Test de resistencia a ARV

Dra Cristina Marson

Hospital Rawson

HIV RESISTENCIA A DR.

Es la habilidad del virus VIH de entrar en

la célula humana y multiplicarse en presencia

de Drogas Antirretrovirales que usualmente

impiden su replicación

CUAL ES LA IMPORTANCIA

DE LA RESISTENCIA A ARV

Una de las primeras causas de falla de

tratamiento

Su aparición basal es causa de respuesta

sub-optima

Puede ser transmitida

Limita el uso de Dr. En el futuro

ORIGEN DE LA RESISTENCIA

La replicación del VIH es sujeta a errores 2º

a la ausencia de un mecanismo efectivo de

lectura a “prueba de errores”

Se genera un alto nº de mutaciones que

resultan en la producción de proteínas no

funcionales

Algunas mutaciones emergen en los sitios

blancos de los ARV

DEFINICIONES

Virus Salvaje: virus original, previo al inicio

de los ARV

Fitness viral: habilidad de un virus para

competir con otro virus en un ambiente

definido. Ej. virus resistente sobre el salvaje

Capacidad de replicación: se refiere a la

habilidad del virus a replicar puede aumentar

o disminuir con ciertas mutaciones

DEFINICIONES

BARRERA GENETICA: numero de

mutaciones especificas que son necesarias

para hacer a un virus resistente a un

medicamento especifico.

FALLO VIROLOGICO: supresión viral

incompleta, o rebote después de alcanzar los

limites de detección

ADHERENCIA : apego de las indicaciones

para la toma de los medicamentos

TRATAMIENTO ARV

Aumento de la expectativa de vida

Diagnostico temprano

Buenos tratamientos

Mejorar la calidad de vida

Régimen eficaz

Simplificado

Momento del inicio CD4 >500 Cel/mm3

Comienzo tardío <200 CD4

ESTRATEGIA DE

SIMPLIFICACION

Disminuir el nº de comprimidos

Frecuencia de dosis

Reducción cantidad de droga

Reducción en la complejidad

Mejorar adherencia

FACTORES RELACIONADOS

ÉXITO VIROLOGICOS

CV – CD4 Basal

Adherencia

Adicciones

Condición social

Edad del paciente

Tratamiento original

Toxicidad / Efectos adversos de las drogas

Calidad de la atención medica

REPUNTES VIROLOGICOS

TRANSITORIOS BLIPS

Valores de CV aislados y transitorios entre

>50 y 1000 copias/ml.-

No se asocian a mayor riesgo de fracaso

virológico

Ante la presencia de Blips debemos: evaluar

adherencia, y barrera genética TAR

Cuando es muy frecuente la presencia de

Blips algunos autores lo asocian a MR

DEFINICION DE FALLO

CLINICO: evento relacionado después de 3 meses

de TARV

INMUNOLOGICO: aumento de CD4,25-50 Cel/mm3

respecto del basal en 12 meses

VIROLOGICO: CV >50 copias/ml, confirmada con

una 2º medición de CV luego de 24 semanas de

haber iniciado el trat. ARV (o haberse modificado)

MALA ADHERENCIA

ATENCION MEDICA

TTO SUBOPTIMOS TOXICIDAD

INTOLERANCIA

PROVISION IRREGULAR

FARMACOCINETICA

FALLO

DEBEMOS ANALIZAR

SIEMPRE

Tipo de fallo

Tratamientos previos

Tiempo de tratamientos previos

Adicciones del paciente

Antec. personales

Enf. Oportunistas vs Marcadoras

Enf. concomitantes

Adherencia

Relación medico/paciente

Toxicidad / tolerancia

CV Y CD4 Basales y actuales

IMPACTO DE MULTIPLES TTO

ARV EN LA RESP. VIROLOGICA

ARV en pacientes naive

ARV en pacientes experimentados

ARV en pacientes en 1º Fallo

ARV en pacientes en 2º Fallo

ARV en pacientes multifallados

El 1º tratamiento debe ser el mejor…

PARA QUE EXISTA

RESISTENCIA

Generalmente se necesitan mas de 2 Mutaciones Relevantes

En el caso de IP de alta barrera genética mas de 3

TEST DE RESISTENCIA

Ensayo de secuenciamiento del Gen del VIH para detectar mutaciones que confieren RESISTENCIA a drogas

Antirretrovirales

¿Cuantas mutaciones se necesitan para

crear resistencia?

Mutaciones Sencillas: M184V (emtricitabina, lamivudine)

K65R (tenofovir)

L74V (didanosina)

K103N (NNRTI)

Mutaciones Múltiples: TAM’s (estavudina, zidovudine)

Protease (inhibidores de proteasas)

Para la mayoría de las drogas se necesitan varias mutaciones para crear resistencia (Barrera genética alta)

La resistencia no es “ todo o nada” - es un continuo entre total susceptibilidad a total resistencia.

TAMS ANALOGOS

TIMIDINICOS AZT-D4T

Vía Buena: K67N , K70R, K219Q/E

R de bajo nivel para: AZT,

Menor R cruzada

Vía Mala: M41L, T215Y, L210W

Mayor nivel de resistencia R: AZT, Aumento de la R cruzada Reduce la susceptibilidad a Tenofovir

Multirresistencia Q151, T69, 69SS

Debe tener mas de 4 TAMS

¿Que es la Resistencia Viral?

Una reducción de susceptibilidad continua al efecto

inhibitorio de la droga.

Mas Susceptible Mas Resistente

TIPOS DE RESISTENCIA

SELECCIONADAS O ADQUIRIDAS por

tratamiento 2º Secundarias

-Puede perdurar mas de un año

-Tienden a revertir a la forma salvaje

NATURALES O PRIMARIAS/

TRANSMITIDAS

-Previas al uso de fármacos debido a

variabilidad viral.

SUPRESION VIRAL

INCOMPLETA

RESISTENCIA A DR.

FRACASO DE TERAPIA ARV

FALTA DE ADHERENCIA

INTOLERANCIA A DR.

LA TOXICIDAD

NIVELES INSUFICIENTES DE DR.

COMO OCURREN LAS

RESISTENCIAS

R. a drogas ocurre cuando la disminución de la susceptibilidad es tan severa que el virus no responde al tto.

Un pte. puede estar R a todas las drogas incluyendo las que nunca utilizo

La R a drogas es causada por patrones complejos de Mutaciones

CUANDO OCURREN LAS

RESISTENCIAS

Cuando el virus tiene la oportunidad de

replicarse en presencia de concentración

SUBINHIBITORIA de la DR.

- No adherencia al tto

- Farmacocinética o interacciones

- que causan una exposición a dr.

inadecuadas

POR QUE ES IMPORTANTE

ENTENDER LA RESISTENCIA

R es el factor que mas limita la eficacia de

las dr.

Las pruebas de R pueden ayudar a mejorar

la respuesta al tratamiento

R a la Dr. A puede llegar a causar R cruzada

a la Dr. B

R puede limitar las opciones terapéuticas

RESISTENCIA A LA TERAPIA

ANTIRETROVIRAL

COMO OCURREN LAS RESISTENCIAS ?

VIH se replica a gran velocidad se estima en 10 billones de partic. virales diarias

VIH comete muchos errores [mutaciones] durante la replicación

Algunos errores reducen la susceptibilidad a Dr. ARV

Dinámica del Virus y Resistencia a Drogas

HAART

TIEMPO

Virus Salvaje

(susceptible a droga)

Virus Mutante

(resistente a droga)

CARGA VIRAL t

¿Por qué aparece carga viral si el

tratamiento me estaba funcionando?

TIEMPO

Re

pli

ca

ció

n V

iral

Sensitivo

100%

< 20%Resistente

0

El virus salvaje se replica

mejor que el virus

mutante en ausencia de

droga

El virus mutante se continua

replicando en presencia de

drogas.

Dinámica del Virus y Resistencia a drogas

Mono terapia o dual

TIEMPO

Virus salvaje

(susceptible droga)

Virus mutante

(resistente a droga)

Carga Viral t

Designación de letras para Aminoácidos

A Alanina I Isoleucina R Aspargina

C Citosina K Lisina S Serina

D Acido

Aspártico

L Leucina T Treonina

E Acido

Glutámico

M Metionina V Valina

F Fenilalanina N Aspargina W Triptofano

G Glicina P Prolina Y Tirosina

H Histidina Q Glutamina

IDENTIFICANDO LAS

MUTACIONES

M184V

184 posición del Codón

M Metionina Aminoácido salvaje ¨WILD

TYPE¨ (VIH que no ha sido expuesto a

drogas)

V Valina Aminoácido Mutante

METIONINA fue cambiado por VALINA

IDENTIFICANDO LAS

MUTACIONES

M184M Aa, salvaje en posición 184

M184V Aa mutante en posición 184

M184I Aa mutante en posición 184

M184M/V mezcla de Aa salvajes y mutantes en

posición 184

RESISTENCIA

RESISTENCIA PRIMARIA: es la observada en

pacientes sin experiencia previa a ARV

RESISTENCIA SECUNDARIA: es la presencia de

Mutaciones relevantes en pacientes

experimentados por presión de selección de dr.

Baja prevalencia de resistencia primaria

Transmisión global de cepas R en el mundo es del

9% aproximadamente

COMO SE MIDE LA

RESISTENCIA

IC50 es la concentración de droga

requerida para inhibir el 50% de la

replicación viral

Mientras mas baja IC50 mas Potente es la

droga

MEDICION DE RESISTENCIA

FOLD CHANGE

Nivel de cambio

IC50 paciente/IC50 control

Mayor nivel de cambio = A mayor R

RESISTENCIA GENOTIPICA

GENOTIPICA: cambio en el genoma viral

Detecta Mutaciones

FENOTIPO: mide la habilidad del virus

para crecer en diferentes concentraciones

de ARV

GENOTIPO

Detecta mutaciones

Interpretación: requiere conocimientos de las

Mutaciones seleccionadas y R cruzada

Sensibilidad: mayor sensibilidad para

detectar mezclas

Costo: relativamente bajo

FENOTIPO

Mide la habilidad del virus para crecer en

diferentes concentraciones de dr

Interpretación: visual por barras

Sensibilidad: refleja susceptibilidad de la

especie dominante

Mayor costo

RESISTENCIA FENOTIPICA

FENOTIPICA: es la reducción de la

susceptibilidad del virus frente a una Dr.

*Aumento de IC50 en relación a la cepa

Patrón, denominada FC fenotípica O CCO2

feno virtual

Cuantas veces cambio IC50 en la cepa

Patrón

TEST DE RESISTENCIA

META

Seleccionar drogas activas para un nuevo

régimen

Ayudar a las decisiones de tratamiento

Determinar si un virus Resistente fue

transmitido

METODOLOGIA

Amplificación del Gen TR y de la Proteasa

por RT-PCR

Secuenciamiento del ADN de ampliaciones

generados por Especies Dominantes

Las mutaciones están limitadas a aquellas

presentes en + 20% de Viriones Plasmaticos

CUANTAS MUTACIONES SE

NECESITAN PARA CREAR R

MUTACIONES SENCILLAS

M184V EMT 3TC

K65R TDF

L74V DDI

K103N NNRTI

MUTACIONES MULTIPLES

TAM´S D4T AZT

PROTEASAS IP

PARA LA MAYORIA DE LAS

DR. SE NECESITAN VARIAS

MUTACIONES PARA CREAR

RESISTENCIA

BARRERA GENETICA ALTA

*GENERALMENTE SON LOS IP

~ 9 kb

METODOLOGÍA PARA EL ESTUDIO DE RESISTENCIAS

pol (RT/PR)

Obtención de secuencias de gp41

Integrasa

Uso de diferentes programas para corrección y análisis de secuencias

Translación a una línea de amino ácidos

Doblado como una proteína funcional

RNA de VIH

Fenotipo

evalúa esto

Genotipo evalúa esto

Pruebas de Genotipo y Fenotipo

MÉTODOS GENOTÍPICOS: Secuenciación

PlasmaExtracción

RNA viral

RT-PCR

cDNA

Amplicones

Cebador marcado para

replicación

Cadena a secuenciar

4 mezclas de reacción que incluye

cada uno de los diferentes ddNTP

que paran la replicación

Productos de

la reacción de

replicación

Separación de

productos por

electroforesis

Electroferograma

RESISTANCE ANALYSIS

vircoTYPE REPORT

vircoTYPE page 1

SUSCEPTIBILIDAD

Sensible: IC50 4< Cepa Ref

Parc.Res:IC50 4-10 > Cep.Ref

Resistente: IC50 +10> Cep.Ref

FENOTIPO REAL

CAPACIDAD DE REPLICACION EN

CULTIVO FRENTE A DETERMINADAS

CONCENTRACIONES DE ARV.

PERMITE EL ANALISIS CUANTITATIVO DE

CONCENTRACION DE DR. QUE SERIA

NECESARIO PARA LA INHIBICION DE LA

REPLICACION DEL VIRUS

FENOTIPO VIRTUAL

Medición Cuantitativa estimada de susceptibilidad

No detecta poblaciones minoritarias menos del 20%

Provee CUT OFF clínicos obtenidos de una Base de datos, puntos de corte biológicos BCO

CUT OFF de Max, y Min, estandarizados

Capacidad de Replicación

La CR indica la habilidad del virus del paciente a

replicarse relativo a la mediana de la población de

virus salvaje (NL4-3)

La mediana del valor de CR de una

población salvaje de define como el

100%

MUTACIONES CLAVES INTR

M184V

TAMs mutaciones asociadas a los analogos

de la timidina

K65R

L74V

Mutaciones q confieren resistencia multiple:

complejo Q151M, inserción T69S

Mutaciones claves para INNTR

Baja barrera genética

Mas comunes K103N, Y181C

Reacción cruzada entre ellos

Otras mutaciones adicionales Y188L, L100I,

V106A, G190S/A, M230L (2 o mas

mutaciones resistencia amplia de clase)

Etravirina V90I, A98G, L100I ninguna se

asocia a resistencia de alto nivel

SCORE DE SUSCEPTIBILIDAD

DE ETRAVIRINA

Esta basado en análisis genotypico

El score esta basado por la suma de peso de

las mutaciones presentes

Monogram System , Tibotec system

Score interpretación:

0-2 Susceptible

2.5 – 3.5 Intermedia

> 4: mayor o igual Resistente

RILPIVIRINA INNTR

K101E, V189I, Y181C, V90I, H221Y,

E138K mas frecuente, resistencia cruzada

INHIBIDORES DE PROTEASAS

La mayoría IP tienen alta barrera genética

La disminución de la sensibilidad requiere la

acumulación de varias mutaciones

Atazanavir: I50L 184v y N88S

Darunavir: I50L, I54L/M,L76V

Lopinavir: V32I, I47V/A

Fosamprenavir I50V disminuye la

susceptibilidad a LPV y DRV

IP

Mutaciones múltiples afectaran a la mayoria

de los IP probados

Mutaciones mayores M46I, V82A/T/S, L90M

IP busteados con ritonavir aumenta la

barrera genética.-

INHIBIDORES DE LA

INTEGRASA Y CCR

Inhibidores de la Integrasa seleccionan

mutaciones especificas que les confieren

resistencia

Tres vias identificadas para Raltegravir

N155H

Q148K/R/H resistencia de alto nivel

Y143C/R

Resistencia cruzada con elvitegravir

RESISTENCIA AL MARAVIROC

Maraviroc: actúa bloqueando una de las

membranas de superficie de los CD4 y el

correceptor CCR5 el utiliza para unirse a ella

y penetrar en su interior.-

TROFILE co-receptor tropism assay

RT: K65R, 103N, M184V, Y181C

Hipersusceptibilidad a ZDV con

resistencia a TDF, ABC, 3TC, NVP

RECOMENDACIONES PARA

EL USO DE PRUEBAS DE R

FALLO TERAPUETICO

NO SUPRESION

SUPRESION INCOMPLETA

RESPUESTA LENTA

PACIENTES RECIENTEMENTE

INFECTADOS EMBARAZADAS

RECORDAR

El paciente debe estar con tratamiento ARV

mínimo 20 a 30 días

En lo posible con el mismo tratamiento que

esta en fallo

Debe tener mas de 1000 copias en su CV

para considerar fallo

ANALIZAR el test de resistencia

conjuntamente con los test previos si los

hubiere

RECORDAR

Utilizar base de datos

Realizar los cambios lo mas pronto posible

Reforzar la adherencia

Siempre utilizar por lo menos 2 dr nuevas

activas

ALGORITMOS RESISTENCIA

http://hivdb.stanford.edu

http://www.iasusa.org/resistance-

mutations/mutations-figures.pdf

http://resdb.lanl.gov/Resist DB/default.htm

http://www.iasusa.org/resistance

MUCHAS GRACIAS!!!