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Red de Revistas Cientficas de Amrica Latina, el Caribe, Espaa y Portugal

Acosta-Salinas, Rosalinda;Estrada-Chvez, Ciro;Milin-Suazo, Feliciano

Tipificacin de cepas de Mycobacterium bovis. Revisin

Tcnica Pecuaria en Mxico, Vol. 47, Nm. 4, octubre-diciembre, 2009, pp. 389-412

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrcolas y Pecuarias

Mxico

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Tcnica Pecuaria en Mxico

ISSN (Versin impresa): 0040-1889

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Instituto Nacional de Investigaciones Forestales,

Agrcolas y Pecuarias

Mxico

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TIPIFICACIN DE CEPAS DE Mycobacterium bovis. RevisinTc Pecu Mx 2009;47(4):389-412

Tipificacin de cepas de Mycobacterium bovis. Revisin

Genotyping methods for Mycobacterium bovis. Review

Rosalinda Acosta-Salinasa, Ciro Estrada-Chvezb, Feliciano Milin-Suazoc

RESUMEN

La tuberculosis bovina es una zoonosis que produce grandes prdidas a la economa de muchos pases y constituye un problemade salud pblica. Su epidemiologa resulta muy compleja debido a que se trata de una bacteria de lento crecimiento, que puedepermanecer de forma latente y afectar a diversas especies animales, incluyendo fauna silvestre que funge como reservorio. Poreste motivo en todo el mundo existe la necesidad de genotipificar de manera precisa las cepas de M. bovis y rastrear el origende la infeccin. En la actualidad existen tcnicas de genotipificacin sustentadas en marcadores genticos polimrficos condistinta estabilidad gentica, entre los que se cita a los RFLP, Spoligotyping y VNTRs. Su factibilidad, reproducibilidad yutilidad para crear bases de datos dinmicas que coadyuven al control de la TBB se discuten en este trabajo.

PALABRAS CLAVE: Genotipificacin, Spoligotyping, VNTRs, Tuberculosis bovina, Mycobacterium bovis.

ABSTRACT

Bovine tuberculosis (BTB) is a zoonotic disease that causes big losses to the livestock industry and represents a risk to publichealth in many countries. The epidemiology of BTB is quite complex, the bacilli grows very slowly, it can remain in dormancyfor long periods of time and affects different animal species; including non-reservoir wildlife. Because of this, internationalefforts have been focus on developing genotyping techniques for better understand the epidemiology of the disease and traceback sources of infection. Nowadays, genotyping is based on the polymorphism of genetic markers with variation in stability.In this paper, the role of RFLP, spoligotyping and VNTR in genotyping M. bovis is discussed. The possibility of creatingnational and international dynamic databases of genotypes that support policies to eradicate the disease from cattle is analyzed.

KEY WORDS: Genotyping, Spoligotyping, VNTR, Bovine tuberculosis, Mycobacterium bovis.

Recibido el 30 de octubre de 2008. Aceptado para su publicacin el 6 de mayo de 2009.

a) Centro de Investigaciones en Ciencias Veterinarias. Instituto de Ciencias Agropecuarias, UAEH.

b) Centro de Investigacin y Asistencia en Tecnologa y diseo del Estado de Jalisco A.C. (CIATEJ, A.C. ), Unidad de Biotecnologa, Av. Nor malistas 800, Col. Colinas dela Normal, 44270 Guadalajara, Jalisco, Mxico. [email protected]. Correspondencia al segundo autor.

c) Centro Nacional de Investigacin Disciplinaria en Fisiologa, INIFAP.

CONACYT-SAGARPA-2004-C01-161/C-1

INTRODUCCIN

La tuberculosis bovina (TBB) es una enfermedadbacteriana crnica causada por Mycobacteriumbovis, que se caracteriza por producir granulomasen diferentes rganos, especialmente pulmones yndulos linfticos de varias especies animales y elhombre. Es una enfermedad zoontica que puedeser adquirida por la ingestin de leche sinpasteurizar o derivados de sta, por lo quetrabajadores de establos, de rastros y veterinarios

son considerados poblaciones de alto riesgo(1,2).La va de infeccin ms frecuente es la respiratoria,

INTRODUCTION

Bovine tuberculosis (BTB) is a chronic diseasecaused byMycobacterium bovis whose characteristicis the presence of tubercles in different organs,especially lungs and lymph nodes from differentanimal species and man. The disease is a zoonosisthat can be acquired by ingesting no pasteurizedmilk or fresh cheese elaborated with contaminatedmilk; farm and abattoir workers and veterinariansare considered high-risk populations(1,2). The main

route of infection is the respiratory route; however,the oral route may also be important. Lesions in


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por exposicin a microaerosoles cargados conbacilos, pero tambin puede ser entrica. Las lesionesen el tracto digestivo son comunes en animalescarnvoros que ingieren su alimento contaminado(1).

En la actualidad la importancia de la tuberculosisbovina en Mxico radica en que representa unriesgo para la salud pblica y en que se haconvertido en una barrera no arancelaria para elcomercio internacional(1,2). La participacin de M.bovis en casos de TB humana en algunas regionesde Mxico se ha estimado hasta en un 7 %(3),mientras que en la zona fronteriza sur de los EstadosUnidos la proporcin llega al 40 %(4). Por ser stauna enfermedad que limita el comercio, los canalestradicionales internos de comercializacin de

animales se han visto afectados como consecuenciade su presencia en el ganado y la vulnerabilidad alas presiones comerciales internacionales es latente.Por esto, la mayora de los pases afectados cuentancon programas nacionales para eliminar laenfermedad.

La estrategia para el control de la tuberculosis enel humano es la vacunacin de infantes y la terapia;sin embargo, esta estrategia no est disponible enel ganado. La vacunacin no se usa porque larespuesta inmune interfiere con las pruebas de

campo y los tratamientos antimicrobiananosresultaran extremadamente costosos eincrementaran el riesgo de desarrollar cepasresistentes. M. bovis presenta resistencia natural ala pirazinamida, usada en la terapia de cortaduracin (DOTS) recomendada por la OrganizacinMundial de la Salud (OMS), que incluye isoniazida,rifampizina, estreptomicina y etambutol(5 ).Lamentablemente, la estrategia DOTS deja de serla opcin teraputica para pacientes infectados concepas multirresistentes a pirazidamida o algn otro

de estos cinco antibiticos(6)

. La posibilidad deimplementar la vacunacin en el ganado y dediferenciar infecciones causadas por M. bovis enpacientes son razones epidemiolgicas deimportancia para identificar las especies delcomplejo de M. tuberculosis.

La epidemiologa de la TBB en el mundo se hacomplicado por la participacin de la fauna silvestre

the digestive tract are common in carnivorousanimals that eat contaminated food(1).

BTB represents a risk to public health and is oneof the most important non-tariff barriers for

international trade of cattle(1,2). Human cases ofTB by M. bovis in some parts of Mexico havebeen estimated in 7 %(3). In the San Diego areain the United States this proportion is 40 % (4).Presence of TB in cattle greatly reduces trade,eliminates traditional channels of marketing fordomestic animals, limits genetic improvement oflivestock and reduces exportation. Currently, mostaffected countries have national programs toeliminate the disease.

The main strategy for controlling tuberculosis inhumans is vaccination of infants and therapy.However, none of these is available in cattle:vaccination is not used because the immune responseinterferes with field testing, and treatment isexpensive and increases the risk of resistant strains. M. bovis is resistant to pirazinamide, which isused in short-time directly observed treatments(DOTS), recommended by the World Healthorganization (WHO), which also includes isoniacide,rifampicine, streptomycin and ethambutol(5).Unfortunately, DOTS is not the best option for

patients with resistantance to pirazinamide orresistance to any of the other five drugs againstTB(6). Opportunities to use vaccination against TBin cattle and to differentiate infections by M bovisin patients are good epidemiological reasons todifferentiate species of theM. tuberculosis complexspecies.

The epidemiology of BTB in the world has beencomplicated by the involvement of wildlife inpersistence and spread of the bacilli. For example,a problem considered particular of cattle in New

Zealand has spread to possums(7), to badgers inIreland and the United Kingdom(8,9) and to deer inthe United States(10,11); the jump of M. bovis toother species seem to increase virulence. Othercountries may be experiencing wildlife infectionsbut the lack of studies might be masking theproblem. International trade of animals as aconsequence of globalization increases the risk of


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en la persistencia o en la diseminacin de laenfermedad. Un problema que se considerabaespecial de los bovinos se ha propagado a lazarigeya en Nueva Zelanda(7), el tejn en Irlanday el Reino Unido(8,9) y el venado en los Estados

Unidos(10,11). El salto del agente etiolgico entreespecies parece incrementar la virulencia de lascepas. Otros pases pueden estar experimentandola participacin de la fauna silvestre en ladiseminacin de la enfermedad, slo que la faltade trabajos no ha permitido la identificacin delproblema. El comercio internacional de animalesincrementa el riesgo de la diseminacin de cepas,aunque no se sabe la repercusin de stas en lavirulencia y diseminacin del agente.

Todo lo anterior hace patente la necesidad deincrementar el arsenal tecnolgico para combatir laenfermedad, a la vez que se entiende mejor suepidemiologa. Se requiere de estudios epidemiolgicosms precisos que permitan definir el origen de lainfeccin, identificar las cepas de mayor prevalenciapor regin geogrfica, medir el riesgo de lamovilizacin de animales y su efecto en ladistribucin de la enfermedad; as como realizarestudios poblacionales y filogenticos, asociar elgenotipo bacteriano con su fenotipo y caracterizarel grado de patogenicidad y virulencia de las

diferentes cepas. Es necesario integrar bases dedatos accesibles, de uso fcil, flexibles y coninformacin detallada de las cepas obtenidas. Lagenotipificacin deber estar basada en criterios detipificacin que sean homogneos, reproducibles,con amplio poder de discriminacin entre casos sinrelacin y con una concordancia alta con eldiagnstico convencional.

GENOMA DE MYCOBACTERIUM BOVIS

Con tcnicas inmunolgicas y de biologa molecularse ha determinado la enorme similitud existente entrediversas micobacterias causantes de tuberculosis;algunas de ellas, las de mayor similitud, se hanagrupado en lo que se conoce como complejo M.tuberculosis, que incluye a: M. tuberculosis, M.africanum. M. microti, M. pinipedii, M. caneti, M.bovis y M. caprae. M. bovis posee un genoma de4,345,492 pb, con 4,003 genes que codifican para

spreading tuberculosis; however, up to now it isnot well known the impact of this spreading onvirulence changes of the bacillus.

To better understand the epidemiology of

tuberculosis and to increase the probabilities ofsuccess of eradicating this disease, it is necessaryto increase also the battery of technologies available.Epidemiological studies are required to preciselydefine sources of infections, to identify prevalentstrains in specific geographic regions, to evaluatethe risk of moving animals between regions andthe effect of this on the distribution of the disease.It is also important to perform population andphylogenetic studies, correlate bacterial genotypewith phenotype and to characterize the degree ofpathogenicity and virulence. There is a need forintegrating databases which are accessible, user-friendly, flexible, and detailed enough to be useful.Genotyping should be based on criteria which are:homogeneous, reproducible, with high power ofdiscrimination between unrelated strains and highcorrelation with conventional diagnosis.

MYCOBACTERIUM BOVIS GENOME

A high degree of similarity has been establishedbetween Mycobaterium that cause tuberculosis,

throughout immunological and moleculartechniques. Some of these techniques, the one swith the highest level of similarity, have beengrouped in what is known as M. tuberculosisComplex. This complex includes M. tuberculosis,M. africanum. M. microti, M. pinipedii, M. caneti,M. bovis andM. caprae. M. bovis has a 4,345,492bp genome, 4.003 to 3.952 genes that encodeproteins and 50 structural RNAs. The genome alsoincludes a phago and 42 insertion sequences (IS)(http://www.sanger.ac.uk/Projects/M_bovis/).

Structurally, M. bovis also contains about 65 % G+ C combination, which is reflected in the contentof basic amino acids of proteins, mostly enzymesfor metabolism of lipids in the cell wall, such asmycolic acids(12).

The genome of M. bovis is 99.95 % identical tothat of M. tuberculosis, but the size has beenreduced due to deletions, -events considered unique


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3,952 protenas y 50 RNAs estructurales, incluyeun profago y 42 secuencias de insercin (IS) (http:/ / w w w . s a n g e r . a c . u k / P r o j e c t s / M _ b o v i s / ) .Estructuralmente M. bovis adems, contieneaproximadamente 65 % de G+ C, lo que se refleja

en el contenido de aminocidos bsicos de susprotenas, en su mayora enzimas necesarias parael metabolismo de lpidos constitutivos de su paredcelular, tales como los cidos miclicos(12).

El genoma de M. bovis tiene ms del 99.95 % deidentidad con M. tuberculosis, pero su tamao seha reducido debido a deleciones, eventos consideradosnicos y unidireccionales en las bacterias: larecombinacin gentica en micobacterias es un eventoraro. As como tampoco hay evidencias detranslocacin, duplicacin e inversiones, posiblementedebido a su lento crecimiento. La ausencia demecanismos de intercambio gentico, como laconjugacin o la transformacin se le considera comoel origen de la similitud entre las especies delcomplejoM. tuberculosis. Algunas teoras suponenque evolucionaron como patgenos no hace muchotiempo, con la aparicin de los primeros homnidosen frica oriental(13,14).

La mayora de los cambios del genoma del complejoM. tuberculosis se han asociado a elementos mviles

como las IS, constituidas por fragmentos pequeosde DNA capaces de auto-insertarse dentro del genomade la micobacteria y conferir polimorfismo entre lascepas. No obstante, en cepas de M. bovis estepolimorfismo se asocia a deleciones de IS, puescomnmente, poseen una sola copia(12,15,16). Existenal menos cinco tipos de secuencias repetidas asociadasa la diversidad gentica de cepas del complejo M.tuberculosis, entre ellas las secuencias en tndem ricasen GC (PGRS) y las secuencias repetidas en serie denmero variable (VNTR). Estos ltimos agrupanvariantes, como son las secuencias polimrficasrepetidas principales en serie, (MPTR), las secuenciasrepetidas exactas en serie (ETR) y las unidadesrepetidas dispersas deMycobacterium (MIRU)(17-20).

PRINCIPIOS DE LA GENOTIPIFICACIN

La genotipificacin de las micobacterias se basa enel principio de la estabilidad gentica por su

and unidirectional in bacteria; genetic recombinationin Mycobacterium is uncommon. There is noevidence either of translocation, duplication andinversions, probably due to its slow growth. Theabsence of genetic exchange mechanisms, such as

conjugation or transformation is considered theorigin of similarity between species of the M.tuberculosis Complex. Some theories assume thatthey evolved as pathogens not long ago, withemergence of early hominids in East Africa(13,14).

Most changes in the genome of M. tuberculosishave been associated with mobile elements such asinsertion sequences (IS), which are small fragmentsof DNA capable of auto-insert into the genomeand confer polymorphism among strains. However,polymorphism of M. bovis is more associated todeletions of IS, since they have a single copy(12,15,16).There are at least five types of repeated sequencesassociated with genetic diversity of strains of the M.tuberculosis complex, including tandem GC-rich(PGRS) sequences and variable number tandemrepeats (VNTR). The latter group of variants suchas major polymorphic tandem repeat (MPTR), theexact tandem repeat (ETR) and Mycobacteriuminterspersed repeated units (MIRU)(17-20).

PRINCIPLES OF GENOTYPING

Genotyping ofMycobacterium is based on the principleof genetic stability due to asexual reproduction, whichallows to the bacillus to create clones: bacteria withthe same genetic information. Therefore, it is assumedthat strains with the same genotype have the sameorigin and that strains with different genotypescome from different sources(14,17,18); based onthis, traceability is possible. Throughout genotypingcan be establish if a recently introduced animal isresponsible for an outbreak, if an outbreak comes

from the reactivation of latent infections in falsenegative animals or if infection comes from reservoirs.Nevertheless, it is important to remember that bacteriaare susceptible to change after a number of no lethalreplications occur. In this case, survival of thebacteria is possible and a new genetic line arises.

Genotyping requires polymorphic markers toidentify minor differences between strains. Some


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reproduccin asexual, donde una bacteria da origena clonas: bacterias con la misma informacingentica. De este modo, se deduce que cepas demicobacterias con idntico genotipo tienen el mismoorigen y que cepas con genotipo diferente provienen

de lugares diferentes(14,17,18). La rastreabilidad,con el principio de estabilidad gentica, permitedeterminar si un animal recientemente introducidoes el causante de un brote de tuberculosis.Asimismo, se puede analizar si el brote deriv dela reactivacin de la infeccin latente en animalesfalsos negativos, desapercibidos por la falta desensibilidad del diagnstico o si proviene de lainfeccin en reservorios silvestres. No obstante,las bacterias son susceptibles de experimentarmutaciones despus de un nmero indeterminado

de replicaciones, que si stas no afectan elfuncionamiento de enzimas esenciales o de protenasestructurales, permiten la sobrevivencia de lasbacterias y la herencia del cambio a su descendencia,dando origen a nuevas lneas genticas.

La genotipificacin requiere marcadorespolimrficos que definan diferencias sutiles entrelas diversas cepas. Algunos de estos marcadoresson capaces de detectar polimorfismos y distinguira la cepa como una clona diferente, pero no todoslos marcadores son capaces de detectar dichas

diferencias. Por lo tanto, para genotipificar cepasde micobacterias se debe de considerar el cambioque cada marcador es capaz de detectar de maneraefectiva. Se deben seleccionar marcadores genticosdependiendo de su tasa de mutacin(17,18,19,21),ya que si el reloj molecular de la mutacin marcadaes demasiado rpido ( 2 aos), existe el riesgo deque el nmero de cepas sea sobre-estimado y si esmuy lento ( 100 aos) el riesgo es de una sub-estimacin. Por lo tanto, el marcador ideal debeser de estabilidad media, capaz de discriminar cepas

sin sesgos severos en la estimacin(17-20)

.La importancia de la tuberculosis como unaenfermedad re-emergente ha favorecido el desarrollode numerosas tcnicas de genotipificacin para M.tuberculosis y M. bovis. Algunas de estas tcnicasinvolucran todo el genoma en el anlisis, otrasnecesitan gran cantidad de ADN de buena calidad(1 g), lo que representa un problema por el

of the markers are able to detect polymorphismand distinguish specific clones; however, not alldetect clones; thus, to appropriately genotype strainsit is necessary to consider the changes in the strainthat each marker is able to detect. Thus, geneticmarkers should be selected depending on the rateof mutation(17,18,19,21). On the one hand, if themolecular clock of mutation is marked too fast (2 yr), there is a risk that the number of strains isover-estimated, on the other hand, if it is too slow( 100 yr), the risk is a sub-estimation. Therefore,the ideal marker should be half of stability, whichcan discriminate strains without severe bias in theestimation(17-20).

The importance of tuberculosis as a re-emerging

disease has encouraged the development ofnumerous techniques for genotypingMycobacterium .Some techniques involve the whole genome in theanalysis and some others require large amounts ofDNA ( 1 g), which is a problem becauseMycobacterium grows slowly. Some techniques arebased on the polymerase chain reaction (PCR) forthe analysis of polymorphic loci. Those have betterdiscrimination power and require minimum amountsof DNA (< 1 ng); besides, amplify a few viablemicroorganisms impossible to recover by culture

(Figure 1)(17,18,19)

.

Genotyping with restriction endonucleases. One ofthe first techniques for genotyping is formerlyknown as genomic footprints or fingerprints, whichconsists of banding patterns obtained by cuttinggenomic DNA with restriction enzymes; forexample, PvuII or AluI(22,23,24). The fragments(30 to 50 kb) are then separated by pulsed fieldelectrophoresis (18 h). Because the process islaborious, the fact that requires a large number ofbacilli and that the discrimination power is poor,

the technique has been disposed. The technique iscommonly known as restriction fragment lengthpolymorphism (RFLP) and it has been widely usedto link outbreaks to sources of infection and tostudy transmission between species(25-28). Probeshave been used against various targets, the mostcommon for M. tuberculosis are: IS6110, PGRS-RFLP and DR-RFLP.


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lento crecimiento de las bacterias. Por otro lado,existen tcnicas basadas en la reaccin en cadenade la polimerasa (PCR, por sus siglas en ingls)para el anlisis de loci polimrficos que tienenmayor poder de discriminacin, requieren una

cantidad mnima de ADN (< 1 ng) y permitenamplificar muestras con microorganismos pocoviables o imposibles de recuperar, como es el casode las micobacterias latentes (Figura 1)(17,18,19).

Genotipificacin con endonucleasas de restriccin

Una de las primeras tcnicas de genotipificacinen los organismos es la antes denominada huellagentica o fingerprint, que consiste en obtenerpatrones de bandeo a partir del DNA genmicocortado con endonucleasas de restriccin; por

ejemplo, PvuII o AluI(22,23,24) . Esta tcnicainvolucra el anlisis del genoma completo de lamicobacteria, donde se utilizan endonucleasas consecuencias consenso de corte poco frecuente, loque produce fragmentos largos (30 a 50 kb). Estosfragmentos son separados mediante electroforesisen campos pulsados (18 h). Lo laborioso delproceso de este tipo de tipificacin y la grancantidad de ADN requerida ha provocado su desuso.Esta tcnica es comnmente conocida comofragmentos de restriccin de longitud polimrfica

(RFLP) y ha sido ampliamente utilizada pararelacionar brotes de tuberculosis a focos de infeccinespecficos o estudiar la transmisin de laenfermedad entre especies(25-28). Las sondasutilizadas han sido dirigidas contra diversos blancos,entre las ms frecuentes paraM. tuberculosis estn:IS6110, RFLP-PGRS y RFLP-DR.

RFLP-IS6110

El RFLP-IS6110 es el mtodo ms usado debido aque analiza al elemento IS6110 integrado en diversosloci del genoma de las especies del complejo M.tuberculosis, comnmente en hot spots, tales como:las secuencias de repeticin directa (DR), el locusipl y la regin intergnica dnaA-dnaN. Estemarcador es considerado estndar de oro para laevaluacin de nuevos mtodos de tipificacin decepas de M. tuberculosis. Algunas cepas de M.tuberculosis llegan a presentar hasta 25 copias. Enla IS6110 existe una secuencia consenso para la

IS6110-RFLP typing

IS6110-RFLP is the most common method fortyping M. tuberculosis. It analyzes the elementIS6110 integrated at various loci of the genome,usually located in hot spots, such as the directrepeat sequences (DR), the ipl locus andintergenerational dnaA-dnaN regions. This flagis considered the gold standard for evaluating newmethods for genotyping M. tuberculosis. Strains ofM. tuberculosis have up to 25 copies of the elementIS6110, which is located in a consensus sequencefor the restriction enzyme PvuII; therefore, whenthe Mycobacterium DNA is cut, a specific patternof bands is formed. The number and size of bandsdepends on the number of copies of IS6110, thelocation and the distance between cuts in the genome

Figura 1. RFLP-IS6110. Los patrones de restriccin

obtenidos con la enzima PvuII se evidencian por medio

de la hibridacin con la sonda que reconoce la IS6100.

Secuencias repetidas directos (DR), secuencias repetidas

inversos (IR)

Figure 1. RFLP-IS6110. The restriction patterns were

gotten with PvuII and hybridization with a probe directed

to IS6110. Direct repeated sequences (DR), inverse

repeated sequences (IR), Open reading fremes (ORF)

Figure taken from Gutirrezs talk, MTET Course 2005-

2006- Pasteur Institute.


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(Figure 2). To reveal the fingerprint, the slicedDNA is passing throughout agarose gels byelectrophoresis and transferred to a nylonmembrane, where it hybridizes to biotinylatedDNA-fragments (probes) complementary to the

sequence 3' of the IS6110 element.

The number and location of the IS6110-RFLP makea good typing method for M. tuberculosis, however,in the case ofM. bovis, it has serious limitations.First of all, M. bovis has a reduced number ofIS6110 copies (five), depending on the species.This fact, in addition to the large quantities ofpure DNA required and the need for skilledpersonnel, the method is barely used to genotype

enzima de restriccin PvuII, por lo tanto, al cortarel ADN de las micobacterias se forma un patrnde bandas especfico que depende del nmero decopias y los cortes en el genoma (Figura 2), ascomo a su localizacin, la distancia entre los sitios

de corte y la longitud de cada banda. Para revelarel patrn, el DNA cortado se somete a electroforesisen agarosa y se transfiere a una membrana denylon, para hibridar los fragmentos con una sondabiotinilada complementaria a la secuencia 3 delIS6110, inmediata posterior a la secuencia consensode la PvuII.

El nmero y la localizacin de las copias de IS6110hacen del RFLP un buen mtodo de tipificacinpara M. tuberculosis, sin embargo, en el caso de M. bovis presenta algunas limitaciones, dado queesta micobacteria presenta entre una y cinco copias;comnmente localizadas en el locus DR,dependiendo de la especie de origen. Esto, aunadoa que se requieren grandes cantidades de ADNpuro y a la necesidad de personal calificado, hacende ste un mtodo poco til para tipificar cepas deM. bovis. Adems, la estabilidad y la rastreabilidaddel RFLP-IS6110 es dudosa: el cambio de una oms bandas es frecuente en aislamientos de pacientescuya re-infeccin era poco probable, sugiriendoque su reloj gentico es de aproximadamente 3.2

aos (Cuadro 1). En un intento por compensar estainestabilidad se agrupan cepas con una banda dediferencia, pero la interpretacin inter-laboratorioses muy variable(23-31).

Polimorfismo de secuencias ricas en GC (PGRS)

En cepas de bacterias del complejo M. tuberculosis,con pocas copias del IS6110, se recurre al anlisisde otras regiones distribuidas mltiples veces en sugenoma: tal es el caso de aqullas ricas en lasbases guanina y citocina (G+ C, 66 %) agrupadasen secuencias repetidas cortas de 24 pb, llamadassecuencias polimrficas ricas en GC (PGRS)(32).Para identificar este tipo de secuencias se digiereel ADN con AluI y los fragmentos obtenidos sehibridan con el plsmido pTBN12, que contieneuna secuencia PGRS clonada de 3.8 Kb del genomadeM. tuberculosis H37Rv. La estabilidad reportadade este marcador es de aproximadamente 3.5 aos,

Figura 2. Los productos de amplificacin de las secuencias

espaciadoras entre los repetidos directos son hibridados

con sus secuencias complementarias inmovilizadas en

una membrana y detectados por quimioluminiscencia

Figure 2. Spoligotyping method. The spacer sequences

amplified between direct repeat sequences are hybrid to

complementary sequences fixed in a membrane and

detected by quimioluminicense

Figure taken from the Hasss talk, MTET Course 2005-2006. Pasteur Institute.


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similar a la observada para IS6110 y con los mismosproblemas tcnicos (Cuadro 1). Una desventajaadicional es que las PGRS no son especficas delcomplejo M. tuberculosis y en M. bovis suinterpretacin es ms complicada, pues aunque es

ms sensible para diferenciar entre aislamientoscon una sola copia de IS6110, por lo generalmuestra patrones de bandeo de polimorfismomoderado, es menos reproducible y sumamentelaboriosa(26,27,28,30,32).

Otros RFLP

Ninguno de los marcadores RFLP mencionados(IS6110, PGRS o MPTR) posee el polimorfismoadecuado para la diferenciacin precisa de cepas de M. bovis, por lo que otros mtodos han sido

probados. El polimorfismo de las secuencias derepeticin directa del locus DR es otro marcadorusado para genotipificar cepas de M. bovis conpocas copias de IS6110. Las secuencias DR serepiten a lo largo del genoma y entre sus secuenciasrepetidas de 36 pb se localizan espaciadores desecuencias nicas que varan de 36 a 41 pb delongitud. Para identificarlos tambin se digiere conAlu I y los fragmentos obtenidos se hibridan conla sonda DR(33). La estabilidad de este marcadores de aproximadamente 10 a 20 aos y su

polimorfismo se presenta por delecin de secuenciasrepetidas y secuencias adyacentes (Cuadro 1). ElRFLP-DR es ms estable y al ser multicopia, sudeteccin es ms sensible que la deIS6110(19,22,29,30).

El RFLP-pUCD es otro marcador que requierecortar el ADN con Alu I y su posterior hibridacincon el plsmido pUCD, que contiene un insertogenmico de M. bovis con una serie de cincounidades de secuencias repetidas perfectas de 69pb y tres copias de otra regin de secuenciasrepetidas; identificados como parte de la familiagnica de protenas ricas en prolina-prolina-glutamato (PPE), ampliamente dispersa en elgenoma de las micobacterias(34,35,36). Otro RFLPreportado usa DNA digerido con EcoR1 y comosonda la secuencia promotora PAN de M.paratuberculosis, localizada adyacente a la secuenciaterminal 3 del elemento de insercin 900 (IS900).

M. bovis. More than that, stability and traceabilityof IS6110-RFLP has been questioned: a change ofone or more bands is common in isolates from patientswhose re-infection was unlikely, suggesting that thegenetic clock is about 3.2 yr (Table 1). In an

attempt to compensate for instability, strains witha band difference are group together, but theinterpretation inter-laboratory is highly variable(23-31).

GC-rich sequence polymorfism (PGRS)

Because of the low copy number of IS6110 in M.bovis, other genotyping methods have been tried.The GC-rich sequence polymorfism method (PGRS)is based on the analysis of G-C rich regions of theMycobacterium genome. These are guanine andcytokine (G + C, 66 %) rich areas grouped into24 short repeated base pairs distributed multipletimes in the genome(32). In this method, DNA isdigested with the enzyme AluI and fragmentshybridized to the pTBN12 plasmid, which containsa PGRS sequence cloned: 3.8 Kb of the genome of M. tuberculosis H37Rv. Stability of this marker isapproximately 3.5 yr, similar to that observed forIS6110. Technical problems between PGRS andIS6110-RFLP are quite similar (Table 1). Additionaldisadvantages are that PGRS is not specific for M.

tuberculosis and M. bovis, interpretation of theresults are complicated due to the moderate

Cuadro 1. Valores de reproducibilidad y capacidad de

discriminacin usando diversos marcadores genticos

Table 1. Reproducibility values and discrimination capacity

using diverse genetic markers

Binary code Octal code

0 000 0

0 001 1

0 010 2

0 011 3

0 100 4

0 101 5

0 110 6

0 111 7


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polymorphism of bands, it is extremely laboriousand has poor reproducibility. Nevertheless, PGRSis more sensitive for differentiating isolates with asingle IS6110 copy(26,27,28,30,32) .

Direct repeat (DR) sequence polymorphism.Polymorphism of the DR locus is another markerused to genotype M. bovis strains with low copynumber of IS6110. DR are sequences that repeatthroughout the genome with spacers in-between.These are unique sequences ranging from 36 to 41pb long. To identify these markers, DNA is digestedwith Alu Iand fragments hybridized to the DRprobe(33). Genetic stability of this marker is about10 to 20 yr and the polymorphism is a consequenceof deletions of repeated sequences and sequencesadjacent to each other (Table 1). DR-RFLP is morestable and, because of the large number of DRcopies, it is more sensitive than the IS6110-basedmethods(19,22,29,30).

RFLP-pUCD is another marker that works bycutting the DNA with AluI. The DNA is cut withthe enzyme and fragments hybridize to the pUCDplasmid, which contains an insert of genomic M.bovis with series of five units perfect repeatedsequences 69 bp long and three copies of anotherregion of repeated sequences, -identified as part of

the gene family of protein-rich Proline-Proline-glutamate (PPE), widely dispersed in the genomeofMycobacterium(34,35,36). Another RFLP reportedis the one that digest DNA with EcoR1 and usesas a probe sequence the promoter sequence PANofM. paratuberculosis, located next to the terminalsequence 3' from the insertion element IS900. PANis present in M. bovis, M. bovis BCG and M.tuberculosis and has a 70 % identity with thesequence of PAN M. paratuberculosis. PAN locusis located near the terminal sequence 3' of the

polymorphic region of DR1 of M. bovis and M.tuberculosis. This polymorphism allowsdifferentiating between BCG vaccine strains(11).

In general, other than the IS6110 restriction fragmentsmentioned are multicopy in M. bovis, which is anadvantage for discrimination of strains, but its stabilityis not well known (Table 1). The main disadvantageof RFLP and any of the target sequences analyzed

El locus PAN se presenta en M. bovis, M. bovisBCG y M. tuberculosis y tiene una identidad del70 % con la secuencia PAN deM. paratuberculosis.El locus PAN est localizado cerca de la secuenciaterminal 3 de la regin polimrfica DR1 de M.bovis yM. tuberculosis, y su polimorfismo permitediferenciar entre las cepas vacunales BCG(11).

En general, los otros RFLP mencionados distintosal IS6110 son multicopia enM. bovis, lo que puedeser una ventaja para la discriminacin de cepas,pero no se ha determinado con precisin suestabilidad (Cuadro 1). Las principales desventajasdel RFLP y por tanto, para cualquiera de lassecuencias blanco analizadas mediante esta tcnica,son requerir demasiado DNA, de calidad y purezaexcelentes, sin degradacin, ni contaminacin conDNA de otra especie, as como tambin, la excesivalaboriosidad del procedimiento. Adems, dependede comparar patrones de bandeo completos, lo quehace imposible la creacin de bases de datos y laautomatizacin del anlisis.

Genotipificacin con PCR

Los mtodos de tipificacin basados en la PCRtienen la caracterstica de requerir cantidadesmnimas de ADN, incluso parcialmente degradado

y mezclado con ADN de otras especies, la cualpuede ser amplificada haciendo ms factible, rpida,estable y verstil la genotipificacin. En el caso demicobacterias del complejo M. tuberculosis sehicieron intentos por amplificar las regionesdescritas en RFLP, pero los mltiples problemasexperimentados, principalmente la pobrereproducibilidad, hicieron que se desechara la ideade los PCR-RFLP(37,38).

Tipificacin de oligonucletidos espaciadores

(Spoligotyping)

En la actualidad una de las tcnicas ms utilizadaspara la genotipificacin de micobacterias delcomplejo M. tuberculosis es Spoligotyping. Estemtodo se basa en la presencia o ausencia devariantes de DR (DVR, por sus siglas en ingls).Las DVR se componen de una secuencia repetidade 36 pb conservada y de una secuencia espaciadoravariable de 35 a 41 pb: el blanco de la tipificacin


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es esta regin variable. A la fecha se han reportado94 diferentes espaciadores entre los DR: elcromosoma de la cepaM. tuberculosis H37Rv tiene48 DVR y el de M. bovis BCG 41. De este modo,para la genotipificacin se utilizan de manera

rutinaria 43 espaciadores, 37 de H37Rv y 6 deBCG. Como ya se mencion, las secuencias deinsercin IS6110 se integran preferencialmente eneste tipo de hot spots, favoreciendo la delecin deespaciadoras, ya sea por insercin asimtrica o porescisin de las secuencias IS6110(39-42).

El mtodo de Spoligotyping inicia con una PCR dondese utiliza un par de oligonucletidos complementariosa la regin conservada de los DVR, de modo que apartir de ah se inicie la amplificacin de las regionesespaciadores. A los productos de la PCR se les hibridacon cada una de las 43 secuencias complementariasconocidas, previamente fijadas en una membrana deNylon. Para discriminar los diversos espaciadoresamplificados, uno de los oligonucletidos est marcadocon biotina. Finalmente, los puntos de hibridacinsern revelados con un conjugado de estreptavidina-peroxidasa, que se une a la biotina para formar uncomplejo luminoso al agregar el sustrato luminol. Lareaccin enzimtica que se produce es capaz de quemaruna placa radiogrfica, en el punto que correspondea cada espaciador hibridado, determinando los

espaciadores presentes o ausentes en cada una de lascepas (Figura 3)(22,30,43,44,45,46,47).

La presencia o ausencia de espaciadores, permitecrear bases de datos sencillas, con un cdigo binariode 1 (presencia) y 0 (ausencia), las cuales sirvenpara formar matrices que ms tarde son utilizadasen diferentes tipos de anlisis filogenticos paradeterminar grupos de cepas de similitud gentica.Estas matrices de 0 y 1 pueden ser utilizados parahacer cdigos que se pueden transformar en octales,

agrupando los patrones binarios de 3 en 3 yasignndoles un nuevo valor del 0 al 7, donde 0corresponde al cdigo 000 y 7 al 111 (Cuadro 2).La codificacin permite comparar fcilmente elgenotipo de cepas aisladas en diversos laboratoriosen diferentes partes del mundo.

El polimorfismo generado por Spoligotyping tieneuna reproducibilidad alta, dentro de y entre los

Figura 3. Origen de los ecotipos del complejo M.

tuberculosis, donde se muestran las regiones perdidas

durante el proceso de evolucin de estas bacterias, as

como sus hospederos

Figure 3. Origin of the M. tuberculosis complex ecotypes.

This figure showed the region loosed into genome during

the evolve to this bacterial species

Adapted from Brosch et al.(9).

by this technique are they required large amounts ofDNA with excellent quality and purity. Moreover,comparisons depend on complete banding patterns,making impossible to create databases and makingdifficult automation of the analysis.

PCR genotyping

PCR-genotyping has the advantage of requiring lowamounts of DNA. Partially degraded and mixed-DNA is also useful; thus, PCR-genotyping is fast,stable and versatile. In the case ofMycobacteriumfrom the M. tuberculosis complex, attempts weremade by amplifying the regions obtained with RFLP,however, due to the multiple problems experienced,the PCR-RFLP idea was disposed(37,38).

Spacer oligonucleotide typing (spoligotyping)

Currently, one of the most commonly usedtechniques for genotyping mycobacteria of the M.tuberculosis complex is spoligotyping. This methodrelies on the presence or absence of variants of thedirect repeat sequences (DR). The DVR consists


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laboratorios, y una estabilidad media de 10 a 20aos, lapso durante el cual se espera que las cepasmantengan sus cdigos (Cuadro 1). Esta y otrastcnicas de genotipificacin basadas en la PCR,tienen como ventajas la rapidez, la sencillez y el

requerimiento de poco ADN de calidad media.Adems, el Spoligotyping permite el diagnstico ygenotipificacin de bacterias del complejo M.tuberculosis directamente de muestras clnicas.

No obstante, como ya se mencion, a mayor esta-bilidad menor el polimorfismo de un marcador, ascomo su poder de discriminacin entre cepas no

of a repeated sequence of 36 bp conserved sequenceand a variable spacing from 35 to 41 bp. Thetarget for typing is this variable region. Up todate, 94 spacers have been reported in the DR s:the chromosome of M. tuberculosis H37Rv has 48

DVR, M. bovis BCG has 41. For rutinspoligotyping M. bovis, 43 spacers are used: 37from the H37Rv M. tuberculosis strain and 6 fromthe M. bovis BCG strain. As mentioned above,insertion sequence IS6110 are frequently integratedin such hot spots, which increases the deletion ofspacers, either by asymmetric insertion or excisionof IS6110 sequences(39-42).

Cuadro 2. Cdigos usados para el reporte de spoligotipos

Table 2. Codes used for the report of Spoligotypes

Locus Alias Localization* Size** Alleles Reference

ETR-A pUCD 2165 1-7ETR-B 2561 1-5

ETR-C 577 230-404 pb (2-5) 4 25

ETR-D MIRU 4 580 253-715 pb (2-8) 7 25, 2, 75

ETR-E MIRU31 3192 545-819 pb (1-6) 6 25, 2, 75

ETR-F 3239 (1-3) 3 25

MPTR-A 531 (15-16) 3 25

MPTR-B 1010 12 1 25

MPTR-C 1010 15 1 25

MPTR-D 2640 10 1 25

MPTR-E 2160 14 1 25

QUB-5 MIRU 27 3007 551-710 pb (1-4) 4 71, 2, 75

QUB-11a pUCD 2163 305-1832 pb (3-26) 15 71

QUB-11b pUCDI 2163 136-2, 756 pb (2-11) 8 71

QUB-18 192, 75 387-1167 pb (2-12) 9 71

QUB-23 1612 141-203 (5-8) 3 71

QUB-26 4052 abr-14 5 71

MIRU 2 154 455-561 pb (1-3) 3 2, 75

MIRU 10 959 537-1014 pb (1-10) 9 2, 75

MIRU 16 1644 618-777pb (1-4) 4 2, 75

MIRU 20 2059 01-feb 2 2, 75

MIRU 23 2531 608-979 pb (1-8) 7 2, 75

MIRU 25 2684 (1-2) 2 2, 75

MIRU 26 2996 563-818 pb (2-7) 5 2, 75MIRU 39 4348 593-699 pb (1-3) 3 2, 75

MIRU 40 802 199-469 pb (1-6) 5 2, 75

* In M. tuberculosis H37Rv genome (Kb). ** Amplicon and (number of copies).


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relacionadas, lo que indudablemente constituye unadesventaja para estudios epidemiolgicos, pero unaventaja para estudios filogenticos(13,14). De estosltimos se ha concluido que las especies ahoraconocidas como complejoM. tuberculosis derivan deun ancestro comn, que por adaptacin a determinadoshospederos se habra diversificado(13,48). Estaespeciacin puede ser monitoreada por Spoligotyping.Por ejemplo, la mayora de las cepas de M. boviscarecen de diversos DR y la ausencia de cuatro deesos puede ser comprobada fcilmente por la ausenciade los espaciadores 39 al 43 (Figura 4)(34,39,40,43,49).

Secuencias repetidas en serie de nmero variable

(VNTR)

Estos marcadores genticos, antes denominados

minisatlites, se identificaron inicialmente en sereshumanos, donde han tenido su mayor aplicacin enpruebas forenses y de paternidad(50,51). Los VNTRson secuencias repetidas en tndem de nmerovariable dispersas en el genoma, cuyo polimorfismose origina por adicin o delecin de secuenciasrepetidas. Para identificar un VNTR se amplificasu secuencia por PCR con oligonucletidoscomplementarios a secuencias especficas en susflancos. El tamao del amplicn revela elpolimorfismo del VNTR y puede expresarse comoel nmero de secuencias repetidas que contiene,permitiendo almacenar cdigos numricos comparablesentre diversos laboratorios y crear bases de datos defcil acceso (Cuadro 3). Usando VNTR se hangenotipificado diversos microorganismos, entreellos: M. leprae, M. ulcerans, Brucella abortus,Francisella tularensis, Streptococcus pneumoniae,Yersinia pestis, Bacillus anthracis, Salmonellaenterica y Staphylococcus aureus(52-58).

Secuencias repetidas polimrficos principales en serie

(MPTR) y secuencias repetidas en serie exactos (ETR)

En el caso de micobacterias del complejo M.tuberculosis, Frothingham y Meeker-OConnellanalizaron 11 loci VNTR dentro del genoma deM.tuberculosis H37Rv y de acuerdo a su estructuragentica los dividieron en dos tipos diferentes(49):MPTRs y ETRs. Los primeros cinco son similaresa los DRV, pero con secuencias repetidas,prcticamente homogneas de 10 pb, ms un

The method starts with a PCR, which uses a pairof oligonucleotides complementary to the conservedregion of the DVR, so amplification of spacerregions start from there. PCR products arehybridized to each of the 43 complementary knownsequences previously set in a nylon membrane. Todiscriminate between amplified spacers, one of theoligonucleotides is biotin-labeled. Finally,hybridized points are revealed with a streptavidin-peroxidase conjugate, which binds to biotin to forma luminous complex when luminal is added to thesubstrate. The enzyme reaction produced is able toburn a radiographic plate at the hybridized pointdetermining presence or absence of spacers foreach strain (Figure 3)(22,30,43,44,45,46,47).

The presence or absence of spaces can create simpledatabases, with a binary code of 1 (presence) and0 (absence). This information is used to formmatrices that are later used in phylogenetic analysis

Repeat units Repeat units

Figura 4. Determinacin de marcadores VNTR. Los

iniciadores amplifican la regin aledaa a los repetidos, por

lo que el tamao del amplicon depender del nmero de

repetidos

Figure 4. Determination of VNTR markers. The primers

amplified repeat sequences into genome to mycobacterias,the size of the amplicon depends on the number of repeats

in the clone

Taken of the Supplys talk, MTET Course 2005-2006.

Pasteur Institute.


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espaciador adyacente variable de 5 pb. La mayorade los VNTR dentro del genoma de M. tuberculosispertenecen a esta familia y se han designado MPTR.De los cinco MPTR analizados (del A al E) slose observa un polimorfismo ligero en MPTR-A,

con tres variantes allicas. El MPTR-A se localizaen el gen de una protena de pared celular, de lafamilia de protenas PPE, caracterizada por contenermltiples copias del motivo Asn-X-Gly-X-Gly-Asn-X-Gly en la porcin C-terminal(19).

Los otros seis VNTR analizados son secuenciaspolimrficas repetidas de 53 a 79 pb, denominadosETR, del ETR-A al ETR-F. Excepto el ETR-A,que se encuentra dentro del gen katG, se localizanen regiones no codificables. La reproducibilidadde los ETR es del 97 %, pero su poder dediscriminacin entre cepas no relacionadas esinferior al observado con RFLP-IS6110 para cepascon mltiples copias y mejor para cepas con pocascopias. En la Universidad Queen de Belfast sedescribi a otros VNTR con secuencias repetidas56 a 60 pb y los denominaron QUB. Al igual quelos ETR, los QUB presentan una reproducibilidadalta, pero un poder de discriminacin menor entrecepas con alto nmero de copias IS6110 y mayorpara cepas con pocas copias. Los anlisis con VNTRpermiten discriminar cepas de M. bovis no

relacionadas mejor que el Spoligotyping(59-62).

Unidades repetidas dispersas de Mycobacterium

(MIRU)

Los marcadores VNTR descritos originalmente porSupply et al(63) y denominados MIRU, seidentificaron al estar buscando una secuenciaespecfica deM. tuberculosis en la regin intergnicaSenX3-RegX3 del complejo M. tuberculosis(64).Los MIRU se agrupan en tres familias de acuerdoa su tamao: de 77 a 101 pb; de 46 a 53 pb; y de

58 a 101 pb. Se estiman de 40 a 50 MIRU en elgenoma de M. tuberculosis, cuya diferencia conotros VNTR radica en su asimetra y orientacinen fase con los genes adyacentes. Para lagenotipificacin del complejo M. tuberculosis se hanutilizado los 12 MIRU con mayor polimorfismo. LosMIRU tienen una estabilidad mayor de 18 meses ydebido a que su anlisis implica a ms de un locus,

or to identify groups of strains with geneticsimilarity. Matrices of 0 s and 1s can be used tomake codes that can be converted into octal,grouping binary patterns in sets of three, assigninga new value from 0 to 7, where 0 corresponds to

code 000 and 7 to 111 (Table 2). Coding allowseasy comparisons of spoligotypes from differentlaboratories in different parts of the world.

Polymorphism generated by spoligotyping is highlyreproducible within and between laboratories, andan average genetic stability of 10 to 20 yr; aperiod in which strains are expected to keep theircodes (Table 1). This and other PCR-basedgenotyping techniques, have advantages such asspeed, simplicity and use of low amounts of DNAwith average quality. In addition, spoligotypingallows both, diagnostic and genotyping of bacteriaof theM. tuberculosis complex directly from clinicalsamples.

However, as mentioned earlier, the larger thestability the smaller the polymorphism of a Marker,as well as the power of discrimination in unrelatedstrains. What is certainly a handicap for epide-miological studies, but an advantage for phylogeneticstudies(13,48). Of the latter, it has now beenestablished that the species known as from the M.

tuberculosis complex came from a commonancestor, that through adaptation to specific hostshave been varied(13,47). The speciation can bemonitored by spoligotyping. For example, most M. bovis strains have not specific DRs, and theabsence of four of those can be easily verified bythe absence of spacers 39 to 43 (Figure4)(34,39,40,43,49).

Variable number tandem repeats (VNTR)

These genetic markers, formerly known asminisatellites, were identified initially in humanswhere have been mostly applied in forensics andpaternity tests(50,51). VNTR are repeated sequencesin variable number tandem scattered throughoutthe genome. Polymorphism is caused by additionor deletion of repeated sequences. To identify aVNTR the sequence is amplified by PCR witholigonucleotides complementary to specificsequences at their flanks. Size amplicon reveals


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su poder de discriminacin es comparable al descritopara los RFLP -IS6110 y DR (Cuadro 1). Ademstienen una reproducibilidad, intra e interlaboratorios,hasta de un 98 %, por lo que son buenos marcadorespara estudios de epidemiologa molecular. La

genotipificacin por MIRU basada en PCR tiene laventaja de analizar cantidades nfimas de ADN yque en combinacin con Spoligotyping permitediscriminar un mayor nmero de cepas no rela-cionadas. Los resultados expresados sencillamentecon el nmero de secuencias repetidas presente porlocus permiten comparar rpidamente cepas y crearbases de datos mundiales(20,25,65,66).

Otra ventaja de los VNTR sobre otros mtodos detipificacin es la posibilidad de automatizar elanlisis. En lugar de hacer mezclas de PCR paracada locus y visualizar los amplicones en geles deagarosa para determinar su tamao y asignar elnmero de secuencias repetidas, se pueden disearmezclas con mltiples oligonucletidos marcadosdiferencialmente con fluorocromos, organizndolasen funcin de los tamaos esperados de losamplicones para cada locus. La automatizacinahorra tiempo, optimiza reactivos y disminuyecostos, aunque es necesario el acceso a equipos deelectroforesis capilar. Adems, si se cuenta con unprograma de genotipificacin como en el caso de

los sistemas de secuenciacin, el tamao del alelotambin puede codificarse automticamente(23,62).Otras formas de automatizar el anlisis de los

the VNTR s polymorphism and can be expressedas the number of repeated sequences contained.This allows the storage of numeric codes whichcan be used to compare results between laboratoriesand the creation of accessible databases (Table 3).

Different microorganisms, includingM. leprae, M.ulcerans, Brucella abortus, Francisella tularensis,Streptococcus pneumoniae, Yersinia pestis, Bacillusanthracis, Salmonella enterica and Staphylococcusaureus have been genotype by VNTR(52-58).

Mayor polymorphism tandem repeats (MPTR) and

exact tandem repeats (ETR)

In the case of mycobacteria of the M. tuberculosis,complex, Frothingham and Meeker - OConnell(49)

analyzed 11 VNTR loci within in the genome of M. tuberculosis H37Rv. According to the geneticstructure those loci were divided into two differenttypes: MPTR s and ETR S. The first five aresimilar to the DRV s, but with repeated sequencesalmost homogeneous in 10 bp plus an adjacentvariable spacer 5 bp long. Most VNTRs from M.tuberculosis genome belong to this family calledMPTR. Of the 5 MPTR analyzed (from A to E)only a small polymorphism, MPTR-A is observedwith three allelic variants. The MPTR-A is locatedin a protein cell wall gene from the PPE family of

proteins, characterized by containing multiple copiesof the plea Asn-X-Gly-X-Gly-Asn-X-Gly in the C-terminal portion(19).

Cuadro 3. VNTRs utilizados en la actualidad para la genotipificacin del complejo Mycobacterium tuberculosis

Table 3. VNTRs used at the present time for the genotyping Mycobacterium tuberculosis complex

InstabilityGenetic marker Method Biological clock (years) Reproducibility Discrimination

IS6110 RFLP 2-4 Medium Low*

PCR Very lowPGRS RFLP 3-5 Medium High

DR RFLP 10-20 Very low Low

Spoligotyping High

MPTR VNTR 1.5 High LowETR High**

MIRU

* With M. bovis. ** Using several loci.


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amplicones obtenidos es el anlisis por cromatografade lquidos a alta presin (HPLC) acoplado aespectrofotometra por UV(67). La automatizacinconfiere robustez al anlisis VNTR porque minimizael error humano y lo hace ms objetivo,

reproducible y eficiente. En el Cuadro 2 se muestrauna lista de los loci VNTRs que se han estudiado,la localizacin dentro del genoma deM. tuberculosiscepa H37Rv, el tamao del amplicon esperado y elnmero de alelos que se han identificado en lasdiversas cepas del complejo tuberculosis que sehan analizado.

Secuencias repetidas cortas o simples (SSR)

Otros marcadores tiles para la genotipificacinson las secuencias repetidas cortas o simples (SSR),

antes microsatlites. Los SSR son secuencias repetidasde 1 a 6 nucletidos distribuidas en los genomas detodo tipo de organismos. Su polimorfismo debido adeleciones o adiciones va de 10-6 hasta 10-2 porgeneracin. Al igual que los VNTRs estos marcadoresse amplifican con oligonucletidos especficos porPCR y para su lectura es preferible usarelectroforesis capilar, por lo que su automatizacines una necesidad. El genoma de las micobacteriastiene 220 SSR por kilobase, aproximadamente.Debido a su abundancia y polimorfismo ser

interesante comparar su utilidad para genotipificarcepas del complejo M. tuberculosis(68).

GENOTIPIFICACIN DE M. BOVIS

La necesidad de genotipificar M. bovis ha sidomundial, en especial de cepas aisladas de bovinostratando de determinar focos de infeccin. Laexistencia de reservorios de fauna silvestre hafomentado estudios epidemiolgicos para determinarel papel de sta en la persistencia regional de latuberculosis, as como tambin para evaluar suimpacto en salud pblica(69-74). En la ltimaconferencia internacional sobre M. bovis semanifest el enorme riesgo de generar cepas msvirulentas por la interaccin de este bacilo con lafauna silvestre y es necesario estimar el riesgoderivado de la movilizacin indiscriminada deanimales. La rastreabilidad permitir evaluar losriesgos derivados tanto de la movilizacin, la fauna

There are other six VNTR polymorphic repeatsequences, 53 to 79 bp long, used for genotyping,called ETR, from ETR-A to ETR-F. Except forthe ETR-A, which locates within the katG gene, therest are located in not coding regions. Reproducibility

of the ETRs is 97 %, but the power to discriminatebetween unrelated strains is lower than the observedwith IS6110-RFLP for strains with multiple copies,and a little better for strains with low copy number.In Queen University in Belfast, another set of VNTRsequences repeated, 56 to 60 pb long have beendescribed, called QUB. Like the ETRs, the QUBshow high reproducibility but lower discriminationpower for strains with high copy number of IS6110and higher for strains with low copy number. VNTRanalysis allows discriminating unrelated strains of

M. bovis better than spoligotyping(59-62)

.

Mycobacterium interspersed repeated units (MIRU)

VNTR markers originally described by Supply etal(63) called MIRU, were identified while lookingfor a specific sequence of M. tuberculosis in theintergenic region SenX3-RegX3 region of M.tuberculosis(64). According to size, MIRU groupsinto three families: from 77 to 101 bp; 46 to 53bp, and from 58 to 101 bp. The number of MIRUin the genome of M. tuberculosis is estimated in40 to 50. Difference with other VNTR is theasymmetry and orientation in phase with adjacentgenes. For genotyping strains from the M.tuberculosis complex the 12 most polymorphicMIRU s hve been used. MIRU have stability largerthan 18 mo, and because any analysis involvesmore than one locus, the power of discriminationis comparable to that described for IS6110-RFLPand DR- (Table 1). Reproducibility betweenlaboratories is as high as 98 %, which makes themgood markers for molecular epidemiology studies.MIRU genotyping based on PCR has the advantage

of detecting very small quantities of DNA and hatin allows in combination with spoligotypingdiscriminates more unrelated strains. Resultsexpressed simply by the number of repeated sequencesby locus allow quick comparison of strains and tocreate worldwide databases(20,25,65,66).

Another advantage of VNTR typing over othermethods is the possibility of systematize the


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silvestre, como de la inminente reactivacin de latuberculosis latente en los bovinos. Por otra parte,la caracterizacin de genotipos persistentes en unazona geogrfica o poblacin determinada puedefacilitar el desarrollo de nuevos mtodos de

control(75-78).

La genotipificacin de cepas deM. bovis con RFLPinici desde 1985. Los marcadores RFLP msusados han sido: -IS6110, -DR y -PGRS. A partirde 1995 se inicia la utilizacin del Spoligotyping,mtodo que debido a su rapidez, reproducibilidady poder de discriminacin se ha convertido en laprimera opcin para la genotipificacin deM. bovis.Tal ha sido su utilidad que en 2001 se cre unabase internacional de datos con spoligotipos de cepasde M. bovis (www.mbovis.org) (14,27,43,44,65).Posteriormente, los primeros trabajos de tipificacinde M. bovis con VNTR se reportaron a partir del2002 y debido a su robustez, tambin se estconstruyendo una base de datos internacional congenotipos identificados por MPTR, ETR y MIRUsen la misma pgina www.mbovis.org. En la literaturaan se reportan trabajos con RFLP, pero encombinacin con Spoligotyping y VNTR para tenerun mayor poder de discriminacin(29,44,47,59,71,72).

Entre los ejemplos recientes del poder de la

epidemiologia molecular combinando de maneraobjetiva distintos marcadores genticos, est untrabajo en poblaciones de ganado de varios pasesafricanos sub-saharianos(79). En ese trabajo seidentifica con alta frecuencia al denominadocomplejo clonal deM. bovis Af1 caracterizado por ladelecin RDAf1, mediante la ausencia del espaciador30 en el Spoligotyping(80). Este grupo determinque este complejo clonal est geogrficamentelimitado en la regin, como resultado de laintroduccin de la tuberculosis bovina en vacas

nativas. No obstante, al incluir marcadores VNTRdemostr que existen distintas cepas dentro delgrupo clonal correspondientes a cada pas,probablemente debido a que la mezcla de cepasentre los pases es poco comn en esta rea.

En China, se estudia una poblacin de vacas conuna prevalencia de 38 % de tuberculosis y porSpoligotyping se identifica a M. tuberculosis como

analysis. Instead of mixtures of PCR for each locusand display amplicons in agarose gels to determinesize and allocate the number of repeated sequences,mixtures can be designed with multipleoligonucleotides marked differentially with

fluorochromes, organized according to the sizesexpected for each locus. Systematization saves time,optimize reagents nd reduces costs. There is aneed for capillary electrophoresis though.Furthermore, if there is a program for genotyping,such as sequencing systems, the size of the allelecan also be codified automatically(23,62). Some otherways to systematize the analysis of amplicons isby high pressure liquid chromatography (HPLC)coupled to UV spectrophotometry(67). VNTRsystematization confers robustness to the analysis

because it minimizes person error and makes theanalysis more objective, reproducible and efficient.Table 2 shows a list of VNTR s loci that havebeen studied, location within the genome of M.tuberculosis H37Rv strain. Expected amplicon sizeand the number of alleles identified in differentstrains of the tuberculosis complex analyzed up tonow.

Short or simple sequence repeat (SSR)

Other markers useful for genotyping are short or

simple sequence repeat (SSR) known before asmicrosatellites. The SRS are 1 to 6 nucleotidesdistributed in genomes from all kinds of organisms.Polymorphism due to additions or deletions goesfrom 10-6 to 10-2 per generation. Like VNTRmarkers, SRS markers are amplified by PCR withspecific oligonucleotides. Polymorphism reading ispreferred by capillary electrophoresis, thussystematization is required. Mycobacteria genomehas 220 SRS per KB. Due to abundance andpolymorphism, it would be interesting to compareits usefulness for genotyping strains from the M.tuberculosis complex(68).

M. BOVIS GENOTYPING

There has been an increasing demand for genotypingM. bovis strains lately, especially in cases of cattleTB searching for sources of infection. The existenceof reservoirs for BTB has encouraged the


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causante de algunos de ellos(81). Paralelamente, latipificacin de MIRU-VNTR del 82 % de las cepasde M. tuberculosis aisladas de pacientes en esazona, tipificadas como de la familia Beiging,demostr que el tercer genotipo con mayor

incidencia en humanos era igual al encontrado enel ganado bovino. En Portugal, al determinar ladiversidad gentica por Spoligotyping de cepasaisladas de ganado bovino, caprino, venado rojo y jabales se encontraron 29 spoligotipos distintos,en ganado bovino para produccin de carne ensistema extensivo 12 de 13 spoligotipos secompartan con animales de fauna silvestre(82).

En un Parque Nacional en Espaa se desarroll unestudio para entender la epidemiologa de M. bovisque afecta al ganado y a los animales silvestres(83).La caracterizacin molecular por Spoligotyping yMIRU- VNTR de las cepas aisladas revel 9genotipos de los cuales dos eran los de mayorprevalencia SB1232 (77.30 %) y SB1230 (15.34 %).Se pudo corroborar a las cepas de M. bovispersistentes en especies silvestres, como las demayor prevalencia en ganado bovino. La variacinde los genotipos observada sugiere eventos demicroevolucin en la poblacin de M. bovis deesta rea. Este estudio evidencia el riesgo quepresenta la introduccin de animales domsticos en

reas de vida silvestre, donde no existen garantasde libertad de enfermedades, diagnostico apropiadoy medidas de control. En Korea, la combinacinde loci de VNTR permiti una discriminacin entrecepas de 0.86, permitiendo sealar a dos genotiposcon la mayor prevalencia (20 %)(84). Mediante unndice de la diversidad allica (h), se determinque los loci ms discriminativos fueron QUB 3336(h= 0.64), QUB 26 y MIRU 31 (h= 0.35).

Los estudios filogenticos han determinado que lascepas de M. bovis de mayor prevalencia enArgentina fueron introducidas en bovinosimportados del Reino Unido en el siglo XIX(9).Tambin han permitido identificar factores de riesgopara la transmisin del agente etiolgico y laidentificacin de cepas drogo-resistentes; as comolas vas comunes de infeccin en nios(70,71,85,86,87).En Mxico, el primer reporte de genotipificacinde M. bovis se realiz en 1997 comparando los

development of epidemiologic studies to determinethe role of wildlife in regional persistence of thedisease, as well as to assess the impact on publichealth(69-74). In the 2005 international conferenceon M. bovis, enormous interest was expressed in

relation to the risk of more virulent strains arisenfrom of wildlife reservoirs. The evolution of strainsto virulence and the epidemiologic impact of theindiscriminate move of animals between regions haveto be established. More than that, characterization ofgenotypes persistent in a geographic area or apopulation need to be studied to develop new controlstrategies of the disease(75-78).

Genotyping ofM. bovis by RFLP started in 1985.Most used RFLP-bookmarks at that time were:IS6110, DR and PGRS. However, since 1995spoligotyping became the first-choice methodbecause it is fast, reproducible, easy to performand shows high discriminatory power. The methodbecame so popular that in 2001 an internationaldatabase of spoligotypes for M. bovis(www.mbovis.org) was created(14,27,43,44,65). Asnew markers were identified in theM. bovis genome,new genotyping methods have been developed. In2002 the VNTR method was reported. VNTR is arobust method based on MPTR and ETR MIRU s.International types for M. bovis obtained with this

method are also in www.mbovis.org. Spoligotyping,in combination with VNTR, have become themethods of choice for M. bovis epidemiologicalstudies worldwide(29,44,47,59,71,72).

A recent example of using a combination of thesetwo methods to increase discrimination in M. bovistyping is that reported by Mller et al(79) in cattlepopulations in several sub-Saharan African countries.Authors identify a so called clonal complex ofM.bovis characterized by the deletion RDAf1 throughthe absence of spacer 30 in spoligotyping(80). Thisgroup found that this clonal complex isgeographically limited to that region, as a result ofthe introduction of bovine tuberculosis in nativecattle. However, when VNTR markers wereincluded, it was shown that different strains,particular to each country were present, indicatingthat mixture of strains between countries is notcommon in that area.


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patrones de RFLP-DR de las cepas BGC utilizadascomo vacuna en diversos pases(33). Posteriormentese realizaron algunos trabajos con Spoligotyping enaislamientos de M. bovis de bovinos sacrificadosen el norte y de algunas otras regiones del pas,

incluyendo una combinacin de marcadores RFLP-IS6110 y RFLP-PGRS(32,40,46).

La tipificacin molecular puede innovar laidentificacin de M. bovis y al mismo tiempo,generar genotipos mediante la combinacin dedistintos marcadores polimrficos, para lainvestigacin epidemiolgica en zonas acreditadaspara la exportacin de ganado(4,7). En EstadosUnidos de Amrica (EUA) se analizaron 41 cepasaisladas deM. bovis en ese pas, utilizando 27 lociVNTR(88). Usando slo un subgrupo de 6 loci, lascepas se diferenciaron en 14 grupos, los cualesestaban genticamente relacionados y presentaronconcordancia con los datos de rastreoepidemiolgicos generados de forma tradicional.

La combinacin de los marcadores spoligootypingy VNTR ha demostrado el mayor poder dediscriminacin entre cepas. Al tratar de determinarla fuente ms probable de infeccin en el ganadobovino de origen mexicano que ingresa a los EUA,utilizando la genotipificacin por Spoligotyping, un

grupo de investigacin binacional, observspoligotipos especficos de cada pas y una mayordiversidad gentica en los aislamientosmexicanos(77). Se concluye que a pesar de laposibilidad del origen mexicano de algunos bovinoscon lesiones sacrificados en los EUA, ese pastiene sus propias fuentes de infeccin,probablemente derivados de la transmisin entreganado lechero y venados(11). El rastreo de cepasfuera del pas es un logro conjunto de la tecnologay el quehacer cientfico, que permiten un dilogo

franco y la toma de decisiones a luz de lasevidencias.

Recientemente en Mxico, mediante bacteriologase identific a M. bovis como causa del 20 % deltotal de casos nuevos de tuberculosis en humanos,indudablemente asociados a la TBB(89). Asimismo,con Spoligotyping se identific a M. bovis comocausante de ms del 13 % de tuberculosis activa en

In China, Chen et al(81) studied a population ofcows with a 38 % prevalence of tuberculosis byspoligotyping was determined that M. tuberculosiswas the cause for some of them. When MIRU-VNTRwas used, it was found that one third of 82 % of

the M. tuberculosis strains isolated from patientsin this area, defined as the Beijing family, wassimilar to that found in cattle. Similarly, in Portugal,while determining genetic diversity by for strainsisolated from cattle, goats, red deer and wild boarsby spoligotyping, found 29 different spoligotypesin beef cattle, 12 of 13 were similar to those foundin wildlife(82).

A study was conducted to explore the epidemiologyof M. bovis in cattle and wildlife in a SpanishNational Park(83). Molecular characterization byMIRU-VNTR and spoligotyping ofM. bovis foundthat from 9 genotypes, 2 were the most frequent:SB1232 (77.30 %) and SB1230 (15.34 %). Someof the most persistent strains in wildlife were similarto those found in cattle, suggesting microevolutionof M. bovis in the area. This findings support therisk of introducing cattle in areas of wildlife, whereno guaranty of disease freedom, biosecurity anddiagnostic services are present. It has beenestimated(84) that the combination of all VNTRloci have a discrimination power of 0.86. The

combination was able to draw two genotypes withthe highest prevalence (20 %). Calculating an allelicdiversity index (h), it was demonstrated that themost discriminatory loci were: QUB 3336 (h =0.64), QUB 26 and MIRU 31 (h = 0.35).

Phylogenetic studies have shown that the mostprevalent strains of M. bovis in Argentina wereintroduced with cattle imported from the UnitedKingdom in the nineteenth century(9). They havealso identified risk factors for transmission ofM.bovis and drug-resistant strains, as well as commonpathways of infection in children(70,71,85,86,87).The first report ofM. bovis genotyping in Mexicowas conducted in 1997, comparing patterns ofRFLP-DR from BGC strains used as vaccine indifferent countries(33). Subsequently, studies havebeen conducted using spoligotyping, and some othergenetic markers (RFLP-IS6110 and RFLP-PGRS)in isolates of M. bovis from cattle slaughtered in


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pacientes de una zona con alta incidencia de TBB(3).Tambin en Mxico se identific a M. bovis comocausante de casos de tuberculosis extra pulmonaren aproximadamente 14 % de pacientes con HIVy 7 % sin el virus(90). Estos casos estaban

comnmente asociados al consumo de productoslcteos no pasteurizados. Para entender laepidemiologa de la tuberculosis causada por M.bovis en pacientes de los EUA se tipificaron 11,860aislamientos por Spoligotyping y MIRU(91). Ellosencontraron 165 (1.4 %) casos asociados a M.bovis, principalmente en pacientes hispanos nonacidos en EU, de menos de 15 aos de edad, HIVpositivos y con tuberculosis extra pulmonar,sugiriendo la transmisin alimentaria de M. bovis.

Las investigaciones para definir el impacto de M.bovis en la salud pblica se vern beneficiadas conlas tcnicas de genotipificacin modernas. Estastcnicas tambin coadyuvan al control de calidaddel diagnstico bacteriolgico mediante el monitoreode la contaminacin, evitando el reporte deaislamientos falsos positivos asociados a lasobrecarga de trabajo o inexperiencia en laboratoriosrecin integrados(51,92,93).

PERSPECTIVAS Y CONCLUSIONES

El RFLP-IS6110 es poco eficiente para discriminarcepas deM. bovis debido a que posee pocas copias.Adems los marcadores RFLP constituyen unatcnica exhaustiva y demandante. Por el contrario,las tcnicas basadas en PCR que permiten analizarun locus, como el Spoligotyping o diversos loci,como los VNTRs, son altamente factibles,reproducibles y codificables. La combinacin demarcadores genticos de alta y mediana estabilidad,como el Spoligotyping y los VNTRs,respectivamente, tiene un efecto sinrgico paradiscriminar entre cepas. Dicha combinacinconstituye potentes criterios de genotipificacin,para expresar grupos discretos de clonas, crearbases homogneas que integren informacinfidedigna y efectivos para la rastreabilidad. Otrosmarcadores como los SSR requieren una estimacinconfiable de su estabilidad, pero dada su abundanciapodran ser de gran utilidad en combinacin y paracasos con mayor informacin epidemiolgica.

different regions trying to group strains bygeographic location(32,40,46).

Nowadays, molecular typing can identify andgenotype M. bovis in tissue at the same time by

combining different polymorphic markers forepidemiological studies in cattle exportation-accredited areas(4,7). Forty-one M. bovis isolatesfrom animals in North America were analyzed using27 loci of VNTRs known(88). When using only asubset of 6 loci, 14 epidemiologically related groupsof strains were distinguished; epidemiologicalrelationship was determined by tracing back animalsto origin.

The combination of markers, spoligootyping andVNTRs, have shown the best results in terms ofdiscrimination. In trying to determine the probablesource of infection for cattle of Mexican originentering the United States of America (USA) Milian-Suazo et al(77) observed spoligotipes specific bycountry and greater genetic diversity in Mexicanisolates. Conclusion was that despite of thepossibility of some Mexican calves pass the borderas false negative, the USA has its own sources ofinfection, most probably coming from wildlife(11).Tracking strains in a different country is theachievement of collaboration in technology and

science, which allows communication and commondecisions supported by scientific evidence.

Recently, M. bovis was identified as the cause of20 % of all cases of tuberculosis in humans in aMexican region(89). By spoligotyping it wasestablished that M. bovis was involved in 13 % ofthose cases and that some share genetic similaritywith those found in cattle(3). Also in Mexico, Ciceroet al(90) reportedM. bovis cases of extrapulmonarytuberculosis (14 % HIV-positive and 7 % HIV-negative) which related to the consumption of dairy,

unpasteurized products. To understand theepidemiology of tuberculosis caused by M. bovisin patients from the United States, Hlavsa et al(91)

typed 11, 860 isolates by spoligotyping and MIRU,165 (1.4 %) of these cases were caused by M.bovis. Patients were primarily Hispanics, less than15 yr old, HIV positive and with extra pulmonarytuberculosis; suggesting oral transmission.


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La genotipificacin bacteriana es un proceso queha venido evolucionando de manera continuatratando de dar respuesta a los cuestionamientosepidemiolgicos de la biomedicina. Una de susprincipales aplicaciones es la deteccin de focos de

infeccin. La identificacin precisa de M. bovis encada caso es de vital importancia para conocer ladistribucin de este microorganismo en diversaspoblaciones, pero el cultivo bacteriolgico y laspruebas bioqumicas constituyen una barrera detiempo. No obstante, a pesar de que el poderdiscriminacin, reproducibilidad, estabilidad yfactibilidad de algunos mtodos sean ptimos, larelacin gentica no es sinnimo de relacinepidemiolgica. De esta observacin deriva laimportancia de capturar informacin geogrfica,

clnica y patolgica entre otras, que sustente loshallazgos. Lo anterior nos lleva a concluir tambinque la informacin generada por la tipificacin nodeja de ser una herramienta al servicio delprofesional de la salud para la toma de decisiones.En Mxico, la integracin de diversos grupos deinvestigadores permitir la creacin de una base dedatos nacional que agrupe los genotipos obtenidosde M. bovis, tanto de animales domsticos, comode humanos y fauna silvestre. Esta base saturadade genotipos con diversos marcadores, as comode informacin epidemiolgica convencional,

coadyuvar al control y erradicacin de la TBB.

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Research to identify the impact of M. bovis inpublic health will benefit from the existence ofmodern genotyping techniques. These techniqueswill contribute to evaluate quality of bacteriologicaldiagnosis by monitoring contamination and

preventing false positive reports in new laboratoriesor laboratories with high workload andinexperience(51,92,93).

PERSPECTIVES AND CONCLUSIONS

IS6110-RFLP is not very efficient in discriminatingstrains of M. bovis due to low copy number andbecause the process is demanding and timeconsuming. PCR-based techniques, which allowanalyzing a locus, such as spoligotyping, or various

loci, such as VNTRs, have shown to be better.They are reproducible and produce genetic patternseasy to codify. The combination of genetic markerswith high and medium stability, such asspoligotyping and VNTR, has a synergistic effectto discriminate strains. This combination constitutespowerful criteria for genotyping, to express discretegroups of clones and to build homogeneousdatabases with reliable information for effectivetraceability. Other markers, such as the SSR requirereliable estimates of stability; however, becausethey are abundant they are useful when used in

combination and in those cases with goodepidemiological information.

Bacterial genotyping has been evolving continuouslyin response to epidemiological and medicalquestions. One of the main applications is indetecting sources of infection in outbreaks. Theidentification of M. bovis in each case is vital toknow the distribution of the bacilli in differentpopulations, but bacteriological culture andbiochemical tests represent a barrier of time.However, despite the fact that discrimination power,reproducibility, stability and feasibility of thegenotyping methods are optimal, the geneticrelationship is not synonymous of epidemiologicalrelationship. Therefore, in order to establish geneticand epidemiological information, appropriategeographic, clinical and pathological informationis required to support findings. This leads us toconclude that any information generated by


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genotyping is nothing more than a tool to helpprofessionals to make decisions. In Mexico,integration of scientists working in molecularepidemiology will allow the creation of nationaldatabases that group M. bovis genotypes from

different sources: domestic animals, humans andwildlife. There is no doubt that databases, full ofgenotypes from different markers andepidemiological information will support policiesfor the control and eradication of bovinetuberculosis.

End of english version

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