Transformacin de Plantas de Tomate Verde (Physalis ixocarpaBrot. var. rendidora) con el Gen oc-I (Oriza cistatina I)Jorge Cesar Cisneros F.

RESUMEN Se utiliz un sistema de transformacin por medio de Agrobacterium tumefaciens para introducir el gen oryza cistatina I (oc-I) en el genoma de Physalis ixocarpa variedad Rendidora. Se inocularon explantes de hoja con la cepa EHA-R 105 de A. tumefaciens portando el vector pCAMBIA::oc-I que contena el gen reportero glucuronidasa (uidA) y el gen marcador de seleccin neomicina fosfotransferasa (nptII), controlados por el promotor 35S.se seleccionaron cuatro lneas transgnicas (JM-05-II, DJ-01-I, DJ-08-II y DJ-12-III), y slo una lnea fue morfolgicamente normal.

OBJETIVO En el presente trabajo se reporta la transformacin gentica de plantas de Physalis ixocarpa var. Rendidora con el gen oc-I, como una alternativa biotecnolgica para el control de plagas.

MATERIALES Y MTODOSMaterial vegetal Semilla germino en in vitroTratamiento - 0.1% (v/v) de Tween 20 -20 min.- hipoclorito de sodio al 20% (v/v). - etanol al 95% durante 10 seg.Incubacin Medio MS13-15 das - 28C - fotoperiodo -16 h luz y 8 h sombra - intensidad luz 70 mE (mM/m2/s)Transformacin de A. tumefaciens con el pCAMBIA::oc-I.-cepa EHA-R 105 se realiz por el mtodo de cruza triparental utilizando las cepas DH5a y RK2003 de E. coli.- E. coli se medio LB a 38C con agitacin 210 rpm durante 24 h- A. tumefaciens en medio YEBa 28C con agitacin constante a 180 rpm durante 48 h.Cultivo de E. coli y A. tumefaciens

MATERIALES Y MTODOSTransformacin gentica del tejido vegetal.Medio lquido MS al 50% haciendo varias micropunciones A. tumefaciens cepa EHA-R 105 durante 30 mmedio lquido MS incubaron -48 h a 28C en oscuridad.Los explantes / cultivaron Lavado 3- MS al 50%2- agua estrilmedio slido MS al 100%conteniendo 0.1 mg/L de cido indolactico (AIA), 100 mg/ L de kanamicina y 500 mg/L de cefotaxima

MATERIALES Y MTODOSEnsayosEnsayo histoqumico de -glucuronidasa (Gus).Ensayo de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)Ensayo de inhibicin de papana.Detectar la actividad de la enzima glucuronidasa para identificar los posibles brotes transformados de Physalis ixocarpa.Un trozo de hoja delbrote se coloc en la solucin Gus, se incuba 37C durante 24 h en oscuridad. Y se elimino la clorofila. detectar la presencia de los genes introducidos al genomade P. ixocarpa se purific el DNA de las plantas por el mtodo de CTAB, utilizando 300 mg de tejido vegetal, y se disearon oligonucletidos para amplificar fragmentos de los genes oc- I, nptII y uidALa actividad enzimticade la papana se analiz de manera indirecta por la produccinde p-nitroanilina, de tonalidad amarilla,

RESULTADOSRegeneracin de plantas transgnicas.Semana 1: Observ un alargamiento de los explantes. Semana 2. Se apreciaron los primeros indicios de la formacin de callo.Semana 3 - 4. Se observ la formacin de callos. Semana 5. Los explantes se transformaron completamente enCallo.Semana 6. Se empezaron a generar brotes adventicios. Despus los brotes setransfirieron a medio MS para inducir la formacin de racescon la adicin de auxina.Finalmente, las plantas se transfirieron a macetas con tierra estril y se mantuvieron a 28C- 30C y condiciones de luz controladas .

180 plantas. Se seleccionaron cuatro lneas para los estudios posteriores y se nombraron JM-05-II, DJ-01-I, DJ- 08-II y DJ-12-III.lneas mostraron una respuestapositiva (coloracin azul) a la reaccin de GUS.

RESULTADOSAnlisis por PCR de los genes oc-I, uidA y nptII.Se amplificaron por PCR fragmentos correspondientes a losgenes de seleccin (nptII), reportero (uidA) y de inters (oc-I) para analizar su presencia en el genoma de tomate. Se Confirm la transformacin gentica de las diferentes lneas analizadas.Ensayo de la transcripcin inversa-PCR.Se analiz la expresin del gen de inters (oc-I) utilizando el RNA total de las plantas transformadas.La intensidad de la bandas fue diferente para cada una de ellas; la lnea DJ-12-III mostr amplificacin con mayor intensidad, lo que sugiere una mayor expresin del gen.La banda de amplificacin de la lnea DJ-08-II fue la de menor. Las otras dos lneas, DJ-01-I y JM-05-II, mostraron una intensidad de amplificacin intermedia entre las lneas DJ-12-III y DJ-08-II.

RESULTADOSInhibicin de la actividad enzimtica de la papana.Se realiz utilizando extractos solubles obtenidos del tejido vegetal.Lnea que mostr la actividad inhibitoria ms alta fue DJ12-III con un 48% de inhibicin. Seguida por JM-05-II, DJ-01-I y DJ-08-II con un 33.7, 30.1 y 24.4% de inhibicin.Alteraciones fenotpicas observadas en las plantas transgnicas.La lnea DJ-12-III . Esta planta perdi ladominancia apical y desarroll una gran cantidad de races areas. Las hojas mostraron un enrollamiento hacia el interiordel has y fueron alargadas.Las lneas DJ-01-I y JM- 05-II desarrollaron un fenotipo similar.La lnea DJ-08-II, que mostr el ms bajo porcentaje de inhibicin tuvo un aspecto fenotpico semejante a las plantas silvestres y fue la nica lnea que se pudo aclimatar a tierra hasta desarrollar flores y frutos.

DISCUSINCuatro lneas denominadas DJ- 01-I, DJ-08-II, DJ-12-III y JM-05-I fueron seleccionadas para realizar los anlisis moleculares y bioqumicos posteriores.La incorporacin del gen oc-I en el genoma de las plantas se analiz por PCR.La intensidad de las bandas amplificadas fue diferente para cada lnea transgnica.La lnea DJ-12-III mostr la mayor intensidad de banda y su contraparte fue la lnea DJ-08-II.Expresin del gen oc-I probablemente se debe a que el gen se insert en diferentes lugares del genoma, lo que afect su expresin gentica o a que en las lneas de mayor expresin se insert ms de una copia del gen.

DISCUSINLa lnea DJ-12-III fue la que desarrollo ms alteraciones fenotpicas, algunas de las cuales fueron prdida de dominancia apical, alargamiento del tallo y pecolo, el tallo principal present varias bifurcaciones meristemticas, present clorosis y un ensanchamiento de la lmina foliar, as como el enrollamiento hacia el interior del as de la hoja.

Las semillas obtenidas de la lnea DJ-08-II podrn ser utilizadas en un trabajo futuro para analizar el efecto de la transformacin sobre plagas o patgenos que utilizan como estrategia de invasin.

BIBLIOGRAFIA Jos Mara Martnez-Oceguera, Rafael Gutirrez-Campos, Ernesto Garca-Pineda, 2006. Transformacin de Plantas de Tomate Verde (Physalis ixocarpa Brot. var. rendidora) con el Gen oc-I (Orizacistatina I). Revista Mexicana de Fitopatologa, vol. 24, nm. 1, enero-junio, 2006, pp. 13-19, Sociedad Mexicana de Fitopatologa, A.C. Mxico.

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