EQUIPO 6:EQUIPO 6:AGUILAR GARCA TANIA ELIRERANGEL GUERRERO SERGIO ISRAELSALGADO ALBARRN MARISOLVALERIO CABRERA SARA

Proceso por el cual

DEFINICIN

Proceso por el cual el ADN libre se incorpora a la clula receptora y provoca un cambio gentico.

EXPERIMENTO DE GRIFFITH

COMPETENCIA

Slo ciertas cepa denominadas COMPETENTES son transformables

Una clula capaz de adquirir una molcula de DNA y transformarse es COMPETENTE.

Propiedad heredable.

Algunas veces est gobernada por protenas especiales que juegan un papel en la captacin y procesamiento del DNA.

Protena de fijacin del DNA asociado a membrana. (autolisina y nucleasas)

Para ser competentes, las bacterias requieren factores de competencia. Pptidos pequeos que se expresan en la membrana y permite la fijacin y entrada del ADN.

A 10 ml de medio LB (Luria-Bertani) previamente autoclavado se le aaden, "picando" de una colonia, las bacterias (E. coli).

2. Se deja crecer en agitacin y a 37C hasta que llega a una D.O. de 0.6-0.7

3. Poner en hielo rpidamente en cuanto se retiren de la agitacin.

4. Se centrifugan a 5 C durante 7 minutos a 4000 r.p.m. en una centrfuga de mesa (8000 g)

Preparacin de clulas competentes.

5. Se descarta el sobrenadante y al pellet (bacterias) se le aaden 5 ml de CaCl2 0.1 M

6. Se mantienen las bacterias en hielo durante 10 minutos.

7. Se vuelve a centrifugar 5 minutos a 2500 r.p.m. en la misma centrfuga (2500 g)

8. Descartamos el sobrenadante y al pellet se le aade 1ml de CaCl2 0.1 M fro

9. Aqu tendremos ya las clulas competentes, que pueden conservarse a -80C.

Transformacin

La entrada del DNA a las clulas es independiente de: La fuente del DNA La secuencia del DNA

Es dependiente de: Es dependiente de: Tamao Hebra simple o doble Lineal o circular

El DNA exgeno pasar a la descendencia slo si ste se integra al DNA genmico de la clula o si tiene su propio origen de replicacin (Ori)

Procedimiento

DNA

Clulas competentes

Shock TrmicoIncubar en hielo

Incubar en hielo

Medio de

cultivoClulas

Incubar 37CMedio selectivo

Pasos crticos Mantener siempre a las clulas en hielo

Trabajar en condiciones aspticas

Shock Trmico siempre a la temperatura y tiempo indicadoindicado

Primera incubacin en medio rico en nutrientes sin antibitico

Plaquear en medio selectivo

INTEGRACIN DEL DNA INCOPORADO

INTEGRACIN DEL DNA INCOPORADO

DNA unido a la superficie de la clula por una protena de unin al DNA.

Puede incorporarse el fragmento bicaternario entero o una nucleasa degrada una cadena mientras se fija la otra.

DNA incorporado se asocia con una protena de competencia especfica, que permanece unida al DNA, evitando una ataque por una nucleasa, hasta que llega al cromosoma, donde lo captura la protena RecA.

El DNA integrado es integrado al receptor o por recombinacin.El DNA integrado es integrado al receptor o por recombinacin.

Replicacin del DNA hbrido, se forma una molcula parental y otra molcula de DNA recombinante.

Segregacin en la divisin celular, lo molcula de DNA recombinante estar en la clula transformada.SOLO DNA LINEAL.

Transformacin de DNA DEL PLSMIDO se efecta en ausencia de recombinacin entre e plsmido y cromosoma bacteriano.

Insercin de un fragmento de DNA en una molcula de DNA linearizada(vctor) permite multiplicar determinados fragmentos de DNA en clulashusped.

Vectores: plsmidos (molculas de DNA circulares presentes en lanaturaleza con ms de 100 kbp, que poseen un origen de replicacin ypueden multiplicarse independientemente del genoma del husped.

Se linealiza el DNA del plsmido con la misma enzima de restriccin quese usa tambin para fabricar el fragmento de DNA de inters; acontinuacin se mezclan ambos DNA.

Los extremos cohesivos de los fragmentos de DNA hibridan con losextremos libres del DNA vector y cubren el hueco en el DNA del plasmido.

El resultado: DNA VECTOR CIRCULAR AUMENTADO.

Una DNA ligasa precinta la rotura de la hebra.

El plsmido recombinante se introduce en la bacteria donde puedemultiplicarse.