TESIS PROFESIONAL
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS CAMPUS IV TESIS PROFESIONAL Que como requisito parcial para obtener el TÍTULO de: INGENIERO AGRÓNOMO TROPICAL Presenta: LEYSVER DE LA ROSA CANCINO Director de tesis: DR. ALEJANDRO LEY DE COSS HUEHUETÁN, CHIAPAS; MEXICO, ABRIL DE 2012. POBLACIÓN MICROBIANA Y PRODUCCIÓN DE GASES DE EFECTO INVERNADERO (GEI) DE CAULOTE (Guazuma ulmifolia Lam) EN UN SISTEMA in vitro DE FERMENTACIÓN RUMINAL
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POBLACIÓN MICROBIANA Y PRODUCCIÓN DE GASES DE EFECTO INVERNADERO (GEI) DE CAULOTE (Guazuma ulmifolia Lam) EN UN SISTEMA in vitro DE FERMENTACIÓN RUMINAL
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS
FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS
CAMPUS IV
TESIS PROFESIONAL
Que como requisito parcial para obtener
el TÍTULO de:
INGENIERO AGRÓNOMO TROPICAL
Presenta:
LEYSVER DE LA ROSA CANCINO
Director de tesis:
DR. ALEJANDRO LEY DE COSS
HUEHUETÁN, CHIAPAS; MEXICO, ABRIL DE 2012.
POBLACIÓN MICROBIANA Y PRODUCCIÓN DE
GASES DE EFECTO INVERNADERO (GEI) DE
CAULOTE (Guazuma ulmifolia Lam) EN UN
SISTEMA in vitro DE FERMENTACIÓN RUMINAL
El presente trabajo de investigación fue realizado en la Facultad de
Ciencias Agrícolas, en el Laboratorio de Biotecnología Animal bajo la dirección del
Dr. Alejandro Ley de Coss. Este experimento fue financiado por la Secretaria de
Educación Pública mediante el Programa de Mejoramiento del Profesorado
(PROMEP) con el proyecto PROMEP/103.5/10/4666 con registro
06/AGV/PMP/070/11 intitulado “Plantas Nativas con Potencial uso Forrajero
que mitigan la Producción de Metano en el Rumen” en una sub-línea de
investigación titulada “Población Microbiana y Producción de Gases de Efecto
Invernadero (GEI) de Caulote (Guazuma ulmifolia Lam) en un Sistema in vitro
de Fermentación Ruminal”.
AGRADECIMIENTOS
A la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Autónoma de Chiapas, Campus
IV, por permitir terminar mi carrera como Ingeniero Agrónomo Tropical.
Al Dr. Alejandro Ley de Coss; por haberme dado la oportunidad de ser su tesista y quien
brillantemente hizo posible la dirección y asesoría de esta investigación, pero sobre todo
le doy mis más sinceros agradecimientos por el apoyo y los buenos consejos sobre la
enseñanza.
Al Dr. Jaime Jorge Martínez Tinajero M.C. Carlos Gumaro García Castillo, M.C. Saúl
Posada Cruz y al M.C. José de Jesús Maldonado Méndez, por las sugerencias y
observaciones del presente trabajo en la revisión del escrito final.
A mis compañeros de la generación 2007 – 2011 por convivir durante el largo periodo en
nuestra formación académica y por su valiosa y sincera amistad.
A mis compañeros y amigos del Laboratorio de Biotecnología Animal, Williams, José
Francisco, Luis, Marco Antonio, Elfer Misael, Benjamín, Gilberto, David Pacheco,
David Pineda y Luis Alberto. Por su amistad y por el apoyo brindado durante la
realización del presente trabajo de investigación.
Al Laboratorio de suelo por el material brindado y el apoyo durante el periodo de
trabajo.
Y a todas aquellas personas que de una u otra forma, colaboraron en la realización de
esta investigación, hago extensivo mi más sincero agradecimiento, mil gracias.
Leysver de la Rosa Cancino
DEDICATORIA
A Dios
Por permitirme llegar a este momento tan especial en mi vida. Por haberme dado
vida para lograr mis triunfos y guiarme en los momentos difíciles que me han
enseñado a valorarte cada día más.
A mis padres
Quienes me han apoyado en todo momento, por sus valiosos consejos, los valores
y la motivación para seguir adelante. Este logro también es de ustedes, y por todo
ese esfuerzo brindado hacia mí, siempre les estaré agradecido toda la vida, con
cariño y amor.
A mis hermanos
Javier y Wilmar que siempre he contado con ustedes para todo, por su apoyo
incondicional gracias a la confianza que siempre nos hemos tenido; ¡Gracias
hermanos!
A mis abuelos
José domingo †, María del Carmen
†, Humberto
†, Carmen. Por todos los consejos
que han brindado, siempre los llevare en mi mente.
A ti
Andrea con mucho cariño y amor, por todos los momentos compartidos, por tu
valioso apoyo, comprensión y amor incondicional, muchas gracias, corazón!!
ÍNDICE
Página
ÍNDICE DE CUADROS i
ÍNDICE DE GRÁFICAS ii
ÍNDICE DE FIGURAS iii
RESUMEN iv
1. INTRODUCCIÓN............................................................................... 1
2. OBJETIVOS 3
3. HIPÓTESIS 4
4. REVISIÓN DE LITERATURA 5
4.1. La Producción de Gases de Efecto Invernadero (GEI) en la
Ganadería y su Impacto
5
4.2. Emisión de Metano (CH4) y Bióxido de Carbono (CO2) por los
Rumiantes
6
4.3. Microbiología del Rumen 7
4.3.1. Protozoarios 8
4.3.2. Bacterias 9
4.3.3. Hongos 10
4.4. Alternativas para Reducir la Producción de GEI 10
4.4.1. Manipulación de Microorganismos Ruminales 11
4.4.2. Mejoramiento de las Dietas para la Nutrición Animal 12
4.5. Uso de Árboles y Arbustos Multipropósito (AMP) en la Nutrición
Animal
15
4.6. Caulote (Guazuma ulmifolia Lam) 17
4.7. Técnica de Fermentación Ruminal in vitro 18
4.7.1. Ecuaciones de Predicción 18
4.7.2. Técnicas Cerradas 19
4.7.3. Métodos Fermentativos in vitro 19
5. MATERIALES Y MÉTODOS 21
5.1. Ubicación 21
5.2. Colecta de Material Vegetal 21
5.3. Procesado de Material Vegetal 21
5.4. Distribución de las Dietas 21
5.5. Digestibilidad in vitro de la Materia Seca 22
5.6. Producción de Gas 24
5.7. Concentración de Ácidos Grasos Volátiles 25
5.8. Concentración de Bacterias Celulolíticas 25
5.9. Concentración de Bacterias Totales 26
5.10. pH 27
5.11. Diseño y Análisis Estadístico 28
6. RESULTADOS 30
6.1. Digestibilidad in vitro de MS (DIVMS) 30
6.2. Producción de Gas Total 33
6.3. Concentración de Ácidos Grasos Volátiles 35
6.4. Concentración de Bacterias Totales 37
6.5. Concentración de Bacterias Celulolíticas 38
7. CONCLUSIONES 40
8. BIBLIOGRAFÍA 41
i
ÍNDICE DE CUADROS EN EL TEXTO
Cuadro Página
1 Aumentos en la concentración atmosférica de CO2, CH4, y
N2O del año 1750 al año 2005.
6
2 Tratamientos para digestibilidad in vitro de Materia Seca 21
3 Tratamientos para producción de gases totales 22
4 Medio de cultivo para digestibilidad in vitro de materia
seca.
23
5 Composición del medio de cultivo base (GCA-FR) para
crecimiento y supervivencia de bacterias totales y
celulolíticas.
27
6 Digestibilidad in vitro de materia seca (DIVMS %) y pH del
medio de cultivo.
30
7 Producción de gases totales de la materia seca
fermentada (MSF).
33
8 Concentración (mM L -1) de ácido acético, propiónico,
butírico y AGV totales.
36
9 Concentración (%) de ácido acético, propiónico y butírico a
las 96 horas de incubación.
37
10 Concentración de Bacterias totales (BT). 38
11 Concentración de Bacterias Celulolíticas (BC). 39
ii
ÍNDICE DE GRÁFICAS EN EL TEXTO
Página
Gráfica 1 Porcentaje de digestibilidad in vitro de la materia seca. 32
Gráfica 2 Porcentaje de producción de Gases Totales de la Materia
Seca Fermentada.
34
iii
ÍNDICE DE FIGURAS EN EL TEXTO
Página
Figura 1 Fermentador Ruminal artificial para evaluar producción
de gases totales.
24
Figura 2 Bacterias totales en microscopio de contraste de fases
con apoyo de cámara Petroff-Hausser.
26
Figura 3 Medición de pH en tubos de cultivo de 18 x 150 mm
durante periodos de incubación.
28
iv
de la Rosa, C. L. 2012. Población Microbiana y Producción de Gases de efecto
Invernadero (GEI) de Caulote (Guazuma ulmifolia Lam.) en un Sistema in
vitro de Fermentación Ruminal. Tesis Profesional. Facultad de Ciencias
Agrícolas, Campus IV. Universidad Autónoma de Chiapas. Huehuetán,
Chiapas; México.
Palabras Clave: Producción de GEI, Metano, Rumen, Caulote (Guazuma ulmifolia
Lam)
RESUMEN
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Biotecnología Animal de
la Facultad de Ciencias Agrícolas, con el objetivo de evaluar in vitro la
digestibilidad y la producción de gases totales, así como los cambios en las
poblaciones de microorganismos del rumen, como una alternativa para optimizar
el proceso de fermentación ruminal con el uso de dietas a base de Caulote
(Guazuma ulmifolia Lam), Pasto Estrella (Cynodon nlemfuensis Vanderyst) y
Alimento concentrado (AC) con 16% de PC y 1150 Mcal de ENl. Se utilizó un
diseño completamente al azar con cinco tratamientos y tres repeticiones. Las
variables fueron evaluadas con el procedimiento GLM y las medias se analizaron
con la prueba de Tukey (SAS, 1998). Se compararon con el procedimiento de
mediciones repetidas de Wilcoxon o pruebas de suma de rangos (SAS, 1998). La
digestibilidad de G. ulmifolia fue superior (P<0.05) a C. nlemfuensis a las 3, 6, 12,
24, 48, 72 y 96 h de incubación, aunque el alimento concentrado (AC) fue superior
(P<0.05) a ambos con 68% de DIVMS. El tratamiento con alimento concentrado
tuvo la menor producción de gases totales (P>0.05), a mayor concentración de G.
ulmifolia en los tratamientos, la cantidad de gases totales fue menor (P>0.05). La
concentración de AGV fue mayor (P<0.05) en el tratamiento con alimento
concentrado y no se presentó diferencia (P>0.05) entre los tratamientos en la
concentración de bacterias totales y celulolíticas.
1. INTRODUCCIÓN
En México, la región tropical de la costa de Chiapas ha sido un área de
preferencia para la producción ganadera, lo cual ha propiciado la acelerada
deforestación (Carranza et al., 2003); aunado a lo anterior, otros graves problemas
en el trópico subhúmedo son la producción irregular de forraje y la baja calidad de
los pastos. La ganadería contribuye a las emisiones antropogénicas de metano,
bióxido de carbono, y óxido nitroso a la atmosfera; a estos y otros gases se
atribuyen el efecto invernadero. Los microorganismos del rumen producen metano
durante la fermentación anaeróbica de carbohidratos solubles y estructurales, este
gas que se emite por los rumiantes no es solamente un problema ecológico, sino
que representa una pérdida de la energía del alimento ya que se pierde entre 8 y
12 % de la energía bruta procedente de los alimentos que consumen los animales
en forma de metano, además de disminuir la productividad de los animales.
Los sustratos de baja calidad están relacionados con una baja tasa de
pasaje, bajos índices productivos y reproductivos además de tener efecto en el
incremento de emisiones de Gases de Efecto Invernadero (GEI). El mejoramiento
de la dieta se considera una alternativa viable para aminorar la producción de
metano y para disminuir las pérdidas energéticas en el animal. El uso de árboles
forrajeros en la alimentación de rumiantes es una opción para superar esta
problemática, ya que poseen una buena calidad nutricional a diferencia de la
mayoría de los pastos. El mejoramiento de las características nutricionales de la
dieta con sistemas estratégicos de suplementación con árboles forrajeros, permite
mejorar las características fermentativas a nivel ruminal, una mayor productividad
y disminución en las emisiones de GEI, por lo anterior, el caulote (Guazuma
ulmifolia Lam.) es una fuente alterna de alimento para los rumiantes, ya que el
valor forrajero de sus hojas y frutos es superior al de las plantas herbáceas.
2
En el presente trabajo se utilizó un sistema in vitro de fermentación ruminal
al cual se adicionaron dietas a base de caulote en diferentes concentraciones,
pasto estrella y alimento concentrado. Este sistema permite medir los gases de
efecto invernadero que se generan mediante la fermentación ruminal, así como las
concentraciones de microorganismos presentes en cada tratamiento.
2. OBJETIVOS
Evaluar la producción in vitro de gases de efecto invernadero (GEI) totales
(principalmente bióxido de carbono y metano) en un sistema in vitro de
fermentación ruminal.
Evaluar los cambios en la población de microorganismos del rumen,
principalmente bacterias totales y celulolíticas.
Evaluar las concentraciones de AGV y pH en medio de cultivo in vitro con
diferentes concentraciones de caulote (Guazuma ulmifolia Lam).
3. HIPÓTESIS
- Guazuma ulmifolia Lam como fuente de alimento para los rumiantes
reduce la producción y emisión de GEI totales (principalmente CO2 y CH4),
además mantiene las poblaciones de los microorganismos del rumen, las
concentraciones de AGV y el pH dentro de los parámetros normales.
4. REVISIÓN DE LITERATURA
4.1. La producción de Gases de Efecto Invernadero (GEI) en la Ganadería
y su Impacto
El metano (CH4), el bióxido de carbono (CO2), el óxido nitroso (N2O), entre
otros, son gases de efecto invernadero; estos provocan que la radiación infrarroja
sea retenida en la atmosfera, causando que se caliente la superficie de la tierra y
la parte inferior de la atmosfera. El CH4 es considerado como uno de los gases
que contribuye principalmente al efecto invernadero y a la destrucción de la capa
de ozono causando un grave impacto al medio ambiente al igual que el CO2, el
cual tiene el segundo lugar de importancia en los efectos dañinos que contribuye
al calentamiento global (Carmona, 2005).
La agricultura y la producción pecuaria contribuyen a las emisiones
antropogénicas de metano, bióxido de carbono y óxido nitroso a la atmosfera. A la
gama de estos gases se atribuye el efecto invernadero (Primavesi, 2004). El
metano es un potente gas de efecto invernadero, ya que su potencial de absorción
de la radiación es aproximadamente 21 veces superior al del bióxido de carbono,
si bien, su concentración con respecto al CO2 es muy baja, su contribución al
efecto invernadero es importante. Así mismo, debido a que su tiempo medio de
vida en la atmósfera es corto, las pequeñas disminuciones que se producen
pueden ocasionar ventajas ecológicas (Moss et al., 2000).
En el sector ganadero, únicamente la emisión de metano es importante,
esto a pesar de que se emite más CO2 que CH4 mediante el eructo del rumiante
en relación 70:30 respectivamente; la razón, es que el CO2 emitido por los
rumiantes forma parte del ciclo biológico natural del CO2 en el planeta (Cobos,
2007).
6
Cuadro 1. Aumentos en la concentración atmosférica de CO2, CH4, y N2O
del año 1750 al año 2005.
GEI Año 1750 Año 2005 Incremento %
CO2 277ppm 382 ppm 138
CH4 600 ppb 1728 ppb 288
N2O 270-290 ppb 318 ppb 114
4.2. Emisión de Metano (CH4) y Bióxido de Carbono (CO2) por los
Rumiantes
El ganado bovino emite metano debido a que en el proceso digestivo, que
ocurre bajo condiciones anaeróbicas, participan diferentes tipos de
microorganismos; estos degradan la celulosa ingerida a glucosa, que fermentan
después a ácido acético, propiónico y butírico, el CO2 e hidrogeno resultante de
esta fermentación es usado por las bacterias metanogenicas, las cuales forman
metano en el proceso que se pierde en forma de gas, y que no es aprovechada
para producción de leche o carne (Montenegro y Abarca, 2000).
El proceso de la metanogénesis se desarrolla en diversos hábitats
anaerobios y se lleva a cabo por un pequeño y único grupo de bacterias
metanogénicas (McAllister et al., 1996; Joblin, 2004). El metano entérico que
emiten los rumiantes a la atmosfera constituye un problema ecológico, representa
pérdida de la energía del alimento y disminución en productividad de los rumiantes
(Soliva et al., 2003). Se reporta que entre 8 y 12 % de la energía bruta procedente
de los alimentos que consumen los animales se pierde en forma de metano
(Johnson et al., 2000).
7
En los rumiantes el sitio principal de formación de metano es el rumen y se
produce como una consecuencia inevitable de la fermentación de los
carbohidratos solubles y carbohidratos estructurales por los microorganismos que
habitan en ese reservorio (MacCaughey et al., 1997). Se ha reportado que el 98%
total de metano producido por el rumiante es expirado por la boca y orificios
nasales, la emisión de metano a la atmósfera se produce mediante la eructación, y
la cantidad que se libera depende del volumen y tipo de alimento que consumen
los animales, su producción es menor en dietas bajas en fibra (Gil, 2004). La
producción de metano por parte de los microorganismos del rumen se estima
entre 300 y 600 L al año en ganado adulto, esto representa alrededor de 80 a 110
millones de toneladas al año. La cantidad de metano producida depende de
diversos factores, como el estado fisiológico, nivel de alimentación y el tipo de
dieta forrajera, dieta mixta o dieta concentrada (González et al., 2006). Además
no solo constituye un problema ecológico, si no también representa la perdida de
energía del alimento y la disminución en la productividad de los animales (Johnson
et al., 2000; Anderson et al., 2003).
4.3. Microbiología del Rumen
Los protozoarios, bacterias y hongos existentes en el rumen-retículo son
responsables de la digestión de la mayoría de los nutrientes, principalmente de los
carbohidratos complejos (FDN y FDA) de la pared celular de los vegetales. El tipo
de dieta, el nivel de energía y la proteína de la ración influyen en la concentración
y composición de la fauna ruminal a través de la acción directa o indirecta sobre el
pH y la tasa de pasaje del contenido ruminal (Franzolin et al., 1998).
En el rumen encontramos una población de microorganismos como
bacterias, hongos y protozoarios, quienes proporcionan características al rumen,
los rumiantes utilizan celulosa y hemicelulosa mediante procesos bioquímicos de
fermentación (Chaudhary et al., 1993; Oguimoto e Imai, 1981). Los cuales
8
también mantienen una compleja simbiosis con el hospedero, además son
responsables de la digestión de nutrientes, pero igualmente de otros aspectos que
afectan de forma positiva y eventualmente de forma negativa al animal y al medio
ambiente (Dehority, 1993; Williams y Coleman, 1992; citados por Ley de Coss et
al., 2011a).
Los rumiantes establecen una simbiosis con los microorganismos ruminales
mediante la cual el rumiante aporta nutrientes y un medio ruminal adecuado para
la supervivencia de los microorganismos además de la fermentación de los
alimentos. Los microorganismos tienen la capacidad de utilizar la fibra y proteína
microbiana sintetizada en el rumen que constituye la fuente principal de energía y
proteína respectivamente para el animal. Los rumiantes emiten mayores
cantidades de metano, debido a la elevada población de microorganismos
productores de metano que habitan en el retículo-rumen. Sin embargo, esta
relación de simbiosis es ineficiente en algunos aspectos, tanto desde el punto de
vista energético (pérdidas de metano) como desde la pérdida proteica de
nitrógeno amoniacal (Van Nevel y Demeyer, 1988).
4.3.1. Protozoarios
El primer reporte de la existencia de protozoarios en el tracto digestivo de
animales herbívoros fue publicado por Gruby y Delafond en 1843. Actualmente se
conoce la existencia de alrededor de 30 géneros y 300 especies de protozoarios
ruminales, la concentración normal es de 104 a 106 protozoarios por mL de fluido
ruminal. De acuerdo a su morfología, se clasifican en ciliados y flagelados. Los
protozoarios ciliados son los más importantes en concentración y actividad. Todos
los protozoarios son anaerobios estrictos (Williams y Coleman, 1992).
9
Se manifiesta que los protozoarios del rumen son proteolíticos y parecen
disponer de una cisteína proteinasa junto con elevada actividad aminopeptidasa y
una actividad limitada de desaminasa. Aminoácidos y amoniaco son excretados
como productos finales de su digestión de proteína, además los protozoarios
ingieren activamente bacterias como fuente de proteína y compiten eficazmente
por sustratos. Excepto por tamaño, los protozoarios no muestran preferencias por
alguna determinada especie de bacterias del rumen, e ingieren también especies
que no son propias del rumen (Forsberg et al., 1984).
4.3.2. Bacterias
La concentración de bacterias en el rumen varía de 1010 a 1012 células por
mL de fluido ruminal. La mayoría de las especies son anaerobias estrictas Gram (-
), con formas variadas (cocos, cocobacilos, bacilos, espiroquetas, esporoformes y
treponemas). Las bacterias ruminales son los microorganismos más abundantes
del rumen, y los principales responsables de la degradación y utilización de los
diferentes nutrientes que llega al duodeno (aproximadamente 80%). De acuerdo a
su principal actividad degradativa se clasifican en amilolíticas, celulolíticas,
hemicelulolíticas, proteolíticas, ureolíticas, metanogénicas, utilizadoras de amonio,
de lípidos y ácidos orgánicos (Yokoyama y Johnson, 1988; Cobos et al., 2007).
Las bacterias metanogénicas son del género Archaea, las cuales
constituyen un grupo microbial genéticamente diferente a las bacterias verdaderas
(Van Soest, 1994). Se ha demostrado que las bacterias metanogénicas viven de
manera endosimbiótica dentro o sobre la superficie de los protozoarios. Cualquier
factor que haga que disminuya la población de protozoarios será capaz de reducir
la población de bacterias metanogenicas, así como la producción de metano
(Galindo et al., 2009). Las bacterias utilizan diferentes sustratos para la producción
de metano, pero los principales son hidrogeno y bióxido de carbono. La
eliminación de estos gases, principalmente del hidrogeno implica la remoción de
10
un factor implicado en la estabilidad del pH ruminal siendo este esencial para una
óptima fermentación (Carmona et al., 2005).
4.3.3. Hongos
Los hongos presentes en el retículo-rumen tampoco son esenciales para la
vida en los rumiantes, pero tienen una función importante en la digestión de las
paredes celulares de los vegetales, sobre todo en aquellos de baja calidad (Van
Lier y Regueiro, 2008). Existen antecedentes de la presencia de hongos en el
rumen, Orpin en 1975 fue el primero en reportar la existencia de hongos
anaerobios en el rumen. Entre las especies más conocidas están Neocallimastrix
frontalis, Sphaeromonas communis, Piromonas communis y Orpinomyces (Kudo
et al., 1990). La concentración dentro del rumen es de 103 a 105 hongos por mL de
fluido ruminal.
4.4. Alternativas para Reducir la Producción de GEI
La posibilidad de limitar las emisiones de gas metano por el ganado en los
sistemas de producción animal, provee beneficios económicos y
medioambientales. Una opción de reducción consiste en la sustitución de
tecnologías convencionales por nuevas alternativas asociadas para obtener una
adecuada producción y reducir los efectos medioambientales sobre la producción
de gases de efecto invernadero (Carmona et al., 2005). Por otra parte existen
alternativas en investigación para reducir las emisiones de metano por parte de los
rumiantes como el manejo animal, composición de la dieta, suplementos de
aditivos como ionóforos, ácidos orgánicos, compuestos halógenados, lípidos y la
selección de plantas forrajeras con altos contenidos de proteína bruta y
metabolitos secundarios (taninos y saponinas), así como opciones en
mejoramiento animal tales como la inmunización o transformación genética de
microorganismos del rumen (Lascano y Cárdenas, 2010). Sin embargo, en las
11
últimas dos décadas, los programas de investigación en Europa, Oceanía y
América del Norte han explorado una variedad de sustratos que tratan de reducir
el suministro de hidrógeno para la metanogénesis (McAllister y Newbold, 2008).
La producción de metano representa una correlación negativa con la
disponibilidad de energía proveniente de los alimentos, por lo tanto, una reducción
en la producción de metano a través del uso de aditivos para alimentos y de la
canalización de hidrogeno hacia los ácidos grasos de cadena corta y masa
microbial es deseable siempre y cuando estos no afecten la productividad animal.
Los métodos indirectos, se basan en limitar la cantidad de hidrógeno requerido
para la síntesis de metano, o bien, en crear condiciones desfavorables para el
crecimiento de bacterias metanogénicas. Mientras que los métodos directos se
basan en disminuir el crecimiento de bacterias metanogénicas o de su actividad
metabólica (Lila et al., 2003).
En Australia se logró disminuir el 8 % de la producción de metano en
borregos aplicando vacunas contra bacterias metanogénicas (Wright et al., 2004).
Sin embargo, esta vacuna fue preparada contra tres especies de
Methanobrevibacter ruminantium y la inmunización no afecta a otros géneros de
bacterias metanogénicas y no funciona con ovinos de otras regiones geográficas.
4.4.1. Manipulación de los Microorganismos Ruminales
La manipulación de las poblaciones de microorganismos del rumen es una
alternativa para aumentar el suministro de nutrientes en el rumen hasta el
duodeno. Existe evidencia de que la eliminación de protozoarios ciliados del
rumen (desfaunación) mejora el rendimiento y la productividad en los animales
alimentados con dietas de baja calidad (Demeyer et al., 1981). Según Nolan
(1975) destaca una de las estrategias para manipular la fermentación ruminal, la
12
cual consiste en modificar la población microbiana para suprimir procesos no
deseados, como la perdida de energía.
La desfaunación dentro de la relación entre las bacterias metanogénicas y
los protozoarios del rumen es muy estrecha, debido al fenómeno de transferencia
interespecifica de hidrogeno (Finlay y Fenchel, 1993; Johnson y Johnson, 1995).
Al respecto Cobos (2007) menciona un mutualismo metabólico entre bacterias
metanogénicas y protozoarios. De esta relación tanto protozoarios como las
bacterias se benefician, los protozoarios evitan la acidificación de su endoplasma y
las bacterias metanogénicas se abastecen de H2 y CO2. Para McAlister (1996)
menciona que la eliminación de los protozoarios del rumen puede disminuir la
producción de metano hasta en 50 %; sin embargo, todavía no se conoce un
método de defaunación seguro para el animal o que no afecte la actividad
metabólica o viabilidad de otros microorganismos ruminales (Ley de Coss, 2003;
Ley de Coss et al., 2011b; Baker, 1999). Además en rumiantes alimentados con
dietas a base de forrajes la eliminación de los protozoarios no ha demostrado
tener un efecto positivo en disminuir la producción de CH4 en el rumen (Newbold
et al., 1995; Johnson y Johnson, 1995; Ushida et al., 1997).
4.4.2. Mejoramiento de las Dietas para la Nutrición Animal
La mejor estrategia para mitigar la producción de metano, es a través de
metodologías que mejoren la eficiencia de la energía de los alimentos. La
implementación de prácticas de manejo en las pasturas que mejoren la calidad
nutricional, el incremento en productividad y el efecto sobre la reducción de las
emisiones de metano (DeRamus et al., 1994).
13
Para Carmona et al. (2005) reportan que la manipulación de la dieta de los
rumiantes se considera una alternativa viable para aminorar la producción de
metano y disminuir las pérdidas de energía en el animal. Esta estrategia es
particularmente importante en el trópico debido a las dietas de baja calidad que se
suministran con forrajes de muy poco valor nutricional. Al respecto Itabashi et al.
(2000) mencionan que en los rumiantes la producción de metano es afectada por
una variedad de factores dietarios y microbianos, así como muchos agentes
químicos que son capaces de inhibir la producción de metano.
Los principales factores responsables de las variaciones en la producción
de metano son: la cantidad de carbohidratos fermentados en el retículo-rumen, lo
cual implica diversas interacciones dieta-animal que afectan el balance entre las
tasas de fermentación de estos carbohidratos y la tasa de pasaje. El otro
mecanismo es la relación de ácidos grasos volátiles (AGV) lo cual regula la
producción de hidrogeno (Johnson y Johnson, 1995).
Carmona et al. (2005) han demostrado que las prácticas de alimentación
aumentan el consumo y la velocidad de digestión ó reducen el tiempo de
permanencia de los alimentos en el rumen, pueden disminuir la producción de
metano por unidad de forraje digerido. También mencionan que la utilización de
preparados microbianos con levaduras viables puede ser una opción atractiva,
debido a su importante función como manipuladoras de la fermentación ruminal.
Para Moss et al. (2000) el tipo de carbohidrato empleado es un factor que afecta la
producción de metano a través de impactos en el pH y la población microbiana.
Los carbohidratos fibrosos producen alta relación entre el acetato: propionato y
una alta producción de metano. Con las dietas ricas en almidón se mejora la
relación metano/materia orgánica fermentada en el rumen y se favorece la
producción de propionato.
14
El nivel de consumo en relación con características de las dietas constituye
otro factor a tener en cuenta, pues con altos consumos de dietas de buena
digestibilidad se presentan menores niveles de energía no aprovechada, debido a
menores producciones de metano (Carmona et al., 2005). Al respecto Monsalve
(2003) señala que las estrategias de alimentación que aportan nitrógeno
fermentable, mejoran el desempeño productivo de los animales, y conlleva a
reducir la producción de metano por unidad de carne o de leche producida en
condiciones tropicales.
Carmona et al. (2005) mencionan que otro método que se emplea para
reducir la producción de metano es la adición de grasa a la dieta, la cual afecta los
mecanismos de biohidrogenación de los ácidos grasos insaturados, el aumento de
la producción de ácido propiónico y la inhibición de protozoarios disminuye la
población de bacterias metanogénicas, así mismo la adición de ácidos grasos poli-
insaturados de cadena larga disminuye la metanogénesis ya que se convierte en
una alternativa metabólica para el hidrógeno. Según Leng (1997) cuando hay baja
productividad en los animales, es cuando los forrajes contenían baja cantidad de
proteína, baja digestibilidad y deficiencia de nutrientes esenciales. Es posible
mejorar la productividad mediante el manejo de la dieta con el uso de
leguminosas, o afectando de manera selectiva las poblaciones microbianas del
rumen, además de mejorar la conversión alimenticia y la productividad animal, al
disminuir las emisiones de metano y las pérdidas energéticas.
Galindo et al. (2009) han demostrado que las bacterias metanogénicas
viven de manera endosimbiótica dentro o sobre la superficie de los protozoarios; y
cualquier factor que disminuya la población de protozoarios será capaz de reducir
las bacterias metanogénicas, así como la producción de metano. El empleo de
plantas, árboles y arbustos de leguminosas, entre otras, puede ser capaz de
cumplir este propósito debido a la presencia de metabolitos secundarios, tales
como taninos y saponinas capaces de ejercer efecto desfaunante.
15
4.5. Uso de Árboles y Arbustos Multipropósito (AMP) en la Nutrición
Animal
Topps et al. (1992) mencionan que en México existe una gran variedad de
especies de árboles y plantas arbustivas que tienen potencial para ser
incorporadas en los sistemas de producción de rumiantes en el trópico. De
acuerdo a Enkerlin et al. (1997) se podrían introducir elementos de sostenibilidad
en los sistemas de producción ganadera. Entre las diferentes alternativas
disponibles para reducir el deterioro ambiental producido por la expansión de la
ganadería tradicional extensiva en el trópico mexicano, se tiene la implementación
de prácticas de tipo agroforestal (Vera et al., 2009). Sin embargo Johnson et al.
(2000) señala que se debe recurrir a nuevas estrategias de alimentación animal
basadas en el uso de árboles y arbustos multipropósito bajo sistemas de manejo
silvopastoril.
Los arbustos y árboles, aparte del uso como recurso maderable, tienen el
potencial de ser usados como alimento para los rumiantes. Esta ventaja se debe
en primer lugar a que dichas especies vegetales, principalmente leguminosas,
tienen mayor concentración de nitrógeno proteínico en comparación con los
pastos con las que comparten el mismo nicho ecológico en el sistema silvopastoril,
además de menor proporción de Fibra Detergente Neutro (FDN) y Fibra
Detergente Acida (FDA) y minerales (Aerts et al., 1999; García et al., 2008). Para
Soto et al. (1997) la introducción de árboles y arbustos forrajeros a los sistemas de
producción pecuaria permite incluir elementos de sostenibilidad y menores
dependencias de insumos externos.
Según Vera et al. (2009) el uso de árboles y arbustos en los sistemas de
producción animal tropical tiene varias ventajas entre ellas sus múltiples usos,
pueden ser empleados como cerco vivo, como sombra, para leña, y con
propósitos ornamentales, etc. En zonas tropicales de América Latina y el Caribe
16
las leguminosas son ampliamente utilizadas como suplemento proteico para
rumiantes y monogástricos y existe una tendencia a la búsqueda de nuevas
fuentes de proteínas, en la que los árboles forrajeros podrían desempeñar un
papel significativo (Clavero, 1998).
De acuerdo a Suárez (2008) en la actualidad los sistemas de producción
ganadera dependen de alimentos bajos en calidad, por lo que el follaje de árboles
y arbustos forrajeros puede servir como alternativa debido a los mayores
contenidos de proteína y minerales. Para Galindo et al. (2009) se conoce poco
respecto a la preferencia y palatabilidad por parte de los animales de árboles y
arbustos forrajeros, así como el valor nutritivo y digestibilidad de los nutrientes
(materia seca, materia orgánica, proteína, FDN, FDA y minerales). No obstante, es
conocido que la mayoría de las investigaciones con árboles que han podido
constituir tecnologías para la alimentación bovina se basan principalmente en L.
leucocephala y G. sepium (Alonso et al., 1999).
En rumiantes alimentados con forrajes de mala calidad se estima una
producción anual de CH4 es de 60 a 120 kg con pérdidas de 15 a 18% de energía
bruta del alimento consumido (Kurihara et al., 1999), en cambio, cuando se usan
arboles forrajeros altamente digestibles o dietas con elevado contenido de
carbohidratos de rápida fermentación, la producción anual de CH4 puede ser de 35
a 55 kg con pérdidas de 2 a 12 % de la energía bruta consumida (Kinsman et al.,
1995). El efecto se debe a una mayor síntesis de propionato (se usa hidrógeno) y
una disminución en la producción de acetato (se libera hidrógeno), que en
conjunto disminuyen la disponibilidad de hidrógeno para la síntesis de metano.
Para Hess et al. (2002) es importante reportar que la liberación de metano
se puede disminuir con el uso de frutos de Sapindus saponaria cuando se provee
en dietas con pastos de baja calidad con o sin suplementación de leguminosa. Sin
embargo Abreu et al. (2003) señalan que el uso del mismo árbol en proporciones
17
de 8% de fruto y 5% de pericarpio o 1.2% de extracto de saponinas
semipurificadas (en base seca de la dieta basal) en una dieta compuesta por
Brachiaria dictyoneura (60%) y Cratylia argentea (40%) no manifestó efectos sobre
la disminución de las emisiones de metano.
La suplementación con 30 % de la MS como L. leucocephala en vacas y la
composición del pastizal de Leucaena leucocephala con gramíneas en la
población microbiana ruminal de toros, demostró que esta leguminosa arbustiva
incrementa la población de bacterias celulolíticas y la actividad de sus enzimas.
Además, reduce el número de protozoarios y de metano, es decir que la
implementación de árboles, leguminosas arbustivas pueden disminuir la
producción de gas metano (Galindo et al., 2005; Galindo et al., 2007).
4.6. Caulote (Guazuma ulmifolia Lam.)
Conocida como guácimo y por otros numerosos nombres, es un árbol de
tamaño mediano y ramificado, la madera es una fuente importante de leña en las
áreas rurales. El follaje y frutos de guácimo son consumidos de buena manera por
las vacas, los caballos y otros animales domésticos y silvestres (Janzen, 1983). Es
un árbol mediano con copa abierta, redondeada y extendida. Presenta hojas
alternas, simples; láminas de 3 a 13 cm de largo por 1.5 a 6.5 cm de ancho,
ovadas o lanceoladas, con el margen aserrado. El tronco más o menos recto,
produciendo a veces chupones, frecuentemente ramificado a baja altura, flores
actinomórficas pequeñas, blancas y amarillas con tintes castaños, los frutos son
cápsula de 3 a 4 cm de largo, en infrutescencias de 10 cm, ovoide, 5-valvada,
Semillas numerosas (entre 40 a 80) de menos de 1 mm, duras, redondeadas y
pardas (Acuña, 1987).
Las hojas y frutos son palatables y comestibles para el ganado. La
digestibilidad in vitro de la materia seca de las hojas jóvenes y tallos se encuentra
18
dentro de los rangos 56 - 58% y 31 - 36%, respectivamente (Araya et al., 1995;
Medina et al., 1994). Tiene un contenido de proteína cruda en las hojas jóvenes
que oscila entre 16 - 23% y tallos de 7.8%, respectivamente. Las hojas basales
contienen 2,4% de taninos (materia seca).
4.7. Técnica de Fermentación Ruminal in vitro Para Medir Producción de
Gas
Para desarrollar estrategias que mitiguen las emisiones de metano en la
ganadería, debe ser posible cuantificar estas emisiones bajo un amplio rango de
circunstancias. El metano puede ser medido usando espectroscopía infrarroja,
cromatografía de gas, espectroscopia de masa y técnicas de diodo láser (Johnson
y Johnson, 1995).
4.7.1. Ecuaciones de Predicción
Las mediciones de metano son difíciles de realizar sin cámaras
respiratorias; una alternativa es estimar el metano a través de cálculos. Esto
usualmente se realiza por ecuaciones de regresión de consumo de energía
digestible (ED), las cuales ignoran las relaciones de ácidos grasos volátiles y el
balance de carbono. Esto conlleva a que los valores de energía metabolizable
(EM) puedan no ser buenos estimativos de la producción de metano (Van Soest,
1994).
Un método desarrollado en 1960 por Wolin permite calcular las emisiones
de metano a través de la distribución molar de los AGV. El balance fermentativo se
usa para predecir la producción de metano por la conversión de carbohidratos de
la dieta a AGV. Esta metodología asume que todo el exceso de H2 es convertido
en metano y no hay hidrógeno asociado con la síntesis de células microbiales,
además que de la fermentación de los sustratos no carbohidratados no se
19
producen AGV (Johnson y Johnson, 1995). Según Van Kessel y Russell (1995)
indican que cuando las células microbiales son incluidas en la estequiometría de la
fermentación, los estimativos de la producción de metano disminuyen lo cual la
técnica es útil para propósitos comparativos.
4.7.2. Técnicas Cerradas
Las técnicas calorimétricas de respiración tales como las cámaras
cerradas, cajas en la cabeza, o capuchas ventiladas y máscaras faciales han sido
usadas con efectividad para la determinación de las emisiones de metano
(DeRamus et al., 2003), sin embargo Johnson y Johnson (1995) señalan que
estas emisiones son determinadas por la medición del flujo total de aire por el
sistema y la diferencia en la concentración entre el aire inspirado y espirado. En
las cámaras, la mayor ventaja radica en las mediciones de metano tanto
proveniente de la fermentación ruminal como de la fermentación del tracto
posterior. Las desventajas de esta técnica involucra: los costos de construcción y
de mantenimiento, la restricción de movimiento de los animales y la alta mano de
obra.
4.7.3. Métodos Fermentativos in vitro
Para Kajikawa y Terada (2003) los estudios en fermentación y digestión
juegan un papel crucial en los estudios nutricionales y fisiológicos en rumiantes.
Desde la década de los 50´s muchos métodos han sido desarrollados para simular
el ecosistema ruminal. Aunque los estudios in vivo han sido de gran importancia,
las simulaciones in vitro del medio ambiente ruminal son frecuentemente efectivas
y eficientes por su rapidez y bajo costo de operación. Además, porque se pueden
definir factores específicos, que en condiciones in vivo, pueden ocultarse por una
gran complejidad de factores. Dentro de las técnicas más conocidas in vitro están
la de Tilley y Terry implementada en 1963, o sus diversas modificaciones. Entre
20
algunas desventajas de estos métodos se tienen: largo tiempo requerido para
realizar un análisis, la gran cantidad de pasos y que la muestra no tiene flujo de
recambio (Primavesi, 2004).
21
21
5. MATERIALES Y METODOS
5.1. Ubicación
El presente trabajo de investigación se realizó en las instalaciones del
laboratorio de Biotecnología Animal y el módulo de bovinos de la Facultad de
Ciencias Agrícolas de la Universidad Autónoma de Chiapas, México, situada en
Huehuetán, Chiapas a (94o 30’ longitud oeste y 15o 30’ latitud norte y 35 msnm).
5.2. Colecta de Material Vegetal
La colecta de material vegetal de caulote se realizó en las regiones Sierra y
Frailesca del Estado de Chiapas, donde productores identificaron que el caulote
(Guazuma ulmifolia Lam) es consumido por rumiantes.
5.3. Procesado del Material Vegetal
Todas las muestras de caulote se deshidrataron por un periodo de 72 horas
por secado natural a 40° C hasta obtener una húmedad constante de 10 a 20 %,
posteriormente se molieron y se almacenaron en recipientes de vidrio hasta su
posterior uso.
5.4. Distribución de las Dietas
Cuadro 2. Tratamientos para Digestibilidad in vitro de Materia Seca
Tratamiento 1 100% de Caulote (Guazuma ulmifolia Lam)
Tratamiento 2 100% de Pasto Estrella (Cynodon nlemfuensis)
Tratamiento 3 100% Alimento Concentrado (16% de PC y 1150 Mcal. de ENl).
T1, Guazuma ulmifolia, T2, Cynodon nlemfuensis y T3, Alimento concentrado
22
Cuadro 3. Tratamientos para Producción de Gases Totales
Tratamiento 1 100% de Pasto Estrella (Cynodon nlemfuensis)
Tratamiento 2 20% G + 70% C + 10% AC
Tratamiento 3 40% G + 50% C + 10% AC
Tratamiento 4 60% G + 30% C + 10% AC
Tratamiento 5 100% Alimento Concentrado (16% de PC y 1150 Mcal. de ENl).
Guazuma ulmifolia (G), Cynodon nlemfuensis (C) y Alimento concentrado (AC)
5.5. Digestibilidad in vitro de la Materia Seca
En tubos de cultivo 18 x 150 mm (por triplicado) con 0.2 g de los tratamientos
(Cuadro 2) se adicionaron 9 mL de medio de cultivo (Cuadro 4) con flujo de
CO2, de acuerdo a Cobos y Yokoyama (1995). Se inoculó con 0.5 mL de Liquido
Ruminal Fresco (LRF), y se incubó en una estufa (Felisa FE-133ª) a 38 °C. La
digestibilidad tuvo periodos de incubación (0, 3, 6, 12, 24, 48, 72 y 96 h), para
restar el material adicionado (no degradado) al momento de la inoculación, se filtró
el material residual previamente pesado en papel Whatman N° 40 con la ayuda de
una bomba de vacío (NOVATECH EV-58, México), posteriormente se secó en una
estufa (Felisa FE-133ª, Fabricantes Feligneo, México) a 70° C por 24 h. El residuo
se pesó en una balanza analítica (Ohaus Corporation E0RR80, EE.UU). El
porcentaje de sustrato no degradado se calculó en el programa Microsoft Excel.
23
Cuadro 4. Medio de Cultivo para Digestibilidad in vitro de la Materia Seca
Compuesto Cantidad (mL) para 100 mL de medio
Agua destilada 52.9
Líquido ruminal clarificado (1) 30.0
Solución mineral I (2) 5.0
Solución mineral II (3) 5.0
Carbonato de sodio, al 8% (4) 5.0
Solución sulfido-cisteína (5) 2.0
Solución resazurina al 0.1% (6) 0.1
1, Líquido ruminal clarificado previamente filtrado en una gasa triple y centrifugado a 10,000 rpm, por 15 min a 4 °c,
esterilizado 20 min a 15 psi, 121 °C; 2, contenido (por 1000 mL) 6 g de K2HPO4, 3, contenido (por 1000 mL) 6 g KH2PO4; 6
g (NH4)2SO4; 12 g NaCl; 2.45 g MgSO4 Y 1.6 g CaCl2*H2O; 4, 8 g carbonato de sodio en 100 mL agua destilada; 5, 2.5 g L-
cisteína (disuelta en 15 mL 2n NaOH) + 2.5 g Na2S-9H20 (en 100 mL H2O); 6, 0.1 mL resazurina en un volumen final de 100
mL, calentando hasta que el indicador pierde su coloración y esterilizado.
24
5.6. Producción de Gas.
Se utilizó un sistema de fermentación ruminal artificial anaerobio, al cual se
adicionaron 250 mL de medio de cultivo para los microorganismos del rumen
(Cuadro 4) se adicionaron 20 g de la dieta de cada tratamiento (Cuadro 3) y se
inoculó con 200 mL de LRF. Se incubó en un periodo de 24, 48, 72 y 96 h. Se
sometió a baño maría a 38 °C. Respectivamente a las 24 y 72 h se agregaron 50
mL de medio de cultivo (Cuadro 4). La presión de gases se midió con un
manómetro cada 24 h. Luego a las 72 h se procedió a medir el gas por presión y
principio de pascal. La captura de gases se realizó por un sistema en globo que
permitió llevar todas las muestras al cromatografo. La concentración de gases
totales se analizó en un cromatografo de gases (Equipo Perkin-Elmer Claurus 500;
EE. UU.) Con una columna capilar empacada ELITE-FFAB Perkin-Elmer (15m),
se usó una solución calibradora de H2 y CH4 de 11 y 89%, respectivamente.
Fig. 1. Fermentador Ruminal artificial para evaluar producción de gases totales.
25
5.7. Concentración de Ácidos Grasos Volátiles (AGV)
De las pruebas para producción de gas se tomaron muestras de 8 mL del
fermentador a las 96 h de incubación (por triplicado), se adicionaron 2 mL de
ácido metafosfórico al 4 % (Proporción 4:1), y se colocaron en viales de plástico.
Los tubos se centrifugaron a 10,000 rpm durante 20 min; 2 ml del sobrenadante
fueron depositados en tubos eppendorf y agitados en un vortex (Science MED MX-
S USA) para homogenizar las muestras, posteriormente se almacenaron a -10 °C
para llevar a cabo su análisis. Luego fueron descongeladas a 25°C y centrifugadas
a 10000 rpm por 20 min; las muestras fueron depositadas en viales para
cromatografía. Para determinar la concentración de AGV, se llevó a cabo el
análisis en un cromatografo de gases (Equipo Perkin-Elmer Claurus 500; EE. UU)
con automuestreador.
5.8. Concentración de Bacterias Celulolíticas
Se desarrolló un medio de cultivo (Cuadro 5), en tubos de cultivo de10 x
120 mm a los cuales se agregó una tira de papel celulosa (papel whatman N° 40)
la cual sirve como fuente de carbohidratos para las bacterias, a cada tubo se
adicionaron 4.5 mL de medio de cultivo (Cuadro 5), posteriormente se inoculó con
0.5 mL de líquido ruminal extraído de los fermentadores a las 96 horas de
incubación. Luego se realizaron diluciones de 10-1 hasta 10-13 y tres repeticiones
por tratamiento (Cuadro 3). Todas las muestras fueron incubadas a 38 °C por 10
días. La concentración de bacterias por mL de medio de cultivo se calculó
mediante la técnica determinada NMP. Los tubos que presentaron degradación de
papel celulosa se marcaron como positivos.
26
5.9. Concentración de Bacterias Totales
Para determinar la concentración de bacterias, en las pruebas de
producción de gas, se extrajo del fermentador 1 mL de inóculo a las 96 horas de
incubación para agregarlo en tubos Eppendoff, se adicionó (por triplicado) 1 mL de
Formaldehido y una gota de azul de metilo. Para contar bacterias; con una pipeta
Pasteur se extrajeron 0.5 mL de cada dilución y se llenó (por capilaridad) la
cámara Petroff-Hausser, después se observó en un microscopio de contraste de
fases (NATIONAL, EE. UU) donde se realizó el conteo del número de bacterias
por mL del medio de cultivo.
Fig. 2. Bacterias totales en microscopio de contraste de fases con apoyo de
cámara Petroff-Hausser.
27
Cuadro 5. Composición del medio de cultivo base (GCA-FR) para crecimiento
y supervivencia de bacterias totales y celulolíticas.
Compuesto Cantidad para 100 mL de medio de cultivo
Medio para BT Medio para BC
Agua destilada 47.42 mL 52.60 mL
Líquido ruminal clarificado (1) 30.0 mL 30.0 mL
Solución mineral I (2) 5.0 mL 5.0 mL
Solución mineral II (3) 5.0 mL 5.0 mL
Carbonato de sodio, solución 8% (4) 5.0 mL 5.0 mL
Acetato de sodio, 1.5% (5) 5.0 mL 5.0 mL
Solución de sulfido-cisteína (6) 2.0 mL 2.0 mL
Solución de resazurina al 0.1% (7) 0.1 mL 0.1 mL
Tripticasa-peptona 0.20 g 0.20 g
Extracto de levadura 0.10 g 0.10 g
Glucosa 0.06 g
Celobiosa 0.06 g
Almidón 0.06 g
Papel celulosa Una tira
BT, bacterias totales; BC, bacterias celulolíticas; (1), líquido ruminal clarificado previamente filtrado en una gasa triple,
centrifugado por 15 min a 4° C, y esterilizado 20 min a 15 psi, 121° C; (2), contenido (por 1000 mL) 6 g K2HPO4; (3),
contenido (por 1000 ml) 6 g K2HPO4, 6 g (NH4)2SO4; 12 g NaCl; 2.45 g MgSO4 y 1.6 g CaCl2H2O; (4), 8 g de carbonato de
sodio en 100 mL de agua destilada; (5), 1.5 g de acetato de sodio en 100 mL de agua destilada; (6), 2.5 g de L-cisteina
(disuelta en 15 mL de 2N NaOH) + 2.5 g Na2-9H2O en 100 mL de H20); (7), 0.1 mL de resazurina en un volumen de 100 ml,
calentando hasta que el indicador pierde su coloración y estelirizado.
5.10. pH
El pH se medió respectivamente a las 0, 3, 6, 12, 24, 48, 72 y 96 h. de
incubación de los tratamientos en un potenciómetro (Thermo orion, modelo 230A,
USA).
28
Fig. 3. Medición de pH en tubos de cultivo de 18 x 150 mm durante periodos de
incubación.
5.11. Diseño y Análisis Estadístico.
El diseño experimental fue completamente al azar, donde las unidades
experimentales se distribuyeron en forma aleatoria en cinco tratamientos
individuales con tres repeticiones. El modelo es el siguiente (Steel y Torrie, 1988):
Yij = µ + Ti + Ɛij
Donde Yij es la variable respuesta del i-ésimo tratamiento en la j-esima
repetición µ es la media general, Ti es el efecto en el i-ésimo tratamiento y Ɛij es el
error experimental.
29
El análisis de varianza se realizó con el procedimiento GLM y las medias
fueron analizadas con la prueba de Tukey (SAS, 1998). El procedimiento de
mediciones repetidas de Wilcoxon o pruebas de suma de rangos (SAS, 1998) fue
usada para determinar diferencias estadísticas en las concentraciones de
bacterias totales y celulolíticas.
30
30
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. Digestibilidad in vitro de la MS (DIVMS)
Esta prueba de digestibilidad in vitro de la materia seca es una técnica
utilizada principalmente para estimar el valor nutritivo de los forrajes y observar las
variaciones de las diferentes dietas con las determinaciones de digestibilidad in
vivo (Tilley y Terry, 1963). Se observó la digestibilidad in vitro de G. ulmifolia, en
comparación con C. nlemfuensis y Alimento Concentrado (16% de PC y 1150
Mcal. de ENl).
T1, Guazuma ulmifolia Lam (Caulote); T2, Cynodon nlemfuensis (pasto Estrella); T3, Alimento concentrado (16% de PC y
1150 Mcal de EN); a, b, y c, Medias con diferente letra en una hilera son diferentes (p<0.05); E.E.M, Error estándar de la
media.
Cuadro 6. Digestibilidad in vitro de materia seca (DIVMS; %) y pH del medio
de cultivo.
TRATAMIENTO
TIEMPO DE INCUBACIÓN (HORA)
3H 6H 12H 24H 48 H 72H 96H
Digestibilidad in vitro (MS) %
T1 28.86ab 29.36b 35.56b 36.13b 37.06b 39.37b 39.80b
T2 9.50b 10.26c 17.23b 25.56c 23.53c 33.90b 36.30b
T3 41.30a 43.23a 63.13a 61.63a 61.66a 60.80a 68.00a
EEM 81.09 15.34 88.91 7.88 11.05 17.82 3.93
pH
T1 7.22b 6.48b 6.40ab 6.04a 5.79a 5.73a 5.83a
T2 7.90a 7.43a 6.52a 5.91ab 5.67ab 5.67a 5.55a
T3 7.08b 6.75b 6.19a 5.80b 5.57b 5.61a 5.67a
EEM 0.012 0.029 0.008 0.004 0.004 0.039 0.029
31
Los resultados de DIVMS (Cuadro 6) indican que el tratamiento T1 (G.
ulmifolia 100%) tuvo mayor digestibilidad que el tratamiento T2 (C. nlemfuensis
100%) pero la digestibilidad fue menor que en el tratamiento con dieta a base de
alimento concentrado. A las 3 horas de incubación los tratamientos T1 (G.
ulmifolia) y T3 (concentrado) presentaron los mayores valores (p≤0.05) de
digestibilidad de materia seca (MS) con 28.86 % y 41.30%, respectivamente.
Mientras que a las 6, 12, 24, 48, 72 y 96 horas el T3 tuvo la mayor (p≤0.05)
digestibilidad de MS respecto a los tratamientos T1 y T2. El menor porcentaje de
digestibilidad se observó en el tratamiento T2 (C. nlemfuensis), a las 6, 24 y 48
horas respecto a los tratamientos T1 y T3. Los tratamientos T1 (G. ulmifolia) y T2
(C. nlemfuensis) a las 72 y 96 horas de incubación no tuvieron diferencia (p>0.05)
entre ellos en cuanto a digestibilidad pero si difieren con el tratamiento T3
(concentrado). El tratamiento T1 (G. ulmifolia) presentó mayor digestibilidad con
respecto al tratamiento T2 con pasto estrella, debido al mejor y mayor contenido
nutricional, y un porcentaje de proteína cruda (PC) contenido en el árbol forrajero
superior al contenido del pasto estrella. Araya et al. (1994) reportan que obtuvieron
23% de PC en caulote lo que podría resultar en una mejora en la digestibilidad de
la dieta. Además Cárdenas et al. (2003) señala la presencia de taninos en el
forraje de caulote que mejoraron la digestibilidad de la dieta.
En el Cuadro 6, se encuentra información del pH del medio de cultivo con
los tratamientos y periodos de incubación. A las 3 horas de incubación se observó
que el T2 (C. nlemfuensis) presento un pH de 7.90; sin embargo a las 12 horas de
incubación los tratamientos T1, T2 y T3 presentaron un pH dentro del rango
óptimo en el rumen (6.2 y 6.8). Según Scandolo et al. (2007) eso significa que
existe una eficiente actividad fermentativa mediante las bacterias ruminales, sin
embargo al termino de las horas de incubación, los tratamientos T1, T2 y T3 no
presentaron diferencia (P>0.05).
32
Grafica 1. Digestibilidad in vitro de Materia Seca %
T1, Guazuma ulmifolia Lam (Caulote); T2, Cynodon nlemfuensis (Pasto Estrella); T3, Alimento concentrado (16% de PC y
1150 Mcal de EN).
En los resultados de la digestibilidad in vitro de MS (Grafica 1) se observa
al tratamiento T3 (concentrado) con un mayor porcentaje durante las horas de
incubación, aunque se observó que el caulote presentó una digestibilidad a las 96
horas de incubación de 39.80%.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
H0 H3 H6 H12 H24 H48 H72 H96
T1 Caulote (G. Ulmifolia)
T2 Pasto Estrella (C.nlemfuensis)
T3 concentrado al 16% PC
Horas de incubación
33
6.2. Producción de gases totales
Cuadro 7. Producción de GEI totales por gramo de la materia seca fermentada (MSF).
TRAT.
mL de gases totales g-1 de MSF
TIEMPO DE INCUBACIÓN (HORA)
24 48 72
T1 5.47a 10.35a 16.40a
T2 5.49a 11.20a 16.38a
T3 4.15ab 7.63b 12.45b
T4 3.68b 7.5b 11.26b
T5 2.2c 4.08c 7.03c
E. E. M 0.078 0.25 0.20
Guazuma ulmifolia Lam (G), Cynodon nlemfuensis (C), Alimento concentrado (AC). T1, 100% C; T2, 20% G + 70% C + 10% AC; T3, 40% G + 50 C + 10% AC; T4, 60% G + 30% C + 10 AC; T5, 100% AC; a, b, y c, Medias con diferente letra en una hilera son diferentes (p≤0.05); E.E.M, Error estándar de la media.
La producción de GEI que se observa en los tratamientos T1 y T2 (Cuadro
3) compuestos por pasto estrella presentan mayor cantidad de gas total producido,
esto puede deberse a la baja calidad nutricional y poca digestibilidad del pasto. La
cantidad de gases se fue reduciendo (P≥0.05) a medida que se aumentó la
cantidad de caulote en los tratamientos y se disminuyó la cantidad de pasto en los
tratamientos T3 y T4. El tratamiento con alimento concentrado presentó a las 24,
48 y 72 horas de fermentación una menor producción de gas (P>0.05) que los
tratamientos con G. ulmifolia y C. nlemfuensis. Sin embargo la cantidad de gases
totales se redujeron aún más con la inclusión de caulote en los tratamientos. Las
reducciones en la emisión de GEI, principalmente CH4, se han reportado en
Sapindus saponaria y Leucaena leucocephala (Muerza, 2007), Hess et al.
(2002), reportaron que S. saponaria y Calliandra calothyrsus presentaron
reducción del 50% y del 36% en las emisiones de CH4 y N2O, respectivamente al
ser suministradas conjuntamente con pastos de baja calidad, esto se debe al
mejorar la calidad nutritiva del alimento y la tasa de pasaje.
34
Grafica 2. Porcentaje de Producción de Gases Totales de la Materia Seca
Fermentada.
Guazuma ulmifolia Lam (G), Cynodon nlemfuensis (C), Alimento concentrado (AC). T1, 100% C; T2, 20% G + 70%
C + 10% AC; T3, 40% G + 50 C + 10% AC; T4, 60% G + 30% C + 10 AC; T5, 100% AC
Los resultados que se obtuvieron muestran una tendencia mayor en cuanto
a producción de gases totales en los tratamientos a base de pasto estrella, debido
a la baja calidad nutricional y mala sincronización en la degradación de la fuente
energética. Mientras los tratamientos a base de G. ulmifolia disminuyen la
producción de GEI ya que juegan un doble papel, por ser un complemento de
nitrógeno y un agente desfaunante potencial (Domínguez-Bello y Escobar, 1997).
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
T1 T2 T3 T4 T5
24 HORAS
48 HORAS
72 HORAS
35
6.3. Concentración de ácidos grasos volátiles
Las concentraciones de ácido acético, propiónico, butírico y AGV totales de
los tratamientos a las diferentes horas de incubación se presentan en el Cuadro 8.
La concentración de AGV totales a las 96 horas de incubación no fueron diferentes
(p>0.05) entre los tratamientos T1 y T4 (Cuadro 3) con 102.45 y 102.04 mM L -1
pero si presentan diferencia (p≤0.05) entre los tratamientos T2 y T3
respectivamente, el tratamiento T5 presentó mayor concentración con 120.7 mM
L -1.
La relación de concentración de ácido acético a las 96 horas de incubación
no fue diferente (p>0.05) entre los tratamientos. Mientras que el ácido propiónico a
las 96 horas de incubación presentó mayor concentración (p≤0.05) en el
tratamiento T5 con 37.37 mM L -1
, los tratamientos T2, T3 y T4 no presentaron
diferencia (p>0.05) entre ellos, el tratamiento T1 presentó menor concentración
con 18.76 mM L -1. Para la concentración de ácido butírico a las 96 horas de
incubación, el tratamiento T5 presentó mayor concentración (p≤0.05) con 28.42 y
fue diferente a los tratamientos T1, T2, T3 y T4 los cuales no presentaron
diferencia (p>0.05) entre ellos al finalizar los periodos de incubación.
Según Calsamiglia y Ferret, 2002; Cobos (2007) la proporción de AGV
producidos en el rumen en condiciones normales de alimentación es de (60-65%
de acético, 25% propiónico y 10 a 15% de butírico), la concentración porcentual de
AGV calculadas en la presente investigación (Cuadro 9) indica que la
concentración de ácido acético fue superior en el tratamiento T1. Pero los
tratamientos T2, T4 y T5 se mantuvieron por debajo de proporción normal 60-65%,
mientras para la concentración de ácido propiónico todos los tratamientos
mantuvieron una proporción mayor respecto a los rangos normales de (10 a
15%). La concentración de ácido butírico en el tratamiento T1 se mantuvo por
debajo del rango normal, para los tratamientos T2, T3 y T4 se mantuvo dentro de
36
los rangos normales en el metabolismo normal del rumen, mientras que en el
tratamiento T5 se mantuvo por arriba del rango normal con 23.53%.
Cuadro 8. Concentración (mM L -1) de Ácido Acético, Propiónico, Butírico y AGV Totales
Tratamientos
T1 T2 T3 T4 T5 EEM
HORA Ácido Acético
24 41.92a 25.04b 25.95b 28.57b 26.90b 19.27
48 45.93a 27.43b 28.43b 31.30b 29.47b 23.13
72 57.67a 36.89b 38.23b 42.10ab 39.63b 38.47
96 45.27a 51.15a 53.00a 58.37a 54.95a 105.9
Ácido propiónico
24 9.50b 17.30ab 12.61ab 16.71ab 18.93a 11.29
48 10.41b 18.95ab 13.81ab 18.31ab 20.74a 13.55
72 13.53b 24.63ab 17.95ab 23.79ab 26.96a 22.91
96 18.76b 34.14ab 24.89ab 32.99ab 37.37a 44.02
Ácido Butírico
24 4.82a 6.35a 4.67a 5.47a 4.26a 4.13
48 6.69a 8.80a 6.47a 7.58a 5.91a 7.93
72 6.80b 8.94b 6.58b 7.71b 20.50a 5.83
96 9.43b 12.40b 9.13b 10.69b 28.42a 11.19
AGV totales
24 56.25a 48.68a 43.23a 50.25a 50.09a 30.78
48 63.02a 55.17a 48.72a 57.19a 56.12a 41.1
72 77.99ab 70.43ab 62.77b 73.60ab 87.09a 65.23
96 102.45ab 97.69b 87.02b 102.04ab 120.74a 156.81 Guazuma ulmifolia Lam (G), Cynodon nlemfuensis (C), Alimento concentrado (AC). T1, 100% C; T2, 20% G + 70% C + 10%
AC; T3, 40% G + 50 C + 10% AC; T4, 60% G + 30% C + 10 AC; T5, 100% AC; a y b Media con diferente letra en una hilera
son diferente (p<0.05); E.E.M, Error estándar de la media.
37
Cuadro 9. Concentración (%) de ácido acético, propiónico y butírico a las
72 horas de incubación.
Tratamientos
T1 T2 T3 T4 T5
AGV
Acético 73.94 52.37 60.90 57.20 45.50
Propiónico 17.34 34.97 28.59 32.32 30.95
Butírico 8.71 12.69 10.48 10.47 23.53 Guazuma ulmifolia Lam (G), Cynodon nlemfuensis (C), Alimento concentrado (AC). T1, 100% C; T2, 20% G + 70% C + 10%
AC; T3, 40% G + 50 C + 10% AC; T4, 60% G + 30% C + 10 AC; T5, 100% AC.
La medición de la producción y concentración de los ácidos grasos volátiles
(AGV) en el rumen son indicativos de la producción de metano. En la presente
investigación el ácido acético tuvo la mayor concentración porcentual en todos los
tratamientos además de que no se encontraron diferencias sustanciales en la
proporción molar de los tres principales ácidos grasos volátiles dentro de los
tratamientos adicionados con diferentes niveles de G. Ulmifolia, C. nlemfuensis y
concentrado en la ración, se sabe que cuando se incorporan concentrados en la
ración, la eficiencia de conversión de glucosa a AGV puede llegar hasta valores de
80-82% (Orskov, Flatt y Moe, 1968), lo cual tiende a mejorar la eficiencia de
utilización de la energía metabolizable.
6.4. Bacterias totales (BT)
En esta prueba se cuantificó el número de bacterias que se encontraron en
el medio de cultivo ruminal y su concentración, para analizar que tratamiento o
dieta resultó más efectiva en cuanto a sobrevivencia de las bacterias.
38
Cuadro 10. Concentración de Bacterias totales (X109).
TRATAMIENTO
TIEMPO DE INCUBACIÓN (HORA)
24H 48H 72H 96H
T1 1.74 6.96 9.28 11.6
T2 2.30 9.20 12.3 15.3
T3 1.65 6.60 8.80 11.0
T4 2.00 8.00 10.7 13.3
T5 1.67 6.68 8.91 11.1
EEM 13.50 26.89 13.67 12.95
Guazuma ulmifolia Lam (G), Cynodon nlemfuensis (C), Alimento concentrado (AC). T1, 100% C; T2, 20% G + 70% C + 10% AC; T3, 40% G + 50 C + 10% AC; T4, 60% G + 30% C + 10 AC; T5, 100% AC
El Cuadro 10 muestra el crecimiento de bacterias totales, no existe
diferencia significativa (p>0.05) entre los tratamientos T1, T2, T3, T4 y T5, la
concentración de bacterias a las 96 horas de incubación fue de 109 bacterias mL-1.
6.5. Bacterias celulolíticas
Se utilizó un análisis que permite comparar la cantidad de bacterias
presentes en cada uno de los tratamientos, se sabe que a mayor concentración de
bacterias mejor es la degradación del alimento, esto facilita la digestión y
aprovechamiento proteico.
Esta prueba nos sirve para la identificación de bacterias celulolíticas,
consiste en la observación de la degradación de una tira de papel celulosa (fuente
de carbohidratos para las bacterias celulolíticas) y el medio de cultivo donde se
deposita esta misma. La presencia de las bacterias celulolíticas se determina
mediante cambios en el medio de cultivo; es decir, degradación de la tira de papel
celulosa y coloración turbia del medio de cultivo.
39
Cuadro 11. Concentración de Bacterias Celulolíticas
TRATAMIENTO
TIEMPO DE INCUBACIÓN (HORA)
24H 48H 72H 96H
T1 1.46 X 107bc 1.22 X 108a 2.71 x 108bc 3.08 x 108ab
T2 5.23 X 106a 4.36 X 107a 9.68 x 107a 1.10 x 108ac
T3 19.6ab 1.63a 363 ab 413a
T4 12.0b 99.7 a 222bc 252bc
T5 2.03b 16.9a 3.75b 4.27a
EEM 2.78 11.45 2.78 2.78
Guazuma ulmifolia Lam (G), Cynodon nlemfuensis (C), Alimento concentrado (AC). T1, 100% C; T2, 20% G + 70% C + 10%
AC; T3, 40% G + 50 C + 10% AC; T4, 60% G + 30% C + 10 AC; T5, 100% AC; a, b y c. Media con diferente letra en una
hilera son diferente (p<0.05); E.E.M, Error estándar de la media
En el Cuadro 11 se observa que no existió diferencia significativa (p>0.05)
entre los tratamientos T3 y T5, que presentaron una menor concentración de
bacterias celulolíticas. En el tratamiento T2 se presentó mayor concentración, sin
embargo los tratamientos T3, T4 y T5 son iguales en su concentración a las 24 h,
48 h, 72 h y 96 h, de incubación. En general se presentó una disminución en la
concentración de bacterias celulolíticas de acuerdo a mayor tiempo de incubación.
40
40
7. CONCLUSIONES
De acuerdo a los objetivos y resultados obtenidos en este presente trabajo se
concluye que:
1) Es posible reducir la cantidad de gases de efecto invernadero con la
inclusión de G. ulmifolia en la dieta.
2) Con una mayor inclusión de G. ulmifolia en la dieta se tuvo una
menor concentración de bacterias celulolíticas.
3) La concentración de AGV aumentó con la inclusión de G. ulmifolia.
41
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