Trancripción 3 Junio 2009/ II parte.

Mariela Guevara Solera.

Prof: Pedro García.

Aquí se hace la analogía entre lo que sucede con la formación de acetales y hemiacetales. La formación de un hemiacetal se da si se agrega alcohol a un carbonilo, y si se agrega otra molécula de alcohol se forma el acetal. El acetal es muy estable y ya no va a tener el equilibrio con el carbonilo que tiene el hemiacetal.

Esto es análogo a lo que tenemos aquí, sólo que en vez de oxígeno tenemos un nitrógeno (hemiaminal). El hemiaminal puede entrar en equilibrio con su forma abierta donde tenemos el carbonilo (aldehído) y la amina que es análogo al alcohol y a partir de esto puede darse una formación de la cetona α-β insaturada por la eliminación del hidrógeno más ácido, que sería el que está a la par del carbonilo.

Entonces se forma la acroleína y la fosforamida con la mostaza nitrogenada, la cual es la parte activa. Esta activación de la ciclofosfamida y de la difosfamida es muy importante saberla.

La acroleína y la fosforamida que si pueden entrar en contacto con las hidrolasas o inclusive con agua, porque el fósforo tiene mucha afinidad por el oxígeno y se libera la mostaza nitrogenada dentro del cuerpo.

A manera de resumen, se va a liberar la mostaza nitrogenada y la acroleína a partir de la ciclofosfamida, cuya activación se dio por el CYP 450 hidroxilando una posición en el anillo del compuesto.

Pedro comenta que le pongamos mucha atención a lo que él dice que es importante…posiblemente es de examen.

Ifosfamida:

Importante notar que en esta estructura uno de los cloruros de alquilo se encuentra unido a el nitrógeno del ciclo. Entonces lo que pasa con la ifosfamida es que se pueden dar dos tipos de hidroxilaciones. Esta hidroxilación en cuestión se va a ver desfavorecida por el impedimento estérico, y cuando rota también hay que tener en cuenta que esta axial, que esta ecuatorial y este tipo de cosas, pero lo más importante es que va a haber una cadena que va a estar rotando y puede tapar su función. Esto puede generar que cuando la molécula se hidroxile se pierde ClCH2CHO y forma una acroleína, generando metabolitos inactivos porque ya no se va a tener la potencia del catión tiaziridinio que puede alquilar.

Entonces el problema de la ifosfamida es que su activación va a ser mucho más costosa que la de la ciclofosfamida. Esto implica que vamos a tener que usar dosis más altas para lograr el mismo efecto.

Vean también que cuando se hidroxila en el ciclo se va a formar la acroleína y la “cuasi” mostaza nitrogenada que es el metabolito activo.

Básicamente lo que tenemos es un problema de activación y lo que hacen para resolverlo no es cambiar la estructura sino aumentar la dosis.

Acroleína:

Tiene cierta actividad citotóxica pero va a ser muchas veces menor que la de un agente alquilante como las mostazas nitrogenadas. Su problema principal es que causa cistitis hemorrágica porque se acumula en los túbulos renales.

Entonces este va a ser uno de los problemas que va a tener la ciclofosfamida, además de los problemas en general de anticancerígenos como depresión de médula ósea, sed desecante, úlceras, caída de pelo, diarrea, etc. va a tener como característica este problema.

Siendo este problema clínicamente relevante, se generaron compuestos que neutralizaran esa acroleína. A partir de esto se generó la N-acetilcisteína que se usa también para otro tipo de intoxicaciones (como por acetaminofén), Mesna (el más usado en la CCSS para disminuir la toxicidad de ciclofosfamida). Éstos van a actuar a través de una reacción de Michael que es una adición 1,4.

La N-acetilcisteína y el Mesna ambos tienen un sulfhidrilo, que se van a oxidar y se quenchean con un radical y en plasma van a formar disulfuros, que son reducidos por la glutatión transferasa en riñón y aquí obtengo de nuevo sulfhidrilos, que se agregan por una reacción de Michael a la acroleína.

Si nosotros queremos que se dé la inactivación de la acroleína y que sea menos tóxica debemos de hacerla más polar, porque estoy en riñón y no quiero que se reabsorbe (que es uno de los problemas de la acroleína, que se reabsorbe, se reabsorbe, etc). Esto se logra por pérdida de doble enlace y ganancia de un hidroxilo.

El Mesna es 2-mercaptoetanosulfonatosódico y la N-acetilcisteína lleva acetil, y si es cisteína lleva su respectivo carboxilo y amina. Formo compuestos polares que se excretan con facilidad, y disminuyen los efectos tóxicos y la cistitis hemorrágica.Les adjunto aquí lo que apunto en clase, donde el R difiere para Mesna y N-acetilcisteína, como se comentó en el párrafo anterior :

Como resumen: El Mesna entra en plasma, se hace un sulfhidrilo que se oxida y pasa a sulfuro. Una vez que llega a riñón la glutatión transferasa renal va a generar que se produzcan otra vez los sulfhidrilos y esos sulfhidrilos reaccionan por una reacción de Michael con la acroleína.

Pregunta: Este compuesto que se forma, cuando se les pega el tiol, a pesar de que se excreta en orina sigue teniendo actividad citotóxica? Pedro dice que realmente no sabe si se pierde la actividad de cistitis hemorrágica pero el hecho de que se excrete es beneficiario. No es importante la citotoxicidad comparada con la de la mostaza nitrogenada que está del otro lado del compuesto. Esta parte la queríamos eliminar para que no cause cistitis hemorrágica.

Se administran de forma concomitante, Pedro no sabe si en la misma bolsa de infusión.

Siguiendo con lo que son prodrogas, talvez las que se presentan a continuación no son tan importantes pero son una estrategia interesante para ver un ejemplo de cómo la estructura puede ser diseñada para atacar un sitio del organismo en específico:

El tejido tumoral tiene poca irrigación, por lo tanto va a ser un ambiente que carece de oxígeno. Si carece de oxígeno, no vamos a tener la capacidad oxidante del mismo y por lo tanto ese tejido va a estar en un ambiente reductor. A la hora de hacer compuestos, se pueden hacer prodrogas que estén en su forma oxidada que en el cuerpo no van a ser oxidadas porque hay suficiente presencia de oxígeno pero cuando llega al tumor se va a reducir y generar el compuesto activo.

Habíamos dicho que un -OH o una amina activa la mostaza y la hace menos estable y más tóxica. Un grupo nitro en esa misma posición la haría inactiva y más estable. Podemos generar un compuesto con un grupo nitro, que se puede pasar a amino en un ambiente reductor y con eso mejoro la toxicidad y se enfocan más al cáncer en sí.

Aquí tenemos el ejemplo:

Un nitro en un ambiente reductor, con alta cantidad de electrones, va a generar un radical y luego de una serie de reducciones se genera la amina. Igual un compuesto azida va a generar el radical y luego de eso libera dos aminas, una por cada nitrógeno. Es importante saber el ambiente en que voy a trabajar, las enzimas, condiciones, favorece ciertas reacciones, si uso compuestos más o menos solubles, etc.

Extractores (nitro) en “para” respecto al nitrógeno previenen la ciclación del aziridinio porque desestabilizan aún más el catión aziridinio al tener una gran conjugación a lo largo del resto del compuesto y se puede reducir a la amina la cual si sería mucho más activa.

Por el otro lado, la azida puede formar la amina y dar el catión aziridinio con mucha más facilidad. Esto siempre pensando que va a ocurrir con más frecuencia en tejido tumoral.

Se recalca que lo más importante de la clase pasada:

¿Qué hace que un anticancerígeno sea específico al cáncer?

Primero dicen que p53, pero todas las células lo tienen.

Pedro dice que alta proliferación celular y va a estarse replicando el ADN con más facilidad. Si esto pasa se pueden dar alteraciones en p53, pero esto no va a decirnos que las células normales no tienen p53.

A esta alta tasa de metabolismo es muy importante que se están produciendo constantemente proteínas, transcribiendo el ADN y traduciendo el ARN entonces eso va a generar que si nosotros queremos algo que nos ataque la DNA polimerasa de un tejido cancerígeno va a ser mucho más fácil porque van a estar en mayor concentración.

Después, volviendo a lo de los receptores. Por ejemplo, un tejido como mama va a tener receptores estrogénicos. ¿Pero qué va a tener más cantidad de receptores estrogénicos…un tejido normal o un tejido cancerígeno con un alto metabolismo que necesita de esos impulsos y esas señales para continuar proliferando? Lo que pasa no es que el tejido normal no tenga receptor, si lo tiene pero en mucho menor cantidad.

Pedro dice que específicamente para lo que es tejido mamario existe una familia de receptores que se llama HER (además de otros tipos de receptores presentes). A esta familia de receptores se dirigen específicamente los anticuerpos monoclonales como Pracixumab (para HER2). HER significa Hormone estrogen receptor.

Con esto de los receptores es más que todo una cuestión de expresión, recordemos que cáncer es un descontrol en la proliferación metabolismo y crecimiento.

Luego tenemos otra mostaza nitrogenada, quizá un ejemplo un poco más abstracto. Es un complejo con metales: El Co+3 pasa a Co+2 entonces tiene un espacio menos para un ligando al ganar un electrón y hace que se dé la liberación de la mostaza nitrogenada que se va a alquilar al ADN.

Después tenemos otro, un grupo nitro bien lejos de la mostaza nitrogenada pero igual por conjugación extrae carga, se reduce, se forma el grupo amino y facilita que el nitrógeno sea más básico, y pueda extraerse el hidrógeno, se dé la reacción de eliminación y se libere la mostaza con el otro compuesto inactivo.

Este otro tiene una porción quinona que se reduce y forma la hidroxiquinona. Aquí hay interacciones fuertes entre la nube de la densidad electrónica del metilo y nitrógeno. El enlace rota y entonces se da lactonización espontánea, se forma la lactona y se libera la mostaza nitrogenada. Eso no ocurría antes porque teníamos la presencia de carbonilos y de hidroxilos.

Lo importante de esto es ver como las cosas adquieren una conformación diferente, como depende mucho de un simple cambio en la estructura el ser activo o inactivo. Una vez que se da la lactonización libera el mefalam….. (no se entiende).

Importante acá, había dicho que un enlace carbonilo nitrógeno va a ser muy estable (el más estable de los derivados de ácido). Pero al formarse un ciclo de 6 va a ser la fuerza motriz para que la reacción se dé.

Los ciclos más estables son de 5, 6,7.

DE ESTO NO ENCONTRE EL DIBUJO, LE PREGUNTO A PEDRO MAÑANA SOBRE ESTA PARTE DE LA CLASE.

Derivados de Aziridinio:

Son un grupo extractor de electrones con tres aziridinas. Ya esto no sería un ión aziridinio porque tendría una carga positiva.

Al tener tres aziridinas hace que tenga tres sitios en los cuales pueda alquilar el ADN. Desde la perspectiva de Pedro, el considera que sería difícil alquilar el ADN en tres sitios, por efecto estérico, pero en dos si es perfectamente realizable.

Primero se hicieron derivados de aziridinio con donadores de electrones, y ahora vean que estos son grupos extractores, similar a un grupo carbonilo sólo que más débil.

Al hacerlo con donadores de electrones, ellos pensaban que éstos iban a donar cargas negativas a los nitrógenos, va a aumentar la pka de estos nitrógenos, los hace más básicos y nucleofílicos y se va a dar la formación del catión aziridinio por protonación. Se puede decir que el compuesto actúa como una base, que interacciona con una molécula de agua para formar el catión aziridinio.

Lo que vieron es que éstos eran muy activos para la clínica y por lo tanto eran muy tóxicos. Pero ellos idearon poner el extractor de electrones que disminuye la actividad, como el grupo

esterfosforamida, el enlace doble sulfuro fósforo. Además, generaron el TEM donde los nitrógenos van a estar extrayendo electrones y estabilizándolos por conjugación dentro del anillo aromático lo que lleva a disminuir la actividad y mejorar el perfil de toxicidad.

Siempre andamos buscando mejorar toxicidad y actividad.

Teníamos entonces lo que pasaba con los compuestos muy básicos que se protonaban, llegaban y alquilaban el ADN fácil y eran tóxicos. También, estos otros compuestos que era por un mecanismo similar a una … quimérica llega el nucleofilo y abre el ciclo. La fuerza motriz la da la inestabilidad de un anillo de tres y genera la alquilación, se protona y genera el compuesto neutro.

Se usan en clínica los que no se protonan porque son muy reactivos.

Se van a protonar los que tienen donadores de electrones, y los que tienen extractor no. El fosforoamida es extractor porque actúa como un carbonilo, tiene una carga positiva y va a hacer que se dé una conjugación. De estos ninguno es donador, un grupo donador podría ser un grupo alifático por inducción y no por donación de carga directamente.

En el TEM se extraen electrones por los nitrógenos y además porque esto funciona casi como un aromático. Al tener un aromático se van a estabilizar los pares de electrones por resonancia.

Es mejor un extractor, como los tres anteriores.

Tenemos las benzoquinonas, que son alquilantes bifuncionales y por ende pueden generar buenos resultados.

Son menos polares y van a cruzar BHE.

Cuando fueron probados en estudios clínicos no fueron más activos o fueron citotóxicos . También se les atribuye una vida media corta por la reducción de la quinona.

Entonces se puede ver, que este grupo no es tan importante.

Metanosulfonatos (Busulfán):

Funcionan porque el metanosulfonato es un buen grupo saliente. Es aún mejor grupo saliente que el acetato. Es un buen grupo saliente porque el ácido de este grupo es un ácido más débil.

Dentro de estos compuestos tenemos el Busulfán, lo tiene la CCSS ( Pedro dice que va a tratar de pasarnos unas fotocopias de la LOM: Lista Oficial de Medicamentos). El metanosulfonato actúa como un electrófilo al igual que las mostazas nitrogenadas nada más que es un grupo saliente muy bueno, no necesita que se forme el catión aziridinio, para que se dé la alquilación. (no entendí muy bien esta parte)

Se ha visto por SAR, que el compuesto que presenta una separación de 4C es el más activo. Esto es lo ideal para generar un puente cruzado entre dos hebras de ADN, o en una misma hebra de ADN.

En cuanto a toxicidad, muy importante depresión de médula ósea, daño a tejidos, cartílago, etc.

Tenemos el buen grupo saliente, porque es un grupo grande y la estabilidad del anión que genera es bastante grande.

En el metabolismo se encontró la producción de ese compuesto como metabolito, y a partir de eso se genero la idea de que el busulfán reacciona con la cisteína: El sulfhidrilo ataca, metanosulfonato sale, por una reacción de SN2, se da ciclación por la SN2 intramolecular y a partir de acá se da una beta eliminación que genera un aminoácido que ya no va a tener el grupo sulfhidrilo y el compuesto “tiopano” se oxida y eso es lo que se encuentra en la orina.

Este es un ejemplo de lo que se hace para estudiar el metabolismo en fármacos. Se parte de sustancias en orina, heces y otros fluidos corporales, se cuantifican los metabolitos tanto en control como personas que están recibiendo el compuesto y a partir de lo encontrado se hace una retrobiosíntesis para ver de dónde salió ese compuesto.

Nitrosureas:Fueron descubiertas en 1959 a partir de 1-metil-3 nitrosoguanidina (antileucémico).

La guanidina tiene dos nitrógenos, se hizo un SAR, se obtuvieron muchos compuestos, pruebas biológicas y se vio que en la N-metil-N-Nitrosurea cambiando la amina por el carbonilo se mejoraba la actividad.

Además, después se vio que si le agregamos una función 2-cloroetil como la de las mostazas nitrogenadas se va a dar un aumento de la lipofilicidad y un aumento de la actividad. Recordar que un aumento de la actividad siempre nos va a llevar a aumentar la toxicidad.

Los más utilizados de éstos, que están en la CCSS son: Lomustina, carmustina, nimustina.

De estos que tenían el grupo cloroetil, todos aumentan la lipofilicidad, a excepción de Tauromustina, esto por el grupo sulfonato, que podemos ver que es la diferencia con los otros compuestos. Este no atraviesa la BHE.

Los compuestos son altamente tóxicos pero son bastante utilizados y forman parte de la LOM en su gran mayoría.

Pedro comenta que además de la LOM existe una lista de medicamentos de compra. Muchos de los medicamentos que vemos acá son de la LOM, pero hay veces en que se mandan a hacer pedidos especiales para cierto tipo de pacientes cuyo cáncer presenta resistencia a medicamentos, mostazas nitrogenadas, etc. Son fármacos más nuevos, no tan utilizados y que no van a ser vistos aquí con profundidad.

El grupo nitro debilita el enlace nitrógeno carbono, y digamos que antes cuando teníamos la guanidina que tenía un nitrógeno, ese enlace era aún más estable todavía porque es casi que un enlace de un carbono alifático con una amina. Entonces al incluir el carbonilo eso nos mejoró la actividad y al incluir el nitro también porque vamos a ver que se forman dos especies: un isocianato que va a inhibir la reparación de ADN por la carbomoilación y un diazeno hidróxido que forma un diazonio y este compuesto como es un electrófilo bastante positivo va a generar que el R salga con facilidad y alquile el ADN. Por eso, ese R nos interesaba que fuera el R de las mostazas nitrogenadas, un cloroetil.

El proceso de alquilación sobre el ADN va a ser el que va a dar la citotoxicidad y la actividad antitumoral. El proceso de carbamoilación que es básicamente con una amida y un nucleófilo inhibe la reparación del ADN, porque la carbamoilación va dirigida a proteínas y no van a ser las enzimas que están encargadas de reparación como topoisomerasa, ADN polimerasa, etc.

Entonces vemos que si se inhibe la reparación del ADN y se aumenta la fragmentación por la actividad citotóxica que puede tener al alquilar el N7 de la guanina vamos a tener una actividad citotóxica por los dos lados, y por eso es que son bastante tóxicos.

Otra cosa importante es que al uno carbomoilar una proteína, esta cambia su conformación tridimensional, y por ende va a dejar de reparar el ADN.

Esto es nada más para que lo vean, cual es la descomposición de las nitrosureas cuando están en solución. La nitrosurea va a estar en equilibrio con su forma enólica y el agua va a poder hacer una adición y a partir de ahí se va a hacer el corte que va a generar un metabolito inactivo, un diazeno hidróxido que como vimos forma el triazonio, que alquila el ADN y el enol también va a formar con un nucleófilo de la proteína (un –OH, un H2, SH) un aducto carbomoilado que hace que la proteína pierda su función.

Aquí lo importante es que se carbomoila, se alquila, afecta la citotoxicidad como se genera la especie a partir de un electrófilo muy activo y va alquilar ADN con facilidad.

Esta última diapositiva es muy importante ( y la menos que se oye en la grabación…buu) Aquí se genera el diazeno hidróxido que va a generar la sal de diazonio y el nitrógeno recupera sus electrones y alquila el ADN en el sitio 6.

Esto más allá de decir que la nitrosurea se alquila en el oxígeno 6 ilustra lo que pasa si se alquila en el oxígeno 6. En otras palabras, siempre vamos a tener los N7 alquilados, esta es otra opción de lo que pasa y otra explicación de la citotoxicidad del compuesto.

Al alquilarse la guanina en el oxígeno 6, el nitrógeno que está a la par vean que está en su forma ceto, puede pasar a enol y otra vez desplazar al cloruro y formar un ciclo nuevo, el cual puede ser atacado por otro nucleófilo, abrir el ciclo de 5 y generar lo que es un enlace cruzado de ADN.

Hay que ver que a pesar de ser no ser un alquilante bifuncional, puede funcionar como tal.

A manera de introducción para la próxima clase, se tienen nitrosureas que van a ser hidrofílicas, habíamos visto que nimustina, lomustina y carmustina son lipofílicas y atraviesan barrera. Las hidrofílicas son análogos de streptozotocina que presenta un azúcar que la hace bastante lipofilo, a partir de un SAR, se hacen mas hidrofilicos que hacen que sean más fácil de eliminar y menos toxicos, No se saben si son más o menos potentes aún, ya que el uso de estos es diferente y no está caracterizado aún de forma clínica.