TESIS Reaccion Cadena Polimerasa Diagnostico Tuberculosis

TESIS DE DIPLOMA

Aplicación de la Reacción en Cadena de la Polimerasa en el diagnóstico rápido de

Mycobacterium tuberculosis.

Autor: Moisés Puma Yance Morales.

UNIVERSIDAD DE LA HABANA

Facultad de Biología

INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL “PEDRO KOURI”

Centro Colaborador OPS/OMS para la Referencia e Investigaciones en Tuberculosis y Micobacterias

2009

UNIVERSIDAD DE LA HABANA

Facultad de Biología

“TESIS DE DIPLOMA”

Empleo del gen hsp65 en el diagnóstico rápido de Mycobacterium tuberculosis.

AUTOR: Moisés Puma Yance Morales. TUTORES: Lic. Iliana Valdés Hernández, MSc. Lic. Sergio L. Yzquierdo Silverio, MSc. ASESOR: Dr. Ernesto Montoro Cardoso, PhD.

INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL “PEDRO KOURI”

2009

"Muchas veces debemos cambiar todos nuestros conceptos, no solamente los

conceptos generales, los conceptos sociales y filosóficos, sino también, a veces, los

conceptos médicos, y veremos que no siempre las enfermedades, se tratan como se

trata una enfermedad en un hospital, en una gran ciudad; veremos entonces, cómo el

médico tiene que ser también agricultor,... un poco pedagogo .... cómo tendremos que

ser políticos también; como lo primero que tendremos que hacer no es ir a brindar

nuestra sabiduría, sino ir a demostrar que vamos a aprender con el pueblo".

Ernesto Guevara (El Che)

A mi querida familia, Mario, Carmen, Ernesto, Sarina, Salvador, Abuela Eva, Micaela y Camila, por todo el apoyo incondicional. Gracias ¡LO LOGRAMOS!

AGRADECIMIENTOS

Mis más sinceros agradecimientos a:

Mario Yance Sullca y Carmen María del Rosario Morales Ponce. Los

promotores de mi existencia.(agradecimiento muy especial)

Ernesto, Sarina, Salvador, Micaela, Mi abuelita Eva, Camilita (la nueva joya

familiar) y mis tíos Queca y Lucho Pecho. Quienes colaboraron en mi

formación y me enseñaron el sentido de la vida, solidaridad, la unión familiar y

el deseo de superación. (agradecimiento muy especial)

Tío Fernando Morales Ponce, que la oscura soledad en la que te encuentras no

destruya tus ideales de cambio y justica.

Eleine Rodríguez C., mi compañera de toda la vida, Elvia y Alvarito por sus

consejos y su gran apoyo.

Odalys y Simón por guiar mis primeros pasos en este hermoso país.

Todo el plantel de investigadores de Bacteriología-Micología del instituto “Pedro

Kouri”, especialmente a:

Mis queridos tutores, María Teresa, Carlos Fernández, Raúl, Lili, Gerardo,

Rosi, Yosli y Ernesto Montoro por la asesoría.

Mis compatriotas y amigos de la beca, quienes me soportaron en los momentos

más difíciles de la carrera, en especial a Yoandri Hinojosa y Natacha Carlos

A todos los que de alguna manera contribuyeron en la realización de este material,

¡Muchas gracias!

RESUMEN

La tuberculosis es causa de elevada morbilidad y mortalidad a nivel mundial, con 8

millones de casos nuevos y entre 2-3 millones de muertes, cada año. El problema

mundial de la Tuberculosis empeora cada año con la diseminación de la enfermedad

multidrogoresistente y el incremento de la susceptibilidad de los individuos VIH

positivos para desarrollar la enfermedad. Durante un siglo el diagnóstico de la

tuberculosis, basado en la baciloscopía y el aislamiento e identificación de

Mycobacterium tuberculosis en los cultivos, ha sido lento y poco sensible. La mejoría

en el control de la tuberculosis depende del desarrollo y aplicación de mejores medios

para diagnosticarla. En este trabajo se empleó un método para la identificación rápida

de micobacterias, basado en la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa

del gen que codifica para la proteína de 65 kDa. Se realizó el análisis de los patrones

de restricción del gen amplificado y las pruebas bioquímicas convencionales a 40

cepas de bacilos ácido-alcohol resistentes crecidas en medio de cultivo sólido,

aisladas en el Laboratorio Nacional de Referencia de Tuberculosis, del Instituto de

medicina Tropical ¨Pedro Kourí¨, en el período comprendido entre enero y diciembre

del 2008. Los resultados se obtuvieron al cabo de 48 horas correspondiéndose con el

patrón específico del complejo M. tuberculosis. El PRA-hsp65 mostró un 100% de

sensibilidad y concordancia en comparación con las pruebas bioquímicas. Basados en

nuestra experiencia práctica, creemos que esta técnica provee de una alternativa

rápida para el diagnóstico de la Tuberculosis.

Palabras Clave: Complejo Mycobacterium tuberculosis, Reacción en cadena de la

polimerasa, patrones de restricción.

ABSTRACT Tuberculosis is a major cause of morbidity and mortality worldwide, with 8–10 million

new cases and 2–3 million deaths each year. The global problem of Tuberculosis is

worsening with the spread of multidrug-resistant disease and the increased

susceptibility of HIV-infected individuals to developing tuberculosis. For a century, the

diagnosis of tuberculosis, based on bacilloscopy and the isolation and identification of

Mycobacterium tuberculosis in cultures, has been slow and not very sensitive.

Improved control of TB depends on development and application of better means of

diagnosing it. A method for the rapid identification of mycobacteria to the species level

was used on the basis of evaluation by the polymerase chain reaction of the gene

encoding for the 65-kDa protein. PCR restriction enzyme pattern analysis and

conventional biochemical test were performed on 40 strains from solid culture media of

acid-fast bacilli, isolated in the National Reference Laboratory of tuberculosis from

Tropical Medicine Institute “Pedro Kouri”, between January and December 2008. We

obtained specific patterns belonging to the M. tuberculosis complex in 48 hours. The

PRA-hsp65 technique showed 100% sensibility and concordance in comparison with

biochemical test. Based on our practical experience, we believe that PRA-hsp65 has

the potential to provide a rapid alternative to diagnosis tuberculosis.

Key words: Mycobacterium tuberculosis complex, polymerase chain reaction,

Restriction enzyme pattern

ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN:...................................................................................................... 1

1.1 Objetivos .............................................................................................................. 4

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA .................................................................................... 5 2.1 Antecedentes históricos: ...................................................................................... 5

2.2 Taxonomía: .......................................................................................................... 6

2.3 Características generales: ................................................................................... 6

2.4 Virulencia: ............................................................................................................ 8

2.5 Genética:.............................................................................................................. 9

2.6 Diagnóstico convencional: ................................................................................. 11

2.6.1 Baciloscopía: ............................................................................................... 11

2.6.2 Cultivo microbiológico:................................................................................. 12

2.7 Nuevas técnicas de identificación: ..................................................................... 15

2.7.1 Métodos genéticos de identificación:........................................................... 16

3. MATERIALES Y METODOS................................................................................... 20 3.1 Cepas:................................................................................................................. 20

3.1.1 Cepas de trabajo: ......................................................................................... 20

3.2 Identificación por Pruebas Bioquímicas: ............................................................. 20

3.2.2 Técnica del PRA:.......................................................................................... 22

3.3 Análisis estadístico:............................................................................................ 25

4. RESULTADOS........................................................................................................ 26 5. DISCUSIÓN............................................................................................................. 29 6. CONCLUSIONES.................................................................................................... 38 7. RECOMENDACIONES ........................................................................................... 39 8. REFERENCIAS....................................................................................................... 40

INTRODUCCIÓN

1. INTRODUCCIÓN: Durante toda su historia, la especie humana ha sido periódicamente atacada por

diferentes agentes biológicos que han puesto en peligro su propia existencia. Uno de

estos microorganismos es precisamente Mycobacterium tuberculosis, causante de la

enfermedad infecciosa denominada tuberculosis (TB).

Se ha estimado que la tercera parte de la población mundial, en su mayoría

pertenecientes a los países del tercer mundo se encuentra infectada por esta bacteria.

Sin embargo, solamente entre el 5-10% de esta población desarrolla la enfermedad en

su forma activa, mostrando síntomas clínicos en los primeros 2 años (TB primaria) o

más tarde (reactivación) (Santiago et al., 2005; Al-Attiyah et al., 2006).

La TB es considerada en la actualidad emergencia mundial por la Organización

Mundial de la Salud (OMS), la cual ha reportado la existencia de 8 millones de nuevos

casos, con una mortalidad estimada de 3 millones de personas por año (Jiménez et

al., 2001; Castro et al, 2005). Según el reporte publicado en el 2008 por esta

organización, África, fue el continente que mostro mayor tasa de incidencia mientras

que en las Américas, el índice de mortalidad fue de 5 casos por cada 100 000

habitantes, siendo Brasil, Haití, y Perú los países con más alto índices de fallecidos.

En Cuba, la tasa registrada en el 2007 fue de 6.7 x 100 000 habitantes, la mortalidad

en los últimos 7 años no ha tenido variaciones significativas y se ha mantenido por

debajo de 1 x 100 000 habitantes (World Health Organization, 2008; MINSAP, 2008).

El alto índice de nuevos casos se debe a diversos factores como el descuido de los

programas de control, los altos índices de pobreza y el aumento de pacientes

coinfectados con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH/TB) (García, 2007)

Introducción

1

Afortunadamente se han venido realizado grandes esfuerzos para dar una respuesta a

esta enfermedad, la cual puede ser curable, siempre y cuando se detecte a tiempo,

mediante un diagnóstico preciso y que el paciente se mantenga dentro de un régimen

de tratamiento estrictamente supervisado (TAES) (Guevara et al., 2003).

En la actualidad la TB es identificada por los procedimientos clásicos de microbiología,

los cuales incluyen la tinción de Ziehl-Neelsen y el cultivo en medio de Löwestein–

Jensen, ambos considerados como técnicas de referencia en el diagnóstico de TB

(Barrón et al., 2006).

Sin embargo, gracias a los grandes adelantos tecnológicos y al surgimiento de los

estudios de biología molecular, nuevos métodos de diagnóstico se están

desarrollando, e inclusive se aplican de forma rutinaria en algunos países del primer

mundo. Entre ellos se encuentran los métodos de cultivo automatizado (BACTEC TB-

460, MGIT-960, Versa TREK, BacT/ALERT 3D), el diagnóstico fenotípico no

convencional, el análisis de los ácidos micólicos de la pared celular y las pruebas de

identificación genotípica (Tortoli, Palomino, 2007).

Dentro de las pruebas fenotípicas, los métodos basados en el análisis lipídico, tales

como la cromatografía líquida de alta eficiencia (siglas en ingles, HPLC), la

cromatografía en capa delgada (siglas en ingles, TLC) y la cromatografía de gas

líquido (siglas en ingles, GCL), han sido aplicadas en la identificación de

M. tuberculosis. Estos procedimientos suelen ser caros, engorrosos, no son lo

suficientemente discriminativos y sólo se encuentra accesibles para algunos

laboratorios clínicos (Uribe et al., 2001).

Las técnicas serológicas pueden ser de gran utilidad en determinadas ocasiones, sin

embargo estas no logran discriminar entre los estados de infección y enfermedad, lo

cual constituye una gran limitación de estas pruebas. A este inconveniente se adiciona

la presencia de actividad cruzada como consecuencia de la infección causada por

micobacterias ambientales (Castro et al., 2005).

Introducción

2

En la pasada década, se han logrado mayores avances en el conocimiento de la

composición genética micobacteriana. Como consecuencia, se han desarrollado

diversos sistemas de amplificación y sondas genéticas para emplearlas en el

diagnóstico de la TB. Dentro de estos sistemas se encuentran las pruebas comerciales

Accuprobe® (Gen-Probe, Inc., San Diego, California, EUA) e INNO-LiPA

(Mycobacteria, Inmunogenetics, Bélgica) los cuales son muy confiables; pero con la

limitante de ser extremadamente costosas para países de bajos recursos (Gómez et

al. 2007).

En 1989, Hance et al. reportaron, la amplificación de un fragmento del gen de la

proteína de estrés térmico de peso molecular 65 kDa (hsp65), el cual acoplado con

pruebas específicas para especies permitía la identificación de micobacterias

provenientes de muestras clínicas. Posteriormente, Plikaytis et al. (1992) y Telenti et

al. (1993), perfeccionaron el método mediante la amplificación de dicho fragmento por

reacción en cadena de la polimerasa (RCP) y el análisis del polimorfismo de la longitud

de los fragmentos de restricción (PLFR). Esta técnica fue denominada PRA (Laborín et

al., 2001; Yzquierdo et al., 2007).

En la actualidad, los métodos de identificación bioquímicos continúa siendo la técnica

de referencia para el diagnóstico de la TB. Sin embargo presentan serias limitaciones

en cuestiones de tiempo y una precisa identificación, retardando el diagnóstico y un

tratamiento adecuado del paciente.

Dado el incremento progresivo del número de casos de la TB, su elevada peligrosidad

en pacientes portadores del virus de inmunodeficiencia adquirida (VIH), y la necesidad

de un diagnóstico temprano para su posterior tratamiento con las drogas de primera

línea, nos hemos propuesto evaluar la técnica del PRA-hsp65, en el Laboratorio

Nacional de Referencia e Investigación de Tuberculosis y otras Micobacterias del

Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (LNRTB-IPK).

OBJETIVOS

Objetivos

4

1.1 Objetivos

General:

Contribuir al diagnóstico rápido de la Tuberculosis en el LNRTB del Instituto de

Medicina Tropical ¨Pedro Kourí¨.

Específicos:

1. Aplicar la técnica del PRA-hsp65 en la identificación de especies

micobacterianas.

2. Realizar las principales pruebas bioquímicas de identificación de Micobacterias.

3. Determinar la sensibilidad y coeficiente de concordancia del PRA-hsp65 con

respecto a las pruebas bioquímicas de identificación.

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

Revisión bibliográfica

5

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1 Antecedentes históricos:

La TB presenta una larga historia. Se presume que se originó hace 150 millones de

años atrás. Fue documentada en Egipto, India y China en los años 5000, 3300 y 2300,

respectivamente. En la antigua literatura griega existen indicios de la enfermedad

refiriéndose a esta como Tisis, definida por Hipócrates como la más grande

enfermedad de todos los tiempos, pues fue casi siempre fatal para los que la

padecían. A inicios del siglo XVII se produjo en Europa una epidemia de TB a la cual

se le dio el nombre de “Gran plaga blanca”, considerándola como una muerte

inevitable. En el siglo XVIII surgen los primeros indicios sobre el principal agente

causal de la TB. El físico ingles Benjamin Marten (1704-1722) conjeturó, por primera

vez, que la TB era provocada por “criaturas de vida diminuta”. Posteriormente los

doctores Jean-Antoine Villemin (1827-1892) y William Budd (1811-1880), concluyeron,

a través de estudios epidemiológicos, que la TB se difundía por la sociedad a través

de gérmenes específicos (Leão, Portaels, 2007).

No fue hasta la tarde del 24 de Marzo de 1882, en Berlín, ante una escéptica

audiencia compuesta por prominentes hombres de ciencia alemanes pertenecientes a

la sociedad fisiológica que, Robert Koch (1843-1910), realizó la famosa presentación

de Mycobacterium tuberculosis como agente causal de la TB, lo que marcó el primer

hito en el estudio de esta enfermedad (Kaufmann, 2003). Estos hallazgos, seguidos

por el desarrollo y refinamiento de las técnicas de coloración y cultivo realizadas por

Paul Erhlich (1854-1915), Franz Ziehl y Friedrich K.A. Neelsen proporcionaron las

primeras herramientas para combatir racionalmente la TB. A más de un siglo de la

introducción de estas herramientas, se desarrolló una vacuna y varios agentes

quimioterapéuticos para combatir esta enfermedad. Aun así, en la actualidad, la TB

sigue siendo la mayor causa de muerte en el mundo debida a un único agente

infeccioso (Chacón et al., 2004).


6

2.2 Taxonomía:

La clasificación de las micobacterias se inició en 1896 cuando Lehman y Neumann

propusieron por primera vez el género Mycobacterium incluyendo a M. tuberculosis y

M. leprae, ubicándolos en la familia Mycobacteriaceae orden Actinomycetales y clase

Actinomycetes (Leâo et al., 2004).

El género Mycobacterium, el cual incluye más de cien especies, se divide en 3

grandes grupos: Complejo M. tuberculosis, complejo leprae y las Micobacterias no

tuberculosas o atípicas (MNT). El complejo Mycobacterium tuberculosis incluye

M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG (derivado atenuado de la cepa de M. bovis

comúnmente utilizado como vacuna para la protección contra M. tuberculosis),

M. africanum (causante de la TB humana en el continente africano), M. canetti

(subespecie de M. tuberculosis) y M. microti. Todas estas causan la TB en humanos.

También alguna de ellas presentan otros reservorios de infección como son: M. bovis

que infecta principalmente el ganado bovino y M. microti es patogénica en roedores

(Arráiz et al., 2006).

2.3 Características generales: M. tuberculosis es un patógeno intracelular facultativo de crecimiento lento que puede

sobrevivir y multiplicarse dentro de los macrófagos y otras células animales como

células dendríticas, mastocíticas, etc. (Persson et al., 2008). Es gram-positivo, aerobio

estricto y no forma esporas, su morfología es delgada de forma recta o ligeramente

curvada en frotis teñidos, y su tamaño suele ser de 1-4 micras de largo por 0,3-0,5

micras de ancho. El tiempo de duplicación de M. tuberculosis en condiciones óptimas

de cultivo es de 15 a 18 horas, tardando varias semanas (de 1 a 3) en aparecer

colonias visibles en medios de cultivo (Casal et al., 1999). Estos bacilos al igual que

otros pertenecientes al mismo género poseen una composición única de su pared

celular.

La pared micobacteriana es una efectiva barrera frente a muchos de los agentes

antimicrobianos convencionales y está constituida por el complejo macromolecular


7

formado por ácidos micólicos arabinogalactano-peptidoglucano (mAGP). La misma

está separada por un espacio periplásmico y posee un elevado contenido en lípidos,

confiriéndole un carácter hidrofóbico que la hace refractaria al ataque por hidrólisis

enzimática (Gorocica et al., 2005). Estudios de difracción de rayos X, han demostrado

que los ácidos micólicos se encuentran orientados en paralelo y perpendicular al plano

de la superficie celular (Song et al., 2008). Las características de esta pared la

convierte en una bacteria ácido-alcohol resistente (BAAR), ya que retiene los

colorantes en presencia de alcohol ácido (North, Jung, 2004).

La membrana celular tiene las características biológicas y bioquímicas de cualquier

membrana, aunque en las micobacterias los derivados de los fosfolípidos se

caracterizan por estar altamente glicosilados dando lugar a moléculas como el

lipoarabinomanano (LAM), que tienen un papel fundamental en la patogénesis de la

tuberculosis (Gorocica et al., 2005).

Figura 1: Estructura de la pared celular de las Micobacterias


8

2.4 Virulencia: Los atributos importantes de la virulencia de M. tuberculosis incluyen su posibilidad de

sobrevivir y multiplicarse intracelularmente, la habilidad de entrar en estado de latencia

ó infección (incluso décadas) y la capacidad de interferir en la respuesta inmune del

hospedero (Bokum et al., 2008).

El más notable atributo biológico de este patógeno lo constituye la composición de la

pared celular, como mencionamos anteriormente compuesta por el complejo mAGP, la

cual le confiere una hidrofobicidad, protección y sobrevivencia dentro de la célula

infectada. Se ha demostrado también la presencia de lípidos libres los cuales tienen

una gran participación en la virulencia, entre ellos se encuentran: el factor cuerda y los

sulfolípidos (Brennan, 2003).

El factor cuerda se encuentra ubicado en la capa más externa de la membrana celular

y presenta una elevada toxicidad. El mecanismo bioquímico que ejerce este factor está

relacionado con la actividad de la enzima NADasa. Esta enzima actúa sobre la

coenzima nicotinamida adenín dinuleótido (siglas en ingles, NAD+) que se encuentra

involucrada en los niveles de energía de distintos órganos del hospedero,

especialmente en el pulmón, hígado y tejido del bazo. Actúa también reduciendo la

actividad enzimática microsomal NAD-dependiente que participa en la producción de

peróxido de hidrogeno (H2O2). Su acción es también atribuible a un efecto directo

sobre las membranas mitocondriales, resultando en la interrupción del flujo de

electrones de la cadena respiratoria mitocondrial y la fosforilación oxidativa. Por otra

parte los sulfolípidos se piensa que está involucrado en el bloqueo de la fusión

fagosoma-lisosoma, sin embargo esta teoría está siendo cuestionada en la actualidad

(Brennan, 2003).

La secuenciación completa del genoma de M. tuberculosis H37Rv, ha conducido a

innumerables avances. Una fuerte evidencia indica que los genes presentes dentro de

la región de diferenciación 1 (DR1, siglas en ingles) son esenciales para la virulencia

en los miembros del complejo M. tuberculosis. Esto queda evidenciado con la deleción

de esta región en M. bovis, originada por una mutación, provocando una atenuación


9

de su virulencia y derivando en la cepa vacunal bacilo Calmett Güerin (BCG). Estos

genes intervienen en la codificación de las proteínas CFP-10 (Rv3874) y ESAT-6

(Rv3875), que en la actualidad son evaluadas como candidatos vacunales y como

antígenos, en la estandarización de nuevos métodos de diagnóstico de la TB. Estas

proteínas también juegan un doble rol en el mecanismo de patogénesis de la

micobacteria tanto en el empleo vacunal como la virulencia produciendo la

desactivación del macrófago y la activación de células T (Guinn et al., 2004; Ernst et

al., 2007; Ganguly et al., 2008).

Otros genes que se encuentran en estudio son el de la proteína MgtC (Rv1811),

involucrada en la sobrevivencia intracelular del bacilo en el macrófago y la adaptación

a las limitaciones de magnesio (Alix et al., 2006) y el operon mce4 que es expresado

durante la fase estacionaria de crecimiento en cultivos y durante el curso de infección

en mamíferos hospederos. Como la proteína Mce4A es expresada durante la fase

tardía del crecimiento esto sugiere la posibilidad de que juegue un rol en la

persistencia de la infección tuberculosa (Saini et al., 2008).

2.5 Genética:

El estudio de la genética micobacteriana ha florecido en los últimos años, por el

desarrollo en los diversos métodos genéticos, secuenciamiento del ácido

desoxirribonucleico (ADN), y la secuenciación del genoma de M. tuberculosis H37Rv

que fue completada en 1998 por The Institute for Genomic Research y por the Sanger

Center-Pasteur Institute consortium (Cole et al., 1998).

El genoma de M. tuberculosis consiste de 4.4 x 106 pares de base (pb) con un alto

contenido de Guanina y Citocina (Blackwood et al., 2000). Presenta aproximadamente

4000 genes que codifican proteínas y 50 que codifican ácido ribonucleico (ARN). La

secuenciación del genoma mostró que esta bacteria tiene características únicas.

Presenta regiones bien conservadas de ADN las cuales contienen las características

de género (RD) y regiones hipervariables propias de cada especie por lo que estas

últimas son usadas para su identificación. Entre las regiones hipervariables se


10

encuentran el gen hsp65, que codifica la proteína de 65 kDa (estrés térmico), regiones

genómicas de la subunidad ribosómal 16S, la región intergénica 16S-23S y los

elementos de inserción o transponibles (IS) siendo el más conocido el IS6110. De los

4000 genes que codifican para proteínas, 200 codifican para enzimas que intervienen

en el metabolismo lipídico y de estos, 100 son predecesores para la función de la β

oxidación de ácidos grasos, a diferencia de E. coli que presenta solo 50. Esta

característica está estrechamente relacionada con la peculiar composición de la pared

de M. tuberculosis (Curtiss, Haydel, 2003)

Tabla I: Distribución general de los genes de M. tuberculosis en base a su función.

Otra inusual característica del genoma de M. tuberculosis es la presencia de genes

que codifican para familias de proteínas acídicas, Pro-Glu (PE) y Pro-Pro-Glu (PPE),

que con secuencias encontradas en dos regiones conservadas N-terminal. Estás son

únicas en los miembros del complejo M. tuberculosis y muchas se encuentran

localizadas en la pared y membrana celular. Algunas de estas proteínas juegan un

papel importante en la variación antigénica de M. tuberculosis durante la infección

(Smith, 2003).

FUNCIÓN Nº de genes % del total Metabolismo lipídico 225 5.7 Vías de información 207 5.2 Pared celular y procesos celulares 517 13.0 codificación de ARNs 50 1.3 Elementos de IS y bacteriófagos 137 3.4 Proteínas PE y PPE 167 4.2 Respiración e intermediarios del metabolismo 877 22.0 Proteinas regulatorias 117 4.7 Virulencia, detoxificación y adaptación 91 2.3 función hipotética conservada 911 22.9 funcion desconocida de proteinas 607 15.3


11

Figura 2: Mapa circular del cromosoma de M. tuberculosis H37 Rv. 2.6 Diagnóstico convencional: 2.6.1 Baciloscopía: Dentro de las técnicas para el diagnóstico de la TB, la baciloscopía que incluye la

tinción microbiológica de Ziehl–Neelsen ha sido la técnica de referencia en la mayoría

de los laboratorios. Se basa en la capacidad de las micobacterias para formar

complejos estables con ciertos colorantes de arylmetano como la fucsina, la cual

penetra en la pared celular uniéndose a los complejos micolil-arabinogalactano. Este

complejo retiene el colorante aún después de su exposición al alcohol ácido o ácidos

minerales (Araujo, Waard, 2004). Esta técnica diagnostica a los enfermos con TB que

son bacilíferos, o sea, que son fuente de diseminación de la enfermedad, Sin

embargo, es en este sentido donde se han observado las mayores limitaciones, ya que

este sistema necesita un número superior a 104 bacterias por mililitro para arrojar un

diagnóstico positivo. Un dato adicional que complica la aplicación de este método

como el único sistema para diagnosticar a pacientes tuberculosos, es la estimación de


12

que más de la mitad de los 10 millones de casos reportados anualmente, son

infecciones pulmonares y extrapulmonares con baciloscopías negativas, los cuales

pueden diagnosticarse con un criterio clínico, histopatológico, epidemiológico,

radiológico e inmunológico (Cuevas, 2003).

2.6.2 Cultivo microbiológico: En respuesta a lo anterior, se propuso como segundo frente de batalla en el

diagnóstico de la TB, el cultivo bacteriano líquido o sólido, que se emplea para

confirmar o descartar baciloscopías negativas así como para identificar de qué agente

se trata, apoyándose en un diagnóstico clínico y radiológico positivo. El medio más

usado en los laboratorios de TB es el Löwenstein-Jensen, el cual contiene sales

definidas, glicerol y sustancias orgánicas complejas como huevo fresco o yema de

huevo o harina de papa y verde malaquita (para inhibir el crecimiento de otras

bacterias y hongos contaminantes), entre otros componentes. Otros medios

propuestos son el agar semisintético Middlebrook 7H10 y 7H11, los cuales dentro de

su composición presentan hidrolizados de caseína y albúmina que actúan inhibiendo

los efectos tóxicos de los ácidos grasos. Por otra parte los medios líquidos

Middlebrook 7H9 y 7H12 requieren de la adición de Tween (ésteres hidrosolubles de

ácidos grasos), para un crecimiento más disgregado del bacilo en el medio líquido. No

obstante, estos métodos tienen la desventaja de que tardan entre dos a ocho semanas

para arrojar un resultado (Montoro et al., 2001).

A principios de la década de los 80 salió al mercado un sistema denominado BACTEC

460, hoy en día comercializado por la compañía Becton Dickinson (BD). Este consiste

en frascos con medio líquido Middlebrook 7H12 que contienen ácido palmítico como

única fuente de carbono, éste marcado radioactivamente. Constituye el patrón de

referencia con el que se comparan todos los medios antes de ser aprobados para su

uso diagnóstico. La principal ventaja de este sistema es el incremento de la

sensibilidad y la reducción en tiempo para el diagnóstico; sin embargo su uso se

encuentra limitado por la necesidad de una infraestructura adecuada para trabajar con

material radiactivo (Harvell et al., 2000).


13

A partir de 1995 empiezan a salir al mercado medios líquidos que obvian el problema

de la radiactividad y del tener que inyectar el frasco (con la teórica posibilidad de

contaminar un frasco con bacterias del frasco anterior). Estos medios se introducen en

equipos que incuban los frascos y a su vez realizan una monitorización continua de la

actividad metabólica que hay en su interior con el objetivo de determinar la presencia o

no de crecimiento. El primero en salir al mercado fue el medio de cultivo liquido,

llamado tubo indicador de crecimiento micobacterial (siglas en ingles, MGIT) el cual

contiene Middlebrook 7H9 modificado y utiliza un sensor de fluorescencia (Somoskövi,

Magyar, 1999). Seguido a este, nuevos sistemas se han puesto a prueba, como son:

el sistema MGIT BACTEC 960 (Kontos et al., 2003), el ESP Culture System II (Trek

Diagnostic Systems) y el MB/BacT ALERT 3D (BioMerieux). ESP y MB/BacT utilizan

sensores de presión y color respectivamente para detectar el crecimiento. Estos

sistemas se han introducido en la mayor parte de los laboratorios ya que reducen el

tiempo de detección de crecimiento con una alta sensibilidad lo que constituye un gran

avance (Piersimoni et al., 2001; Hines et al., 2006; Dorronsoro, Torroba, 2007;

Nyendak et al., 2009). La principal desventaja continúa siendo el alto costo para

países de bajos ingresos, donde la TB constituye un creciente problema de salud.


14

2.6.3 Pruebas bioquímicas: La diferenciación entre las micobacterias del complejo M. tuberculosis y las MNT, está

determinada por tres pruebas bioquímicas fundamentales: niacina, catalasa

termoestable a 68°C y reducción del nitrato.

Prueba de la Niacina:

La niacina (ácido nicotínico) juega un papel vital en las reacciones de oxidación-

reducción que ocurren durante el metabolismo de todas las micobacterias.

M. tuberculosis la produce muy activamente y la acumula en gran cantidad porque no

puede procesarla posteriormente. En dicha prueba, el ácido nicotínico reacciona con el

bromuro de cianógeno dando lugar a una sustancia que, al unirse a una amina

aromática como la anilina o la bencidina, forma una compuesto final que se colorea de

amarillo o rosado, respectivamente. Las cepas de M. tuberculosis negativas a la

niacina son muy poco frecuentes. La acumulación del ácido nicotínico se produce en

gran medida en la fase exponencial del crecimiento de la micobacteria es decir en la

fase comprendida entre la cuarta o quinta semana del cultivo (Konno, 1956).

Prueba de la catalasa termoestable a 68° C: La catalasa es una enzima que presentan los microorganismos para protegerse del

peróxido de hidrógeno, compuesto secretado por las células del organismo hospedero.

En las micobacterias pertenecientes al complejo M. tuberculosis la actividad de esta

enzima es inhibida a 68 °C. Para evaluar su termoestabilidad, en los laboratorios se

adicionan a todos los medios analizados peróxido de hidrógeno al 3%. Esta adición

produce un abundante burbujeo en aquellas cuya enzima sea termoestable. La falta de

burbujeo es interpretado como la inactivación de la enzima y la consiguiente

negatividad de la prueba (Kubica et al., 1966).

Prueba de reducción de nitrato: Es una prueba complementaria a las anteriores y está fundamentada en la capacidad

de M. tuberculosis y algunas micobacterias ambientales de asimilar el nitrato como


15

una fuente de nitrógeno (estas prefieren el amonio o la asparagina). Consiste en la

presencia de la enzima nitrato reductasa a nivel de membrana que tiene la capacidad

de reducir rápidamente el nitrato a nitrito (Virtanen, 1960).

Tabla II: Esquema de diferenciación de M. tuberculosis de las MNT.

2.7 Nuevas técnicas de identificación: Si bien las técnicas de identificación convencionales en la actualidad continúan siendo

consideradas como las técnicas de referencia para el diagnóstico microbiológico, dado

su accesibilidad en costo a todos los laboratorios de TB, queda claro que presentan

limitaciones en cuestiones de tiempo, identificación exacta y oportuno diagnóstico para

un tratamiento adecuado. A través de los años, con los avances tecnológicos y el

estudio molecular, se han desarrollado diversos métodos con el objetivo de corregir

estas limitaciones. Nuevas técnicas de identificación no convencionales se han puesto

a disposición de los laboratorios microbiológicos como: La TLC, usado en los

laboratorios de rutina para identificar aislados micobacteriales, la HPLC y la GCL.

Estos se basan en el análisis metil éster de los ácidos micólicos de la pared celular

(Chou et al., 1998; Queico et al., 2005).

M. tuberculosis MNT

Velocidad de crecimiento Lenta a partir de la tercera semana luego de inoculada una muestra en medio a base de huevos

Lenta o rápida

Aspecto macroscópico de la colonia Rugosa no pigmentada Lisa puede tener pigmentación

Aspecto microscópico Bacilos dispuestos en "cuerdas"

Bacilos muy grandes,

filamentos cortos, cocoides, mayormente desagregados

Niacina Positivo Negativa/ Positiva Catalasa termoestable a 68°C Negativo Positiva/Negativa

Reducción de nitrato a nitrito Positivo Negativa/positiva


16

Las técnicas cromatográficas presentan varias limitantes entre las que se encuentran

la necesidad de abundante biomasa bacteriana, no es diferenciable del todo, por la

continua descripción de nuevas cepas, la necesidad de personal altamente capacitado

y equipos costosos (Dorronsoro, Torroba, 2007).

En el ensayo de amplificación de fagos, se emplea el micobacteriófago D29, virus ADN

que tiene la habilidad de infectar micobacterias de crecimiento lento como

M. tuberculosis. Este es capaz de replicarse en el interior de estas micobacterias,

provocando la lisis de la pared celular y la liberación por ende de la nueva progenie de

fagos. En el ensayo, los fagos exógenos son inactivados por tratamiento químico

mientras que el número de fagos endógenos, el cual es un indicador del número de

células viables de M. tuberculosis, es determinado después de ciclos de infección,

replicación y liberación en una placa indicadora que contiene Mycobacterium.

smegmatis. Los resultados se obtienen en 24-48 horas a través de la aparición de

zonas claras o lisis (Park et al., 2003; McNerney et al., 2004; Yzquierdo et al., 2008).

2.7.1 Métodos genéticos de identificación:

Hibridación en fase sólida: La prueba de identificación AccuProbe® Mycobacterium Tuberculosis (Gen Probe, Inc.

SanDiego, Calif) puede ser usado para la confirmación de cultivos de M. tuberculosis.

Esta se basa en la degradación de acridinium sobre una sonda, que hibridiza con el

ARN ribosomal (ARNr) 16S. Los resultados de cultivos positivos se pueden obtener

por el empleo del luminómetro Gen-Probe’s en alrededor de 2 horas (Somoskövi et al.,

2000).

El INNO LiPA Mycobacteria, comercializado desde 1997, es una extensión del ensayo

de sondas de línea. Este consiste en una prueba de hibridación reversa con diferentes

sondas de ADN inmovilizadas en líneas paralelas en una tira de papel que luego es

sometida a un ciclo térmico. En el caso de las micobacterias, son fragmentos

específicos, de espaciadores transcritos internos (siglas en ingles, ITS), que no son


17

más que regiones interpuestas entre genes de RNAr 16S y 23S. Este sistema incluye

sondas del complejo M. tuberculosis y otras especies y puede ser empleada en la

detección de resistencia a Rifampicina, siendo específica pero poco sensible. Una

defiencia que presenta este es ensayo, es que no puede discriminar entre los

diferentes miembros del complejo M. tuberculosis ya que presentan idénticas

secuencias en el espacio intergénico del ARN 16S y 23S (Miller et al., 2000; Tortoli,

Marcelli, 2007).

Genotipaje Mycobacterium tuberculosis:

La prueba comercial Genotipaje MTBC, fue diseñada para diferenciar entre las

especies del Complejo M. tuberculosis (Richter et al., 2003). Este sistema está basado

en la tecnología de hibridación reversa de ADN sobre tiras de nitrocelulosa

(GenoType® MTBC; Hain Diagnostika, Nehren, Germany) para detectar la secuencia

polimórfica del gen gyrB y la deleción RD1 de M. bovis BCG. Consiste en 11 sondas

de las cuales 1 pertenece a la región del ADN que codifica para el ARNr 23S (para

confirmar que pertenece al Complejo M. tuberculosis), 9 para cuatro regiones del gen

gyrB que permite la discriminación, mas no la diferenciación entre M. bovis y M. bovis

BCG (la sonda hibrida en la deleción detectada en RD1) y una flanquea la región de

RD1 (Goméz et al., 2007)

Secuenciación basado en RCP:

Se basa en una amplificación inicial por RCP seguido del análisis de la secuencia

nucleotídica de lo amplificado en un secuenciador automático. La identificación de una

cepa desconocida es completada por la comparación de la secuencia nucleotídica con

una librería de secuencias conocidas. La base de datos para este propósito está

disponible en internet (Gen Bank, Microsystems database (RIDOM), European

Molecular Biology es (EMBL)). Diversos genes blancos se emplean en este

procedimiento; pero el más común es el gen ARNr 16S, el cual puede ser secuenciado

porque contiene regiones conservadas y variables. A pesar de que este gen contiene

más de 1500 pb, los primeros 500 pb son adecuados para la identificación de especies

comunes al género. Otro blanco génico importante es el que codifica para la proteína


18

de estrés térmico de 65 kDa, la proteína de 32 kDa, el gen que codifica para la sub

unidad β de la ARN polimerasa rpoB, el gen recA (presenta un intrón proteico que al

ser escindido da lugar a la proteína madura Rec A) y los espaciadores transcritos

internos (ITS) del ARNr 16S-32S. De este último los resultados demuestran que las

secuencias espaciadoras pueden diferenciar a micobacterias de crecimiento lento con

una idéntica o cerrada relación en la secuencia de bases de la región del ADN que

codifica para el ARNr 16S. La ocurrencia de elementos estructurales primarios y

secundarios conservados en secuencias ITS indica su potencial utilidad en la

identificación micobacteriana. En la actualidad el sistema comercial de

secuenciamiento de la región del ADN que codifica para el ARNr, MicroSeq System

(Applied Biosystems, CA), presenta buenos resultados y ofrece la posibilidad a los

laboratorios de identificar micobacterias descritas recientemente (Neonakis et al.,

2008).

Análisis del polimorfismo del gen hsp65 (PRA-hsp65): En 1992, Plikaytis et al. desarrollaron un método para identificación de micobacteria

que combina la amplificación por RCP en una secuencia conservada de ADN del

género Mycobacterium, y el análisis con enzimas de restricción, de la secuencia

amplificada. Esta secuencia de ADN corresponde a una porción de 1380 pb del gen

que codifica para la proteína de estrés térmico hsp65. El análisis de los perfiles de

restricción de la secuencia amplificada muestra los patrones de restricción para cada

especie en particular (Chimara et al., 2004). En1993, Telenti et al. usando cebadores

de amplificación para el gen hsp65 con 439 pb y otras enzimas de restricción (HaeIII,

BstEII), planteó un algoritmo de identificación al que denominó PRA-hsp65. En el 2008

Chimara et al., amplificando un segmento de 441 pb del mismo gen, incorporaron un

nuevo algoritmo, tomando en consideración características fenotípicas de las especies

(grupos de Runyon), obteniéndose una aproximación más exacta de la talla de los

fragmentos, resultando en una identificación mucho más precisa de las especies

(Chimara et al., 2008).

En la actualidad se realizan estudios de la técnica del PRA-hsp65 con el uso de otros

genes como el rpoB, mediante el uso de las enzimas de restricción MspI y HaeIII. Se


19

están obteniendo importantes resultados, inclusive nuevos algoritmos de identificación

(Lee et al., 2000).

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales y métodos

20

3. MATERIALES Y METODOS 3.1 Cepas: 3.1.1 Cepas de trabajo:

Se estudiaron 40 cepas aisladas al LNRTB-IPK en el periodo comprendido entre Enero

y Diciembre del 2008.

3.1.1.1 Cepas controles:

M. tuberculosis H37Rv ATCC 27294

M. avium ATCC 25291

M. bovis ATCC 12210

3.2 Identificación por Pruebas Bioquímicas:

Para cumplir el objetivo propuesto se realizaron tres pruebas de identificación,

catalasa, reducción de nitratos a nitritos y niacina. Para descartar entre MNT y las

pertenecientes al complejo M. tuberculosis. Las cepas se identificaron por medio de la

negatividad o positividad a estas pruebas.

Las pruebas se llevaron a cabo con cepas cultivadas en el medio Löwenstein Jensen

(L-J), de tres a cuatro semanas de crecimiento.

Prueba de la catalasa termoestable a 68 ºC: Se identificaron 3 tubos, uno conteniendo 0,5 ml de solución tampón fosfato pH 6,8

estéril con el número del aislamiento a identificar, y dos conteniendo solución tampón

con el número de una cepa de referencia de M tuberculosis H37Rv (control negativo de

la prueba) y M. avium que se usó como control positivo. Se transfirió una asada

abundante de los cultivos a cada uno de los tubos con solución tampón identificado


21

con su número. Seguidamente se colocaron los tubos en baño maría a 68ºC durante

20 minutos. Se enfrió a temperatura ambiente y se agregó a cada uno de ellos,0.5 ml

de una mezcla preparada en el momento con partes iguales de la solución acuosa de

Tween 80 al 10% y peróxido de hidrógeno al 30%, comprobando que las tapas de los

tubos estuvieran bien cerradas. Los tubos se observaron a trasluz para detectar el

desprendimiento de burbujas desde la masa bacilar hacia la superficie del líquido,

evitando generar burbujas por agitación o movimientos bruscos que pudieran interferir

con el resultado. En caso de tener tubos negativos se observó nuevamente a los 20

minutos para verificar si no había actividad de catalasa (Kubica et al., 1966).

Reacción positiva: Se identificó por el desprendimiento de burbujas, producto de la

descomposición del peróxido de hidrógeno por la actividad enzimática.

Reacción negativa: No se observó desprendimiento de burbujas.

Reducción del nitrato a nitrito:

Se preparó un tubo con el sustrato compuesto por nitrato de sodio (NaNO3 0,01M).

Seguidamente se transfirió y disgregó a este una asada con abundante masa bacilar

del cultivo a identificar. Se repitió el procedimiento con la cepa control positivo M

tuberculosis H37Rv y control negativo M. bovis. Posteriormente se agitaron

suavemente los tubos y se incubaron a 37ºC durante 4 horas. Seguidamente se

agregó a cada tubo una gota de Solución A (Ácido clorhídrico 1:1), 2 gotas de Solución

B (Sulfanilamida 0,2%) y 2 gotas de Solución C (Nnaftil etilendiamina 0,1%). Se agitó

manualmente luego de comprobar que los tubos estuvieran bien cerrados (Virtanen,

1960).

Reacción positiva: El desarrollo de color rosa a fucsia indica que se redujo el nitrato

presente en el sustrato por la acción de la enzima nitrato reducatasa.

Reacción negativa: No se observa desarrollo de color.


22

Prueba de la niacina: Se depositó 1 ml de agua destilada estéril en el tubo con crecimiento en medio L-J.

Posteriormente se repitió la operación en el control positivo y un tubo sin inocular

(control negativo). Se rompió el medio con el asa para facilitar la disolución de ácido

nicotínico y se dejó el tubo inclinado al menos 15 minutos. Seguidamente se extrajeron

0,5 ml del líquido y se transfirieron a un tubo de ensayo con tapa de rosca. El revelado

de la reacción, se llevó a cabo agregando 0,5 ml de Bencidina al 3% y 0,5 ml de

Bromuro de Cianógeno al 10%. Los tubos se agitaron manualmente para permitir la

reacción durante los siguientes 5 minutos. Al final de la lectura se adicionó NaOH al

4% para inactivar el Bromuro de Cianógeno (Konno, 1956).

Reacción positiva: La presencia de ácido nicotínico en alta concentración en el medio

de cultivo se visualizó con el desarrollo de una coloración rosado pálido.

Reacción negativa: No se desarrolló color.

Interpretación de los resultados:

La positividad de las pruebas de la niacina y reducción de nitrato a nitrito, además de

la negatividad de la prueba de la catalasa termoestable a 68°C indicó la presencia de

M. tuberculosis en el medio de cultivo. La negatividad de la prueba de la niacina dio la

presunción de la presencia de MNT.

3.2.2 Técnica del PRA: La técnica de PRA fue aplicada a las 40 cepas del estudio siguiendo el protocolo

establecido por Telenti et al. en el año 1993 (Telenti et al., 1993).


23

3.2.2.1 Extracción de ADN micobacteriano: El procedimiento de extracción se llevó a cabo según el trabajo descrito por Van

Soolingen (1992). Se tomó una asada de masa micobacteriana y se resuspendió en

400 μL de solución tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4) en viales de 1,5

mL. Estos fueron sometidos a 80ºC por 20 minutos. Posteriormente se dejo enfriar a

temperatura ambiente y se adicionaron 50 uL de lisozima (Sigma), incubándose

durante 1h, en agitación. Seguidamente se adicionaron 70 uL de SDS (Dodecilsulfato

sódico) al 10 % y 5 µl de proteinasa K (Promega) incubándolo a 65 ºC durante 10

minutos. Se adicionaron 100 µL de NaCl 5 M y 100 µL de CTAB/NaCl, se agitó e

incubó a 65ºC por 10 minutos. A continuación se adicionaron 750 µL de

cloroformo/alcohol-isoamílico (24:1) y se centrifugó a 14,000 g por 5 minutos a

temperatura ambiente.

Para precipitar el ADN se adicionaron 450 µL de isopropanol, el sobrenadante se

incubó a -20ºC por 30 minutos y se centrifugó a 14,000 g por 15 minutos,

posteriormente se lavó el precipitado con 1 mL de etanol 70%, y se procedió a

centrifugar a 14,000 g por 5 minutos. La conservación de la muestra se realizó en

agua destilada estéril (20-30 µL) y se conservó a 4ºC para su uso inmediato o a -

20ºC para su uso posterior.

3.2.2.2 Reacción de amplificación: Mezcla de reacción:

En un tubo de reacción se añadieron 0.5-1µL de ADN micobacteriano. La composición

de la mezcla de reacción consistió en: Solución tampón fosfato de RCP 10X (5 µL),

MgCl2 1.5 mM (3 µL), dNTP 100 mM c/u (1,5 µL), los cebadores se emplearon a una

concentración de 25 pmoles (1µL) y se utilizaron 2U (0.4µL) de Taq polimerasa, para

obtener un volumen final de 50 µL.


24

Programa: La reacción estuvo sujeta a 1 ciclo de desnaturalización de 5 minutos a 95ºC, 35 ciclos

de hibridación a 94ºC durante 1 minuto, 60ºC 1 minuto, 72ºC 1 minuto y un paso de

extensión final de 7 minutos a 72ºC.

Se emplearon como cebadores: Tb11 (5-ACCAACGATGGTGTGTCCAT) y Tb12 (5-

CTTGTCGAACCGCATACCCT), ambos descritos por Telenti et al. Estos fueron

proporcionados por el centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB, La

Habana, Cuba) los cuales están dirigidos a amplificar un fragmento de 441 pares de

base entre las posiciones 398 y 836 de la secuencia nucleotídica publicada del gen

que codifica para la proteína de 65 kDa. Para la reacción de amplificación se empleó el

termociclador PTC 150 (MJ Research).

Análisis de los productos de la RCP:

Se realizó mediante electroforesis submarina en gel de agarosa al 1 % teñido con

bromuro de etidio (1%). Se utilizó como marcador de peso molecular ADN 100 pb (100

bp DNA Letter (Promega)), que abarca un rango desde 100 a 1500 pb y se utilizó en la

aplicación Orange G como indicador de corrida electroforética. Esta se realizó a 90

Volts con Solución tampón fosfato Tris Borato EDTA (TBE) pH 8, durante 45 minutos.

Los geles fueron observados bajo exposición a la luz ultravioleta en un transluminador

UV (VILVER LOURMAT, TFX-20-MC).

3.2.2.3 Análisis de restricción: Luego de comprobar la amplificación del segmento génico, se realizó la digestión

enzimática a partir de 15 µL del producto amplificado, con las respetivas enzimas

BstEII y HaeIII, por separado. En cada caso, la mezcla contenía 2.5 µL de solución

tampón específica para cada enzima (buffer D para BstEII, y buffer C para HaeIII),

1 uL de enzima, 0.3 µL de albúmina de suero fetal bovino y 6.2 uL de agua, para un

volumen final de 25 µL. La digestión con la enzima BstEII fue incubada a 60ºC,

mientras que con HaeIII la temperatura fue de 37ºC. En ambos casos, la incubación se

realizó durante toda la noche.


25

Los resultados de ambas reacciones se analizaron mediante electroforesis submarina

en gel de agarosa 3%, teñido con bromuro de etidio. Se utilizó el marcador de ADN de

50 pb (50 bp DNA Letter (Promega)) que comprende un rango desde 24 a 726 pb y el

indicador Orange G para corrida electroforética, la cual se efectuó a 80 Volts durante 2

horas y 30 minutos. Los geles fueron observados bajo exposición a la luz ultravioleta

en un transluminador UV (VILVER LOURMAT, TFX-20-MC).

3.2.2.4 Análisis e interpretación de Resultados: Se analizaron los fragmentos de restricción obtenidos a partir de las digestiones con

cada una de las enzimas y se determinó la talla de los mismos de acuerdo al marcador

de peso molecular empleado. Posteriormente mediante el algoritmo reportado por

Chimara et al. en el 2008 se procedió a la identificación. (ANEXO 1).

3.3 Análisis estadístico: Con los resultados obtenidos en la identificación bioquímica y la del PRA, se calculó la

sensibilidad y el coeficiente de concordancia entre la prueba evaluada y las pruebas

bioquímicas, técnica de referencia en la identificación de M. tuberculosis.

3.4. Normas de Bioseguridad

Todos los procedimientos que implicaron el manejo de las cepas vivas de

Micobacterias fueron realizados en gabinetes de seguridad biológica Clase II (BSL II),

como se encuentra dispuesto en los Procedimientos Normalizados de Operación

(PNO) del LNRTB del IPK. Las tareas que involucraron la manipulación de sustancias

tóxicas como el Bromuro de cianógeno y el Bromuro de etidio se llevaron a cabo en

campana de extracción.

RESULTADOS

Resultados

26

4. RESULTADOS

Se aplicó la técnica del PRA-hsp65 a cada una de las cepas, obteniéndose los

resultados de la pruebas aproximadamente en 48 horas. Se observó la correcta

amplificación del segmento génico de 441 pb del gen hsp65 mediante electroforesis

submarina en gel de agarosa al 1%. La talla del segmento amplificado fue medida por

la aplicación del un marcador de peso molecular de ADN (figura 1).

Figura 3: Patrones de amplificación del segmento génico hsp65 de algunas cepas,

medidos con el marcador de peso molecular.

Luego de realizada la digestión mediante las enzimas de restricción BstEII y HaeIII se

visualizaron las bandas por medio de una electroforesis submarina en gel de agarosa

al 3%. Los patrones fueron correctamente observados y medidos mediante la

aplicación del marcador de peso molecular para cada enzima (figura 2).

Resultados

27

Figura 4: Patrones de digestión enzimática de BstEII y HaeIII de algunas cepas.

La interpretación de la digestión, se realizó mediante el algoritmo propuesto por

Chimara et al. (2008), logrando identificar a las 40 cepas como pertenecientes al

Complejo M. tuberculosis

La figura 3 muestra los patrones de las pruebas bioquímicas realizadas. La reducción

de nitrato a nitrito se observa en la figura 3c. La totalidad de las cepas analizadas por

esta prueba fueron positivas, observándose desarrollo de color en los tubos que

contenían las mismas.

El 100% de las cepas en estudio fueron negativas para la prueba de catalasa

termoestable a 68ºC. Como se observa en la figura 3b, no se apreció burbujeo en

ninguno de los tubos correspondientes.

Resultados

28

Figura 5: Resultados de las pruebas bioquímicas fundamentales para la identificación

de M. tuberculosis. (a) Niacina (b) Catalasa termoestable a 68 ºC (c) Reducción de

nitrato a nitrito.

La presencia de ácido nicotínico (figura 3a) se detectó en 38 cepas. Dos de las cepas

estudiadas no desarrollaron color. Teniendo en cuenta el resultado de las dos pruebas

bioquímicas anteriores, correspondientes con el patrón típico de las especies del

complejo M. tuberculosis, estas constituían resultados discordantes.

Estas cepas discordantes se subcultivaron nuevamente. Luego de obtener un

crecimiento abundante (4 semanas) se procedió a la repetición de la prueba de la

niacina y el PRA-hsp65, obteniéndose resultados compatibles con M. tuberculosis.

Los resultados del PRA-hsp65 mostraron un 100% de sensibilidad y concordancia al

compararlos con las pruebas bioquímicas de identificación.

a c b

DISCUSIÓN

Discusión

29

5. DISCUSIÓN La TB sigue planteando en la actualidad importantes problemas epidemiológicos, de

diagnóstico clínico-microbiológico, y terapéuticos. La alta incidencia de la enfermedad

en los países en vías de desarrollo y el impacto que sobre ella está teniendo la

coinfección con el VIH imponen urgencia en el correcto cumplimiento de las pautas de

tratamiento, el desarrollo de nuevos candidatos vacunales y la implementación de

nuevas alternativas diagnósticas (Casal et al., 1999).

La identificación rápida y correcta de micobacterias a nivel de especie resulta crucial

para la aplicación de una efectiva terapia con drogas antituberculosas. En los últimos

100 años, la única prueba rápida para el diagnóstico de TB ha sido el examen

microscópico directo, cuya sensibilidad es aceptable cuando la muestra analizada

contiene más de 100 000 BAAR/mL, Las pruebas basadas en las características

fenotípicas y bioquímicas de estos bacilos demoran semanas en conocer los

resultados y son extremadamente laboriosas, fundamentalmente para MNT,

conduciendo en ocasiones a errores en la identificación (Barrera et al., 2008).

En nuestro estudio se realizó la identificación por PRA-hsp65 de 40 cepas aisladas de

esputos de pacientes con sospecha clínica de TB pulmonar. Paralelamente se

realizaron las pruebas bioquímicas, como patrón de referencia en la identificación de

Micobacterias, con el objetivo de evaluar la aplicación del PRA-hsp65 en el LNRTB-

IPK.

Previo a la realización de la reacción de amplificación se realizó la extracción del ADN

de los aislamientos micobacterianos. Para esto se empleó el método de extracción

propuesto por Van Soolingen y colaboradores, en el año 1992. Este método emplea la

digestión enzimática con lisozima y Proteinasa K (Van Soolingen et al., 1992). La

primera actúa catalizando la hidrólisis de las uniones β 1,4 entre los residuos de ácido

N-acetilmurámico y N-acetil-D-glucosamina del peptidoglicano de la pared bacteriana

(Vocadlo et al., 2001). Por otra parte, la Proteinasa K es una serina proteasa de amplio

espectro y su función básica radica en la digestión de proteínas asociadas al ácido

Discusión

30

nucleico bacteriano, así como la inactivación de nucleasas que pudieran degradar el

ADN, durante el experimento (Hilz et al., 1975).

Este método de extracción emplea el detergente catiónico CTAB (Cetyl Trimethyl

Ammonium Bromide, por sus siglas en inglés). Este tiene la propiedad de precipitar

ácidos nucléicos y polisacáridos, siendo especialmente útil para precipitar ADN

genómico de organismos que producen grandes cantidades de polisacáridos como las

bacterias (Van Soolingen et al., 1992).

A pesar de que el método de extracción empleado consume tiempo, permite obtener

un ADN de mayor calidad. No obstante, pueden ser usadas otras alternativas como

son el empleo de un estrés térmico o la ruptura mecánica de las células con perlas de

vidrio o sonicación, obteniéndose rendimientos similares de ADN (Telenti et al., 1993;

Leao et al., 2005; Somerville et al., 2005).

El primer algoritmo descrito para el PRA-hsp65 fue reportado por Telenti et al. hace

más de 10 años. Sin embargo, en nuestro estudio se siguió el protocolo publicado por

Chimara et al. en el 2008. Este último incluye especies de reciente identificación, así

como, se apoya en las pruebas fenotípicas de pigmentación y velocidad de

crecimiento para aquellas especies que presenten patrones de restricción similares

(Chimara et al., 2008).

Luego de realizada la RCP se observó, la amplificación del fragmento de 441 pb del

gen hsp65 ubicándonos en que todas las cepas pertenecían al género Mycobacterium.

El análisis de restricción con las enzimas BstEII y HaeIII arrojó bandas de 235,120, 85

pb y 150, 130 y 70 pb, respectivamente. Estos patrones se corresponden con las

especies del complejo M. tuberculosis (Chimara et al., 2008).

El antígeno de 65 kDa ha sido descrito, por algunos autores, como una proteína

asociada a la pared celular, debido a que esta se ha encontrado en la fracción

insoluble remanente de su ruptura. Sin embargo, otros investigadores proponen una

localización periplasmática, demostrando su presencia en el sobrenadante de cultivos

Discusión

31

de M. bovis, bajo condiciones deficientes de zinc (Young et al., 1987). Esta ha sido

identificada como la proteína más inmunorreactiva presente en las micobacterias y

contiene epítopes comunes al género Mycobacterium y otros únicos para una especie

determinada. Es precisamente esta característica la que la hace el sitio blanco del

PRA-hsp65, en la identificación de las micobacterias y sus especies (Shinnick, 1987).

El hecho de encontrar que el 100% de las cepas pertenecían al complejo

M. tuberculosis resultó ser un hallazgo lógico si tenemos en cuenta que estas

provenían de esputos de pacientes sintomáticos respiratorios, con sospecha clínica de

tuberculosis pulmonar.

Nuestros resultados son similares a los obtenidos por Bannalikar et al., en el 2006.

Estos investigadores reportaron un 82.6% de cepas correspondientes a

M. tuberculosis, tras emplear el PRA-hsp65, en cultivos bacterianos provenientes de

esputos de pacientes sospechosos de TB (Bannalikar et al., 2006).

Por su parte Da Silva et al. en el año 2001 realizaron la identificación de 103

aislamientos clínicos de micobacterias empleando esta misma técnica. En este estudio

se reportó la presencia del complejo M. tuberculosis solamente en un 25% de los

aislamientos, igual cifra se correspondió con el complejo M. avium, seguido por

M. kansassi y otras especies de MNT. En este caso creemos necesario señalar que, a

diferencia de nuestro estudio, las cepas provenían de una gran variedad de muestras

clínicas como esputos, pus, lavado bronquioalveolar, lavado gástrico, biopsias de

nódulos linfoides y piel, líquido peritoneal, cefalorraquídeos y aspirados de médula

ósea. Estas muestras, provenientes de localizaciones extrapulmonares, justifican el

aislamiento en gran medida de MNT (Da Silva et al., 2001).

Aunque el PRA-hsp65 involucra procedimientos relativamente simples en comparación

con otras técnicas de identificación, esta incluye la RCP cuyos valores de sensibilidad

y especificidad están influenciados por un gran número de variables de laboratorio. Por

otra parte la interpretación de la posición de las bandas generadas por las enzimas de

restricción es una tarea delicada, que se ve afectada por la calidad de la agarosa, las

Discusión

32

condiciones de corrida, la subjetividad de la interpretación y la frecuente descripción

de patrones para nuevas especies. Por lo tanto la evaluación de la reproducibilidad

inter-laboratorio ayuda a mejorar la credibilidad del PRA-hsp65 (Hafner et al., 2004;

Leão et al. 2005).

Un estudio multicéntrico realizado en la región de América Latina y el Caribe, con la

participación de laboratorios de Argentina, Brasil, Colombia, Chile y Guadalupe, centró

su objetivo en el control de calidad de la identificación por PRA-hsp65, de especies de

MNT. Los resultados obtenidos les permitieron afirmar que en esta región, la técnica

estaba lista para implementarse pero era necesario mejorar algunos aspectos, entre

los que se encontraban las condiciones de corrida y el entrenamiento en la

interpretación de los patrones con vistas a mejorar la precisión de la técnica (Leão et

al. 2005).

Desde el punto de vista de la identificación bioquímica de las cepas en estudio, se

obtuvo que el 100% fueron negativas en la prueba de catalasa termoestable a 68°C y

positivas en la prueba de reducción del nitrato a nitrito, resultado consistente con

M. tuberculosis.

La catalasa es una enzima cuya función radica en la detoxificación de los compuestos

superoxigenados generados por las células del hospedero durante la respiración. Esta

cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, siendo

inhibida su actividad a 68ºC en las cepas de M. tuberculosis y M. bovis. El resto de las

micobacterias (con la una única excepción de M. gastri, que es muy poco frecuente)

conservan la actividad catalasa después del calentamiento a 68ºC. Por esta razón esta

prueba es muy útil para diferenciar a M. tuberculosis del resto de las micobacterias. A

esto se le suma que es una prueba sencilla de realizar, no genera riesgos por

toxicidad y utiliza reactivos normalmente disponibles en un laboratorio de

bacteriología. Al ser esta una prueba basada en la detección de actividad enzimática,

puede ser realizada en cuanto se detecta el desarrollo del cultivo (Barrera, 2008).

Discusión

33

Aun cuando M. tuberculosis prefiere el amonio y la asparagina, puede utilizar el nitrato

y nitrito como fuente de nitrógeno. Para esto cuenta con la enzima nitrato reductasa

unida a la membrana celular que rápida y activamente reduce nitrato a nitrito. Esta

actividad enzimática es muy estable y otorga una herramienta que ayuda a la

identificación de distintas especies. En particular M. tuberculosis y algunas

micobacterias ambientales tienen actividad de nitrato reductasa mientras que M bovis

y BCG no la presentan, debido a mutaciones que determinan la inactividad de los

genes que la codifican (Casal et al., 1999).

Contradictoriamente, obtuvimos dos cepas que mostraron resultados negativos para la

prueba de la niacina. Estos resultaban discordantes teniendo en cuenta que por las

pruebas descritas anteriormente se había obtenido un patrón típico de

M. tuberculosis.

La niacina (ácido nicotínico) juega un importante papel en el metabolismo de todas las

micobacterias. Aunque todas ellas tienen la capacidad de producirla, la mayoría lo

hace en cantidad moderada y la emplea en la síntesis de otras moléculas. Sólo

M. tuberculosis la produce activamente y la acumula en gran cantidad porque no

puede procesarla posteriormente (Barrera, 2008).

Estas dos cepas fueron subcultivadas nuevamente y repetidas tanto las pruebas

bioquímicas como el método de identificación molecular. Esta vez, ambos métodos

empleados coincidieron en la detección del bacilo tuberculoso.

Está descrito en la literatura que la prueba de la niacina, al igual que muchas pruebas

bioquímicas, requiere realizarse en un determinado estadio biológico del crecimiento.

La acumulación de niacina puede ponerse en evidencia con mayor seguridad luego de

3-4 semanas de la aparición del crecimiento y cuando este es abundante.

Con el objetivo de agilizar el diagnóstico, esta prueba puede ser realizada cuando se

detecta el cultivo positivo pero es necesario considerar que el resultado puede ser

Discusión

34

negativo porque el crecimiento aún es muy joven y no se ha acumulado suficiente

cantidad de ácido nicotínico en el medio, como para ser detectado. Debido a esto, ante

un resultado negativo de un cultivo joven, es necesario repetir la prueba a partir de un

cultivo con un tiempo de incubación entre 3-4 semanas.

Consideramos que estas dos cepas no tenían un crecimiento lo suficientemente

abundante como para realizarles la prueba y por tal motivo, la presencia de ácido

nicotínico en el medio era pobre. Esta, es una de las principales limitantes de las

pruebas bioquímicas pues se requiere de suficiente biomasa para realizar al menos

una de estas pruebas y un abundante crecimiento para realizarlas todas a partir de un

mismo cultivo. Por el contrario, el PRA-hsp65 es tan sensible que a partir de un escaso

número de colonias se puede realizar la extracción del ADN y obtener una exitosa

amplificación del fragmento hsp65. Esta ventaja permite al Laboratorio una reducción

sustancial del tiempo de diagnóstico, ya que esperar por un segundo crecimiento para

la realización de las pruebas bioquímicas se traduciría en la espera de otras 4

semanas para obtener un resultado fidedigno por los métodos convencionales.

Por otra parte, la identificación de estos dos aislamientos discordantes, como

M. tuberculosis, tiene una gran importancia si tenemos en cuenta que tanto la

combinación de las drogas, como las dosis empleadas en los tratamientos difieren

significativamente entre los pacientes con aislamientos pulmonares del bacilo

tuberculoso y micobacterias atípicas (Katoch, 2004)

Los resultados del PRA-hsp65 mostraron un 100% de Sensibilidad y Concordancia al

compararlos con los resultados de las pruebas bioquímicas. Estos valores concuerdan

con los obtenidos por Da Silva et al. en el 2001 y Chaeunoy et al. en el 2005. Ambos

grupos encontraron un 100% para ambos parámetros evaluados (Da Silva et al.,

2001; Cheunoy et al., 2005).

De forma general los valores de sensibilidad disminuyen cuando se trata de la

identificación de MNT (Da Silva et al., 2001; Davies, Pai, 2008). Un reporte realizado

por investigadores belgas demuestra que los niveles de concordancia entre las

Discusión

35

pruebas bioquímicas y el PRA-hsp65 puede caer por debajo del 90 % para MNT

(Martin et al. 2000) aunque existen trabajos publicados donde esta correlación es

mayor (Hafner et al., 2004; Castro et al., 2007)

Bannalikar et al. demostraron que el PRA-hsp65 era una herramienta útil para la

identificación del complejo M. tuberculosis y M. avium, sin embargo está técnica no

lograba distinguir entre las especies pertenecientes al complejo M. tuberculosis. En

este reporte se refleja que los patrones de RFLP de M. tuberculosis (incluyendo H37Rv)

y M. bovis (incluyendo BCG) son idénticos. Este resultado pudiera ser atribuido a la

gran homología existente en el ADN de estas especies, hecho que se encuentra

extensivamente documentado en la literatura científica (Bannalikar, Verna, 2006).

El tiempo consumido para la realización del PRA-hsp65, hasta la obtención del

resultado final, fue de 48 horas, de forma tal que se redujo el tiempo para emitir el

diagnóstico definitivo. Esta reducción viene dada, fundamentalmente, porque no se

necesita esperar las cuatro semanas de crecimiento, ya que esta técnica puede

realizarse a partir de un cultivo con escaso número de colonias. Por su parte, la

identificación bioquímica requiere entre 2 y 3 semanas después de obtenido el

crecimiento micobacteriano.

En el caso de aislamientos de MNT, las pruebas bioquímicas, aun cuando sean

realizadas por personal experimentado, pueden arrojar resultados incorrectos debido a

su baja reproducibilidad, a que los fenotipos esperados no son propiedad absoluta de

una sola especie y a que la base de datos reportada que contiene las características

fenotípicas está limitada a las especies más comúnmente aisladas (Chimara et al.,

2008)

Otra de las ventajas de la técnica molecular radica en que la manipulación de las

bacterias vivas es mínima a diferencia de las pruebas bioquímicas, con los

consiguientes riesgos de bioseguridad que este manejo implica (Da Silva et al., 2001;

Wang, 2005). Todos los procedimientos empleados en nuestra investigación fueron

realizados siguiendo los protocolos descritos en los Procedimientos Normales de

Discusión

36

Operación del LNRTB, en gabinete de seguridad clase II, con el objetivo de minimizar

los riesgos de bioseguridad que conllevan los trabajos de investigación con

micobacterias virulentas.

Algunos autores plantean que además de la ganancia en el tiempo y considerando

solamente los reactivos usados en ambos métodos de identificación, el PRA-hsp65 es

un 50% más barato que la identificación bioquímica en MNT. Además puede ser

realizado por una sola persona, mientras que las pruebas bioquímicas involucran,

usualmente, varias personas que intervienen en la esterilización, preparación de

medios de cultivo y manejo de los cultivos (Da Silva et al., 2001; Wang, 2005).

Existen estudios a nivel internacional comparan el PRA-hsp65 con técnicas

alternativas de diagnóstico como son el HPLC, obteniendo mayores niveles de

sensibilidad, precisión y menor tiempo de realización para la primera (Mondragón et

al., 2000)

Uno de los métodos moleculares más empleados en el diagnóstico de TB es la

secuencia de inserción IS6110, presente solamente en M. tuberculosis y capaz de ser

detectada por una simple RCP. Sin embargo, se han reportado micobacterias atípicas

que presentan esta secuencia así como cepas de M. tuberculosis con bajo o ningún

número de copias de IS6110, provocando el fallo de la técnica (McHugh et al., 1997).

En Cuba existen antecedentes del uso de esta técnica para la identificación de MNT.

El reporte realizado por Yzquierdo et al., en el 2007 comprendió la evaluación del

PRA-hsp65 en la identificación de 47 cepas de MNT pertenecientes a una colección

internacional. En este trabajo se obtuvo un 100% de concordancia. Sin embargo la

realización en paralelo de un batería de pruebas bioquímicas arroió cuatro resultados

discordantes entre ambos métodos (Yzquierdo et al., 2007).

El diagnóstico está llamado a convertirse en la piedra angular dentro de la lucha contra

la TB Las técnicas de biología molecular han sido probadas como herramientas útiles

Discusión

37

en el diagnóstico de esta enfermedad. Ellas pueden estimar el número de casos

atribuido a infección reciente con M. tuberculosis, identificar factores de riesgo,

documentar reinfecciones exógenas, estudiar patrones de resistencia, detectar

diferencias fenotípicas rápidamente y con mayor precisión que la obtenida por los

métodos tradicionales (Coelho et al., 2008; Lima et al., 2008). Los beneficios de poder

contar con nuevos y más eficaces sistemas de diagnóstico de TB será de un gran

significado en la salud pública de la población en su contexto regional, nacional y

global (Guevara et al., 2003).

CONCLUSIONES

Conclusiones

38

6. CONCLUSIONES

1. Se comprobó la amplificación del gen hsp65 en todas las cepas estudiadas. La

digestión con las enzimas de restricción BstEII y HaeIII mostraron patrones

compatibles, en todos los casos, con el complejo M. tuberculosis.

2. Se evidenciaron las limitaciones de las pruebas bioquímicas en función del

crecimiento bacteriano

3. Los valores de sensibilidad y concordancia fueron del 100% al comparar el

PRA-hsp65 con las pruebas bioquímicas de identificación demostrando la

aplicabilidad de esta técnica para el diagnóstico de la tuberculosis.

RECOMENDACIONES

Recomendaciones

39

7. RECOMENDACIONES

1. Incluir la técnica de PRA-hsp65 en el algoritmo de identificación de

Micobacterias empleado en el LNRTB del Instituto de Medicina Tropical ¨Pedro

Kourí¨

2. Estandarizar el PRA-hsp65 a partir de muestras biológicas con el objetivo de

disminuir, de manera considerable, el tiempo de diagnóstico de la tuberculosis.

3. Extender la aplicación de la técnica de PRA-hsp65 a la identificación de MNT

con la finalidad de evaluar su especificidad en comparación con las pruebas de

identificación bioquímicas.

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40

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ANEXOS

Anexos

ANEXO 1

• Patrones reportados por Chimara et al 2008

TESIS Reaccion Cadena Polimerasa Diagnostico Tuberculosis

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