Bol. San. Veg. Plagas, 30: 635-648, 2004

ENTOMOLOGÍA

Toxicidad en aves (Numida meleagris L.) de insecticidas utilizadosen el control de la langosta (Dociostaurus maroccanus Thunb.)

J. DEL MORAL, E. M. MIGUEL-LASOBRAS, I. S. ÁLVAREZ, A. MURIEL, Fco. PÉREZ-ROJAS, M. SENERO

En Extremadura, para evitar las plagas endémicas de langosta {Dociostaurus maroc-canus Thunb.), se han utilizado procedimientos de control químico (DDT, HCH, feni-trotion, malation y diflubenzuron) y biológicos (el hongo deuteromiceto Beauveria bas-siana Vuill., y el ave depredadora Numida meleagris L., conocida por "Pintada")-

Los experimentos realizados para comprobar el efecto de fenitrotion, diflubenzurony B. bassiana sobre la salud de las Pintadas y los ensayos de teratogeneidad sobreembriones ponen de manifiesto que para controlar las plagas de langosta no parece acon-sejable hacer coincidir el empleo de fenitrotion o diflubenzuron con la utilización deaves depredadoras, mientras que éstas sí pueden compaginarse con el empleo del hongoBeauveria bassiana Vuill.

J. DEL MORAL, A. MURIEL, Feo. PÉREZ-ROJAS, M. SEÑERO: Servicio de Investigacióny Desarrollo Tecnológico. Avda. de Portugal s/n. 06800 Mérida (Badajoz)jmoralv@aym.juntaex.esE. M. MIGUEL-LASOBRAS, I. S. ALVAREZ: Departamento de Biología Celular. Facultadde Ciencias. Universidad de Extremadura. Avda. de Elvas s/n 06071 Badajoz.ialvarez@unex .es

Palabras clave: Fenitrotion, diflubenzuron, Beauveria bassiana, protección integra-da, teratogeneidad

INTRODUCCIÓN

La formación de plagas de langosta es unproblema secular que se desarrolla todos losaños en el sur de España con más o menosintensidad, principalmente en las comarcasesteparias de La Serena (Fig. 1) y Llanos deCáceres (Extremadura), Los Pedroches(Andalucía) y Valle de Alcudia (Castilla-LaMancha).

La lucha química ha sido y es fundamen-tal en la eliminación de Dociostaurus maroc-canus (Fig. 2) en los últimos años. En Extre-madura, el malation ULV( ultra bajo volu-men) distribuido desde avión ha sido un ins-trumento valioso de control desde la décadade los sesenta y hasta el final del siglo XX.En las campañas terrestres, en cambio, se

han empleado distintos específicos: hasta elaño 1986 se utilizó el HCH, a partir deentonces se sustituyó por el fenitrotion, yéste, a su vez, fue cambiado en la década delos noventa por el diflubenzuron aplicadosobre los rodales de puesta ( ÁLVEZ-GÓMEZet al, 1989; ARIAS et al, 1993; DEL MORAL,1986; GARCÍA CONCELLÓN etal., 1987,1988,1991; SÁNCHEZ-GARCÍA et al., 1993); en elmomento actual se emplea, además del diflu-benzuron en el avivamiento, malation sobreadultos.

Los beneficios económicos del control deesta plaga por procedimientos químicos fue-ron calculados por ARIAS et al. (1993) en1000 millones de pesetas de entonces, canti-dad que sería escandalosa si la plaga no secontrolase e invadiese áreas de las Vegas del

Figura 1: La predominancia de pizarras (Dientes deperro) en el suelo de la comarca esteparia de La

Serena es una característica idónea para la formaciónde plagas de langosta.

Guadiana. Aunque esa razón preventivaparece ser incuestionable, la aplicación deinsecticidas tiene un gravísimo inconvenien-te, y es que al envenenar a un elemento de lacadena trófica - la langosta- se está conta-minando gran parte del agrosistema, con locual, la extraordinaria potencialidad comer-cial de estas comarcas rurales -poder presen-tarse ante la opinión pública con productosagrarios naturales obtenidos mediante unaagricultura extensiva- es desbaratada altener que distribuirse, sobre amplias superfi-cies, considerables cantidades de insectici-das con capacidad de contaminar carnes,quesos, miel... y cuyos efectos como cance-rígenos y teratógenos se presume y denunciapor amplios colectivos sociales.

Desde comienzos del siglo XX se hanconsiderado diversas alternativas al empleode insecticidas. La corriente de opiniónactualmente existente en el mundo en contradel uso de insecticidas para combatir plagasestá provocando el planteamiento de formasalternativas al control químico de la langostabasadas en procedimientos naturales. Una deesas formas es el empleo de entomopatóge-nos. Los agentes más prometedores a tal finparecen ser los hongos deuteromicetosBeauveria spp y Metarhizium spp (PRIOR yGREATHEAD, 1989; FENG et al, 1994).

En España también se ha estudiado estaforma de control de la langosta, comprobán-dose que los aislados de Beauveria bassianason los que presentan más posibilidades paraser utilizados como bioinsecticida contra lalangosta mediterránea D. maroccanus. (HER-NÁNDEZ, 1993; HERNÁNDEZ y SANTIAGO,1997).

Pero el empleo de entomopatógenos paracontrolar los insectos, aún cuando se hayacomprobado su eficacia y se demuestre suinocuidad, conlleva el peligro de que necesi-tan una temperatura y humedad precisas paraactuar, y si esto no se produce, el entomopa-tógeno no tiene ningún valor insecticida(GARRIDO, 1994). Es por ello que basar elcontrol de esta plaga en el uso exclusivo deentomopatógenos implica un alto riesgo,razón por la cual no se puede abandonar elcontrol de las plagas de langosta al usoexclusivo de estos insecticidas biológicos,siendo recomendable el concurso de otrosprocedimientos biológicos.

Entre los procedimientos alternativos uti-lizados para el control biológico de las pla-gas de langosta aparece el empleo de anima-les depredadores de la misma. Las referen-cias que tenemos de ello en España son muyantiguas: LÓPEZ-CORDERO y APONTE (1993)extractan unas actas del Cabildo Eclesiásticode Jaén en 1670 donde se describe el proce-

Figura 2: Adultos de langosta en los que se puedeapreciar su capacidad de camuflaje en el suelo de La

Serena.

Figura 3: La facilidad que tiene la pintada paraagregarse es una buena característica de estas aves

para depredar langosta.

dimiento de combatir al parásito mediante elauxilio de cerdos. VÁZQUEZ y SANTIAGO(1993), por su parte, recogen documentosdel siglo XVIII donde se cita el empleo depavos, gallinas e incluso una especie impor-tada de Filipinas {Paradisea tristis L.), con lamisma finalidad. HEREDIA, en 1782, y refi-riéndose a una plaga extraordinaria que huboen Aragón, dice que fueron de gran auxiliolos pavos que se llevaban al campo antes dela salida del sol.

En la bibliografía actual aparecen algunostrabajos que recogen experimentos para con-trolar plagas mediante la depredación conaves. En Kenia, HASSAN*/ al. (1991 y 1992)han puesto a punto un método para emplearpollos como depredadores de parásitos deganado. GREATHEAD (1992) afirma que en elnordeste de África hay ejemplos de depreda-ción de langosta por aves tales como "Mora-bon, White stork, Raven, Hornbill..." cuyacapacidad de depredación es considerable.

En España, DEL MORAL et al (1995,1997,1998 a y b) han elaborado una serie de traba-jos con el interés de utilizar como depredadordel insecto a la pintada (Numida meieagrisL.) (Fig. 3), cuyos resultados evidencian quelas aves muestran un instinto depredador muybien definido, desarrollan su actividad entotal libertad alrededor de sus refugios-corra-les, y su capacidad de exploración es muy

grande. Los resultados de los experimentos yobservaciones realizadas se pusieron en prác-tica en condiciones normales de explotación,demostrándose su viabilidad económica, pro-cedimiento que no sólo es capaz de controlarla plaga sin el uso de insecticidas de síntesis,sino que con él se transforman las plagas delangosta en una carne de consumo humanomuy demandada en la alta culinaria. -En1998 un rebaño de 500 pintadas controló efi-cazmente la plaga de langosta («3 formasmóviles de D. maroccanus/m2) en una fincade 500 ha (DEL MORAL et al, 1999 y 2001;MEJI'AS et al, 1999). Parece suficientementedemostrado que en Extremadura el control delas plagas de langosta se puede hacer eficaz-mente con el uso de insecticidas de síntesis,así como con el uso de entomopatógenos ydepredación mediante aves, pero la utiliza-ción conjunta de los tres procedimientos(Protección Integrada) -tal y como aconsejala OILB (Organización Internacional para laLucha Biológica)-, podría tener una mayoreficacia que el de cada procedimiento usadoaisladamente.

No obstante, la utilización de ese procedi-miento donde coexistan el empleo de insec-ticidas, los entomopatógenos y las avesdepredadoras conlleva un posible riesgo, yaque las aves comerían insectos vivos, perotambién los muertos por el insecticida y elentomopatógeno, desconociéndose, en laactualidad, el efecto que podría tener en lasalud de las aves depredadoras (N. meiea-gris) la ingestión de langostas muertas por elinsecticida o el entomopatógeno.

Adicionalmente, en el control de plagases necesario evaluar la incidencia que loscompuestos químicos utilizados, o en sucaso el agente biológico, tienen no sólosobre el medio ambiente sino sobre la pobla-ción general mediante la transmisión de losmismos a través de la cadena alimentaria. Unmétodo para evaluar la toxicidad potencialde compuestos químicos es el test deembhotoxicidad (JELNIK, 1982). Este test sebasa en la adición del compuesto a evaluaren el medio utilizado para cultivar embrionesde pollo {Gallus galhts) en fase de gastrula-

ción según el procedimiento descrito porNEW (1955). Este test ha mostrado su efica-cia evaluando tanto los efectos teratogénicossobre el desarrollo embrionario, como sobrela fertilidad (NEW, 1990; NISHIGORI et al.,1992). El empleo de este método de evalua-ción de la toxicidad ha sido muy utilizadopara el estudio de compuestos tóxicos de laingesta habitual, como es el caso del etanol(CARTWRIGHT y SMITH, 1995a, 1995b) ytiene plena vigencia para otros compuestosincluyendo los pesticidas.

Parece suficientemente probado que losprocedimientos individuales (químicos ybiológicos) de control de la langosta enExtremadura son eficaces, pero para el dise-ño de un procedimiento de Protección Inte-grada es necesario determinar, con precisión,la inocuidad del entomopatógeno Beauveriabassiana y los insecticidas de síntesis res-pecto a las aves depredadoras (N. meleagris).Éste ha sido el interés de los experimentosdescritos en esta publicación.

ANTECEDENTES

Características de algunos insecticidasempleados contra Dociostaurus marocca-nus en Extremadura

FenitrotionFenitrotion es un insecticida fosforado de

origen japonés y alemán que actúa por con-tacto e ingestión inhibiendo la acetilcolines-terasa (BOVEY, 1984). Su acción sobre lasabejas e insectos auxiliares es elevada, perosu persistencia es escasa -10/15 días- razónpor la que sustituyó ventajosamente al DDTal poco de su aparición en el mercado(ALFARO, 1969, BARBERA, 1976, BROOKS,

1979). En Extremadura se comprobó su efi-cacia contra Dociotaurus maroccanus (DELMORAL, 1986), empleándose desde entoncesy hasta 1993 para evitar las plagas de esteinsecto (GARCÍA CONCELLÓN et al, 1993). LaFAO ha recomendado su empleo contra lasplagas de Langosta (WORTHING et WALKER,1987), y en Kazahstand y Uzbekistan seemplea con dicho fin (LACHININSKII, 2000).

Las cifras dadas para su DL50 por toxici-dad oral agua en ratas son variables segúnlos autores: MARTÍN (1968), LIÑÁN (1981) yFOURNIER y BUNDERF (1983) afirman queestán entre 250 y 500 mgr/kg, mientras queWORTHING y WALKER (1987) establecen unvalor de 800 mgr/kg. Sobre gallinas de pin-tadas (Numida meleagris L.), JUNSHI (1969)determina que la DL50 es de 1880 mgr/kg.Respecto a teratogeneidad, BERLINSKA ySITAREX (1997) determinan que 30 mgr/kgde fenitrotion en ratas no evidencian efectosnegativos.

DiflubenzuronLos insecticidas fosforados empezaron a

ser sustituidos a partir de los años sesentapor los biorracionales, llamados así por sucapacidad de regular el crecimiento o elcomportamiento de los insectos (BELLÉS,

1988). El diflubenzuron fue el primer inhibi-dor de la formación de cutícula que se sinte-tizó (DOMINGO, 1988), actuando preferente-mente en los primeros estadios de desarrollo(GROSSCOURT, 1987).

El diflubenzuron se emplea para controlardiversas plagas de numerosas especies vege-tales en el mundo: en la India contra Schisto-cerca gregaria (RAO et MEHROTRA, 1986); enItalia se ha ensayado contra Psyla pyri (INSE-

RRA, 1987); en Virginia se emplea para con-trolar Lymantria dispar (WHITMORE et al,1993). También se utiliza contra insectosparásitos de hombres y animales: contra mos-quitos (MONTADA et al, 1988, contra Muscadomestica (RUB et al., 1989), para eliminarmoscas de cerdos (ROELOFS, 1998). En Espa-ña se realizó el primer ensayo con difluben-zuron en octubre de 1975 (ROBREDO, 1988),empleándose contra Lymantria monacha(SORIA et al, 1988), y desde 1989 se empleaen Extremadura contra Dociostaurus maroc-canus (GARCÍA CONCELLÓN et al., 1993).

La toxicidad oral aguda (DL50) en rata es>4640 mgr/kg (DE LIÑÁN, 1981; WORTHING

et WALKER, 1987).La toxicidad de diflubenzuron sobre aves

parece ser escasa o nula (Fbz. DE CÓRDOBAet CABEZUELO, 1993, MARTINAT et al, 1987,

MIAO et al, 1988, ROBREDO, 1988, STRIBLINGet SMnH, 1987, WHITMORE et al, 1993).

Sobre diversas especies de abejas su toxi-cidad es muy baja, lo que le hace ser reco-mendable para incluirlo en los programas deProtección Integrada (USHA y KANDASAMY,1986)

En tejidos de hígado, riñones, cerebro ymusculares de humanos, se ha comprobadoque el diflubenzuron actúa inhibiendo lasproteinasas (SALEEM et al., 1995).

Su persistencia sobre los vegetales es alta-En acículas de pino manifestó toxicidadpara Graellsia isabelle dos años después desu aplicación-. En vacas y ovejas se produceabsorción gastrointestinal, siendo metaboli-zado y excretado, pero una parte del produc-to no metabolizado pasa a la leche.

El diflubenzuron es usado en programasde Control integrado (KANDASAMY, 1987),siendo recomendado por la OILB para dichofin sobre plagas forestales (ROBREDO,1988).

Actualmente, en España el fenitrotion y eldiflubenzuron son productos autorizadospara ser aplicados en pastizales contra lan-gosta (DE LIÑÁN, 2003).

Beauveria bassianaLa utilización de hongos en el control bio-

lógico de insectos presenta ventajas impor-tantes frente a otros métodos de control alser inocuos frente a los animales y las plan-tas, y específicos, en algunos casos, para losinsectos. Su persistencia en el medioambiente está relacionada con factores eco-lógicos y climáticos (COREMANS, 1994).

B. bassiana ha demostrado su poderpatógeno (Fig. 4) sobre más de 700 espe-cies de artrópodos pertenecientes a distintosordenes (BALAZY et aLs 1987; DESEO-KOVACS & ROVESTI, 1992; IGNOFFO, 1988;SAMISH et REHACER, 1999). El gobiernochino, por ejemplo, trata anualmente con unpreparado de Beauveria bassiana produci-do en fermentadores distribuidos a lo largode todo el país, de 0,8 a 1,3 millones de ha.para controlar los problemas de plagas(FENG Í-/al., 1994).

Figura 4: El poder patógeno de Beauveria bassiana sepuede medir por su capacidad de infectar y desarrollarse

sobre orugas de Gallería méllemela. En la figura unaoruga totalmente cubierta por micelio del hongo.

En España, las especies reconocidas queatacan a los estados postembrionarios de lalangosta mediterránea (Dociostaurusmaroccanus) son: Beauveria bassiana yMetarhizium anisopliae, (HERNÁNDEZ ySANTIAGO, 1997; JIMÉNEZ MEDINA et al,

1995). Respecto a B. bassiana, JIMÉNEZMEDINA et al. (1997) determinaron que 4,5x 105 esporas/insecto eran suficientes paramatar más del 50% de una muestra de lan-gosta.

En Extremadura, desde el comienzo de ladécada de los noventa se ha evaluado deforma preliminar la posible utilización deeste producto en campo, profundizando enlas diferencias que presentan los distintosmétodos de aplicación, y comparando aisla-dos de esta especie entre sí y con otros per-tenecientes a especies foráneas utilizadascontra langostas (JIMÉNEZ MEDINA et al.,1995).

Los estudios llevados a cabo por PARKERet al. (1997) para evaluar el impacto de lautilización de este hongo sobre la fauna indi-ferente determinan la no aparición de efectosnegativos significativos sobre la misma. Enensayos sobre plagas de algodón no se haobservado acción tóxica sobre fauna auxiliar,aves, peces ni humanos (HINZ et WRIGHT,1997)

Combinación de insecticidas con otrosprocedimientos biológicos para el controlde Dociostaurus maroccanus

Fenitrotion y diflubenzuron son dos espe-cíficos autorizados para combatir la langostasobre pastizales en España (DE LIÑÁN,2003), mientras que los formulados de Beau-veria bassiana registrados actualmente(Botanigard y Naturalis-1), a pesar de losnumerosos experimentos que prueban la efi-cacia de dicho hongo para controlar las pla-gas de langosta, carecen de autorización paraser aplicados contra la misma.

La depredación de langosta con pollos depintada en condiciones naturales ha demos-trado ser un método eficaz para el control deplagas de este insecto, habiéndose determi-nado que un ave de diez semanas de edad escapaz de capturar e ingerir 85 gramos de lan-gosta en una hora de depredación, cantidadque colma la capacidad del buche del ave yque suele saciar a las pintadas durante mediodía (DEL MORAL et al., 1995, 1998a, 1998b,1999,2001).

La combinación de insecticidas junto ala depredación con aves para el diseño deun Programa de Protección Integrada de lasplagas de langosta exige la compatibilidadde los insecticidas entre sí y la inocuidadde los mismos para el ave depredadora.Respecto a esta cuestión, hay autores(ALMEIDA y DINIZ, 1998) que afirmanhaber encontrado una incompatibilidad deBeauveria bassiana con deltametrin, yaque éste afecta al desarrollo, y conse-cuentemente a la eficacia, del hongo; perono parecen existir trabajos sobre la compa-tibilidad o incompatibilidad entre fenitro-tion, diflubenzuron, B. bassiana y pintadas(N. meleagris).

MATERIAL Y MÉTODOS

Determinación en aves de la toxicidadde los insecticidas fenitrotion, diflubenzu-ron y el hongo Beauveria bassiana ingeri-dos junto al pienso

El experimento está definido por lassiguientes características:

* Se dispone de 5 lotes homogéneos de pin-tadas adultas -4 para estudiar el efecto decada insecticida y 1 testigo—, constituidoscada uno por 8 hembras y 8 machos.Todas las aves permanecen enjaulas indi-viduales (Fig. 5), aunque agrupadas lasjaulas de cada lote.

* Cada ave recibe una ración diaria de 100gr. de pienso para gallinas reproductorasque consume "ad libitum" a lo largo deldía.

* Al pienso de cada uno de los 4 lotes deaves se le añaden, diariamente, lossiguientes insecticidas comerciales: feni-trotion del 50%, diflubenzuron del 25% yBeauveria bassiana en medio líquido conuna concentración de 4 x 106 propágu-los/ml -La B. bassiana utilizada corres-ponde a una cepa aislada en la comarca deLa Serena y virulenta sobre D. marocca-nus-. La dosis añadida a cada uno de losinsecticidas está calculada suponiendoque cada ave puede ingerir diariamente150 gr. de langostas muertas por losinsecticidas, usando la DL50 correspon-diente a cada uno de ellos. Dichos valoresestán recogidos en el Cuadro 1.Las aves son observadas diariamente,

registrándose las bajas o síntomas que pre-sentan.

Figura 5: La estabulación de los reproductores depintada facilita el control de la fecundación de huevos

para el estudio de embriones.

Cuadro 1. Forma de utilización de distintos insecticidas sobre aves o los embriones de sus huevos, al objeto deanalizar su toxicidad o teratogeneidad.

1. El análisis de teratogeneidad es sólo para diflubenzuron y Beauveria bassiana2. Cantidad necesaria de insecticida para matar a 150 gr. de langosta según la DL50 de cada producto (WORTHING et

WALKER, 1987)3. Mitad de DL50

Determinación en embriones de avesdel efecto del insecticida diflubenzuron yel hongo Beauveria bassiana ingeridos porlos reproductores junto al pienso.

De las aves alimentadas con pienso conta-minado por diflubenzuron y B. bassiana a laconcentración especificada en el Cuadro 1 einseminadas artificialmente por sus respecti-vos machos, se obtienen 500 huevos/trata-

Figura 6: La extracción de semen de los machos depintada permite realizar una inseminación artificial de

las hembras y controlar la obtención de embriones.

miento a lo largo de 25 semanas. El semen seextrae a los machos (Fig. 6) una vez a lasemana, mediante la técnica de BURROWS yQUINN (1935) y seguidamente se procede ainseminar a las hembras de su mismo lotepor medio de una micropipeta graduada.

La recogida de huevos se efectúa diaria-mente, colocándose en cartones de celulosacon el polo agudo hacia abajo y almacenán-dose en una cámara frigorífica hasta su aná-lisis. Este análisis consiste en abrir los hue-vos y anotar en cada caso si existe o noembrión (fecundados/no fecundados) y encaso de la presencia de embrión, anotar siéste está muerto, presenta alteracionesmayores del desarrollo, o bien es normal.Las alteraciones se determinan mediante laextracción del embrión del huevo y suobservación detallada se hace en un este-reo-microscopio binocular. Por alteracionesmayores se entienden aquellas que afectan ala formación del sistema nervioso, lasextremidades y el corazón y que son obser-vables sin una disección adicional delembrión.

Determinación del efecto de la terato-geneidad del diflubenzuron y de la Beau-

Insecticida Análisis de toxicidad en aves y Análisis deteratogeneidad en embriones(l), por teratogeneidadingestión por las aves reproductoras por contacto con

de pienso contaminado embriones

Cantidad de Insecticida/100 gr Insecticida/medio depienso/día/ave de pienso cultivo de embriones

veria mediante contacto directo conembriones de aves en cultivo.

Para evaluar la toxicidad como teratógenodel insectida diflubenzuron, se incuban 120huevos de pintada por un periodo de 12 a 16horas en una incubadora con 95% de hume-dad y a temperatura de 38.5° C. Una vezextraído el embrión, éste se coloca sobre unmedio de cultivo que consiste básicamenteen una mezcla de albumen y agar en propor-ciones iguales, y que soporta el crecimiento"in vitro" del embrión (NEW, 1955). Estemedio es utilizado como control, y 20 de losembriones se dejan crecer por un periodo de24 h sobre el mismo para confirmar el desa-rrollo normal hasta que se completa la fasede neurulación (24 horas en cultivo). Conotros 20 embriones, se utilizan distintas con-centraciones de diflubenzuron en el mediode cultivo (desde lmg/ml hasta 0.01 mg/ml),hasta llegar a una concentración de estudiode 0.1 mg/ml (Cuadro 1) en la cual se obser-va el efecto teratogénico. Con esta concen-tración de estudio se analizan un total de 80embriones, anotándose en cada caso las alte-raciones producidas en el desarrollo. En elcaso de la Beauveria, es añadido un extractode la misma al medio de cultivo para alcan-zar después del periodo de cultivo una inva-sión completa del medio por este hongo. Elmétodo de cultivo y las observaciones a rea-lizar sobre las modificaciones que se produ-cen en el desarrollo embrionario son las des-critas por el grupo de Alvarez (SCHOENWOLF

y ALVAREZ, 1989; RODRÍGUEZ-GALLARDO et

al, 1997; LLAMAS-CHICOTE, 2000).Algunos embriones, tanto controles como

tratados con la concentración de estudio dediflubenzuron, son procesados para el análi-sis de la muerte celular programada o apop-tosis mediante la técnica de TÚNEL (Termi-nal UTP Nick End Labeling). Este procedi-miento consiste básicamente en fijar losembriones con paraformaldehido 4% toda lanoche para después ser incubados durante 2hcon nucleótidos unidos a fluoresceina y conla enzima dexosi-nucleotidil transferasa ter-minal (TdT), que añade estos nucleótidos alos extremos libres producidos por la frag-mentación del ADN que se produce durantela apoptosis. Las células que se encuentranen proceso de apoptosis son detectadasposteriormente mediante una reacción inmu-nocitoquimica por unión de un anticuerpoanti-fluoresceina conjugado con peroxidasay su posterior revelado con diaminobenzidi-na (DAB). La técnica de TÚNEL seguidapara embriones de pollo en cultivo es la des-crita por MIGUEL-LASOBRAS (2002).

RESULTADOS

Efecto en las aves de los insecticidasingeridos por las mismas

Los resultados obtenidos para valorar elefecto sobre las aves de 3 insecticidas ingeri-dos junto al pienso están recogidos en elCuadro 2.

Cuadro 2. Resultado de alimentar a distintos lotes de aves con diferentes insecticidas más un testigo a lo largo de41 semanas de observación.

Insecticida Dosis N° aves del N° aves Tiempo durante el cualinsecticida/ave/día experimento muertas se mueren las aves a

partir del comienzodel experimento

Figura 7: Resultados de los análisis de teratogeneidad de diflubenzuron y B. bassiana en embriones de aves cuandoéstas son alimentadas con pienso contaminado con los insecticidas.

Figura 8: Resultados de los análisis de teratogeneidad de diflubenzuron en embriones de aves cuando los embrionesson puestos en contacto con distintas concentraciones del insecticida.

Teratogeneidad de los insecticidas en eldesarrollo embrionario de las aves• Fasel. Análisis del tratamiento en la ali-

mentación.Los resultados generales obtenidos eneste estudio se muestran en la Figura 7.Cuando los insecticidas son incorporadosdirectamente a la alimentación de las pin-tadas, la mayoría de los huevos presentantasas de fecundación similares a las pinta-das con alimentación control.

• Fase 2. Análisis de la teratogeneidad de losinsecticidas por contacto con embriones

Figura 9: Análisis de la muerte celular tanto enembriones control como en embriones tratados condiflubenzuron. Después de 4 horas en cultivo (HH4)puede observarse cómo la muerte celular programada

se ve incrementada en los embriones condiflubenzuron como se indica por la línea marcada

con puntos. Después de 24 horas de cultivo (HH10),los embriones tratados además de tener incrementadala muerte celular con respecto al control, presentanuna reducción considerable de tamaño (véase las

flechas indicativas) y ausencia de formación del tuboneural. Las barras indican 0.5 mm.

Para este estudio se utilizó el compuestodiflubenzuron como representativo de uninsecticida de amplio uso y que había deno-tado una tendencia a la teratogeneidad en lafase 1. El hongo Beauveria bassiana se utili-zó para poder comparar si el test de embrio-toxicidad era útil comprobando dos trata-mientos. En el caso del diflubenzuron, y paraun tamaño muestral de 80 embriones seobtiene aproximadamente un 40% deembriones que fracasan en el desarrollo, un40% de embriones con alteraciones severas yun 20% de embriones normales para unaconcentración de 0.1% (peso/volumen). Losresultados completos de los efectos obteni-dos para las distintas concentraciones, asícomo en los embriones control se muestranen la Figura 8.

El análisis detallado de las alteracionesproducidas pone de manifiesto que el efectomás significativo del diflubenzuron se produ-ce sobre el crecimiento inicial del embrióndurante la fase de gastrulación, con un retardosignificativo del crecimiento y fallo en la for-mación del tubo neural. El análisis de lamuerte celular programada o apoptosismediante la técnica de TÚNEL pone de mani-fiesto que ésta se incrementa de manera con-siderable respecto a los embriones control, ypor lo tanto el diflubenzuron produce unadegeneración de las células embrionarias.Ejemplos de los resultados obtenidos condiflubenzuron se presentan en la Figura 9.

La cepa de Beauveria bassiana utilizadano produce modificaciones significativas deldesarrollo embrionario con respecto a losembriones control a pesar de la invasión totalpor parte del hongo del medio de cultivo.

DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos respecto a latoxicidad de fenitrotion sobre las pintadas,cuando éstas son alimentadas con un piensocontaminado por el insecticida, confirman supeligrosidad para aquellas, incluso a unaDL50 mucho más baja que la señalada porJUNSHI, (1969). Estos resultados parecen serútiles para el diseño de un Programa de Pro-

tección Integrada contra la langosta en elcual se quiera incluir el fenitrotion y las pin-tadas, ya que si un ave comiese en un día 150gr. de langostas muertas por el insecticida-cantidad habitual de langostas depredadaspor las aves- tendría muchas probabilidadesde morir también.

El diflubenzuron añadido a la alimenta-ción de las aves provoca alteraciones enembriones procedentes de éstas, aunquedichos resultados no parecen diferir signifi-cativamente con respecto a los embrionescontroles. No obstante, cuando se analiza elcomportamiento por contacto del insecticidacon los embriones, el resultado evidenciauna teratogeneidad del mismo con efectodirecto sobre el desarrollo embrionario a

concentraciones equiparables a las usadas enlos tratamientos de campo.

La suspensión de Beauveria bassiana, a laconcentración ensayada, no produce toxici-dad sobre las aves ni teratogeneidad alguna.

Con los resultados obtenidos no pareceque sea aconsejable el uso simultáneo defenitrotion y diflubenzuron junto a las pinta-das depredadoras en un Programa de Protec-ción Integrada.

AGRADECIMIENTOS

Los trabajos presentados en este artículose han financiado con fondos del proyectoIFD97-1509 del Ministerio de Educación yCiencia.

ABSTRACT

DEL MORAL J., E. M. MIGUEL-LASOBRAS, I.S. ALVAREZ, A. MURIEL, Feo. PÉREZ-ROJAS, M. SEÑERO. 2004. Toxicity in birds (Numida meleagris L.) of insecticides used forthe control of the locust (Dociostaurus maroccannus Thunb.) plague. Bol. San. Veg. Pla-gas, 30: 635-648.

In Extremadura, several chemical (DDT, HCH, fenitrotion, malation y diflubenzuron)and biological (the fungus deuteromiceto Beauveria bassiana Vuill., and the predatorbird Numida meleagris L., known as "Pintada") procedures have been used to avoid theincidence of the plagues produced by the locust (Dociostaurus maroccanus Thunb.). Ourexperiments with fenitrotion, diflubenzuron and B. bassiana about their toxicity and tera-togenicity on the "Pintadas" allow us to conclude that, within a program of integral pro-tection against the locust's plagues, it is not desirable the use of fenitron and diflubenzu-ron together with predator birds. By the contrary, there is not incompatibility in the useof birds and the application of B. bassiana.

Key words: Fenitrotion, diflubenzuron, Beauveria bassiana, integral protection, tera-togenicity.

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(Recepción: 6 febrero 2004)(Aceptación: 7 mayo 2004)