IK1
and IK currents. The separation of the two components of IK (IKs and IKr) current was
carried out with chromanol 293B, a selective IKs current blocker. It was found that:
The ITO1 current was greater in the EPI cells and the middle zone cells with regard to
the ENDO cells (at +20 mV: EPI: 7.9 ± 0.6; M: 7.6 ± 0.98; ENDO: 0.35 ± 0.26 pA/pF).
There were no significant differences in the IK1 current in the three cell types. The IK
current was smaller in the M cells (at +50 mV: EPI: 5 ± 0.58; M: 2.6 ± 0.33; ENDO:
4.7 ± 0.28 pA/pF), as were both components of the IK current (IKs at +50 mV: EPI: 2.1
± 0.17; M: 0.89 ± 0.07; ENDO: 1.3 ± 0.08 pA/pF), (IKr at +50 mV: EPI: 2.99 ± 0.59; M:
1.75 ± 0.37; ENDO: 3.4 ± 0.28 pA/pF). It can be concluded that the longer AP
duration registered in the M cells of cat ventricle is due, in part to the fact, that they
possess a smaller IK current density, with regard to the EPI and ENDO cells.
3
INTRODUCCION
La Función del Corazón.
El corazón es un órgano que posee 4 cámaras, (dos aurículas y dos ventrículos,
figura 1) cuyas paredes están constituidas por el músculo cardiaco (o miocardio) y su
función consiste en bombear sangre desde las venas (territorio de baja presión)
hacia las arterias (territorio de alta presión), asegurando un flujo sanguíneo adecuado
por los tejidos del organismo. El trabajo mecánico del corazón es producto de la
contracción del miocardio auricular y ventricular. Para realizar esta función, las
aurículas y los ventrículos se contraen y se relajan de una manera cíclica; durante la
relajación (diástole) las cavidades cardiacas se llenan con sangre y durante la
contracción (sístole) la sangre es expulsada desde las aurículas a los ventrículos y
de estos hacia las arterias (Berne y Levy, 1997). Los eventos que conducen a la
contracción, son disparados por la excitación de las células musculares cardiacas (o
miocitos cardiacos) que se encuentran acopladas eléctricamente a nivel de los discos
intercalares. Por este acople eléctrico es que funcionalmente el miocardio auricular y
el ventricular se comportan como sincicios, si una de sus células se excita, la
excitación se propaga al resto de las células. Esto es posible debido a que los
miocitos cardiacos son células excitables, es decir capaces de generar potenciales
de acción (PA) y esta señal eléctrica dispara el fenómeno mecánico de la contracción
de las células, las que se relajan al retornar el potencial de membrana al estado de
reposo. Así, el proceso de excitación consiste en la generación de PA y su
propagación de célula a célula, a través de todo el órgano en una secuencia
4
ordenada, que permite la contracción de las aurículas seguida, después de un breve
retardo ( 0.10 s), de la contracción casi simultanea de ambos ventrículos.
Normalmente el proceso de excitación es comandado por la descarga de PA del
nodo senoauricular (nodo SA), estructura localizada a nivel de la desembocadura de
la vena cava superior (véase la figura 1). Los miocitos que constituyen el nodo SA
tienen la propiedad de descargar de manera espontánea PA con una frecuencia
mayor (70 a 80/min) que otras células miocárdicas que también exhiben descargas
espontáneas (nodo auriculo-ventricular 40-60/min; fibras de Purkinje 20/min); por lo
que funciona como marcapaso del corazón (Katz, 1992; Schmidt y Thews, 1987).
Desde el nodo SA la excitación se propaga hacia las aurículas y el nodo
aurículoventricular (nodo AV) donde ocurre un retardo en la
Figura 1. Esquema del corazón del humano. AD) aurícula derecha. AI) aurícula Izquierda.
VD) ventrículo derecho. VI) ventrículo izquierdo. NSA) nodo senoauricular. NAV) nodo
auriculoventricular. HAV) haz auriculoventricular o haz de His. RD, RI) ramas derecha e
izquierda del HAV. FP) fibras de Purkinje. VCS) vena cava superior. VCI) vena cava inferior.
T) tabique interventricular. MP) músculo papilar. Modificada de Harary y Farley, 1962
5
propagación (retardo nodal) de aproximadamente 0.10 segundos. Del nodo AV la
excitación se propaga al sistema de conducción rápida del corazón constituido por el
haz auriculoventricular (HAV o haz de His) localizado en la porción alta del tabique
interventricular, sus ramas derecha e izquierda (que descienden por el tabique
interventricular) y las fibras de Purkinje que conducen la excitación hacia las paredes
libres de los ventrículos. El haz HV constituye la única comunicación eléctrica entre
los sincicios auricular y el ventricular (Fozzard HA, 1991 y Katz AM, 1992).
El Potencial de Acción Cardiaco.
El miocardio no es homogéneo en lo que respecta a las propiedades eléctricas y
mecánicas de sus células. Las células de los nodos (SA y AV), del haz de His y sus
ramas y las fibras de Purkinje, se contraen débilmente al ser excitadas por contener
escasas miofibrillas. En contraste los miocitos de las aurículas y los ventrículos son
células musculares estriadas con abundantes miofibrillas en las que los filamentos de
actina y miosina se disponen en un arreglo semejante al observado en el músculo
esquelético. Estas células miocárdicas son las que realizan el trabajo mecánico del
corazón. También existen diferencias entre las distintas células miocárdicas en la
morfología de los potenciales de acción y la magnitud de su potencial de membrana
en reposo. En la figura 2 se esquematiza la diferencia que existe en la forma y
duración de los potenciales de acción que se registran con microelectrodos
intracelulares en las distintas células del miocardio.
6
Figura 2. Esquema del corazón y morfología de los potenciales de acción en distintas células
miocárdicas, a) nodo SA, b) aurícula, c) nodo AV, d) Haz de His, e) ramas del Haz de His, f)
fibras de Purkinje y g) ventrículos. El tiempo cero coincide con el disparo del potencial de
acción en el nodo SA. En la parte inferior se esquematiza el trazo de un registro
electrocardiográfico (ECG) y su relación con la excitación de las distintas regiones del
miocardio.
En los registros de la figura 2, el tiempo cero corresponde al disparo de un PA en el
marcapaso o nodo SA, desde donde se propaga al resto de las células las cuales se
excitan a distintos tiempos con respecto a la señal inicial durante el ciclo cardiaco. La
propagación de la excitación en regiones extensas del corazón puede apreciarse
mejor en el electrocardiograma (ECG, trazo inferior de la grafica). En el ECG se
registran las diferencias de potencial eléctrico que se establecen entre los electrodos
de registro colocados en sitios específicos de la superficie de cuerpo, durante la
propagación de la excitación en el corazón y representa a cada instante la suma
algebraica de la actividad eléctrica de cientos de células. Como se puede apreciar en
7
la grafica, existe una correlación entre la propagación de la excitación en las distintas
regiones del corazón y la génesis de las ondas electrocardiográficas. En el ECG se
registran varias ondas que representan distintos eventos: Un trazo isoeléctrico
precede a la primera onda positiva u onda P producida por la despolarización de las
aurículas. A ésta le sigue otro segmento isoeléctrico (el segmento P-Q o P-R cuando
falta la Q). A continuación, aparece el complejo QRS producido por la activación
eléctrica de los ventrículos, la onda Q es negativa y corresponde a la despolarización
del tabique interventricular, la onda que sigue a la Q es la onda R de mayor voltaje,
es positiva y corresponde a la despolarización de las paredes libres de los
ventrículos. La R es seguida por la onda negativa S que representa la
despolarización de la base de los ventrículos y a esta onda le sigue la producida por
la repolarización u onda T la cual es precedida de un segmento, que normalmente es
casi isoeléctrico o segmento ST. También se puede apreciar que ni la actividad
eléctrica de los nodos ni la del sistema de conducción (haz de His y sus ramas y las
fibras de Purkinje) producen ondas en el ECG, esto se debe a que son pequeñas
masas de tejido cuya actividad no puede ser detectada con electrodos superficiales
(Jalife et al 1998).
Fases del potencial de acción cardiaco.
En las células del miocardio el potencial de membrana en reposo varia entre -90 a
-70 mV en el sistema de conducción (Schram et al 2002), aurículas (Yamashita et al
1995; Wang et al 1990) y ventrículos (Litovsky y Antzelevitch 1988). En los nodos no
hay un potencial de membrana en reposo estable, pero alcanza por tiempos breves
valores de -50 a -60 mV en el potencial diastólico máximo (pdm) (Billette 1987).
8
Figura 3: Fases del potencial de acción. a) nodo senoauricular (pdm = potencial diastólico
máximo). b) ventrículo. Modificada de Hoffman y Cranefield, 1960.
Durante la generación del potencial de acción (Figura 3), la membrana se
despolariza y el potencial de membrana se invierte (el interior cambia a positivo
respecto al exterior) por algunos milisegundos, finalmente ocurre la repolarización y
la célula recupera el potencial de reposo (Berne y Levy, 1997).
En la figura 3 se ilustran las fases del potencial de acción en células del nodo
senoauricular y del ventrículo. Se observa que en el nodo (figura 3a) existe una
despolarización espontánea lenta (denominada fase 4) desde el potencial diastólico
máximo, (pdm) hasta alcanzar el umbral (u) de disparo del potencial de acción,
dando lugar a la fase de despolarización o fase 0 del potencial de acción, en la cual
9
el potencial de membrana apenas alcanza valores positivos por un tiempo breve. Los
PA de las células del nodo SA no presentan fase 1 y 2.
Después ocurre la fase 3 o de repolarización hasta alcanzar los valores del potencial
diastólico máximo. La velocidad de la despolarización durante la fase 0 en los nodos
es baja, del orden de 4 a 8 V/s. Debido a la despolarización espontánea (potencial de
marcapaso) que ocurre durante la fase 4, en estas células no existe un verdadero
potencial de reposo y descargan potenciales de acción de manera continua y
automática (Bleeker et al 1980; Anumonwo y Jalife 1995; Katz, 1992).
En contraste, en las células ventriculares (figura 3b) el potencial durante la fase 4 se
mantiene estable y corresponde al potencial de membrana en reposo (PMR). Una
vez que la excitación se propaga hacia estas células o se les aplica un estímulo de
intensidad umbral, se inicia la fase de despolarización (fase 0) de manera abrupta y
rápida, con una velocidad del orden de 200 a 250 V/s en células ventriculares de
trabajo y hasta 500 V/s en fibras de Purkinje. En las células ventriculares después
de la fase de inversión del potencial en la fase 0, ocurre una repolarización temprana
denominada fase 1 que es seguida por la fase 2 o meseta del potencial de acción.
Durante la fase 2, el potencial de membrana se mantiene en valores positivos
durante varios milisegundos antes de iniciarse la repolarización o fase 3, al final de la
cual se recupera el potencial de reposo (Schram et al 2002; Sicouri y Antzelevitch
1991).
Mecanismos Iónicos del Potencial de Acción Cardiaco:
El potencial de acción es generado por el flujo de iones a través de canales
constituidos por proteínas transmembranales denominados canales iónicos
10
dependientes de voltaje; ya que su apertura y cierre dependen del potencial de
membrana. Cuando un canal iónico se abre (se activa) permite el flujo de iones a
través de la membrana celular y la dirección de este movimiento depende del
gradiente electroquímico del ión para el cual el canal es selectivo. Este flujo iónico
puede registrarse por medio de técnicas electrofisiológicas como corriente iónica.
Por convención una corriente es de entrada cuando un ion positivo se mueve del
exterior al interior de la célula y una corriente de salida es el movimiento inverso. Si
el ion es negativo, una corriente es entrante cuando el ion se mueve del interior al
exterior; si lo hace en sentido inverso se conoce como corriente de salida. Las
corrientes de entrada despolarizan a la membrana y las de salida la repolarizan
(Katz, 1992; Jalife et al, 1998).
El potencial de acción cardiaco que se observa en los ventrículos (figura 4), es
generado por la participación de varias corrientes iónicas. Estas son: La corriente de
entrada de sodio (INa), la corriente transitoria de salida de potasio (ITO1), la corriente
transitoria de salida acarreada por cloro y activada por calcio intracelular (ITO2), la
corriente de entrada de calcio (ICaL), la corriente de salida de potasio de rectificación
tardia (IK) y la corriente de salida de potasio de rectificación entrante (IK1) (Schram et
al 2002).
En la figura 4 se representa de manera esquemática la correspondencia del curso
temporal de las principales corrientes iónicas con las fases del potencial de acción de
las células del miocardio.
11
Figura 4. Representación esquemática de la correspondencia entre el curso temporal de las
corrientes iónicas y el del potencial de acción ventricular. Se indican también las
correspondientes subunidades que forman los canales iónicos (Tamargo, 2000).
La fase 0 corresponde a la despolarización rápida de la membrana que se genera
cuando los canales de sodio se activan y en consecuencia aumenta la conductancia
al ion Na+, por lo que aparece la corriente entrante de sodio o INa. Los canales de
sodio pueden encontrarse en tres estados: cerrado, abierto e inactivado. Cuando un
estimulo umbral despolariza la membrana, hace que los canales de sodio pasen del
estado cerrado de reposo al abierto debido a la apertura de la compuerta de
activación. Cuando los canales se encuentran abiertos permiten el movimiento del
ion sodio hacia el interior de la célula, desplazando el potencial de membrana hacia
el potencial de equilibrio del sodio (ENa+ = +52.5 mV; calculado con la ecuación de
Nernst usando las siguientes concentraciones de sodio: [Na+]e = 145 mM, [Na+]i = 20
mM, temperatura 37 oC ); sin embargo, cuando el potencial de membrana alcanza
12
valores de +20 y +30 mV, los canales de sodio pasan del estado abierto al
inactivado, por el movimiento de la compuerta de inactivación que bloquea el paso a
los iones de Na+. Para que el canal de sodio pase del estado cerrado e inactivado al
estado cerrado de reposo (disponible para abrirse de nuevo) el potencial de
membrana debe regresar al potencial de reposo (Catterall, 1995; Fozzard y Hanck,
1991).
La INa es una corriente muy rápida y de gran magnitud, se estima que la
conductancia pendiente del canal es de 9.8 pS (a 10º C; de -60 a –20 mV) (en
miocitos de rata). Una fracción de canales de Na+ conducen corriente durante la
meseta del potencial de acción (fase 2) por lo que contribuyen al mantenimiento de la
despolarización durante esta fase. Hay evidencias que pueden existir diferencias en
la cinética de inactivación entre la misma población de canales de Na+ (Patlak y Ortiz
1985) y es probable que las aperturas prolongadas o reaperturas de las canales y
aperturas en ráfagas (“burst behavior”) explique el origen de la corriente de Na+
durante la meseta (Liu et al 1992; Nagatomo et al 1998; Wasserstrom y Salata 1988)
a la que se le ha denominado INa sostenida e INa tardía (INalate). Este componente es
sensible a TTX, aunque otros autores proponen que INa e INalate son conducidas por
canales diferentes, ya que en células aislada del ventrículo de rata se encontró que
la dependencia del voltaje y la sensibilidad a TTX de INa e INalate fueron diferentes
(Saint et al 1992). En células aislados del ventrículo izquierdo de perro, la corriente
INalate se caracterizo como la corriente sensible a 10 µM de TTX, y medida a los 295
ms después del inicio del pulso de prueba, a 0 mV su magnitud fue de -0.463 a -
0.785 pA/pF (Zygmunt et al 2001).
13
La fase 1 se debe en parte a la inactivación de la INa, pero son dos las corrientes que
contribuyen principalmente a la repolarización temprana de la membrana en esta
fase: ITO1 e ITO2 (Gintant, 1991; Jalife et al, 1998; Kass, 1995).
La corriente ITO1 es acarreada por potasio, se activa en el rango de potenciales de -
30 mV y -20 mV (Li et al 1998; Liu et al 1993); tiene una conductancia pendiente de
14 pS (+50 a +150 mV; en miocitos de aurícula de conejo) con una densidad de
canales en la membrana plasmática de 1-3 canales/m2 (Gintant et al, 1991; Kass,
1995). La densidad de corriente de ITO1 es de 8 a 24 pA/pF (entre +20 y +40 mV) y
se bloquea con 4-AP (Fedida y Giles 1991; Liu et al 1993; Volk et al 1999).
Hiraoka y Hirano (1989) encontraron una corriente transitoria de salida que no era
bloqueada por la 4-AP; esta corriente a diferencia de ITO1 se bloqueaba al sustituir el
Ca2+ extracelular por Sr2+, o en presencia de rianodina en la solución del baño o
EGTA en la solución de la pipeta. Estas evidencias sugerían que esta corriente era
activada por iones Ca2+ liberados del retículo sarcoplásmico. Hay evidencias de que
esta corriente es acarreada por iones Cl- (Zygmunt y Gibbons, 1991) ya que la
corriente se inhibe al eliminar el ión Cl- de la solución del baño y al utilizar
bloqueadores de canales de cloro. Esta corriente es conocida como corriente ITO2, se
activa a potenciales de -30 y -20 mV y la densidad de corrientes es del orden de 10
pA/pF a +60 mV (Furukawa et al, 1990).
Se ha propuesto que en miocitos del ventrículo de perro, a frecuencias de
estimulación bajas, la contribución de ITO1 a la repolarización es mayor que la de ITO2,
porque bajo estas condiciones el intervalo entre dos potenciales de acción permite
una completa recuperación de ITO1, lo que combinado con el hecho de que la
14
densidad de ITO2 es pequeña, permite que la fase 1 del potencial de acción dependa
mas de ITO1. Con altas frecuencias de estimulación, el intervalo entre dos potenciales
de acción sucesivos puede ser insuficiente para que ITO1 logre recuperarse
completamente de la inactivación, por lo tanto la cantidad de corriente que fluye a
través de este canal se reduce (Tseng y Hoffman, 1989). Debido a este factor y al
hecho de que la activación de la corriente ITO2 en micitos del ventrículo de conejo
depende del calcio liberado a partir del retículo sarcoplásmico (Zygmunt y Gibbons,
1991) y de que el calcio tiende a acumularse en el citoplasma con la estimulación de
alta frecuencia (Fozzard et al, 1991), en estas condiciones la fase 1 del potencial de
acción depende mas de la corriente ITO2 (Kass, 1995).
En la fase 2 o meseta del PA la membrana se mantiene despolarizada debido a un
delicado balance en las corrientes de entrada de Na+ (INalate), Ca2+ (ICaL) y la
generada por el intercambiador Na+-Ca2+ (INaCa) y las de salida acarreadas por
potasio (ITO e IK) (Jalife et al, 1998; Katz, 1992; Marban y O´Rourke, 1995). Durante
esta fase la corriente ICaL, es la principal corriente de entrada responsable de
mantener la membrana a potenciales positivos, contrarrestando el efecto de las
corrientes de salida de potasio que se conducen durante la meseta (ITO, IK). La ICaL se
activa a potenciales de membrana más positivos (–40 a –30 mV) que la INa. La lenta
inactivación de ICaL contribuye a la gran duración del potencial de acción en las
células cardiacas, excepto en los nodos, donde la meseta no es apreciable y en las
que esta corriente (ICaL) es responsable de la fase cero del potencial de acción (Shih
1994).
En el corazón existen al menos 2 tipos de canales que acarrean la corriente de calcio
(Tsien et al 1987), ICaL (de umbral alto) que se activa a –40 mV, se inactiva
15
lentamente y tiene una conductancia pendiente de 20.6 pS (-30 a +40 mV) e ICaT (de
bajo umbral) que se activa a potenciales positivos a -60 mV, se inactiva rápidamente
y tiene una conductancia pendiente de 7.5 pS (-40 a +40 mV). Una de las principales
funciones de los canales de calcio tipo L cardiacos es permitir el acople excitación-
contracción, es decir, la entrada de calcio por este tipo de canal produce la liberación
de calcio del retículo sarcoplásmico, mecanismo denominado liberación de calcio
inducido por calcio (Fabiato, 1983; Nilius et al, 1986).
La densidad de los canales de calcio tipo L en miocitos ventriculares de cobayo es de
1-3 canales/m2 (Jalife et al, 1998; Pelzer et al, 1991).
En las células del nodo senoauricular la despolarización del potencial de membrana
en la fase cero es producida por la activación de canales de calcio tipo L (Fozzard y
Baumgarten, 1991).
En los nodos los canales de calcio tipo T están involucrados en la actividad de
marcapaso participando en el último tercio de la despolarización espontánea o fase 4
(Billette y Shrier, 1995; DiFrancesco et al, 1995).
Durante la fase 2 el intercambiador Na+/Ca2+ contribuye con corriente entrante para
mantener la despolarización. Este mecanismo utiliza el gradiente electroquímico del
Na+ (3 iones) para expulsar del interior de la célula al exterior al ion Ca2+ (1 ion).
Como resultado de este movimiento de iones Ca2+ del interior al exterior de la célula,
se crea una pequeña corriente iónica, que durante el reposo es de salida,
invirtiéndose durante la meseta (Katz 1992). La corriente generada por el
intercambiador o INaCa a potenciales de membrana positivos (positivos a -24 mV,
16
Vornanen, 1985; Beers, 2003) contribuye a mantener la meseta del PA, por lo tanto
cambios en esta corriente iónica pueden modificar la DPA (Tamargo 2000).
Hacia el final de la meseta la magnitud de ICaL se reduce porque se inactiva
(constante de inactivación 30 ms a 0 mV, 35 C, miocitos de cobayo, Pelzer et al,
1989) y la IK entonces alcanza la magnitud suficiente como para iniciar la fase 3 o de
repolarización del potencial. La IK tiene dos componentes, un componente de
activación lenta o corriente IKs, que tiene una constante de activación de 400 a 2500
ms que no rectifica y un componente de activación rápida o IKr que tiene una
constante de activación de 50 ms y que rectifica hacia adentro. IK es la responsable
de repolarizar la membrana hasta el potencial de reposo, sin embargo, en la parte
final de la fase 3 también contribuye a la repolarización la corriente IK1 (Jalife et al,
1998; Katz, 1992). También se ha descrito una corriente de potasio denominada IKur
o corriente de rectificación ultrarrápida, IKur tiene una constante de activación en
células aisladas de aurícula de perro de 3.5 ms a -10 mV. (Yue et al 1996). Esta
corriente se encuentra presente en células de aurícula de humano, pero en el células
de ventrículo aparentemente se expresan pocos canales para esta corriente (Schram
et al 2002).
En las células miocárdicas excepto los nodos, la fase 4 del potencial de acción
corresponde al potencial de reposo de la membrana (Katz, 1992). El potencial de
reposo se mantiene estable porque los canales del rectificador entrante (IK1)
conducen corriente a potenciales negativos. Aparentemente, las células del nodo
seno auricular carecen de estos canales o bien son escasos, por tal motivo, en estas
células no existe un verdadero potencial de reposo. Al no contar con un potencial de
17
reposo estable estas células presentan una despolarización espontánea y
automatismo.
Las corrientes responsables de la despolarización espontánea de las células del
nodo SA son principalmente: IK e If. Se ha propuesto que después de la
despolarización rápida de la membrana producida por la corriente ICaL (fase 0 del
PA), la corriente IK repolariza la célula hasta su potencial diastólico máximo (fase 3
del PA) y que con la hiperpolarización se activa la corriente If (rango de activación -
50 a -40 mV; Jalife et al, 1998). Simultáneamente, al desactivarse IK (constante de
desactivación 3 s) el potencial de membrana se despolariza lentamente alcanzando
el umbral de activación de los canales de calcio tipo T (-60 mV) por lo tanto la
corriente ICaT contribuye a despolarizar la membrana hasta alcanzar el umbral de
disparo del PA que ocurre cuando se activa la ICaL (Fozzard y Baumgarten, 1991).
En células aisladas del tejido cardiaco se han descrito otras corrientes de potasio que
pueden contribuir a la repolarización del potencial de membrana, estas son la
corriente de potasio activada por acetilcolina IK(Ach) y la corriente de potasio
dependiente de ATP IK(ATP). La corriente IK(Ach) es una corriente que se activa cuando
la acetilcolina se une al receptor muscarinico M2 de las células produciendo una
hiperpolarización; a través de este mecanismo el sistema parasimpático puede
modular la frecuencia de disparo del nodo senoauricular (Nemec et al, 1999; Jalife et
al, 1998). La corriente IK(ATP), se activa cuando los niveles intracelulares de ATP
disminuyen, como ocurre en la isquemia del miocardio, situación en la que se
produce una repolarización mas temprana de las células con el consecuente
acortamiento en la duración del potencial de acción (Furukawa et al, 1991).
18
La participación de las diferentes corrientes iónicas en la generación del potencial de
acción y sus fases, explica las diferencias que se observan en la forma del potencial
de acción cardiaco en los distintos tipos celulares hasta aquí descritos (Jalife et al,
1998).
Bases moleculares de las corrientes iónicas.
Se ha descrito en la literatura que las corrientes iónicas que dan origen al PA
cardiaco, fluyen a través de canales formados por proteínas transmembranales a los
que se les a denominado canales iónicos (Schram et al 2002).
Se han logrado identificar a la mayoría de las subunidades que forman los distintos
canales iónicos, por los cuales fluyen las principales corrientes iónicas que se
registran en las células cardiacas (ver figura 4): En la literatura se ha reportado que
la subunidad NaV1.5 forma el canal iónico por el cual fluye la corriente INa (Cohen et
al 1996). El canal iónico por el cual fluye la corriente ICaT esta formado por las
subunidades CaV3.1 y CaV3.2 (Perez-Reyes et al 1998), por otra parte, las
subunidades CaV1.2 y CaV1.3 forman el canal iónico por el cual fluye la corriente ICaL
(Bohn et al 2000).
Para las principales corrientes de potasio también se han logrado identificar a las
subunidades que forman los canales iónicos, por los cuales fluyen estas corrientes.
Estos canales se forman con tretrámeros de las subunidades. El canal iónico por el
cual fluye la corriente ITO1 esta forma por las subunidades KV1.4, KV4.2, y KV4.3
dependiendo de la especie (Nerbonne 2000). El canal iónico por el cual fluye la
corriente IKs estas formado por 4 subunidades KvLQT1 y la subunidad accesoria
minK (Keating y Sanguinetti 2001). Las subunidades HERG (4) y la subunidad
19
accesoria MiRP1 forman el canal iónico por el cual fluye la corriente IKr (Abbott et al
1999). El canal iónico por el cual fluye la corriente IK1 esta formado por la subunidad
Kir2.1 (Wang et al 1998). Los canales iónicos por los cuales fluyen otras corrientes
iónicas que se registran en las células cardiacas como If, IKAch e IKur están formadas
por las subunidades HCN (Moroni et al 2001; Moosmang et al 2001; Yu et al 2001),
Kir3.1/Kir3.4 (Dobrzynski et al 2001) y KV1.5 (Bou-Abbound et al 1999)
respectivamente.
Figura 5. Representación esquemática de canales iónicos cardiacos. A) canal de Na+ con sus 4
dominios, cada uno constituido por 6 segmentos transmembranales (1 a 6), unidos por enlaces
covalentes. Se muestra la región del poro (b) y el linker de inactivación (c). B) subunidad
KvLQT1 con 6 segmentos transmembranales (S1 a S6), entre S5 y S6 se encuentra la región
del poro (P) y S4 es el sensor de voltaje. 4 sunidades unidas por enlaces no covalentes forman
el canal IKs. C) subunidad Kir con 2 segmentos transmembranles (M1 y M2), 4 subunidades
unidas por enlaces no covalentes forman el canal IK1. Modificada de Shieh et al 2000
20
Las diferencias que se observan en la magnitud de las corrientes iónicas, entre los
distintos tipos de células del corazon (nodos, tejidos de conducción, aurículas y
ventrículos), se deben a diferencias en la expresión de las subunidades
anteriormente mencionadas (Schram et al 2002). Por ejemplo, la baja expresión de la
subunidad Kir2.1 en las células del nodo SA, explicaría porque en estas células se
registra poca corriente IK1 (Brahmajothi et al 1996). La menor expresión de la
subunidad HCN (If) en las células de aurícula y la ausencia de esta subunidad en las
células de ventrículo, puede explicar porque en estas células no se observa
normalmente actividad de marcapaso (Moroni et al 2001; Ishii et al 1999).
Otro ejemplo es la baja expresión de las subunidades KvLQT1 y HERG en las
células del sistema His-Purkinje, lo cual explicaría porque la magnitud de la corriente
IK es menor en estas células y lo prolongado de la duración de su PA (Schram et al
2002). También se ha observado que existe una mayor expresión de las
subunidades Kir3.1 y Kir3.4 en las aurículas con respecto a los ventrículos, a esto se
atribuye que la corriente IKACh es mayor en las células de aurícula comparada con las
células del ventrículo (McMorn et al 1993; Dobrzynski et al 2001).
Otros autores han descrito que la expresión de la subunidad HERG es mayor en los
ventrículos con respecto a las aurículas (Brahmajothi et al 1997). Por ultimo debido a
que la expresión de la subunidad CaV1.2 en las células del sistema His-Purkinje es
baja, la magnitud de la corriente ICaL es pequeña (Verkerk et al 1999). Por el
contrario, debido a la alta expresión de las subunidades CaV3.1 y CaV3.2 en las
células del sistema His-Purkinje, estas exhiben una mayor densidad de corriente ICaT
(Hirano y Fozzard 1989; Tseng y Boyden 1989).
21
Aunque se ha reportado que las subunidades que forman los distintos canales
iónicos se conservan entre especies, como es el caso de Kir2.1, HERG, KvLQT1 y
NaV1.5, que forman los mismos canales iónicos en cobayo (Dhamoon et al 2004; Li
et al 2001; Wymore et al 1997), conejo (Tsuji et al 2006; Wymore et al 1997; Zobel et
al 2003; Orth et al 2006), rata (Brette y Orchard 2006; Nakamura et al 1999; Chen et
al 2002; Wymore et al 1997; Zaritsky et al 2001) y humano (Cruz et al 2003;
Sakakibara et al 1993; Szabo et al 2005; Wang et al 1998); tambien se pueden
observar diferencias entre especies. Por ejemplo, en rata las subunidades que
forman los canales de la corriente ITO1 son KV4.2 y KV4.3 (Barry et al 1995;
Wickenden et al 1999). Además, en esta especie se observa una magnitud mayor de
la corriente ITO1 en EPI con respecto a ENDO en el ventrículo, debido a que en las
células de ENDO hay una menor expresión de la subunidad KV4.2 (Dixon y
McKinnon 1994).
Por otra parte, pueden existir diferencias entre especies en la expresión de las
subunidades que forman el canal para ITO1, como ocurre en las aurícula del humano
(subunidad KV4.3), mientras que en la aurícula de conejo predomina la expresión de
la subunidad KV1.4 (Wang et al 1999). Otro de los canales que también exhibe
diferencias entre especies en la expresión de las subunidades que lo constituyen es
el de la corriente IKur (Nattel et al 1999), ya que en aurícula este canal es formado por
las subunidades KV1.2 y KV1.5 en rata y humano, y en la aurícula del perro por la
subunidad KV3.1 (Yue et al 2000).
22
DIFERENCIAS REGIONALES EN LA FORMA Y DURACION DEL PA.
Por otra parte, se conoce que también existen diferencias en la forma del potencial
de acción que se registra en distintas zonas de la pared de los ventrículos (Gilmour y
Zipes, 1980; Kimura et al, 1990; Litovsky y Antzelevitch, 1988; Watanabe et al, 1983;
Watanabe et al, 1985). Estas diferencias fueron descritas por primera vez para las
células del ventrículo izquierdo de perro (Litovsky y Antzelevitch 1988; Sicouri y
Antzelevitch 1991); en donde los PA que se registran en las células de epicardio
(EPI), presentan una configuración de espiga y domo (ver figura 6), que no se
observa en los PA de endocardio (ENDO). Por otra parte, la duración de los PA en
las células de ENDO es ligeramente mas larga con respecto a las células de EPI.
(Litovsky y Antzelevitch 1988). Además, en el perro se describió una población de
células que se encuentran en las capas subepicardicas profundas de la pared
ventricular a las que se denominó células M (figura 6), que característicamente
mostraban una mayor duración del PA que las de EPI y ENDO (Sicouri y Antzelevitch
1991; Drouin et al 1995). Además, la DPA de las células M, a diferencia de lo que se
observa en los PA registrado en las células de EPI o ENDO, se incrementa
exageradamente a bajas frecuencias de estimulación y bajo la acción de ciertos
fármacos (vrg. eritromicina, dofetilida, sotalol, antihistamínicos) (Tamargo 2000), así
como una Vmax de mayor magnitud (aproximadamente 300 V/s) comparada con la
que se registra en las células de EPI o ENDO (200 V/s) (Sicouri y Antzelevitch 1991).
En la figura 6, se muestran ejemplos de los PA de las 3 distintas variedades celulares
que forman la pared ventricular. Las diferencias en las fase 1 (espiga y domo) del PA
entre las células de EPI y ENDO, se deben a que existe una mayor corriente ITO1 en
las células de EPI (Wettwer et al 1994). También existen evidencias de que la mayor
23
duración del PA de las células M se debe a una menor magnitud de corriente IKs (Liu
y Antzelevitch 1995) combinada con una mayor magnitud de las corriente INalate
(Zygmunt et al 2001) e INaCa (Zygmunt et al 2000), con respecto a las que se registran
en las células de EPI o ENDO. Esto implica que la mayor duración del PA de las
células M no depende de las corriente ITO1 e IK1 (Liu et al 1993).
Figura 6: Potenciales de acción registrado en la pared del ventrículo izquierdo de perro.
Modificado de Sicouri y Antzelevitch 1991.
En preparaciones multicelulares de ventrículo derecho (VD) de perro, usando
registros intracelulares, tambien se ha descrito la presencia de celulas M en capas
subepicardicas profundas (Antzelevitch et al 1991), además se observo que en estas
celulas la magnitud de la fase 1 del PA era mayor que en las del ventrículo izquierdo
(VI), por lo que la configuración de espiga y domo es mas aparente. Por otra parte,
24
también se observo que la DPA90 en las celulas M del VD es menor que en las del VI
(a 0.25 Hz DPA90. VD: 366 ms vs VI 437 ms). Usando células aisladas del VD y del
VI, se demostró que esto se debe a que en las células M del VD, la magnitud de la
corriente ITO1 e IKs (a +50 mV. VD: 0.72 pA/pF vs VI: 0.38 pA/pF) es mayor con
respecto a las células M del VI (Volder et al 1999).
Se sabe que en las células de EPI y ENDO del humano, la expresión de la subunidad
KV4.3 que forma el canal para la corriente ITO1 es similar en EPI y (ENDO) (Kaab et al
1998; Dixon et al 1996), pero defieren en que en ENDO existe una menor expresión
de la subunidad accesoria KChiP2, lo que explica la menor magnitud de ITO1
observada en células de ENDO (An et al 2000; Rosati et al 2001).
Por otra parte, la expresión de las subunidades HERG y KvLQT1 son mayores en las
células de EPI con respecto a las células M (Szabo et al 2005), lo que explicaría, en
parte la menor corriente IKs que se registra en las células M del perro y el humano. A
esto hay que añadir que en las células M (humano), predomina la expresión de una
variedad dominante negativa de la subunidad KvLQT1 (isoforma 2) comparada con
células de EPI y ENDO en las que se expresa KvLQT1 ( isoforma 1) (Pereon et al
2000).
También se ha observado que la expresión de la subunidad NaV1.5 es menor en las
células de EPI con respecto a las células de M, lo cual podría explicar porque en
estas últimas se observa una mayor corriente INalate. De la misma manera la
expresión uniforme de la subunidad Kir2.1 en las tres variedades celulares, explica la
ausencia de diferencias en la magnitud de la corriente IK1 (Szabo et al 2005).
25
DIFERENCIAS REGIONALES DE LA PARED VENTRICULAR EN OTROS
MAMIFEROS
Las diferencias descritas en la forma y duración del PA en distintas zonas de la pared
ventricular del perro (Antzelevitch et al 1999), también se han observado en cobayo
(Watanabe et al 1985; Sicouri et al 1996), conejo (Fedida y Giles 1991; McIntosh et al
2000) y humano (Nabauer et al 1996; Li et al 1999). Sin embargo, en la rata (Shipsey
et al 1997) y el gato (Kimura et al 1987) solo se habían reportado diferencias en la
morfología del PA de las células de EPI y ENDO. Experimentos posteriores indicaron
que en el caso del ventrículo de rata, aparentemente no existen células M (Volk et al
1999; Volk et al 2001). En el caso del gato, en la literatura no existían datos que
confirmaran o negaran la presencia de células M en la pared ventricular.
Al no existir un estudio comparativo que demostrara la presencia o ausencia de
células M en el ventrículo de gato, en el laboratorio se realizaron experimentos en
preparaciones multicelulares del ventrículo derecho de gato, para obtener registros
intracelulares del PA en EPI, capa subepicardica profunda y ENDO, con el objetivo
de determinar si existían células M en el ventrículo de gato (Anell 2001; Anell et al
2002).
Los resultados obtenidos de estos experimentos mostraron que en el ventrículo
derecho de gato se registran en células de las capas subepicardicas profundas (M),
potenciales de acción con características similares a las de las células M reportadas
en otras especies.
26
Figura 7. A: PA registrados en preparaciones multicelulares del ventrículo derecho de gato a
diferentes frecuencias de estimulación. B: DPA90 a diferentes frecuencias de estimulación.
Promedio ± error estándar. * diferencia significativa p < 0.05. Anell 2001
Por ejemplo, en la figura 7 se observa (panel A) que en las células M el potencial de
acción tiene una mayor duración (DPA) y que la dependencia de la DPA con
respecto a la frecuencia es mas acentuada, comparada con las células de EPI o
ENDO. Al graficar la duración del PA al 90% de la repolarización (DPA90) con
respecto a la frecuencia de estimulación (0.1 a 3 Hz), se puede observar que a bajas
frecuencias de estimulación, la DPA90 en las células M se incrementa de manera mas
acentuada que en las células de EPI (panel B) ; tal como se había descrito en células
del ventrículo del perro (derecho e izquierdo) y del humano (izquierdo) (Antzelevitch
et al 1999; Nabauer et al 1996).
27
Ya que en ese momento no existía una estudio comparativo que describiera las
diferencias entre las células del epicardio, del endocardio y las células M, me
propuse como proyecto de doctorado, realizar un estudio comparativo de las
corrientes repolarizantes ITO1, IK1 e IK en las tres variedades de células de la pared
libre del ventrículo izquierdo del gato.
HIPOTESIS
El incremento de la DPA que se observa en las células M a bajas frecuencias de
estimulación con respecto a células del epicardio y el endocardio, se debe a una
menor densidad de corriente IK en las células M.
OBJETIVOS GENERAL
Comparar las corrientes de potasio ITO1, IK1 e IK en células aisladas del epicardio,
endocardio y células subepicardicas profundas de la pared libre del ventrículo
izquierdo del gato.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Comparar la magnitud de las corrientes de K+ registradas en las células de EPI,
zona media de la pared y ENDO, para describir sus diferencias y/o semejanzas.
2. Separar farmacológicamente los componentes de la corriente IK para comparar la
magnitud de IKs e IKr en los tres tipos celulares.
28
MÉTODO
Se usaron gatos de 1.8 a 4 kg de peso, sin distinción de sexo. Diez minutos previos a
la anestesia se les administro heparina por vía intraperitoneal (400 U.I. /kg de peso).
Los animales fueron anestesiados con pentobarbital sódico (40 mg/kg de peso i.p.) y
bajo un estado de anestesia profunda, se realizo una toracotomía medial para extraer
rápidamente el corazón, el cual fue colocado de inmediato en un recipiente que
contenía solución de Tyrode oxigenada a la temperatura ambiente para trasladarlo
rápidamente al aparato de perfusión.
Obtención de células aisladas.
El corazón se montó en un aparato de Langendorff canulando la aorta para
perfundirlo de manera retrograda a través de las arterias coronarias. La perfusión se
realizó con distintas soluciones sucesivas (véase composición de soluciones) por
tiempos variables, para obtener los miocitos ventriculares aislados siguiendo el
método utilizado por Sánchez-Chapula (1996):
1) 5 minutos con la solución de Tyrode normal.
2) 7 minutos con la solución de Tyrode 0 Ca2+.
3) 25 a 35 minutos con una solución de Tyrode 0 Ca2+, que contenía 1 mg/ml de
colagenasa (Sigma tipo I) y 0.1 mg/ml de proteasa (Sigma tipo XIV).
4) 5 minutos con una solución que contenía alto K+ y bajo Cl- (“Kraftbrühe”, Isenberg
y Klockner, 1982).
La temperatura de las soluciones se mantuvo estable en 35 ± 0.5 º C. Las soluciones
fueron oxigenadas de manera continua con una mezcla de 95% O2 y 5% de CO2
excepto la que contenía alto K+ y bajo Cl- y las utilizadas en los experimentos de
fijación de voltaje, las cuales fueron oxigenada con O2 al 100 %. Posteriormente el
29
corazón fue desmontado del aparato de Langendorff y colocado en un recipiente
lleno con la solución alto K+ y bajo Cl-, para realizar la disección de la pared libre del
ventrículo izquierdo. La pared del ventrículo se coloco en una caja de Petri llena con
la misma solución, para proceder a realizar, bajo un microscopio estereoscópico
(Unitron modelo ZSB), la disección fina de tiras delgadas (≈2 mm de espesor) de
tejido. Primero se obtuvieron tiras delgadas del epicardio, después de la región
subepicardica profunda o zona media de la pared y finalmente del endocardio. Las
tiras se colocaron en recipientes separados en la solución alto potasio y bajo cloro
donde se realizo el aislamiento de las células por medio de la agitación mecánica de
los fragmentos de tejido, sujetando las tiras con unas pinzas finas. Estos recipientes
se almacenaron a 4 º C y las células se usaron dentro de las 10 horas posteriores a
la dispersión.
Composición de las soluciones:
La solución de Tyrode normal tenia la siguiente composición (mM): 118 NaCl, 5.4
KCl, 1.05 MgCl2, 1.8 CaCl2, 24 NaHCO3, 0.42 NaH2PO4, 11 glucosa y 20 taurina. La
solución se oxigeno con 95% O2 y 5% CO2 (pH 7.4). La solución de Tyrode 0 Ca2+ se
preparo igual que la normal pero se omitió el Ca2+.
La solución con alto potasio y bajo cloro (“Kraftbrühe”, Isenberg y Klockner, 1982)
tenía la siguiente composición (mM): 20 KCl, 10 taurina, 70 acido glutámico, 0.5
creatina, 10 KH2PO4, 5 acido succínico, 10 glucosa, 10 HEPES y 0.2 EGTA; el pH se
ajusto a 7.4 con KOH.
La composición de las soluciones utilizadas para los registros de las corrientes
iónicas fueron las siguientes:
30
Solución externa normal (mM): 136 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2 1.8 CaCl2, 10 HEPES, y 11
glucosa, el pH se ajusto a 7.4 con NaOH.
Solución Calcio/Cobalto (Ca2+/Co2+): Para el registro de las corrientes de potasio se
sustituyó la solución externa normal con la solución de Ca2+/Co2+ que tenía la
siguiente composición (mM): 136 NaCl, 4 KCl, 2 CoCl2, 1 MgCl2, 0.5 CaCl2, 10
HEPES, y 11 glucosa, el pH se ajusto a 7.4 con NaOH.
Solución de las pipetas: La solución con la que se llenaron las pipetas tenía la
siguiente composición (mM): 80 K-aspartato, 10 KH2PO4, 50 KCl, 1 MgSO4, 3
ATPNa2, 0.2 GTP, 5 HEPES, y 5 EGTA, el pH se ajustó a 7.3 con KOH (Sánchez-
Chapula 1996).
El cromanol se preparó disolviéndolo en dimetilsulfoxido (Busch et al, 1996) y se
diluyó para obtener una concentración final de 1 a 30 µM en la solución de Ca2+/Co2+
para los experimentos en los que se bloqueo la corriente IKs.
Adquisición y análisis de datos. Para el registros de las corrientes iónicas se utilizo
el método de fijación de voltaje en microáreas de membrana en su configuración de
célula completa (“whole cell patch clamp”, Hamill et al 1981), usando un amplificador
Axopatch 200 A (Axon Instruments). La adquisición de los datos y la generación de
los pulsos de voltaje se realizaron por medio de interfase Digidata 1322A (Axon
Instruments), controlada por el programa pCLAMP 8.1 (Axon Instruments). Las
pipetas fueron fabricadas con capilares de vidrio de borosilicato (TW150-6, World
Precision Instruments) usando un estirador de pipetas vertical (Sutter Instruments,
modelo P-30). La resistencia de las pipetas llenas con la solución interna fue de 1.5 a
2 MΩ.
31
Se depositó una alícuota de la suspensión de células en una cámara experimental
que tenia un volumen de 0.5 ml, montada sobre la platina de un microscopio invertido
(World Precision Instruments, modelo PIM-III). Después de permitir que las células
de adhirieran al fondo de la cámara por 5 minutos, se inicio la perfusión con la
solución externa normal (véase composición de las soluciones) durante 3 min.
Posteriormente, las células se perfundieron con la solución Ca2+/Co2+, para registrar
las corrientes iónicas de K+ (ITO1, IK1 e IK). Las pipetas se manipularon con un
manipulador piezoeléctrico (Burleigh, modelo PCS 5000). La temperatura de las
soluciones en la cámara se mantuvo constante en 35 ± 1 º C, por medio de una
microincubadora (Medical Systems, modelo PDMI-2) acoplada a un sistema de
control de temperatura (Medical Systems, modelo TC 202).
Se aplicaron de manera continua pulsos hiperpolarizantes de 10 ms a -10 mV a partir
de 0 mV, para controlar el establecimiento del sello de la punta de la pipeta con la
membrana (> 1 GΩ). Una vez que se lograba el acceso al interior de las células se
tomaron registros para posteriormente calcular la capacitancia de las células
integrando el área bajo la curva de la corriente capacitiva. Usando el mismo
protocolo de pulsos pero con el potencial de mantenimiento fijado en -50 mV, se
procedió a compensar la resistencia en serie (≈ 75%) y la capacitancia de la célula
para minimizar la duración y la amplitud de las corrientes capacitivas. La capacitancia
calculada de las tres variedades de células fue: EPI 114.6 ± 5.9; M 158.9 ± 8.0;
ENDO 132.1 ± 5.7 pF (promedio ± EE, n = 81). La magnitud de las corrientes se
expresan normalizada a la capacitancia de la membrana como densidad de corriente
en pA/pF.
32
Los datos adquiridos fueron almacenados en el disco duro de una computadora
(IBM-PC Pentium 4) para su análisis posterior con el programa Clampfit 8.1. Los
resultados se presentan como el promedio ± error estándar (EE), el ajuste de las
curvas se realizó con el programa Origin5 (OriginLab Co.). La comparación
estadística entre los promedios de los diferentes grupos de resultados, se realizó con
la prueba de t de Student para muestras independientes con un valor de p < 0.05.
33
RESULTADOS
Corriente ITO1 en células aisladas del ventrículo izquierdo de gato.
En la figura 8 se muestran ejemplos de registros de la corriente ITO1 obtenidos en los
tres tipos de células, aplicando pulsos despolarizantes de 600 ms de -20 a -60 mV
(en incrementos de 10 mV con una frecuencia de 1 Hz) a partir de un potencial de
mantenimiento de -80 mV y precedidos de un breve prepulso (20 ms) a -30 mV para
inactivar la corriente entrante de Na+, de acuerdo con el protocolo (véase inserto de
la figura 9) descrito por Guo et al (1999). Todos los registros de ITO1 se obtuvieron
con una frecuencia de muestreo de 10 kHz filtrando a 5 kHz.
Figura 8. Registros de la corriente ITO1 en células de ENDO, M y EPI al aplicar pulsos
despolarizantes de 600 ms a +10, +30 y +60 mV, precedidos de un prepulso de 20 ms a -30
mV. Potencial de mantenimiento -80 mV. Las flechas señalan el pico de la corriente.
34
En la figura 9, se muestran una ampliación de la fase inicial de la corriente ITO1
registrada en las células aisladas de EPI (A), M (B) y ENDO (C) del ventrículo
izquierdo de gato, en donde se aprecia que el pico de la corriente se puede
diferenciar claramente de la corriente capacitiva. Encontramos que no existen
diferencias significativas en la magnitud de la corriente medida a +60 mV entre las
células de EPI (22.7 ± 1.3 pA/pF) y la de las células de la porción media de la pared
ventricular o células M (21.1 ± 2.1 pA/pF). En (D) puede verse que las curvas I-V
correspondientes se superponen.
Figura 9: Corriente ITO1 registrada en células aisladas del ventrículo izquierdo de gato. A) EPI; B):
células M; C) ENDO. D) Curva corriente-voltaje para la corriente ITO1 (promedio ± EE de n = 8).
Inserto: Protocolo de pulsos utilizado para obtener la curva corriente-voltaje (el asterisco representa el
pulso de 20 ms de duración a -30 mV, que se aplicó para inactivar la corriente de Na+).
35
En contraste, esta corriente es de pequeña magnitud en las células de ENDO al
mismo potencial de membrana (1.1 ± 0.8 pA/pF). En las células de EPI y células M,
la corriente ITO1 se activa a -10 mV; en las células de ENDO, el voltaje de activación
de la corriente ITO1 fue de aproximadamente +30 mV. Para graficar la relación I-V se
midió la amplitud de la corriente ITO1 como la corriente al pico menos la corriente al
final del pulso despolarizante.
Recuperación de la inactivación de ITO1.
Para estudiar como se recupera la corriente ITO1 de la inactivación se utilizó un
protocolo de doble pulso con una frecuencia de 0.1 Hz (Xu et al 1999). El resultado
de estos experimentos se resume en la figura 10 en donde se esquematiza el
protocolo de pulsos utilizado: partiendo de un potencial de mantenimiento de -80 mV,
se aplicó un pulso despolarizante de 100 ms de duración (pulso condicionante) a +40
mV, seguido de un pulso idéntico a intervalos variables entre 1 a 700 ms. Cada uno
de estos pulsos pulsos fue precedido por una despolarización de 20 ms a -30 mV
para inactivar la corriente entrante de Na+. En esta serie, la corriente ITO1 al pico
registrada a +40 mV correspondiente a los pulsos de prueba se normalizó con
respecto a la amplitud de la corriente ITO1 al pico a +40 mV registrada con los pulsos
condicionantes. En la figura 10A se puede apreciar que el proceso de recuperación
es muy rápido, la amplitud de la ITO1 con el pulso aplicado después de un intervalo de
1 ms es aproximadamente un 20 % menor que la registrada con el pulso
condicionante (ITO1c). Los datos del curso temporal del proceso de recuperación de la
corriente ITO1 (Figura 16B), fueron ajustados a una doble exponencial obteniendose
una τ1 = 1.2 ± 0.05 ms y τ2 = 5.3 ± 0.09 ms para EPI y τ1 = 1.6 ± ms 0.4 y τ2 = 7.5 ±
36
0.9 ms para M (promedio ± EE, n = 5). No se encontraron diferencias significativas
para la recuperación de la inactivación de ITO1 entre las células de EPI y células M.
Figura 10. A) Corriente ITO1 en una célula M al aplicar el protocolo de pulsos esquematizado
en el inserto. ITO1c (condicionante c) e ITO1 después del intervalo de 1 ms. B) Curso temporal
de la recuperación de la inactivación para la corriente ITO1 de células de EPI () y células de M
() (promedio ± EE de n = 5 células) los datos se ajustaron a una doble exponencial. En el
inserto se muestra el protocolo de pulsos utilizado.
Inactivación en estado estable de la ITO1.
En la figura 11 se muestra el resultado de los experimentos realizados para
determinar si existían diferencias en la dependencia del voltaje de membrana en la
inactivación de la ITO1 en células de EPI y células M. La curva de inactivación en
estado estable de ITO1, se determinó utilizando el protocolo esquematizado en el
37
Figura 11. Inactivación de ITO1 y su dependencia del voltaje: A) Registros de ITO1
correspondientes a los prepulsos a -110 y -20 mV obtenidos en una célula M (solo se
presentan los últimos 200 ms en el trazo de los prepulsos). B) Curva de inactivación en estado
estable para la ITO1 en células de EPI () y células M (). Los datos se ajustaron a la ecuación
de Boltzman (promedio ± EE de n = 8 células). En el inserto se esquematiza el protocolo de
pulsos utilizado.
inserto: se aplicaron pulsos despolarizantes de 300 ms a +50 mV precedidos por un
pulso condicionante de 1 s de duración a voltajes variables desde -100 a +20 mV,
con incrementos de 10 mV a una frecuencia de 0.1 Hz. En A se muestra un ejemplo
de las corrientes registradas con este protocolo en una célula M, correspondiente a
los prepulso de -100 y -20 mV. En B se muestra la curva de inactivación en estado
estable en la cual la amplitud de ITO1 al pico a +50 mV, se normalizó con respecto a la
corriente máxima que se obtuvo cuando el pulso fue precedido por el pulso
condicionante a -100 mV (ITO1c) (Xu et al 1999). Los datos se ajustaron a la ecuación
38
de Boltzman, obteniéndose un voltaje medio de inactivación (V1/2) de -23.1 ± 0.68 mV
para EPI y -23.47 ± 0.63 mV para las células M. No se observaron diferencias
significativas en el V1/2 entre ambas células, aparentemente la dependencia del
voltaje de la inactivación de ITO1 es similar en ambos tipos de células.
Corriente IK1 en las células aisladas del ventrículo izquierdo de gato.
Para determinar si existían diferencias en la relación corriente-voltaje de IK1 en las
células de EPI, M y ENDO, se aplicaron pulsos de 500 ms, a partir de un potencial de
mantenimiento de -30 mV, a distintos potenciales de membrana desde -100 a +10
mV (con incrementos de 10 mV y una frecuencia de 0.1 Hz) (Liu et al 1993). En esta
serie experimental los datos se adquirieron con una frecuencia de muestreo de 2 kHz
filtrando a 1 kHz. En la figura 12 A se muestra un ejemplo de los registros que se
obtuvieron en una célula M y en B las curvas corriente-voltaje correspondientes a las
tres variedades celulares. Como puede verse no existen diferencias significativas en
las corrientes registradas. La corriente es de entrada a voltajes negativos a -80 mV y
el potencial de inversión de la corriente casi correspondió al valor teórico calculado
con la ecuación de Nernst, a partir de las concentraciones de K+ en la solución de la
pipeta y la solución Ca2+/Co2+ (≈ -75 mV). A potenciales de membrana de -70 a -50
mV la corriente IK1 fue de salida para los 3 tipos celulares observándose una
rectificación de la corriente de -40 a -10 mV.
39
Figura 12: A) Corriente IK1 en una célula M obtenida aplicando el protocolo de pulso
esquematizado en el inserto (de -110 a -10 mV). B) Relación corriente-voltaje para la corriente
IK1 registrada en células de EPI (), M () y ENDO () (Promedio ± EE de n = 13 células).
Corriente IK en células aisladas del ventrículo izquierdo.
Para comparar la corriente IK en las tres variedades celulares del ventrículo, se utilizó
el protocolo de pulsos esquematizado en el inserto de la figura 13: A partir de un
potencial de mantenimiento de -80 mV, se aplicaron pulsos despolarizante de 3 s y
una frecuencia de 0.1 Hz, a potenciales de membrana desde -20 a +50 mV precedido
de un prepulso a -40 mV para eliminar la corriente de Na+. Al término de estos pulsos
el potencial de membrana se fijo en -30 mV por 3 s para registrar las corrientes de
cola (Liu y Antzelevitch 1995). En estos registros se midió la amplitud de la corriente
40
activada durante los pulsos despolarizantes (IKact) al final del pulso y la amplitud al
pico de las corrientes de cola (IKcola) (Liu y Antzelevitch 1995). Los registros de la
corriente IK fueron adquiridos a una frecuencia de muestreo 2 kHz y filtrados a 1 kHz
con una frecuencia de 0.1 Hz. En la figura 13A se muestran ejemplos de la corriente
IK registrada en las células de EPI, M y ENDO del ventrículo.
Figura 13: A) Registros de la corriente IK en células de: epicardio (EPI); capa media (M) y del
endocardio (ENDO). B) curva corriente-voltaje para la corriente de cola (IKcola) de células de
EPI (); M () y ENDO () (Promedio ± EE de n = 6 células). En el inserto se muestra el
protocolo de pulsos utilizado (el asterisco representa el pulso de 200 ms de duración a -30 mV
que se aplico para eliminar la corriente de Na+).
41
En los registros se pudo observar una disminución instantánea de la corriente de
salida con los pulsos despolarizantes a -20 y -10 mV (probablemente debida debido
a las propiedades de rectificación entrante de IK1; Barajas-Martinez et al 2000)
seguida del desarrollo de una corriente de salida dependiente de tiempo. En B se
muestra la relación corriente-voltaje para la corriente de cola en las tres variedades
de células. En esta figura se puede observar que tanto la amplitud de la IKact
(registros de corriente) como la amplitud de la IKcola (curvas I-V) son
significativamente menores en las células M con respecto a las de EPI y ENDO,
como se puede constatar en la tabla 1.
Tabla 1. Corriente IK en células del ventrículo izquierdo
Promedio ± EE de n = 6, * diferencia significativa p < 0.05.
Es importante señalar que los datos sobre la IK de la figura 13 fueron obtenidos
aproximadamente 2 a 3 minutos después de lograr el acceso al interior de la célula,
ya que existen reportes del decaimiento espontáneo (“rundown”) en la amplitud del
42
componente lento de la IK o corriente IKs (Liu y Antzelevitch 1995). Para evaluar la
presencia de este decaimiento y su curso temporal en nuestras condiciones
experimentales, se realizó una serie de experimentos usando células M en las cuales
se registró la IK a distintos tiempos por un periodo de 15 min (Figura 14); se midió la
amplitud de la IKcola que se registro al fijar el potencial de membrana a -30 mV durante
3 s, después aplicar del pulso despolarizante a +50 mV.
Figura 14. Curso temporal del decaimiento de la corriente IK en células M. A) Registros de
IKcola a -30 mV después de aplicar un pulsos despolarizantes de 3 s a +50 mV, trazos
superpuestos con un desplazamiento de 200 ms para ilustración, correspondientes al control (2
min), 5, 8, 11, 14 y 17 min después de lograr el acceso al interior de la células. B) Grafica de
la relación de la corriente IKcola a distintos tiempos normalizada a la IKcola control (IKcola / IKcolac
) en función del tiempo posterior del acceso al interior de las células M (promedio ± EE de n =
6 células)
En A se ejemplifican los registros obtenidos a los 2 (control), 5, 8, 11, 14 y 17 min
después del acceso al interior de una célula M y en B la gráfica de la densidad de
43
corriente IKcola normalizada con respecto a la amplitud control (IKcolac) a los a los 2
min. Se puede apreciar que la amplitud de la IKcola prácticamente no varía durante los
11 min posteriores al acceso al interior de las células, y se reduce en un 2 % a los 14
min y aproximadamente 7 % a los 17 min. Los registros de IK reportados en esta
tesis, fueron obtenidos dentro de los 10 minutos posteriores al acceso al interior de
las tres variedades de células. El protocolo mas largo correspondiente a la prueba de
envoltura de colas (ver mas adelante) se realizó en aproximadamente 10 a 11 min.
Separación de los componentes de IK con cromanol 293B. La separación de los
componentes de IK, se realizo usando cromanol 293B, un bloqueador selectivo para
la corriente IKs (Busch et al 1996; Du et al 2003; Lei et al 2002). Para registrar la
magnitud de la corriente IKcola e IKrcola en las células de EPI, M y ENDO, se utilizo el
protocolo de pulsos previamente descrito para registrar IK en ausencia y presencia de
5 µM de cromanol 293B. Para obtener la corriente sensible a cromanol 293B, se
realizo una resta digital de la corriente IKcola control, menos la corriente IKcola en
presencia de cromanol (figura 15). En la figura 15 D se muestran las curvas I-V para
la corriente de cola IK IKr e IKs registrada en células aisladas de EPI, M y ENDO del
ventrículo izquierdo de gato.
Como se puede observa en las curvas I-V, la corriente IKrcola fue mayor que la
corriente IKscola en todas las variedades celulares estudiadas a potenciales de
membrana mayores a +10 mV, siendo mas marcada esta diferencia en las células de
ENDO. En las curvas I-V se puede observar también que la corriente IKscola a un
potencial de membrana de +30 mV fue menor en M (0.74 ± 0.07 pA/pF) con respecto
a ENDO (1.03 ± 0.08 pA/pF) o EPI (1.68 ± 0.13 pA/pF) (p < 0.05). También se
44
encontrarón diferencias significativas en la magnitud de la corriente IKrcola, siendo a
+30 mV mayor en ENDO (3.37 ± 0.26 pA/pF) y EPI (2.88 ± 0.5 pA/pF) con respecto a
M (1.83 ± 0.34 pA/pF) (p < 0.05).
Figura 15. En el panel de la izquierda se muestra la corriente IKcola registrada en una célula M
en condiciones control (a) y en presencia de cromanol (b). En c se muestra la resta digital de a-
b, para obtener el componente sensible a cromanol o IKs. Curva I-V (D) para la corriente de
cola IK (), IKr () e IKs () registrada en células aisladas del ventrículo izquierdo de gato
(promedio ± EE de n = 6 células).
45
Para evaluar la eficacia de la separación de los componentes de IK con 5 µM, se
realizo una prueba de envoltura de colas. A partir de un potencial de mantenimiento
de -80 mV, se dio un pulso a -40 mV de 200 ms de duración para eliminar la corriente
de Na+, en seguida se dio un pulso a +40 mV de duración variable desde 50 ms a 6
s, retornando a -40 mV durante 3 s para registrar la corriente de cola (la frecuencia
de los pulsos fue de 0.1 Hz).
Figura 16. Prueba de envoltura de colas en células M. A) En el panel izquierdo se muestra la
corriente registrada en condiciones control, a la derecha se muestra el cociente de la corriente
IKcola/IKact con respecto a la duración del pulso despolarizante a +40 mV. B) En el panel de la
izquierda se muestra la corriente IK registrada en presencia de cromanol 293B (5 µM), a la
derecha se muestra el cociente de IKcola/IKact con respecto a la duración del pulso despolarizante
a +40 mV (Promedio ± EE de n = 4 células).
En ausencia de cromanol la corriente IKcola es mayor que la corriente IK activada
durante el pulso (IKact) cuando la duración del pulso despolarizante es pequeña, pero
a medida que la duración del pulso despolarizante se incremente la corriente
activada durante el pulso aumenta de magnitud (figura 16 A). En presencia de 5 µM
de cromanol 293B, aun cuando la corriente IKcola es mayor que la corriente IKact, el
46
cociente de IKcola/IKact se mantiene casi constante durante los primeros pulsos de
prueba, para luego volverse independientemente de la duración del pulso
despolarizante (figura 16 B). Además conforme se incremento la duración del pulso
despolarizante, se observo una marcada rectificación de la corriente IKact, en
presencia de 5 µM de cromanol 293B, con respecto al control.
Figura 17. Curva concentración-respuesta para el efecto del cromanol 293B en células M del
ventrículo de gato. La línea continua se obtuvo ajustando los datos a la ecuación de Hill.
(Promedio ± EE de n = 5 células), IC50 = 2 ± 0.2 µM. n = 1.6
En vista de este resultado se realizo una curva concentración-respuesta a cromanol
293 B en nuestras condiciones experimentales, ya que en la literatura se encontró
que se requieren concentraciones mayores para bloquear IKs en miocitos de otras
especies como el cobayo en donde el bloqueo máximo se observa con 30 µM (Lu et
al 2001). En esta serie experimental se evaluó la disminución de la corriente IKact a +
50 mV, usando diferentes concentraciones de cromanol 293B (1, 2, 3, 5, 10 y 30 µM).
Se encontró que con 10 y 30 µM de cromanol se produjo un bloqueo de IKact del 2.6 y
6.7 % mayor respectivamente, que el encontrado con 5 µM de cromanol 293B (79.2 ±
47
5 %, n = 5 células). El IC50 para cromanol 293B se obtuvo al normalizar el bloqueo de
IKact producido por las diferentes concentraciones utilizadas con respecto al bloqueo
registrado con 30 µM, ajustando estos valores a la ecuación de Hill (figura 17)
obteniéndose un IC50 de 2 ± 0.2 µM.
Para obtener el valor exacto de la magnitud de ambos componentes en las tres
variedades celulares, es necesario realizar otra serie experimental usando una
concentración de 30 µM de cromanol 293B o bien, utilizando un bloqueador selectivo
para la corriente IKr, como el E-4031. No obstante, los resultados obtenidos indican
que la magnitud de IKr es mayor que IKs en los tres tipos de células estudiadas.
También señalan que la magnitud de la corriente IK es menor en las células M,
siendo ambos componentes de la corriente IK (IKs e IKr) de menor magnitud en las
células M.
48
DISCUSION.
En el presente trabajo se realizo un estudio comparativo de las corrientes de potasio
ITO1, IK1 e IK, en las tres variedades celulares que componen el ventrículo izquierdo de
gato. Se encontró que no existen diferencias significativas en la magnitud,
recuperación de la inactivación y en la inactivación dependiente del voltaje, para la
corriente ITO1 entre EPI y M, pero en ambas variedades celulares la magnitud de la
corriente ITO1 fue mayor que en las células de ENDO.
Con respecto a la corriente IK1 los resultados obtenidos en el presente estudio
muestran que la magnitud de esta corriente fue mayor en ENDO con respecto a EPI,
pero la magnitud de la corriente IK1 en las células M no fue significativamente
diferente con respecto a EPI o ENDO.
Por otra parte los resultados conseguidos con este trabajo señalan, que la magnitud
de la corriente IK es menor en las células M con respecto a las células de EPI o
ENDO.
ITO1 en las células aisladas del ventrículo izquierdo de gato. En este trabajo se
observo la presencia de un gradiente transmural para la corriente ITO1, donde esta
corriente fue mayor en EPI y M con respecto a ENDO. Este gradiente transmural fue
similar al observado previamente en el ventrículo izquierdo de gato entre las células
de EPI y ENDO (Furukawa et al 1990). Una de las observaciones realizadas en este
estudio fue, que la magnitud de la corriente ITO1 fue similar entre las células de EPI y
M, esto coincide con las observaciones realizadas previamente en el perro (Liu et al
1993) y el humano (Li et al 1998). Lo que explica la configuración de espiga y domo
que se observa en el potencial de acción registrado en ambas variedades celulares.
49
La magnitud de la corriente ITO1 registrada en las células M o EPI del ventrículo
izquierdo de gato, fue mayor (ITO1 a +50 mV: EPI: 19.3 ± 1.1; M: 18.1 ± 1.9 pA/pF) a
la reportada previamente para las células aisladas del ventrículo izquierdo sin
distinción de la región de la pared ventricular (ITO a +50 mV 12.6 pA/pF) (Sánchez-
Chapula 2001), o para las células aisladas del ventrículo derecho (ITO a +50 mV 16.4
pA/pF) (Sánchez-Chapula 1996). Volders et al (1999) reportaron que en las células M
del perro existe una mayor densidad de ITO1 en el ventrículo derecho con respecto al
izquierdo, con los datos del presente trabajo y los reportados previamente (Sánchez-
Chapula 2001) no podemos establecer si esto se cumple en el caso de los
ventrículos del gato.
Con respecto a otros mamíferos estudiados, la magnitud de la corriente ITO1 en las
células M o EPI del ventrículo de gato reportadas en el presente trabajo, es mayor
que en las células de humano (+60 mV. EPI: 9.8; M: 6 pA/pF) (Li et al 1998). Similar
a la registrada en las células de EPI de conejo (+20 mV. 7.66 pA/pF) (Fedida y Giles
1991) y de perro (+50 mV. ≈ 21 pA/pF) (Liu et al 1993); pero menor a la corriente ITO1
registrada en las células EPI de rata (+40 mV. 24 pA/pF) (Volk et al 1999).
El V1/2 de inactivación encontrado para la corriente ITO1 en las células de EPI y M del
ventrículo de gato, fue similar al reportado para las células de EPI (-22.5 ± 0.7 mV) y
M (-26.6 ±1.1 mV) en humano (Li et al 1998). Pero mas positivo al que se reporto
para las células del ventrículo izquierdo de perro (EPI, M y ENDO: -40 mV) (Liu et al
1993), conejo (EPI: -37.8 mV) (Fedida y Giles 1991) y rata (EPI: -35·6 ± 0·6 mV)
(Volk et al 1999). En las células de EPI y M del ventrículo izquierdo de gato, no se
encontraron diferencias significativas en el V1/2 de inactivación. Con estos datos
podemos concluir que en el ventrículo izquierdo del gato, no existen diferencias en la
50
corriente ITO1, entre las células de EPI y M, y es probable que no contribuyan a la
hetereogenidad de la DPA y su dependencia de la frecuencia de estimulación, tal
como se ha reportados previamente previamente paran el perro (Liu et al 1993) y el
humano (Li et al 1998).
IK1 en células aisladas del ventrículo izquierdo de gato. Los resultados obtenidos
muestran que la magnitud de la corriente IK1 en las células M con respecto a las
células de EPI o ENDO, no fue significativamente diferente. Pero se pudo observar
que la magnitud de la corriente IK1 en ENDO fue ligeramente mayor a la registrada en
las células EPI a potenciales de -60 a -40 mV. Esta diferencia en la magnitud de la
corriente IK1 entre EPI y ENDO coincide con la que fue reportada previamente por
Furukawa y colaboradores (Furukawa et al 1992). El que en el ventrículo de gato, no
existan diferencias en la magnitud de la corriente IK1 en las células M con respecto a
las células de EPI o ENDO, coincide con lo observado previamente en perro y
humano (Liu et al 1993; Li et al 1998), confirmándose así que, la corriente IK1 no
participa en el mecanismo que produce el incremento de la duración del PA en las
células M.
IK, IKs e IKr en células aisladas del ventrículo izquierdo de gato. La magnitud IKcola
registrada en las células de EPI o ENDO en este trabajo, fue similar a la reportada
previamente para el ventrículo derecho de gato (IKcola a +20 mV. 3 pA/pF) (Barajas-
Martinez et al 2000; Sanchez-Chapula 2001). Se encontró que el IC50 para cromanol
293B en gato (IC50: 2 ± 0.2 µM) es similar al que se reporto para el cobayo de 2 a 5
µM (Busch et al 1996; Ding et al 2002; Fujisawa et al 2000) y mayor a la que se
reporto para el conejo de 1.35 µM (Lei et al 2002).
51
Al realizar la separación de los componentes de la IK, con 5 µM de cromanol 293B,
se observo que la magnitud de la corriente IKrcola fue menor en las células M
comparada con la registrada para las células de EPI o ENDO (+20 mV. EPI: 2.4 ±
0.4; M: 1.6 ± 0.3; ENDO: 3.0 ± 0.2 pA/pF). La magnitud de la corriente IKrcola
registrada en las células de EPI y ENDO en este estudio, fue similar a la reportada
previamente para las células aisladas (sin distinción de la región de la pared
ventricular) del ventrículo derecho de gato (IKrcola a +20 mV. 2.3 pA/pF) (Barajas-
Martinez et al 2000; Sanchez-Chapula 2001.
Al realizar la resta digital, para obtener el componente sensible al cromanol 293B o
IKscola, encontramos que la magnitud de esta corriente fue menor en las células M,
comparada con la de EPI o ENDO (a +30 mV, EPI: 1.7 ± 0.1; M: 0.74 ± 0.07; ENDO:
1.03 ± 0.08 pA/pF)
En el gato la magnitud de la corriente IKs en células de EPI y ENDO del ventrículo
izquierdo es similar la registrada en células del ventrículo derecho (Barajas-Martinez
et al 2000; Sanchez-Chapula 2001), a diferencia de lo que se observo previamente
en el perro, donde la magnitud de la corriente IKs fue mayor en las células aisladas
del ventrículo derecho con respecto a las células aisladas del ventrículo izquierdo
(Volders et al 1999). Otra diferencia que se puede observar en el gato es que ambos
componentes de la corriente IK están disminuidos en las células M, a diferencia de lo
que fue reportado previamente en el perro, donde solo el componente IKs fue menor
(Liu y Antzelevitch 1995)
En las tres variedades de células estudiadas del ventrículo izquierdo de gato, la
corriente IKrcola fue mayor que la corriente IKscola, como fue reportado previamente
para células del ventrículo derecho de gato adulto (Barajas-Martinez et al 2000;
52
Sanchez-Chapula 2001). A diferencia de lo que fue descrito en la literatura para otras
especies de mamíferos como el cobayo (Lu et al 2001), humano (Li et al 1996) y
perro (Liu y Antzelevitch 1995), donde la corriente IKs fue mayor que la corriente IKr, o
a lo reportado para las células ventriculares de conejo, donde ambos componentes
de la corriente IK tiene una magnitud similar (Lu et al 2001).
Con respecto a otros mamíferos, la corriente IKs registrada en las células aisladas del
ventrículo izquierdo de gato a +20 mV fue similar a la registrada en células aisladas
del ventrículo de humano (+20 mV: 0.6 pA/pF) (Li et al 1996) y de conejo (+20 mV:
0.7 pA/pF) (Lu et al 2001), mayor con respecto a la registrada en células aisladas del
ventrículo de perro a +40 mV en EPI (0.71 pA/pF), M (0.36 pA/pF) y ENDO (0.65
pA/pF) (Liu y Antzelevitch 1995). Pero menor comparada con la registrada en células
aisladas del ventrículo de cobayo (+40 mV: 3.3 pA/pF) (Lu et al 2001).
Para la corriente IKr los resultados obtenidos en el presente trabajo muestran que en
las células aisladas del ventrículo de gato, esta corriente fue mayor a la registrada (a
+20 o a +40 mV según el caso, véase figura 17 curvas IV) en humano (+20 mV: 0.4
pA/pF) (Li et al 1996), conejo (+20 mV: 0.7 pA/pF), cobayo (+40 mV: 1.7 pA/pF) (Lu
et al 2001) y perro (+40 mV. EPI: 0.46; M: 0.36; ENDO: 0.52 pA/pF) (Liu y
Antzelevitch 1995).
Los resultados obtenidos con este estudio muestran que en las células del VI de gato
la magnitud de la corriente IKcola, fue menor en las células M con respecto a la
registrada en las células de EPI o ENDO (ver tabla 1). Lo cual coincide con lo que fue
reportado previamente para el perro (Liu y Antzelevitch 1995), humano (Szabo et al
2005) y conejo (Wang et al 2004). Si bien hay evidencias de las caracteristicas de los
PA de celulas del VD y del VI no son exactamente iguales, las corrientes iónicas que
53
generan ambos PA son las mismas (Varro et al 1999). De tal manera que los
resultados obtenidos en el presente trabajo pudieran explicar, al menos en parte, el
porque la DPA90 en las células M del gato es mayor que la observada en células de
EPI y ENDO, sobre todo a bajas frecuencias de estimulación (Anell 2001) (figura 13).
Al separar los componentes de la corriente IK con 5 µM de cromanol 293B,
encontramos que la magnitud de ambos componentes de la corriente IK estaba
disminuida en las células M, con respecto a las células de EPI o ENDO, sin embargo
se requiere realizar experimentos adicionales con concentraciones mayores de
cromanol 293B (vrg. 30 µM o mayor) para separar los componentes de IK, o bien
utilizar un bloqueador selectivo de lKr como el E4031 para realizar la descripción
definitiva de IKs e IKr en las tres variedades de células en el ventrículo izquierdo del
gato. Sin embargo, los datos obtenidos sustentan el hecho de que en las células M
del gato existe una menor densidad de corriente IK, y sugieren que ambos
componentes IKs e IKr están disminuidos con respecto a las células de EPI y ENDO y
que en los tres tipos de células la densidad de la corriente IKr es mayor que la de IKs.
Participación de la corriente IK en la repolarización del PA cardiaco. La fase 3 de
la repolarización del PA cardiaco se produce por la activación de la corriente IK
(Sanguinetti y Keating 1997). La corriente IK esta formada por 2 componentes uno de
activación lenta o IKs y otro de activación rápida o IKr (Sanguinetti y Jurkiewicz 1990).
La repolarización del PA cardiaco en condiciones normales depende solo de la
corriente IKr en la mayoría de los mamíferos (Varro et al 2000), se ha propuesto que
por este hecho la corriente IKs solo funciona como ”reserva” de la repolarización del
PA cardiaco (Jost el al 2005), es decir que la contribución de IKs a la repolarización
del PA cardiaco se vuelve importante cuando existe una disminución de la corriente
54
IKr, ya sea por una patología (hipocalemia, bradicardia y mutaciones de los genes
que codifican para los canales iónicos), por un bloqueo farmacológico de IKr
(antiarrítmicos clase III, antihistamínicos, antibióticos) (Cheng y Kodama 2004).
También es importante cuando existe una estimulación β-adrenérgica ya que se
incrementa la magnitud de la IKs y su efecto es acortar la duración del PA (Volders et
al 2003, Stengl et al 2003; Cheng y Kodama 2004).
Efecto de la frecuencia de estimulación sobre la repolarización del PA
cardiaco: participación de IKr e IKs. Una de las características del PA cardiaco es
que la DPA, varía con la frecuencia de estimulación. Al pasar de una frecuencia baja
de estimulación a una frecuencia alta, se acorta la DPA. Sicouri et al (1996) por
medio registros con electrodos intracelulares, demostraron que en el ventrículo de
cobayo la DPA90 a 0.2 Hz es 185 ± 24 ms vs 136 ± 9 ms, a 3.3 Hz. En estudios
realizados en miocitos aislados del ventrículo de cobayo, se han encontrado
evidencias de que esto se debe a que a altas frecuencias de estimulación, se
produce una acumulación de la activación de la corriente IKs, (Jurkiewicz y
Sanguinetti 1993; Rocchetti et al 2001) debido a lenta desactivación de IKs. Este
proceso que se ajusta una exponencial (a -30 mV la constante de desactivación de
IKs es τs = 882 ± 19 ms; Chinn 1993). Los canales que conducen IKs, para pasar del
estado de reposo al abierto, transitan por varios subestados cerrados (que no
conducen corriente pero que no estan reposo), por lo que es posible que al final del
intervalo diastolico, parte de los canales se encuentren en un estado “intermedio”
(distinto al de reposo) desde el cual puedan pasar mas rapido al estado abierto. Por
lo que la probabilidad de estar en uno de esos estados intermedios se incrementa al
disminuir el intervalo diastolico, es decir cuando aumenta la frecuencia de
55
estimulacion, lo cual explicaria la acumulación de la activación (Tristani-Firouzi y
Sanguinetti 1998, Rochetti et al 2001).
Por otra parte se ha observado que en el cobayo, la corriente IKr también puede
incrementarse al aumentar la frecuencia de estimulación, pero a diferencia de IKs,
este incremento de IKr depende de la velocidad de repolarización. En miocitos de
cobayo, aplicando pulsos de fijación de voltaje en rampa, con diferentes pendientes
(dV/dT) desde +30 a -80mV, se observó un incremento lineal en la magnitud de IKr a
velocidades de repolarización de entre 0 a 1 V s-1 (Rocchetti et al 2001). De esta
manera IKr tambien podria contribuir a acortar la DPA con incrementos en la
frecuencia de estimulación.
Sin embargo, no en todas las especias de mamíferos estudiadas la desactivación de
IKs es tan lenta como en cobayo. En perro y en humano, se encontró que la constante
de desactivación (τs) de IKs es más rápida con respecto al cobayo (a -40 mV τs: 86 ±
12 y 122 ± 11 ms en perro y humano respectivamente; Cheng y Kodama 2004).
Ademas, en miocitos de perro hay evidencias de que la corriente IKs presenta una
escasa acumulación de la activación a altas frecuencias de estimulación (Stengl et al
2003) y tampoco se observan incrementos en la IKr relacionados con los cambios en
la velocidad de repolarización (Gintant 2000). Por lo tanto, es probable que en el
mecanismo que produce la disminución de la DPA en perro y humano a altas
frecuncias de estimulacion (en el rango fisiológico) participen otras corrientes, y se ha
propuesto que podria ocurrir una disminución de la corriente ICa y/o un aumento en la
corriente producida por la bomba Na+/K+ (Stengl et al 2003; Boyett y Fedida 1984)
En el gato, debido a la mayor magnitud de la corriente IKr con respecto a IKs (figura
15), es probable que la repolarización del PA dependa mas de IKr, mientras que IKs
56
funcionaría como una “reserva” de corriente repolarizante (Cheng y Kodama, 2004).
Por otra parte, en miocitos del VD de gato (sin distinción de la región de donde
fueron aislados), se ha reportado que la desactivacion de IKs se ajusta a dos
exponenciales (τf y τs, Barajas-Martinez et al 2000). En esta especie τf tiene un valor
intermedio entre el de la constante de desactivacion de miocitos de cobayo y el
correspondiente al perro y humano (a -30 mV, τf ≈ 428 ms, determinada en la figura 6
del trabajo de Barajas-Martinez et al 2000), por lo tanto, es probable que al aumentar
la frecuencia de estimulación pueda existir una acumulación de la activación de la
corriente (IKs). Por otra parte, se desconoce si en miocitos de gato la magnitud de IKr
cambia en función de la velocidad de repolarización o si otras corrientes de entrada o
de salida sufren cambios con la frecuencia de estimulación, que tengan un impacto
en la DPA (vrg. INalate, ICa, la generada por la bomba de Na+/K+).
Importancia Clínica de las Células M. Se ha observado que la presencia de células
M en la pared ventricular, crea una dispersión transmural de la DPA (Antzelevitch et
al 1991; Sicouri y Antzelevitch 1991). La dispersión transmural de la repolarizacion se
mide como la diferencia que existe (en ms) entre la duracion del PA mas largo, que
es el de las células M y la duración del PA mas corto, que es el que se registra en las
células de EPI. En la pared ventricular izquierda de perro se ha medido una
dispersión transmural de la repolarizacion de 51 ± 19 ms a una frecuencia de 1 Hz
(Yan et al 1998; Antzelevitch et al 1999).
Existen evidencias de que además de que los PA de las células M son mas
prolongados, en estas la DPA puede incrementarse de manera mas pronunciada que
en EPI o ENDO, en respuesta a la acción de fármacos (vrg. antiarritmicos clase III
entre otros), bradicardia y algunas canalopatías (síndrome del QT largo),
57
incrementandose en consecuencia la dispersión transmural de la repolarizacion
(Antzelevitch et al 1999; Tamargo 2000) lo que puede generar las condiciones
necesarias para la generación de arritmias ventriculares (Antzelevitch y Shimizu
1998; Antzelevitch y Yan 1998).
También se ha demostrado que los gradientes de voltaje, que se crean entre las
células de EPI, M y ENDO, debido a las diferencias en la forma y duracion de los PA,
contribuyen a la generación de algunas ondas electrocardiográficas, por ejemplo, la
onda J, T y U (Yan y Antzelevitch 1998; Yan et al 1998).
CONCLUSION.
En el presente trabajo solo se estudiaron las características de las corrientes de
salida ITO1, IK1 e IK y sus componentes IKr e IKs en células aisladas del ventrículo
izquierdo de gato; de acuerdo con nuestros resultados se puede concluir que:
Existe un gradiente transmural para la IK ya que en las células M se encontró una
menor densidad de esta corriente con respecto a las células de EPI y ENDO,
situación que seria compatible con una mayor duracion de los potenciales de acción
en las células M. Aunque es posible que las características electrofisiológicas de las
células del VD y del VI no sean exactamente iguales, las corrientes iónicas que
participan en la generacion de los PA son las mismas (Varro et al 1999). De tal
manera que los resultados obtenidos en el presente trabajo pudieran explicar, al
menos en parte, el porque la DPA90 en las células M del gato es mayor que la
observada en células de EPI y ENDO, sobre todo a bajas frecuencias de
estimulación tal como se observó en el VD del gato (Anell 2001). Aunque no se
puede descartar la posible participación de las corrientes de entrada que se activan
durante la meseta (vrg. INalate, ICa, INaCa) y que no han sido comparadas en miocitos de
58
las tres regiones de la pared ventricular en el gato. Se sabe que ambas corrientes en
el perro (Zygmunt et al 2001; Zygmunt et al 2000), tienen una mayor magnitud en las
células M con respecto a la registrada en las células de EPI o ENDO.
También existe un gradiente transmural para la ITO1 entre las células de EPI y M con
respecto a las de ENDO, en las que esta corriente es muy pequeña. Pero la ITO1 en
células de EPI y células M muestran propiedades semejantes, por lo que es
razonable suponer que no determinarían diferencias en la DPA en estas células.
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