Topología del ADN

Topología del ADN:

Fundamentos

Sergei Mirkin M, la Universidad de Illinois en Chicago, Illinois, EE.UU.

características topológicas de ADN y el ADN específicamente superenrollamiento influir en todos los principales

ADN de las transacciones en las células vivas. superenrollamiento del ADN induce la formación de inusual

estructura secundaria por repeticiones de ADN específicos que también pueden afectar el funcionamiento del ADN.

Introducción

Una molécula de ADN típico consiste de dos complementarios

cadenas de polinucleótidos que se multiplican interwound,

formando una doble hélice. En la conformación vigente,

llamado B-ADN, se trata de una hélice de la mano derecha con un período de

aproximadamente 10.5 pares de bases (pb) por turno en fisiológicas

condiciones. Aunque a nivel local (es decir, para una secuencia determinada)

ADN puede ser muy diferente de la conformación B, el

éste describe con precisión la estructura general de un ADN

molécula.

aspectos topológicos de la estructura del ADN surgen principalmente

del hecho de que las dos hebras de ADN se repiten

entrelazados. Desenredar estas dos vertientes, que se produce en

todos los procesos genéticos importantes puede resultar bastante difícil. En

el caso más simple de una solución linearDNAin, es desenredar

posible debido a la rotación libre de los extremos del ADN.

Sin embargo, para todas las AND naturales, la rotación de extremo libre está bien

restringido o prohibido por completo. En consecuencia, desenredar

las dos hebras de ADN se convierte en topológicamente

imposible. La Figura 1 ilustra esto para el caso imaginario

de una molécula de ADN circular en las dos cadenas son

enredada una sola vez.

Un segmento de ADN limitado para que la rotación libre de

sus extremos es imposible que se llama un dominio topológico

(Figura 2). Un ejemplo canónico de un dominio topológico

es el ADN circular, que es típica de las bacterias, las mitocondrias,

cloroplastos, muchos virus, etc En este caso, hay

obviamente noDNAends en absoluto, ya que son bothDNAstrands

covalentemente cerrado. A pesar de los cromosomas eucariotas se

lineal general, consisten en grandes bucles de ADN con firmeza

unido a la matriz nuclear. Estos lazos representan

1038 No. de páginas: 11 Mohance

Contenido del artículo

Introductoria del artículo

. Introducción

. Vinculación de Número, Twist y se retuercen

. ADN Superenrollamiento

. Nudos y catenanos

. Transiciones estructurales SuperCoil-dependientes en el ADN

. Métodos de detección y análisis

. Papel de la topología del ADN en el genoma de Funcionamiento

. Función biológica de las estructuras del ADN Alternativa

Figura 1 A circularDNAmolecule hipotética en la que twoDNAstrands

están vinculados sólo una vez. Desenredar una de las dos cadenas es imposible, a menos que

uno de ellos será quebrantado.

(A) (b)

(C)

(D)

Figura 2 Ejemplos de dominios topológicos. (A) de ADN circular, (b)

bucles de ADN cromosómico, (c) lineales de ADN unidas a la membrana, (d)

Lineales de ADN unido a los agregados de proteínas.

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dominios topológicos, es decir, que son equivalentes a la circular

ADN topológicamente. Los extremos de ADN lineal también se puede

colocada en la membrana, como se ha demostrado para algunos

virus, por lo que este ADN topológicamente cerrado. Por último, un

segmento de ADN situado entre la proteína de dos grandes

órganos también puede considerarse como un dominio topológico. Por

simplicidad, las características topológicas de los dominios se

se analiza a continuación para las AND circular, pero pueden los principios

deben aplicarse en todos los demás casos.

Si la separación capítulo dentro de un dominio topológico es

imposible, ¿cómo puede la función del ADN intracelular en absoluto? Para

frente a este problema un grupo especial de enzimas llamadas

topoisomerasas de ADN ha evolucionado. Estas enzimas introducir

transitoria de una o de doble cadena-breaks intoDNA

para liberar la tensión de torsión en la acumulación de línea

separación en un dominio topológico. Las topoisomerasas son

esenciales para la resolución de numerosos topológico

problemas en el ADN. Tenerlos en su arsenal, las células toman

Disfruta de la naturaleza limitada de sus topológicamente

ADN, como se explica al final de este artículo.

Vinculación de Número, Twist y se retuercen

El parámetro fundamental topológica de un enlace covalente

ADN circular cerrada se llama el número de enlace (Lc).

Suponga que una cadena de ADN es el borde de un imaginario

superficie y contar el número de veces que el otherDNA

línea cruza esta superficie (Figura 3). La suma algebraica de

todas las intersecciones (que representa un signo de cada

intersección) es el Lc. Dos características importantes de la Lc

son evidentes en la Figura 3. En primer lugar, Lucas es siempre un número entero.

En segundo lugar, Lucas no se puede cambiar por cualquier deformación de la

Hebras de ADN, es decir, es invariante topológico. El único

manera de cambiar Lc es introducir un descanso en uno o ambos

DNAstrands, gire el twoDNAstrands relativa a cada

otros y el sello de la pausa. Este es precisamente el papel del ADN

topoisomerasas.

Otra de las características de un ADN circular se llama giro,

o Tw. Tw es el número total de vueltas helicoidales en la circular

ADN en determinadas condiciones. Dado que el ADN es un diestro

hélice con 10,5 pares de bases (pb) por turno, Tw es un

gran número positivo para cualquier naturalDNA.Take un plano,

ADN circular y tratar de separar a nivel local el ADN de dos

capítulos, es decir, para disminuir la Tw. Desde Lc no puede cambiar, un

disminución de la Tw será compensado por varios positivos

se retuerce de la doble hélice (Figura 4). Retorciéndose (Wr) es el

tercera característica importante de ADN circular, describiendo

el puerto espacial del eje de la hélice doble, es decir, la forma de la

Molécula de ADN en su conjunto. Wr pueden ser de cualquier signo, y

generalmente su valor absoluto es mucho más pequeño que el de Ta.

La consideración anterior se puede formalizar por el

la siguiente ecuación:

Lk5Tw + Wr [1]

Tenga en cuenta que, si bien Lucas es un número entero, neitherTwnorWrshould

ser tal. Además, invariantes topológicos neitherTwnorWrare

y sus valores cambian fácilmente con los cambios en el ambiente

condiciones, la temperatura y durante el funcionamiento del ADN.

ADN Superenrollamiento

El número de pares de base perDNAturn se designa como g.

Este parámetro puede variar dependiendo de las condiciones iónicas


Figura 3 Vinculación número representa una suma algebraica de todas las

cruces hechas por una cadena de ADN a través de la superficie imaginaria tallada

por otra cadena de ADN. La Lc aquí es 8.

Figura 4 relajarse Local de ADN circular relajado lleva a ADN positivo

superenrollamiento.

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ciones, temperatura, etc Si el Lc de la circular N-pb de longitud

molécula de ADN se corresponde exactamente con

Lk05Tw05N / g [2]

esta molécula de ADN se llama relajado. De hecho, de cerca

se parecen a los planos de ADN circular que se muestra en la Figura 4.

En AND real, sin embargo, la ecuación anterior es casi

Nunca accurate.ADNAmolecule whoseLkdiffers de la

Lk0 se llama superenrollado. Una medida cuantitativa de ADN

superenrollamiento es denominada enlace diferencia (t):

t5Lk2Lk05Lk2N / g [3]

Se deduce de la ecuación anterior que la vinculación de diferencia

puede tener un valor positivo o negativo. Cuando el valor

de t es negativo, el ADN correspondiente es negativa

superenrollado. En este caso, el Lucas es menor que N / g, es decir,

negativamente ADN superenrollado es algo desenrolla

en comparación con el ADN relajado. Cuando el valor de t es

ADN positivo, es positivo superenrollado, y es algo

overwound en comparación con el ADN relajado.

"Superenrollamiento" El término refleja la forma del ADN: se

se parece a una hélice de ADN normal en espiral en una hélice de un

de orden superior. Las dos configuraciones principales de superenrollado

ADN, llamado solenoidal y plectonémica, se muestran

en la Figura 5. El plectonémica (o interwound) superhelicoidal es

característica del ADN en procariotas. Solenoidal superenrollamiento

es típico de los eucariotas, donde el ADN se enrolla

alrededor de las partículas nucleosomal. El signo de una pieza de

ADN superenrollado no puede ser determinado con base en la

imparcialidad de la superhélice. Figura 5 ilustra esto para

configuraciones solenoidal y plectonémica. Tanto las autoridades nacionales designadas en

la cifra se superenrollado negativamente, pero la plectonémica

superhélice es la mano derecha mientras que la superhélice solenoidal

es zurdo. Esto se debe a que para determinar el signo de cualquier

nodo, se debe considerar toda la ruta del ADN.

Las flechas en la figura 5, tomar el camino de ADN en cuenta.

Es evidente que la orientación relativa de theDNAsegments

en una intersección es el mismo para ambos superhelicoidal

configuraciones.

Además de la vinculación de diferencia, una característica útil

de ADN superenrollado es la densidad superhelicoidal (s),

define como:

s5t/Lk05gt/N [4]

Es más cómodo de usar s, en lugar de t, para comparar

superenrollamiento AND entre diferentes, ya que s se normaliza

forDNAlength. En una primera aproximación, s estimaciones

el número de supercoils por vuelta helicoidal del ADN. Por

ADN circular aislado de las células vivas del valor absoluto

de s puede variar entre 0,02-0,09, es decir, hay 9.2

supercoils por 100 vueltas helicoidal del ADN.

Las relaciones entre la diferencia de enlace y

giro y se retuercen se puede determinar mediante la combinación de las ecuaciones

[1] - [3]:

t5Lk2Lk05 (Tw2Tw0) 1Wr5DTw1Wr [5]

La fórmula anterior muestra que el estrés causado por topológico

diferencia que une en un cambio circularDNAboth el giro

de su valor óptimo e introduce retuercen. Estudiar

ADN superenrollado negativamente usando una variedad de diferentes

técnicas se ha demostrado que, en fisiológicas

condiciones, Wr ocupa aproximadamente tres cuartas partes de

la diferencia de enlace, mientras que la cuarta parte restante va a

DTW. La distribución de la tensión de torsión en forma positiva

ADN superenrollado queda por determinar.

Desde superenrollamiento induce graves de torsión y flexión

deformaciones en el ADN, que es energéticamente desfavorable.

análisis experimentales y teóricos han

demostrado que la energía libre de superenrollado negativamente

ADN en condiciones fisiológicas es la siguiente:

DG510RTNs2 [6]

donde R es la constante de los gases, T es la temperatura absoluta y

N es la longitud del ADN en pares de bases. Desde la Dirección General es

proporcional al cuadrado de s, los cambios relativamente pequeños en

la densidad de superenrollamiento puede dar lugar a cambios sustanciales

en la energía libre. Uno debe esperar que la dependencia similares

de ADN superenrollado positivamente.

Debido a superenrollamiento es energéticamente desfavorable, locales

ADN cambios que llevan a la relajación se superhelicoidal

favorables. Considere la posibilidad de un 1050-pb de longitud superenrollado negativamente

molécula con una diferencia de vinculación de t5 24. Para

relajarse completamente este estrés, es suficiente para relajarse un 42 -

ADN pb a lo largo del segmento (cuatro vueltas de la doble hélice)

dentro de esta molécula de ADN. Este ejemplo ilustra dos

características importantes de ADN superenrollado negativamente. En primer lugar, una

cambio en un segmento de ADN correspondiente a sólo una pequeña

porcentaje de la totalDNAlength es suficiente para mantener la

resto de la molécula relajada. En segundo lugar, bajo la influencia de

superenrollamiento negativo, el ADN tiende a relajarse.

Positivamente ADN superenrollado, por el contrario, tendería a

overtwist.


Figura 5 plectonémica (superior) y solenoidal (inferior) supercoils ADN.

Las flechas ilustran que tanto las moléculas de aquí son superenrollado negativamente,

a pesar de imparcialidad diferentes.


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Nudos y catenanos

Vinculación número no es el único invariante topológico

característico de ADN circular. En el proceso de

ciclación, las moléculas de ADN se pueden formar nudos largo de

diferentes tipos y complejidad. Es importante destacar que, después de un

cierre covalente de una molécula de ADN, las características

de un nudo no se puede cambiar por cualquier conformacional

cambios en el ADN por debajo de rotura del hilo. Por lo tanto, el nudo

es otro tipo de invariante topológico. La figura 6a muestra dos

las formas de la más simple nudo, llamado trébol, de diferentes

signos. Nudos de vez en cuando detectó en las células vivas. Ellos

se cree que son los productos secundarios de diversos genética

procesos, tales como recombinación.

También es probable que dos o más moléculas de ADN pueden

interrelación en el proceso de ciclación. Una vez más, después de covalente

cierre de las moléculas, el tipo de vínculo se convierte en

todos los idiomas. ADN circular que están unidos entre sí son

catenanos llamada. Es evidente que hay numerosos posibles

tipos de catenanos. Figure6bshows un catenano simple de dos

Entre los signos posibles. Catenanos rutinariamente se detecten en el interior

las células vivas. Son probablemente se formaron en las últimas etapas de

La replicación del ADN y puede ser posteriormente resueltos por

topoisomerasas.

Superenrollamiento dependiente Estructurales

Transiciones en el ADN

Como se discutió sobre los cambios locales en el ADN de secundaria

estructura que dan lugar a desenrollar el ADN (disminución de la Tw)

son energéticamente favorable en un superenrollado negativamente

ADN. Extensos estudios de estas transiciones en los últimos

dos décadas han puesto de manifiesto varias conformaciones distintas de ADN

que son fundamentalmente diferentes de la canónica

B-DNA. Estas estructuras de ADN se llaman

estructuras alternativas del ADN. Una característica común de estos

estructuras es que están formados por ADN específicas

secuencias, generalmente de carácter repetido, y no por

secuencias aleatorias de ADN. El mejor estudiado alternativas

estructuras de ADN se consideran a continuación.

Cruciformes

Secuencia de elementos llamados repeticiones invertidas son notablemente

generalizada en ambos genomas pro y eucariotas. Estos son

ADN segmentos en los que las bases de ADN que son equidistantes

del centro de la simetría en una cadena de ADN se Watson-

Crick complementa entre sí (Figura 7). En el marco del

influencia de ADN negativo superenrollamiento estas secuencias

pueden formar estructuras de ADN llamado cruciformes (Figura 7).

Estas se forman cuando dos hebras complementarias de ADN

desasociar y, a continuación de cada cadena de ADN de auto-pares. Por lo tanto,

topológicamente, la formación de cruz es equivalente a un total

anulación de la repetición invertida.

Desde desapareamiento de un dúplex de ADN es que consumen energía,

esta etapa representa una barrera energética para la cruz

formación. Además, cruciformes contienen una sola fila

bases en su bucle central y costoso energéticamente

enlaces con el ADN de doble cadena adyacente (la llamada

cuatro cruces de ida). En conjunto, esto conduce a una alta energía

para la formación de cruz, se acerca 20kcal mol21,

lo que significa que la formación de cruz no es factible en

ADN lineal. Debido a cruciformes son topológicamente

equivalente a desenrollar el ADN, sin embargo, su formación

libera la tensión de torsión en el ADN superenrollado negativamente,

el suministro de energía necesario. Obviamente, cuanto más tiempo una

repetición invertida, el supercoils más se relajan en

formación cruciforme. Esto hace que la formación de cruz por

tiempo invertido repite mucho más termodinámicamente

favorable que el de los cortos (que sólo son viables

en densidades superenrollamiento muy alto). De hecho, la energética

cálculos muestran que la probabilidad de cruz

aumenta exponencialmente con la extrusión de la longitud de un

invertida repetir.

Z-DNA

Específica repeticiones directas que consisten en regular alterna

purinas (denotado R) y pirimidinas (denotado Y),


+ -

Figura 6 Primaria nudos (panel superior) y catenanos (panel inferior) de

signos diferentes.

Figura 7 B-ADN cruciforme transición. Las franjas rojas y azules se

mitades complementarias de una repetición invertida. tiras Negro son el ADN adyacentes.

Fractal tiras de negro son las regiones desenrollado.


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d (RY) n, puede adoptar una conformación de ADN llamada ADN-Z

(Figura 8). Estas repeticiones son mucho más comunes en

eucariotas que en el ADN bacteriano. Por ejemplo, una repetición

(CA) n. (TG) n es uno de los más comunes en los microsatélites

en el ADN de eucariotas, presente en aproximadamente 50 000 ejemplares

por genoma humano. Z-DNA es el mejor caracterizado

conformación del ADN alternativa ya que su estructura de cristal

se ha resuelto con una resolución atómica. Aunque se trata de un

doble hélice, que es fundamentalmente diferente de B-DNA.

En primer lugar, Z-DNA es una doble hélice zurda con un período de

de 12 pares de bases por vuelta. Esto significa que topológicamente,

durante la transición B-to-Z, no sólo los complementarios

Hebras de ADN completamente desasociar, pero el viento también

en la dirección opuesta. Por lo tanto, la transición de n helicoidales

vueltas de la B-DNA en el Z-conformación debe

versión 1.8n superhelicoidales negativas. Esto hace que la formación de

Z-ADN en el ADN superenrollado negativamente excepcionalmente

favorables, incluso para las repeticiones relativamente corto. En la práctica,

esta estructura se ve favorecida y no sólo en virtud de exóticos

condiciones tales como la fuerza iónica muy alto, o la metilación

de todas las citocinas en la repetición de Z que forma en el ADN lineal.

En segundo lugar, la estructura se llama Z-DNA debido a la

en zig-zag de configuración de su esqueleto de azúcar-fosfato.

Debido a la naturaleza repetitiva del ADN Z-formación

secuencias, hay dos pasos definidos a lo largo de una cadena de ADN,

RPY YpRand. Las rotaciones relativas de los adjacentDNA

bases en los dos pasos son muy diferentes: 98 para el RPR

paso y 518 para el paso RPY. Por lo tanto, un azúcar-fosfato

columna vertebral a aYpRstep es casi recto, pero es seguido por

un giro brusco en la fase de RPY. En consecuencia, el

unidad simétrica en Z-DNA es un dinucleótido, en comparación

con un mononucleótido en el B-DNA. Esto también conduce a

el hecho de que la doble hélice del ADN-Z tiene un solo

surco profundo, lo que corresponde al surco menor en el

B-DNA.

Otros dos rasgos distintivos química de Z-DNA

son las conformaciones de las bases y la desoxirribosa del ADN.

Desoxirribosa adopta la conformación del C3 denominada 'endo

en el Z-DNA, en comparación con la conformación endo el C2 'de

desoxirribosa en B-ADN. Purinas en Z-DNA se encuentran en una synconformation,

mientras que las pirimidinas se encuentran en una lucha contra la conformación

en relación con desoxirribosa. Por lo tanto, existe una regular

alternancia de conformaciones syn y anti-base a lo largo

la cadena de ADN en el Z-estructura. De hecho, el requisito

para la secuencia Z-formación a ser un habitual

alteración de las purinas y pirimidinas depende en gran medida

el hecho de que el síndrome de conformación es desfavorable para

pirimidinas.

H-ADN

repite espejo son segmentos de ADN que el ADN en las bases

que son equidistantes del centro de la simetría en un ADN

capítulo son idénticos el uno al otro. Un subgrupo de estos

reitera que son homopurina-homopyrimidine, es decir, contienen

sólo en purinas y pirimidinas oneDNAstrand sólo

en la línea de otro, se llama H-palíndromos. Hpalindromes

son enormemente sobrerrepresentadas en eukaryoticDNAbut

ocurren con una frecuencia oportunidad en bacterialDNA.

Estas repeticiones pueden adoptar una conformación inusual llamada

H-DNA en un estado superenrollado negativamente (Figura 9).

El principal elemento OFH-DNAis un triple intramolecular

hélice. Para construir esta estructura, una cadena de ADN a partir de la mitad

de la repetición se pliega hacia atrás, forma un triple con las dos caras

medio de la repetición, mientras que su complemento sigue siendo singlestranded.

Como puede verse en la Figura 9, los dos

hebras complementarias de ADN no están vinculados en este

estructura, es decir, topológicamente, la formación de H-DNA se

equivalente a la anulación de la homopurina toda-

tramo homopyrimidine. Por lo tanto, se ve favorecida en forma negativa

ADN superenrollado. Puesto que la estructura contiene una amplia

solo strandedDNAsegment, así como triple-doble cara a

y dúplex a una sola línea de uniones, la nucleación

la energía es bastante alto, 18 kcal mol21. En consecuencia, HDNA

Es poco probable que la forma en el ADN lineal.

Dependiendo de la naturaleza química de la cadena de ganado

al triple, ya sea de purina o pirimidina, hay dos

subclases de H-ADN llamados Hy o hora, respectivamente. La

el formulario H-y se construye a partir de T * AT y GC * C1 tríadas

(Figura 10a), donde pirimidinas desde el tercer capítulo se

situado en el surco mayor y la forma Hoogsteen

enlaces de hidrógeno con los purines de las dos caras. La


Figura 8 La transición de la mano derecha de B-DNA en ZDNA zurdos

por una purina alterna / secuencia de pirimidina. Las tiras de color verde / rojo

muestran la región de alternar purinas / pirimidinas. tiras Negro son

ADN adyacentes. Fractal tiras de negro son las regiones desenrollado.

Figura 9 H-ADN está formado por el espejo homopurina-homopyrimidine

repite. Una hebra de ADN de la mitad de la repetición se pliega formando un

triplex con semidúplex la repetición, mientras que su complemento sigue siendo singlestranded.

El lazo negro representa la línea de homopurina, el rojo

la cinta es la línea de homopyrimidine y cintas verdes son el ADN adyacentes.


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extingency de protonación citosina hace que esta estructura

preferencia de conformidad con un pH moderadamente ácido. La forma de H-r puede ser

construcción de CG * G, TA A * y, a veces tríadas * AT T. En H-r

tríadas, las bases del ADN de la forma inversa tercer capítulo

Hoogsteen enlaces de hidrógeno con los purines de las dos caras

(Figura 10b). Estas tríadas son estables a physiologicalpHand

son, además, se estabilizó en la presencia de bivalentes

cationes.

Otras conformaciones ADN alternativa

Hay otras conformaciones ADN que podría ser

se espera que ocurra en el ADN superenrollado negativamente. Algunos

de ellos están bien definidas estructuralmente, pero aún no se detecta

experimentalmente en el ADN superhelicoidal. Otros han sido

detectado en el ADN superhelicoidal, pero su estructura fina

claro.


H

G

C +

C

G

G

C

Un

T

T

Un

T

Un

Un

T

T

A. Tríadas Hoogsteen B. Invertir Traids Hoogsteen

Figura 10 tríadas H-DNA.


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G-cuarteto

Esta estructura (Figura 11) puede estar formado por repeticiones directas

contiene en tándem funciona concertada de guaninas. La

elementos de construcción se apilan corre G4 que se estabilizan

por algunos cationes monovalentes (Figure11b). Esta estructura es

definitivamente formado por una sola fila en tándem directa del G-ricos

repite (como repeticiones teloméricas en eucariotas) y es

ampliamente caracterizado con una resolución atómica. Sin embargo,

sólo hay indicios fragmentarios que existe en

ADN superhelicoidal.

S-ADN

repite en tándem directo de la composición de forma aleatoria puede

adoptar una estructura llamada cayó de cadena de ADN (S-ADN).

Esta estructura (Figura 12) utiliza la multiplicación repetida

la naturaleza de la secuencia: a la desnaturalización y renaturalización,

las repeticiones complementarias pueden mispair, resultando en una

peculiar combinación de tramos de doble hélice intercaladas

con bucles de cadena sencilla. Esta conformación es

termodinámicamente desfavorables en el ADN lineal, sino que puede

ser atrapado cinéticamente. En el ADN superhelicoidal, podría

son favorables, dada la liberación de importantes

las torsiones. Los lazos pueden ser estabilizado por el hidrógeno

bonos para algunas de las unidades repetidas, por lo que S-ADN, incluso

más factible. Sin embargo, la prueba inequívoca de la

existencia de S-ADN en el ADN superhelicoidal todavía falta.

ADN-desenrollar elementos

Estas son secuencias muy rica en AT con un cierto sesgo

en la distribución de adeninas y timinas entre el

dos cadenas de ADN. Aparte de eso, no hay evidentes

similitudes entre las secuencias de diferentes DNAunwinding

elementos. Bajo la influencia de negativeDNA

superenrollamiento, estos elementos sufren una transición hacia una

estable conformación desenrollado. Esta transición es no cooperativo,

es decir, la longitud de la zona desenrolla poco a poco

aumenta con el aumento de la densidad de superenrollamiento. La

mecanismo de esta transición es poco conocida. DNAunwinding

elementos que se encuentran a menudo en la replicación

orígenes, los sitios de unión de la matriz y otras importantes

elementos de los genomas pro y eucariotas.

Métodos de detección y análisis

superenrollamiento del ADN ha sido analizada por una variedad de

enfoques y sólo los más comunes se describen

a continuación. Uno de los primeros métodos utilizados históricamente fue el

valoración de superenrollamiento densidad por la sedimentación en

bromuro de etidio gradientes de densidad de sacarosa. Este método

se basa en dos hechos: (1) porque las moléculas de superenrollado

son más compactos que los relajados, que los sedimentos más rápido

a través de un gradiente de densidad de sacarosa; bromuro (2) etidio

intercala entre los pares de bases stackedDNA, relajarse

la doble hélice por 268 por la molécula intercaladas. Como

discutido anteriormente, el ADN desenrollado conduce a una liberación de

superhelicoidales negativas. Cuando negativamente ADN superenrollado es

sometido a centrifugación a través de la densidad de sacarosa


(A) (b)

G

C2 N1

C6 N3

C4 C5

O6

H H N2

H

N7 C5

O6

C6

C4

N3

N1

C2

H

N2

H

H

O6 C6

N7

C8

N9

H

R

H N2

H

C2 C4

N3

C6 H

C5 N1

O6

R

R

N9

R C8

H

H

H

N7

N2

H

H

C2 N1

N3

H

C8

C4 C5

N9

N9

G

G

G

K +

N7

C8

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

Figura 11 G-cuarteto. (A) Visión general. La línea de negro es la cadena de ADN y los rectángulos de color morado son los apilados del G-cuartetos. (B) Estructura de un Gquartet.

Figura 12 Formación para el deslizamiento de cadena de ADN por repeticiones en tándem directo.

En caso de separación por cada tira, repite complementarias pueden mispair, resultando en una

combinación de tramos de doble hélice intercalados con una sola fila

bucles. Las franjas rojas y azules son hebras complementarias de un particular

repeticiones en tándem, las tiras de negro son el ADN adyacentes.


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gradiente con concentraciones crecientes de etidio

bromuro, su coeficiente de sedimentación disminuye primero hasta

todos los superhelicoidales negativos se eliminan, sino que aumenta a continuación,

tras la acumulación de supercoils positivos. Por

medir una concentración de colorante crítica necesaria para la

relajación completa de un ADN superenrollado negativamente

muestra su densidad superenrollamiento se puede calcular. Se trata de un

preciso, pero laborioso enfoque y fue posteriormente

reemplazado por métodos menos electroforético complejo.

métodos electroforéticos también se basan en la diferencia

en forma entre superenrollado y relaxedDNAmolecules.

Circular de las moléculas de ADN cada vez más compacta, con un

aumento de la densidad de superenrollamiento y migrar más rápido a través

un gel de agarosa que sus contrapartes relajado. En consecuencia,

sobre la separación de una mezcla de ADN topoisómeros

en un gel de agarosa, una escalera de bandas ofDNA se puede observar,

donde las bandas de vecinos son químicamente idénticos pero

difieren en t por 1. Sin embargo, la resolución de una norma

gel de agarosa no es suficiente para topoisómeros con alta

co densidad de superenrollamiento, y que-la migración como una sola

banda. (Esta es la razón por una muestra de ADN del plásmido que

normalmente s 20,05 migra como una banda única en un

gel.) Para separar estas topoisómeros ADN altamente superenrollado,

electroforesis en gel de agarosa se realiza en el

presencia de un intercalator, por lo general la cloroquina. Por

desenrollar la doble hélice, esto convierte intercalator

altamente superenrollado negativamente topoisómeros en menos superenrollado

otros, lo que permite su resolución en un gel.

La desventaja de la electroforesis de una dimensión es

que no permite el análisis de mezclas complejas de

DNAtopoisomers que a la vez puede incluir tanto

positiva y superenrollado negativamente topoisómeros de

diferentes densidades. Este objetivo puede lograrse mediante el uso de

de dos dimensiones electroforesis en gel de agarosa. Una mezcla de

topoisómeros ADN primero se separa en una norma de agarosa

gel. Aquí la movilidad de forma positiva y negativa

superenrollado topoisómeros ADN aumenta con un aumento

en el valor absoluto de su camiseta hasta que se alcanza la saturación.

Tenga en cuenta que en caso de separación en la primera dimensión,

topoisómeros con el mismo número de vueltas superhelicoidales de

signo opuesto prácticamente co-migrar. Para resolver estos comigrating

topoisómeros, electroforesis en una segunda dirección,

perpendicular a la primera, se desempeñasen en el

presencia de cloroquina. Desde que se desenvuelve la cloroquina

ADN superenrollado negativamente topoisómeros ser menos

superenrollado y migrar con mayor lentitud, mientras que de manera positiva

los superenrollado ganancia supercoils extra y migrar más

rápidamente. En consecuencia, las movilidades de los anteriormente co-emigrado

topoisómeros de signos opuestos se hacen diferentes en

acuerdo con sus reales t. En la foto de arco como se muestra en

(Figura 13), el brazo derecho representa positivamente superenrollado

topoisómeros mientras que el brazo izquierdo corresponde a la negativa

topoisómeros superenrollado.

Mientras que los métodos anteriores se pueden utilizar para determinar la

superenrollamiento densidad de ADN circular, dan poco

información sobre la forma de las moléculas de ADN superenrollado.

Esta pregunta puede ser tratado adecuadamente por

técnicas de microscopía electrónica. La microscopía electrónica

permite que la forma real de una molécula superenrollada ser

visto y el número de cruces por una molécula de ser

contados. La desventaja de la electrónica convencional

microscopía es que la conformación del ADN puede cambiar

durante la preparación de la muestra. Además, es difícil determinar

el signo de un cruce. Estos problemas pueden ser abordados por

criomicroscopía electrónica microscopía. Aquí, una muestra de ADN en un agua

solución se enfría rápidamente to21508C. Como resultado, el ADN

moléculas son capturados en una capa delgada de agua y vitrificados

sus imágenes en tres dimensiones se pueden obtener. Uso de

estos métodos, se ha demostrado que la relación Wr / t 0,75

en el ADN superenrollado y que una fracción significativa de

moléculas superenrollado contienen estructuras ramificadas.

El método más fiable para medir el ADN superenrollamiento

in vivo se basa en la tasa de psoraleno photobinding

al ADN. Este compuesto se intercala en el ADN y pueden

formar un entrecruzamiento con las pirimidinas adyacentes en la

oppositeDNAstrands cuando absorbe luz de 360 nm. Desde

unión de un ADN intercalator desenrolla, que preferentemente

se une a superenrollado, en lugar de ADN relajado. Por lo tanto,

tratamiento de células con psoraleno seguido por la medición de la

eficiencia de psoraleno entrecruzamiento proporciona una estimación de

superenrollamiento densidad en vivo. Un control esencial aquí es la

medición de psoraleno photobinding a un completo

ADN relajado intracelular, lo que se consigue normalmente

saturación de la irradiación de rayos X de las células.

Otro valioso enfoque se basa en la eficiencia de

la formación de estructuras alternativas del ADN in vivo. Por

ejemplo mediante la comparación de la tasa de formación de cruz en

in vitro en condiciones fisiológicas con la de una cruz

formación en el ADN intracelular (determinado según lo descrito

más adelante) una estimación razonable de la densidad de superenrollamiento en vivo puede ser

obtenidos.

También existen numerosos enfoques para el estudio de

estructuras alternativas del ADN in vitro. Una forma topológica de


segunda dimensión

dimensión de primera

0

+1

+5

-10 +10

-5

-1

(A) -15 -20

segunda dimensión

dimensión de primera

0

+1

+5

-10 +10

-5

-1

-15

-20

(B)

Figura 13 análisis electroforético bidimensional de una mezcla de ADN

topoisómeros (a) sin transiciones estructurales locales y (b) con un local

transición hacia una conformación de ADN alternativa. Llena de círculos marrón

representan topoisómeros relajada, llena de círculos rojos son positivamente superenrollado

topoisómeros y lleno de círculos azules son superenrollado negativamente topoisómeros.

Vaciar los círculos azules (b) mostrar el resultado de la movilidad prevista de topoisomers215

TO220 si no se produjo la transición.


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la detección de estas estructuras utiliza gel de dos dimensiones

electroforesis. Si una transición hacia una conformación no-B

se produce, acompañado por la liberación de algunos superhelicoidal

el estrés, la movilidad de los correspondientes topoisómeros

disminuiría. Así, el topoisomer en transición

que co-migran con un topoisomer menos superenrollado en el

primera dimensión de la electroforesis. Debido a la presencia

de un intercalator en la segunda dimensión de la electroforesis,

la tensión superhelicoidal se libera y alternativa

estructuras de ADN se convierten en la B-forma. Posteriormente,

movilidades de los anteriormente co-emigraron topoisómeros se

diferentes, de acuerdo a sus reales t. Un aumento gradual de

movilidad topoisomer se puede ver en la imagen final, hasta que

hay una fuerte caída, lo que refleja la transición (Figura 13b).

Desde su patrón de dos dimensiones, dos características importantes

de una transición estructural se puede obtener: (1)

número de supercoils liberados durante la transición, y (2)

la densidad de superenrollamiento necesarias para la transición. Si el

longitud de la secuencia de la adopción de una nueva configuración es

se conoce, el número de supercoils permitirá a la topológica

situación de esta conformación que se deduce. Medición de la

la densidad de superenrollamiento permitirá que la energía libre necesaria

que se calcula.

La formación de estructuras de ADN alternativa es acompañada

por la aparición de tramos de cadena sencilla

ya sea dentro de las estructuras (como en la cruz o ADN-H)

o en sus fronteras con adyacente B-ADN (como en el Z-DNA).

Por lo tanto, estas estructuras pueden ser detectados por las enzimas y

productos químicos que reconocen específicamente una sola strandedDNA.

Estos agentes se utilizan ampliamente, ya que permiten singlestranded

regiones que se asigna a una resolución de secuencia, es decir,

que proporcionan información estructural bien. Monocatenario

nucleasas específicas de ADN-S1 y P1 son los más comúnmente

utilizada por los enzimas. Superhelicoidal ADN se trata con

cantidades no saturados, de una nucleasa seguido por la restricción

la digestión, al final el etiquetado y la electroforesis en gel de secuenciación.

Como resultado, un patrón de división en un nivel básico puede ser

visto.

También hay productos químicos conveniente que preferentemente

modificar una sola fila bases de ADN. Dietílico pirocarbonato

carboxyethylates purinas en sus posiciones en N7

sola cadena de ADN o la conformación Z. Osmio

formas tetróxido osmate ésteres con el C5-C6 doble enlace

de una sola fila timinas. Cloroacetaldehído formas

ethenoderivatives con las posiciones de apareamiento de bases de

adeninas, citosinas y, menos prominente, guaninas.

El permanganato de potasio oxida timinas monocatenario

y, en menor medida, citocinas. Todos estos

residuos modificados son detectables con una resolución de nucleótidos

después de la escisión piperidina, seguida de la secuenciación del gel

electroforesis.

Los métodos más fiables para el estudio de alternativas

ADN in vivo se basan en la química de sondeo. Algunos de los

productos químicos descritos anteriormente, incluyendo el tetróxido de osmio,

cloroacetaldehído, permanganato de potasio y psoraleno,

penetrar en las células pro-y eucariotas. Intracelular

El ADN es aislado después de la modificación química, con modificaciones,

bases de ADN se detectan. Esto se puede hacer ya sea por

químicos convencionales de secuenciación de ADN o, por cromosómicas

ADN, por métodos más sofisticados de genómica

secuenciación.

Papel de la topología del ADN en el genoma

Funcionamiento

Como se mencionó en el principio de este artículo,

las unidades operativas de prácticamente todos los genomas de ADN son

dominios topológicos. Estos pueden ser simplemente ADN circular,

típica para prácticamente todas las bacterias, mitocondrias y cloroplastos,

ADN, etc, o son grandes bucles adjunta a la

matriz nuclear, como es el caso de los cromosomas eucarióticos.

Por último, los extremos de ADN lineal de algunos virus pueden ser

colocada en la membrana celular. Esto indica que ciertas

características de topológicamente restringida ADN les hizo

ventajosa en el curso de la selección natural.

Una característica importante proviene de ecuación [1]. Esto demuestra que

para un dominio ADN topológicamente cerrado, cualquier cambio de un

secondaryDNAstructure (Tw) se refleja inmediatamente por

un cambio en su forma general (Wr). Por lo tanto, un cambio local en un

topológicamente cerrado ADN, por ejemplo relajarse causada por un

unión a proteínas, se reflejan inmediatamente por un cambio

en el superenrollamiento de la molécula entera, y viceversa. Este

ofrece dos importantes beneficios biológicos. En primer lugar, si es celular

máquinas pueden detectar una relación entre local y global

cambios en el ADN, puede estar seguro de que ambas cadenas de ADN

son integrales, es decir, el ADN no está dañado. Otra garantía de

que el ADN no está roto viene de su superenrollamiento. Como

se discutió anteriormente, es la torsión del ADN superenrollado subrayó,

por lo tanto la aparición de una suela de un solo descanso transición a la competencia dentro de

que conduce a la relajación inmediata. Mientras que el ADN es

superenrollado, no contiene saltos de ADN. Está claro que es

Convendría saber si el ADN está dañado antes de tomar decisiones

en su réplica se hacen. No es de extrañar, son replicones,

por-y-grandes, topológicamente restringida. Tenga en cuenta que este

tema ha sido más estudiado en el procariotas

sistemas, donde se ha demostrado de forma inequívoca

superenrollamiento del ADN que es un requisito previo para la replicación

iniciación. Mientras que algunos estudios insinúan que el mismo es cierto para

eucariotas, se necesitan más datos para apoyar esta conclusión.

El segundo beneficio es que la estructura del ADN en el cambio

un segmento de ADN puede ser inmediatamente detectada en un control remoto

segmento de ADN, es decir, ADN topológicamente son limitados

ideal para la comunicación a distancia. Esto es

importante para muchos procesos genéticos regulada a través de

interacción de dos o más segmentos de ADN separados.

iniciación de la transcripción en pro y eucariotas, por

ejemplo, es a menudo co-regulados por las proteínas que interactúan con

segmentos de ADN separados por cientos o incluso miles

de pares de bases. Este es, sin duda fuera del alcance de un particular



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interacción proteína-proteína en un linearDNAmolecule. Es

ampliamente asumido, por lo tanto, que alguna forma de topológico

la comunicación entre los segmentos de ADN a distancia

involucrados. Del mismo modo, en muchos casos, la recombinación genética

se produce entre los segmentos de ADN muy lejano.

Además de ser topológicamente cerrado, el ADN en la mayoría de

casos es superenrollado. Intracelular del ADN en las bacterias es

de hecho hincapié en la torsión y tiene todas las propiedades de

ADN superenrollado se describe anteriormente. La situación es más

complicado en los eucariotas. Supercoils se acumulan en

la cromatina, donde el ADN se envuelve alrededor de los nucleosomas.

Por lo tanto, a menos que los nucleosomas se quitan, thisDNAis

No torsión restringida. Durante el funcionamiento del genoma,

Sin embargo, los nucleosomas debe ser eliminado o

reubicadas. Se cree, por tanto, que el ADN eucariota

es por lo menos transitoriamente superenrollado. Es revelador considerar

las ventajas biológicas de superenrollamiento del ADN.

DNAis superenrollado negativamente en la mayoría de los organismos vivos,

pro y eucariotas. La razón de que es probablemente el

hecho de que el ADN tiene que ser desenrollada, al menos temporalmente, a

participar en todos los procesos de la genética importante. La replicación del ADN

parte de la primera anulación de la replicación

origen y posteriormente se expande hacia el resto de la

molécula. Durante la transcripción, el ARN polimerasa desenrolla

un ADN de 15 pb a lo largo del segmento a un promotor

seguido de su desplazamiento a lo largo de la plantilla de ADN.

Dos moléculas de ADN intercambiar sus hebras individuales en

el curso de la recombinación homóloga, que requiere

línea de separación en las parejas. Dado que, como se discute

anteriormente, superenrollamiento negativo hace que el ADN desenrollado

energéticamente favorable, todos los procesos anteriores debe

ser facilitado por el superenrollamiento negativo. De hecho, hay

amplia evidencia de que la replicación del ADN, transcripción y

recombinación son estimuladas por el superenrollamiento negativo.

Además, en algunos casos, superenrollamiento negativo es absolutamente

necesarios para esos procesos. Tenga en cuenta, sin embargo, que

los datos más fiables sobre el papel de superenrollamiento del ADN se

obtenidos para el sistema de procariotas, donde el ADN es de hecho

torsión subrayó. Si bien hay datos fragmentarios sobre la

los efectos de superenrollamiento en eucariotas, la situación

es más complicado (ver arriba) y además garantiza

los estudios.

Curiosamente, mientras que los procesos básicos de genética dependen de

DNAsupercoiling, pueden, a su vez, cambia la última. La

mejor estudiados caso de este tipo de relaciones es el proceso de

transcripción. ARN polimerasa desenrolla un segmento de ADN

en un sitio de inicio de la transcripción y se transloca a lo largo de la

gen transcrito. Este ADN translocación fuerzas para girar

alrededor de la elongación de la RNA polimerasa, para que negativas

y ondas positivas de superenrollamiento se generan aguas arriba

y aguas abajo del mismo, respectivamente (Figura 14). Esta así llamada

superenrollamiento transcripcional está bien documentada tanto

in vitro e in vivo. Dado que las ondas se disipan superenrollamiento

rápidamente, el superenrollamiento del ADN de la transcripción es principalmente

dinámica y difiere de la superenrollamiento en estado estacionario

se describe anteriormente. Sin embargo, se sabe que afectan a la estructura y

funcionamiento de los genes que se encuentran en importantes

distancias de un segmento de ADN transcrita.

Algunas arqueas viven en temperaturas extremadamente altas, es decir,

en condiciones en que la separación no deseada de ADN

hebras puede suceder. superenrollamiento negativo sólo

agravar este problema en este caso. Una solución elegante

para este problema encontrado por los termófilos es mantener

su ADN superenrollado positivamente. Desde corrección de los

positivamente ADN superenrollado es energéticamente desfavorable,

esto proporciona una barrera topológica de la cadena de ADN

separación.

Superenrollamiento también mejora sustancialmente la probabilidad

de la yuxtaposición de segmentos de ADN a distancia. Está claro que

equiparación de los dos segmentos de ADN a distancia se produce como

resultado de un randomDNAwalk. Este paseo procede en tres

dimensiones en un nonconstrained (relajado circular o lineal)

molécula de ADN, por lo que la colisión de segmentos distantes

relativamente poco probable. Sin embargo, esta es esencialmente una unidimensional

caminar a lo largo del eje superhélice en barra-como supercoiledDNA

moléculas. Por lo tanto en el ADN superhelicoidal, la probabilidad

del segmento de colisión aumenta en aproximadamente dos órdenes

de magnitud. Esta característica del ADN superenrollado es

importante para los procesos genéticos que requieren colisión de

segmentos distantes de ADN, y está particularmente bien documentado

para la recombinación sitio-específica de las bacterias.

Función biológica de ADN Alternativa

Estructuras

Utilizando los métodos experimentales se discutió anteriormente,

estructuras alternativas del ADN, incluyendo cruciformes, ZDNA

y H-DNA, se ha encontrado que existen en vivo.

A pesar de importantes esfuerzos, sin embargo, sus biológica

funciones siendo difícil de alcanzar. cruciformes de ADN han sido

implicados en la iniciación de la replicación del ADN, la transcripción

y la recombinación en los dos pro-y eucariotas. ZDNA

podrían estar involucrados en el acoplamiento de la transcripción


Figura 14 Un modelo de superenrollamiento del ADN de la transcripción. ARN polimerasa

transloca un segmento de ADN desenrollado a lo largo del gen transcrito. Este

translocación del ADN a las fuerzas para girar alrededor de la polimerasa de ADN, de modo que

superenrollamiento del ADN negativo y positivo se genera aguas arriba y aguas

aguas abajo de la enzima, respectivamente. El círculo gris representa ARN

polimerasa, las cintas de color marrón se desenrolla el ADN, el lazo rojo es un

ola superenrollamiento positivo y azul de la cinta es un superenrollamiento negativo

onda. Flecha indica la dirección del movimiento de la polimerasa.


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10 ENCYCLOPED IA DE CIENCIAS DE LA VIDA / y 2002 Macmillan Publishers Ltd, Nature Publishing Group / www.els.net

alargamiento withRNAprocessing en eucariotas. Se ha

especuló que H-ADN positiva puede regular la

iniciación de la transcripción y replicación, inhibir la transcripción

y el alargamiento de replicación, y sirven como un punto de acceso

para la recombinación homóloga. ADN-desenrollar elementos

Se cree que participar en la iniciación de la replicación.

G-cuartetos podrían participar en el mantenimiento de la integridad

del ADN cromosómico termina en eucariotas. Por último,

varias proteínas que reconocen específicamente estos inusuales

DNAconformations se han aislado y caracterizado.

La proteína más estudiada de este tipo es un eucariota

enzima adenosina deaminasa dsRNA, que une a Z-DNA

con el mayor grado de especificidad. Los estudios futuros se

necesaria para distinguir entre estos numerosos ya veces

ideas conflictivas.

Lecturas

CR Calladine y Drew HR (1997) Descripción de ADN: La Molécula

y cómo funciona. ed segundo. San Diego, EE.UU.: Academic Press.

Frank-Kamenetskii MD (1997) Desentrañar el ADN: El más importante

Las moléculas de la vida. Lectura, EE.UU.: Addison Wesley.

RR Sinden (1994) Estructura y función del ADN. San Diego, EE.UU.:

Academic Press.

Travers Un Interacciones (1993), la proteína ADN. Londres, Reino Unido: Chapman

y Hall.

Vologodskii Una topología (1992) y Física de ADN circular. Boca

Raton, EE.UU.: CRC Press.



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Topología del ADN

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