TRABAJO DE BACTERIOLOGIA

1 TIPOS DE SIEMBRA EN AGAR

1.-Técnica de siembra para aislamiento:

1.1.-ESTRÍA MÚLTIPLE:

Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la placa con agar nutritivo, en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el agar.

Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este proceso se repite sucesivamente, flameando

y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estría. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en

posición invertida.

Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado número de gérmenes.

Ejemplo de resultado con estría múltiple

Ejemplo de estría múltiple crecida

1.2-TÉCNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES:

Se divide la placa en cuatro cuadrantes.

Se toma el inóculo y se siembra consecutivamente en 1-2-3-4.Incubar.

En el cuarto cuadrante, al menos, obtendríamos colonias aisladas.

1.3.- SIEMBRA POR AGOTAMIENTO (O EN SUPERFICIE)

Se realiza una descarga y se realiza estría por toda la placa.

2.-SIEMBRA PARA RECUENTO:

2.1.--Técnica de Barry

En una placa de Petri vacía se deposita un pequeño volumen conocido de muestra y a continuación se añade el medio de cultivo (agar nutritivo) fundido y atemperado aproximadamente a 45ºC. Se mezclan ambos por rotación suave de la placa. De esta forma los microorganismos se distribuirán de forma homogénea en el medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.

2.2.-de inoculo a dilución conocida y con asa de Dygraski (Barry modificada):

Depositar sobre la superficie de una placa con agar nutritivo una gota ó 0,1 ml de una determinada dilución del cultivo de microorganismos problema y extenderlo con ayuda del cayado, previamente esterilizado, en todas las direcciones hasta que esté completamente seco. Incubar la placa, en posición invertida, a la temperatura deseada (durante 24, 48 ó 72 horas) según el tipo de microorganismo.

La posición invertida evitará que el agua de condensación se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtención de colonias aisladas.

Es una técnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente la dilución.

2.-CÁLCULOS PARA SACAR LA CANTIDAD DE BACTERIAS EN UNA MUESTRA

Método de   conteo   en placa o recuento de colonias . Introducido por Kaas para evitar los riesgos del cateterismo vesical y diferenciar bacteriuria verdadera de contaminación, se realiza de la siguiente manera:

Se homogeneiza la muestra mediante agitación.

Se diluye la muestra al 1:100, colocando 0.1 ml. de orina en 9.9 ml. de caldo de tripticasa o de suero fisiológico, estériles.

Se preparan diluciones al 1:1000 y 1:10 000, a partir de la dilución al 1:100.

Se deposita 1 ml. de cada dilución en placas de Petri esterilizadas, sobre las cuales se vacía un tubo de agar-tripticasa o medio CLED, fundidos y enfriados a 45°. Mediante rotación suave, se favorece la distribución homogénea de la siembra.

Se incuban todas las siembras a 37° durante 24 a 48 horas.

Para calcular el número de colonias se eligen placas que contengan entre 30 y 300 colonias. Contadas éstas, basta multiplicar su número por la dilución respectiva para obtener la cuenta total.

Método del   asa calibrada . Esta estimación cuantitativa consiste en sembrar una placa con medio de agar-sangre o agar con CLED en una muestra de orina, sin centrifugar, empleando asa de platino calibrada (4 mm. de diámetro). Después de incubar las siembras a 37° durante 24 a 48 horas, se cuenta el número de colonias desarrolladas y el resultado se multiplica por 100, ya que la asada de platino contiene 0.01 ml. de orina.

Los resultados del estudio cuantitativo se informan de la siguiente manera:

No hubo desarrollo microbiano.

Menos de 10 000 colonias por ml.

Entre 10 000 y 100 000 colonias por ml.

Más de 100 000 colonias por ml.

Cuando se obtienen dos recuentos sucesivos con más de 100 000 colonias por ml., la probabilidad de infección es de 80%, cifra que se eleva a 95% si el mismo resultado se logra en tres recuentos sucesivos.

Por lo general, las muestras contaminadas tienden a mostrar cuentas inferiores a 10 000 colonias/ml. Cuando el recuento revela valores intermedios, entre 10 0000 y 100 000 colonias /ml, el examen debe repetirse. Conviene advertir que pueden pasar inadvertidas infecciones urinarias verdaderas, si no se toman en cuenta cuentas inferiores a 100 000 colonias por ml, ya que existen diversos factores que pueden explicar recuentos bajos en infecciones urinarias verdaderas, diuresis acentuada, obstrucción uretral, infecciones crónicas e infecciones por cocos grampositivos.

Nosotras vimos en un video:

Si el método de siembras fue de estrías entonces se hacia los cálculos :

Primera estría 10000 UFC x ml de orina

Segunda estría 1000000UFC x ml de orina

Tercera estría 1000000 o más UFC x ml de orina

3.- ANTIBIOTICOS Y MEDIDAS PARA LA RESISTENCIA Y SENSIBILIDAD BACTERIANA.

El antibiograma es la prueba microbiológica que se realiza para determinar la sensibilidad de

una colonia bacteriana a un antibiótico o grupo de antibióticos.

El antibiograma, una vez realizado, da la siguiente información:

Grado de sensibilidad de la colonia bacteriana a un determinado antibiótico.

Diferencia de sensibilidad por parte de la colonia a diferentes antibióticos.

Con esta información, se clasifica el efecto del antibiótico sobre esa determinada colonia en:

Resistente (R), Intermedio (I) y Sensible (S).

En el ámbito clínico, el estudio sobre la bacteria causante de la infección y sobre el antibiograma es

entregado al médico responsable del paciente. Este último es quien se encarga de decidir el tipo de

antibiótico adecuado, dependiendo de los resultados del antibiograma y de otros factores

procedentes del paciente, como por ejemplo una alergia a la penicilina.

En una placa de Petri, se siembra la bacteria por "siembra en césped" para que esta pueda crecer de manera homogénea por toda la placa. Acto seguido, se colocan los discos difusores, unas pequeñas cápsulas que contienen antibiótico, que liberan al medio. Las placas se incuban y pasado el tiempo pertinente (varía según la especie de bacteria) se observa. Las bacterias habrán crecido por toda la placa salvo en las zonas impregnadas con el antibiótico.

Dado que la concentración de antibiótico es menor a mayor distancia del disco difusor, llegará un momento en que la bacteria crecerá tolerando la ínfima concentración de antibiótico. A esta distancia se le denomina "radio de inhibición".

Las propias empresas farmacéuticas que distribuyen los discos difusores tabulan, en centímentros, el radio de inhibición que debería provocar tal antibiótico para ser considerado Sensible,Intermedio o Resistente. El bacteriólogo se ocupa de medir con regla el radio y considerarlo según las tablas.- Antibiograma

Una vez que se ha determinado que un cultivo es significativo, el microbiólogo debe realizar el antibiograma. Para tal fin, resulta suficiente en la mayoría de los casos, el ensayo de difusión con discos en agar (método de Kirby-Bauer). Si bien los detalles técnicos de este método pueden encontrarse en una variedad de libros de texto, por lo que no serán discutidos en esta entrega, la elección de los discos no es una práctica sencilla.

Antibióticos sugeridos para ensayarcon fines terapéuticos en infecciones urinarias

DROGA

Antibiótico a ensayar (x) en :

Enterobacteria

BNNF Estafilococo Enterococo

A I

PEN       x*  

AMP x x   ^ x

AMS x x x@ x  

OXA       x*  

CTN x x   ^  

TMS x x   x  

NIT x x   x x

NOR x x x x x

CIP ^ ^ ^ ^ ^

CTX   x      

CAZ   x x    

IMI   x x    

GEN   x x   x&

AMK   x x    

PIP   x x    

VAN       x x

PEN, penicilina; AMP, ampicilina; AMS, aminopenicilina-sulbactama; OXA, oxacilina; CTN, cefalotina; TMS, cotrimoxazol; NIT nitrofuranto«na; NOR, norfloxacina; CIP, ciprofloxacina; CTX, cefotaxima o ceftriaxona; CAZ, ceftacidima; IMI, imipenem; GEN, gentamicina; AMK, amicacina; PIP, piperacilina; VAN, vancomicina. A, ambulatorio; I, internado, BNNF, principalmente Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumanniiï Probar PEN para informar AMP y OXA para informar OXA y CTN, @ sÚlo en A. baumannii, & con disco de alta carga, sÚlo en internados. ^ Informar AMP, CTN, y CIP de acuerdo a los resultados de PEN, OXA y NOR, respectivamente.

La tabla muestra una lista de antibióticos sugeridos para ensayar sólo con fines terapéuticos. Por lo tanto, la tabla no incluye ciertas drogas útiles para la vigilancia de algunos mecanismos de resistencia de importancia clínica, ni para la búsqueda de resistencia asociada, ni para la sospecha de determinadas especies por el antibiotipo. El microbiólogo debe recordar que lo importante es ensayar e informar los antibióticos de elección para el tratamiento de la IU y los que sean apropiados para las distintas especies (no informar un antibiótico frente a una especie que es naturalmente resistente al mismo). Finalmente, se debe considerar el precio y la toxicidad de la droga. Es decir, tratar de informar la droga más barata y menos tóxica, cuando esto sea posible