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Editada e impresa por AENORDepósito legal: M 14598:2011

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© AENOR 2011

Reproducción prohibida

Génova, 6

28004 MADRID-Espa

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biología de los alimentos para conl

ración de las muestras de ensayo, suones decimales para examen microbioló

5: Reglas específicas para la preparctos lácteos

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ogy of food and animal feeding stuffs. Preparation of test samples, i

or microbiological examination. Part 5: Specific rules for the(ISO 6887-5:2010).

ogie des aliments. Préparation des échantillons, de la suspension

l'examen microbiologique. Partie 5: Règles spécifiques pour la prép

SO 6887-5:2010 .

ma es la versión oficial, en español, de la Norma Europ

vez adopta la Norma Internacional ISO 6887-5:2010.

ma anula y sustituye a la Norma UNE-EN ISO 8261:2

rma ha sido elaborada por el comité técnico A

rios cuya Secretaría desempeña FIAB.

ERVACIONES A ESTE DOCUMENTO HAN DE DIRIGIRSE A:

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ISO 6887-5

Marzo 2011

umo humano y

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ea EN ISO 6887-5:2010,

02.

N/CTN 34 Productos

19 Páginas

102 201

104 032

Grupo 14

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S


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NORMA EUROPEA EUROPEAN STANDARD

ORME EUROPÉENNE EUROPÄISCHE NORM

EN ISO 6887-5Agosto 2010

ICS 07.100.30 Sustituye a EN ISO 8261:2001

Versión en español

Microbiología de los alimentos para consumo humano y animalPreparación de las muestras de ensayo, suspensión inicial y

diluciones decimales para examen microbiológico

Parte 5: Reglas específicas para la preparación de leche y productos lácteos(ISO 6887-5:2008)

Microbiology of food and animal feedingstuffs. Preparation of test samples, initialsuspension and decimal dilutions formicrobiological examination. Part 5:Specific rules for the preparation of milkand milk products. (ISO 6887-5:2010).

Microbiologie des aliments. Préparationdes échantillons, de la suspension mère etdes dilutions décimales en vue de l'examenmicrobiologique. Partie 5: Règlesspécifiques pour la préparation du lait etdes produits laitiers. (ISO 6887-5:2010).

Mikrobiologie von Lebensmitteln undFuttermitteln. Vorbereitung vonUntersuchungsproben und Herstellungvon Erstverdünnungen und vonDezimalverdünnungen fürmikrobiologische Untersuchungen.Teil 5: Spezifische Regeln für dieVorbereitung von Milch undMilcherzeugnissen. (ISO 6887-5:2010).

Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 2010-03-25.

Los miembros de CEN están sometidos al Reglamento Interior de CEN/CENELEC que define las condiciones dentro delas cuales debe adoptarse, sin modificación, la norma europea como norma nacional. Las correspondientes listasactualizadas y las referencias bibliográficas relativas a estas normas nacionales pueden obtenerse en el Centro deGestión de CEN, o a través de sus miembros.

Esta norma europea existe en tres versiones oficiales (alemán, francés e inglés). Una versión en otra lengua realizada bajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada al Centro de Gestión, tiene el mismorango que aquéllas.

Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalización de los países siguientes: Alemania, Austria,Bélgica, Bulgaria, Chipre, Croacia, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia,Hungría, Irlanda, Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal,

Reino Unido, República Checa, Rumanía, Suecia y Suiza.

CEN COMITÉ EUROPEO DE NORMALIZACIÓN

European Committee for StandardizationComité Européen de NormalisationEuropäisches Komitee für Normung

CENTRO DE GESTIÓN: Avenue Marnix, 17-1000 Bruxelles

© 2010 CEN. Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.


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EN ISO 6887-5:2010 - 4 -

PRÓLOGO

El texto de la Norma EN ISO 6887-5:2010 ha sido elaborado por el Comité Técnico ISO/TC 34 Productos alimenticios en colaboración con el Comité Técnico CEN/TC 275 Análisis de los productosalimenticios. Métodos horizontales, cuya Secretaría desempeña DIN.

Esta norma europea debe recibir el rango de norma nacional mediante la publicación de un texto idénticoa ella o mediante ratificación antes de finales de febrero de 2011, y todas las normas nacionalestécnicamente divergentes deben anularse antes de finales de febrero de 2011.

Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento estén sujetosa derechos de patente. CEN y/o CENELEC no es(son) responsable(s) de la identificación de dichosderechos de patente.

Esta norma anula y sustituye a la Norma EN ISO 8261:2001.

De acuerdo con el Reglamento Interior de CEN/CENELEC, están obligados a adoptar esta norma europealos organismos de normalización de los siguientes países: Alemania, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre,Croacia, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría,Irlanda, Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal,Reino Unido, República Checa, Rumanía, Suecia y Suiza.

DECLARACIÓN

El texto de la Norma ISO 6887-5:2010 ha sido aprobado por CEN como Norma EN ISO 6887-5:2010 sinninguna modificación.


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- 5 - ISO 6887-5:2010

ÍNDICE

Página

PRÓLOGO .............................................................................................................................................. 6 1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN ............................................................ ................. 7 2 NORMAS PARA CONSULTA ........................................................... .................................. 7 3 TÉRMINOS Y DEFINICIONES ........................................................... ............................... 7 4 PRINCIPIO............................................................................................................................. 8 5 DILUYENTES ............................................................ ......................................................... ... 8 5.1

Materiales básicos .................................................................................................................. 8

5.2 Diluyentes de uso general ........................................................... ............................................ 8 5.3 Diluyentes para casos especiales ............................................................... ........................... 10 5.4 Distribución y esterilización del diluyente ................................................ .......................... 12 5.5 Ensayo de rendimiento para el control de calidad ............................................................ 12 6 APARATOS .......................................................................................................................... 13 7 PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS ............................................................................ 13 7.1 Productos congelados ........................................................................................................... 13 7.2 Productos secos y duros ....................................................................................................... 13 7.3 Productos líquidos y no viscosos ......................................................................................... 14 7.4 Productos heterogéneos ....................................................................................................... 14 8 PROCEDIMIENTOS GENERALES ........................................................ ......................... 14 8.1 Generalidades ....................................................................................................................... 14 8.2 Toma de muestras ................................................................................................................ 14 8.3 Caso general para los productos ácidos .......................................................... .................... 14 8.4 Alimentos de alto contenido en materia grasa (contenido en materia grasa > 20%

en fracción en masa) .............................................................. ............................................... 15 9 PROCEDIMIENTOS ESPECÍFICOS .......................................................... ..................... 15 9.1 Leche y productos lácteos líquidos ............................................................. ......................... 15 9.2 Leche en polvo, suero de leche en polvo, suero ácido de leche deshidratado,

suero de mantequilla en polvo y lactosa ............................................................................. 15 9.3 Queso y productos elaborados a base de queso ................................................................. 16 9.4

Caseína ácida, caseína láctica, caseína al cuajo mediante hidrólisis enzimática(caseína rennet) y caseinatos................................................................................................ 16

9.5 Mantequilla ........................................................................................................................... 17 9.6 Helados .................................................................................................................................. 17 9.7 Natillas, postres y nata (pH > 5) .......................................................................................... 17 9.8 Leche fermentada y nata agria (pH < 5) ............................................................................ 18 9.9 Alimentos infantiles a base de leche .......................................................... .......................... 18 10 DILUCIONES DECIMALES SUCESIVAS ...................................................................... 18 BIBLIOGRAFÍA ..................................................... ........................................................ ...................... 19


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ISO 6887-5:2010 - 6 -

PRÓLOGO

ISO (Organización Internacional de Normalización) es una federación mundial de organismos nacionalesde normalización (organismos miembros de ISO). El trabajo de preparación de las normas internacionalesnormalmente se realiza a través de los comités técnicos de ISO. Cada organismo miembro interesado enuna materia para la cual se haya establecido un comité técnico, tiene el derecho de estar representado endicho comité. Las organizaciones internacionales, públicas y privadas, en coordinación con ISO, también

participan en el trabajo. ISO colabora estrechamente con la Comisión Electrotécnica Internacional (IEC)en todas las materias de normalización electrotécnica.

Las normas internacionales se redactan de acuerdo con las reglas establecidas en la Parte 2 de lasDirectivas ISO/IEC.

La tarea principal de los comités técnicos es preparar normas internacionales. Los proyectos de normasinternacionales adoptados por los comités técnicos se envían a los organismos miembros para votación.La publicación como norma internacional requiere la aprobación por al menos el 75% de los organismosmiembros que emiten voto.

Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento puedan estarsujetos a derechos de patente. ISO no asume la responsabilidad por la identificación de cualquiera o todoslos derechos de patente.

La Norma ISO 6887-5 fue preparada por el Comité Técnico ISO/TC 34, Productos alimenticios,Subcomité SC 9, Microbiología.

Esta primera edición anula y sustituye a la Norma ISO 8261|IDF 122:2001, que ha sido revisada técnicamente.

La Norma ISO 8261|IDF 122:2001 fue elaborada por el ISO/TC 34/SC 5 Leche y productos lácteos, y con

su visto bueno, ha sido renumerada como ISO 6887-5 y revisada técnicamente por el ISO/TC 34/SC 9 conlas siguientes modificaciones:

a) la introducción de agua de peptona tamponada como un disolvente de uso general;

b) el precalentamiento sistemático del disolvente se mantiene sólo para aquellos casos en los queresuelve problemas de homogeneidad de la suspensión;

c) la eliminación de la etapa de reactivación.

La Norma ISO 6887, consiste en las siguientes partes, bajo el título general Microbiología de losalimentos para consumo humano y animal. Preparación de las muestras de ensayo, suspensión inicial ydiluciones decimales para examen microbiológico:

− Parte 1: Reglas generales para la preparación de la suspensión inicial y las diluciones decimales.

− Parte 2: Reglas específicas para la preparación de carne y productos cárnicos.

− Parte 3: Reglas específicas para la preparación de pescados y productos de la pesca.

− Parte 4: Reglas específicas para la preparación de productos distintos a leche y productos lácteos,carne y productos cárnicos y, pescados y productos de la pesca.

− Parte 5: Reglas específicas para la preparación de leche y productos lácteos.

La siguiente parte está en elaboración:

− Parte 6: Reglas específicas para la preparación de muestras tomadas en la etapa de producción

primaria.


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- 7 - ISO 6887-5:2010

AVISO La utilización de esta norma internacional puede suponer el uso de equipamiento, procedimientos ymateriales peligrosos. Es responsabilidad del usuario establecer las prácticas de seguridad e higiene adecuadas ydeterminar las limitaciones reglamentarias de aplicación con anterioridad a su puesta en práctica.

1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

Esta parte de la Norma ISO 6887 define las reglas para la preparación de las muestras de leche y productos lácteos y desus suspensiones para el examen microbiológico cuando las muestras necesitan una preparación diferente de losmétodos generales descritos en la Norma ISO 6887-1. La Norma ISO 6887-1 define las reglas generales para la prepara-ción de la suspensión inicial y de las diluciones decimales para el examen microbiológico.

Esta parte de la Norma ISO 6887 excluye la preparación de muestras en métodos de análisis de detección y recuento para los que los detalles de la preparación se describen en las correspondientes normas internacionales.

Esta parte de la Norma ISO 6887 resulta aplicable para:

a) leche y productos lácteos líquidos; b) productos lácteos en polvo;

c) queso;

d) caseína y caseinatos;

e) mantequilla;

f) helados;

g) natillas, postres y nata;

h) leche fermentada y nata agria;

i) alimentos infantiles a base de leche.

2 NORMAS PARA CONSULTA

Las normas que a continuación se indican son indispensables para la aplicación de esta norma. Para las referencias confecha, sólo se aplica la edición citada. Para las referencias sin fecha se aplica la última edición de la norma (incluyendocualquier modificación de ésta).

ISO 707|IDF 50 Leche y productos lácteos. Directrices para la toma de muestras.

ISO 6887-1 Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Preparación de las muestras de ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para examen microbiológico. Parte 1: Reglas generales para la preparaciónde la suspensión inicial y las diluciones decimales.

EN ISO 7218 Microbiología de los alimentos para consumo humano y alimentación animal. Requisitos generales y guía para el examen microbiológico.

ISO/TS 11133-2 Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Guía para la preparación y producción de medios de cultivo. Parte 2: Guía práctica para las pruebas de rendimiento de medios de cultivo.

3 TÉRMINOS Y DEFINICIONES

Para los fines de este documento, se aplican los términos y definiciones siguientes:

3.1 muestra de laboratorio:

Muestra preparada para su envío al laboratorio y destinada a su inspección o análisis. NOTA Adaptado del capítulo A.19 de la Norma ISO 7002:1986[1].


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ISO 6887-5:2010 - 8 -

3.2 porción para análisis:Volumen medido o masa medida de una muestra representativa, recogida de la muestra de laboratorio y destinada a la

preparación de la suspensión inicial.

3.3 suspensión inicial; dilución inicial:Suspensión, disolución o emulsión obtenida cuando se ha mezclado una cierta cantidad medida o pesada del productoexaminado (o de una muestra para análisis preparada a partir del producto), utilizando en caso necesario un mezclador yobservando las precauciones necesarias, con una cantidad nueve veces superior del medio de dilución (diluyente),dejando que las partículas grandes, si existen, queden sedimentadas.

NOTA 1 Véanse las precauciones necesarias en el apartado 8.1.

NOTA 2 Véanse los detalles sobre los diluyentes en el capítulo 5.

3.4 diluciones decimales sucesivasSuspensiones, disoluciones o emulsiones obtenidas al mezclar un volumen determinado de la dilución inicial (3.3) conun volumen nueve veces superior de diluyente, y repitiendo esta operación con todas las demás diluciones preparadasde la misma manera, hasta conseguir una serie de diluciones decimales adecuada para la inoculación de los medios decultivo.

4 PRINCIPIO

Se prepara una suspensión inicial (3.3) con una distribución tan homogénea como sea posible de los microorganismos presentes en la muestra para análisis.

En caso necesario, se preparan diluciones decimales sucesivas (3.4) destinadas a reducir el número de microorganismos por unidad de volumen, que permita, tras la incubación, la observación de todo tipo de crecimiento (en el caso de losmedios líquidos) o de colonias (en el caso de las placas de agar), según se establece en cada norma internacional

correspondiente.

Para restringir, en caso necesario, el rango del recuento dentro de un intervalo definido, o si se prevé la presencia de ungran número de microorganismos, es posible inocular solamente las diluciones decimales adecuadas (al menos dosdiluciones consecutivas) para conseguir un recuento conforme a los cálculos descritos en la Norma ISO 7218.

5 DILUYENTES

Durante los análisis, y salvo indicación en sentido contrario, se utilizan exclusivamente reactivos de calidad analíticareconocida y solamente agua estéril destilada o desionizada.

5.1 Materiales básicos

Véase la Norma ISO 6887-1.

5.2 Diluyentes de uso general

5.2.1 Disolución salina de peptona

5.2.1.1 Composición

Digerido enzimático de caseína 1,0 g

Cloruro sódico (NaCl) 8,5 g

Agua 1 000 ml


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- 9 - ISO 6887-5:2010

5.2.1.2 Preparación

Se disuelven los componentes en el agua, calentando suavemente en una placa calefactora (6.6) en caso necesario. Se

ajusta el pH si es necesario, de forma que tras la esterilización sea de 7,0 ± 0,2 unidades a 25 ºC.

5.2.2 Disolución de Ringer de potencia 1/4x



Cloruro potásico (KCl) 0,105 g

Cloruro cálcico (CaCl2), anhidro 0,06 ga

Hidrógeno carbonato sódico (NaHCO3) 0,05 g

Agua 1 000 mla Alternativamente, se utilizan 0,12 g de CaCl2·6H2O.


Se disuelven las sales en el agua. Se ajusta el pH si es necesario, de forma que tras la esterilización sea de 6,9 ± 0,2unidades a 25 ºC.

5.2.3 Disolución de peptona


Digerido enzimático de caseína 1,0 gAgua 1 000 ml


Se disuelve la peptona en el agua. Se ajusta el pH si es necesario, de forma que tras la esterilización sea de 7,0 ± 0,2unidades a 25 ºC.

5.2.4 Disolución tamponada de fosfato


Dihidrógeno fosfato potásico (KH2PO4) 42,5 g

Agua 1 000 ml


Se disuelve la sal en 500 ml de agua. Se ajusta el pH si es necesario, de forma que tras la esterilización sea de 7,2 ± 0,2unidades a 25 ºC. Se diluye hasta 1 000 ml con el resto del agua.

La disolución concentrada se almacena refrigerada.

Se añade 1 ml de esta disolución concentrada sobre 1 000 ml de agua para su uso como diluyente.


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ISO 6887-5:2010 - 10 -

5.2.5 Disolución de peptona tamponada


Digerido enzimático de tejidos animales 10,0 g


Hidrógeno fosfato disódico dodecahidratado (Na2HPO4·12H2O) 9,0 ga

Dihidrógeno fosfato potásico (KH2PO4) 1,5 g

Agua 1 000 mla Alternativamente, se utilizan 3,56 g de hidrógeno fosfato disódico anhidro (Na2HPO4).

5.2.5.2 PreparaciónSe disuelven los componentes en el agua, calentando suavemente en una placa calefactora (6.6) en caso necesario. Seajusta el pH si es necesario, de forma que tras la esterilización sea de 7,0 ± 0,2 unidades a 25 ºC.

5.2.5.3 Aplicación

Se recomienda en especial este diluyente para la detección de Salmonella spp. o para el recuento de Listeriamonocytogenes, pero también se puede utilizar para la preparación de las suspensiones iniciales en otrasdeterminaciones.

5.3 Diluyentes para casos especiales

Estos diluyentes solamente deben utilizarse para la preparación de las suspensiones iniciales.

5.3.1 Disolución de citrato sódico


Citrato trisódico dihidratado (Na3C6H5O7·2H2O) 20,0 g

Agua 1 000 ml


Se disuelve la sal en el agua, calentando en caso necesario en una placa calefactora (6.6) a una temperatura de 45 ºC a50 ºC. Se ajusta el pH si es necesario, de forma que tras la esterilización sea de 7,5 ± 0,2 unidades a 25 ºC.

5.3.1.3 Aplicación

Esta disolución se utiliza para queso y leche en polvo obtenida mediante rodillos (Hatmaker ), y para algunos caseinatos.

5.3.2 Disolución de hidrógeno fosfato dipotásico


Hidrógeno fosfato dipotásico (K 2HPO4) 20,0 g

Agua 1 000 ml


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- 11 - ISO 6887-5:2010


Se disuelve la sal en el agua, calentando en caso necesario en una placa calefactora (6.6) a una temperatura de 45 ºC a

50 ºC. Para el suero agrio en polvo, se ajusta el pH de forma que para la dilución inicial, tras la esterilización, sea de8,4 ± 0,2 unidades a 25 ºC. Para el queso, la leche en polvo obtenida mediante rodillos ( Hatmaker ), la leche fermentada,los caseinatos y la nata agria, se ajusta el pH de forma que tras la esterilización sea de 7,5 ± 0,2 unidades a 25 ºC.

5.3.2.3 Aplicación

Esta disolución se utiliza para el queso, la leche en polvo obtenida mediante rodillos ( Hatmaker ), la leche fermentada,algunos caseinatos, el suero agrio en polvo y la nata agria.

5.3.3 Disolución de hidrógeno fosfato dipotásico con agente antiespumante

5.3.3.1 Disolución de hidrógeno fosfato dipotásico

5.3.3.1.1 Composición

Hidrógeno fosfato dipotásico (K 2HPO4) 20,0 g

Agua 1 000 ml

5.3.3.1.2 Preparación

Se disuelve el hidrógeno fosfato dipotásico en el agua, calentando en caso necesario en una placa calefactora (6.6) a unatemperatura de 45 ºC a 50 ºC.

5.3.3.2 Disolución concentrada de antiespumante

5.3.3.2.1 Composición

Polietilénglicol 2 000 1 g

Agua 100 ml

5.3.3.2.2 Preparación

Se disuelve el polietilénglicol 2 000 en el agua mezclando.


Se añade 1 ml de la disolución concentrada del agente antiespumante (5.3.3.2) a 1 l de la disolución de K 2HPO4 (5.3.3.1). Se ajusta el pH de forma que la dilución inicial tanto para la caseína láctica como ácida, tras la esterilización,

sea de 8,4±

0,2 unidades a 25 ºC, y para la caseína al cuajo mediante hidrólisis enzimática (caseína rennet), tras laesterilización, sea de 7,5 ± 0,2 unidades a 25 ºC.

5.3.3.4 Aplicación

Esta disolución se utiliza para caseína ácida, caseína láctica y caseínas al cuajo mediante hidrólisis enzimática (caseínasrennet).

5.3.4 Disolución de tripolifosfato


Tripolifosfato sódico (Na5O10P3) 20,0 g

Agua 1 000 ml


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ISO 6887-5:2010 - 12 -


Se disuelve la sal en el agua, calentando suavemente en caso necesario en una placa calefactora (6.6). La disolución de

tripolifosfato se reparte en botellas en porciones de 90 ml y se esterilizan. El medio se puede almacenar a unatemperatura de 5 ºC ± 3 ºC durante un máximo de un mes.

5.3.4.3 Aplicación

Esta disolución se utiliza como diluyente alternativo para las caseínas al cuajo mediante hidrólisis enzimática (caseínasrennet) difíciles de disolver.

5.3.5 Diluyente de uso general con disolución de α-amilasa


Se añaden 12,5 mg de α-amilasa (EC 3.2.1.1, véase la referencia [3] de la bibliografía), de una actividad específica deaproximadamente 400 unidades1) por miligramo sobre 225 ml del diluyente de uso general (véase el apartado 5.2). Estediluyente se utiliza para una porción para análisis de 25 g. Se utilizan cantidades proporcionales para la preparación de

porciones de ensayo diferentes (por ejemplo, para una porción para análisis de 10 g, se añaden 5 mg de α-amilasa sobre90 ml de diluyente de uso general).

5.3.5.2 Aplicación

Esta disolución se utiliza para alimentos que contienen almidón.

5.3.6 Agua de peptona tamponada con púrpura de bromocresol


Agua de peptona tamponada (véase el apartado 5.2.5) 1 000 ml

Púrpura de bromocresol (disolución en alcohol al 4%, por ejemplo disolución etanólica) 0,1 ml


Se añade 0,1 ml de disolución de púrpura de bromocresol a 1 000 ml de agua de peptona tamponada (5.2.5).

5.3.6.3 Aplicación

Esta disolución se puede utilizar con ciertos productos ácidos de forma que el ajuste del pH se puede realizar sin el usode una sonda de pH estéril (véase 8.3).

El púrpura de bromocresol es amarillo a pH ácido, virando a púrpura a un pH superior a 6,8.

5.4 Distribución y esterilización del diluyente


5.5 Ensayo de rendimiento para el control de calidad

Se realiza un control de calidad para todos los diluyentes incluidos en esta parte de la Norma ISO 6887, según sedescribe para la disolución salina de peptona en la Especificación Técnica ISO/TS 11133-2.

1) Esta unidad (frecuentemente denominada Unidad Internacional o Unidad Estándar) se define como la cantidad de enzima que cataliza latransformación de 1 μmol de sustrato por minuto en condiciones normales.


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Incubación: 45 min a una temperatura de 20 ºC a 25 ºC.

Cepa: Escherichia coli WDCM 00013a,2 o WDCM 00012a,2

Staphylococcus aureus WDCM 000342)

Medio de control: TSA a 37 ºC ± 1 ºC durante 24 h ± 2 h

Método de control: Cuantitativo

Criterios: ± 50% del recuento a t 0 a Cepas para ser utilizadas por el laboratorio del usuario (como mínimo).

6 APARATOS

El equipamiento habitual de un laboratorio microbiológico (véanse las Normas ISO 7218 e ISO 6887-1) y, en particular,

lo siguiente.

6.1 Mezclador peristáltico o giratorio

6.2 Mezclador de vórtex

6.3 Cuentas de vidrio, de un diámetro de aproximadamente 6 mm.

6.4 Baños de agua, capaces de mantener respectivamente unas temperaturas de 37 ºC ± 1 ºC y 45 ºC ± 1 ºC.

6.5 Espátulas o varillas de vidrio

6.6 Placa calefactora u otro aparato capaz de un calentamiento suave (no un mechero de gas), y capaz de funcionar ala temperatura requerida.

7 PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

7.1 Productos congelados

Los productos almacenados congelados deberían calentarse hasta alcanzar una consistencia que permita su toma demuestras, por ejemplo manteniéndolos a una temperatura de 18 ºC a 27 ºC (temperatura del laboratorio) durante untiempo máximo de 3 h o a una temperatura de 3 ºC ± 2 ºC durante un tiempo máximo de 24 h. Las muestras deberíanensayarse lo más rápidamente posible después de esto. Véase la Norma ISO 6887-1.

Si el producto se mantiene aún congelado mientras se divide, pueden utilizarse algún diluyente (capítulo 5) a latemperatura del laboratorio para facilitar su descongelación.

7.2 Productos secos y duros

Para mezclar productos duros en un mezclador peristáltico (6.1), la muestra y el diluyente se colocan en dos o más bolsas estériles para evitar que se agujeree y la posible pérdida de muestra.

Los productos secos o duros no se deben homogeneizar en el homogeneizador giratorio durante más de 2,5 min cadavez.

2) Para más información acerca de los números de las cepas de la colección de cultivos y los detalles de contacto, consúltese el catálogo de cepas dereferencia disponibles (consultado el 19-07-2010) en http://www.wfcc.nig.ac.jp/WDCM _Reference_Strain_Catalogue.


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ISO 6887-5:2010 - 14 -

En el caso de los productos secos y duros o heterogéneos, puede ser necesario deshacer o triturar la muestra de laboratorio.En este caso, para evitar un aumento excesivo de la temperatura, no se deben deshacer o triturar durante más de 1 min.

7.3 Productos líquidos y no viscosos

La muestra para análisis se agita manualmente (véase 9.1) o mecánicamente para asegurar una distribución uniforme delos microorganismos antes del análisis.

7.4 Productos heterogéneos

La toma de muestras de los productos heterogéneos (que contienen porciones de distintos alimentos) debería realizarserecogiendo alícuotas de cada componente, representativas de sus proporciones en el producto original.

También se puede homogeneizar toda la muestra de laboratorio para conseguir que la toma de muestras se realice sobreuna muestra para análisis más homogénea.

Puede resultar necesario deshacer o triturar la muestra de laboratorio. En este caso, para evitar un aumento excesivo detemperatura, no se deben deshacer o triturar durante más de 1 min.

8 PROCEDIMIENTOS GENERALES

8.1 Generalidades

Todas las preparaciones y las manipulaciones deberían realizarse utilizando buenas prácticas asépticas y utilizando unequipamiento estéril para evitar la contaminación microbiológica de las muestras por fuentes externas. Consúltese la

Norma ISO 7218.

Se indica en el informe qué procedimiento se utiliza para el análisis si es distinto del procedimiento descrito en esta parte de la Norma ISO 6887.

8.2 Toma de muestras

Debería haberse enviado al laboratorio una muestra representativa que no debería haber sufrido daño o transformacióndurante el transporte o el almacenamiento.

La toma de muestras no es parte del método descrito en esta parte de la Norma ISO 6887. En la Norma ISO 707|IDF 50se expone un método de toma de muestras recomendado.

Si no hay una norma internacional específica relacionada con el producto considerado, se recomienda que las partesinteresadas alcancen un acuerdo sobre el particular.

8.3 Caso general para los productos ácidos

Cuando se utiliza una disolución en suspensión de productos ácidos, se verifica que el pH se revierte a un valor neutro.El uso de un diluyente con indicador de pH añadido (5.3.6) puede evitar la necesidad de utilizar y esterilizar sondas de

pH; se añade hidróxido sódico (NaOH) hasta que el indicador comience a cambiar de color.

En los diluyentes tamponados, suele ser necesaria la adición de NaOH, para aumentar la capacidad tamponante delcomponente alcalino. La concentración de NaOH añadido depende de la acidez del producto. La concentración másadecuada (por ejemplo 0,1 mol/l o 1 mol/l) es la concentración que todavía mantiene una proporción cercana a 1 a 9 conel diluyente.


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- 15 - ISO 6887-5:2010

8.4 Alimentos de alto contenido en materia grasa (contenido en materia grasa > 20% en fracción en masa)

El uso de un diluyente con una cantidad añadida de monooleato de sorbitán [polisorbato 80 3)] entre 1 g/l y 10 g/l, en

relación aproximada a los niveles de materia grasa (por ejemplo se añaden 4 g/l para un contenido de materia grasa del40%) puede mejorar la emulsificación durante la suspensión.

9 PROCEDIMIENTOS ESPECÍFICOS

9.1 Leche y productos lácteos líquidos

La muestra para análisis se mezcla exhaustivamente de forma que los microorganismos se distribuyan lo más homogé-neamente posible invirtiendo el recipiente de la muestra 25 veces. Se evita la formación de espuma o bien se deja que sedeshaga la espuma formada. El tiempo transcurrido entre la mezcla y la recogida de la porción para análisis no debe sermayor de 3 min.

Se retira como mínimo 1 ml de la muestra para análisis con una pipeta estéril y se añade un volumen nueve vecessuperior del diluyente de uso general (5.2). Se agita esta disolución inicial [por ejemplo 25 veces con un movimiento deaproximadamente 300 mm durante 7 s de forma manual, o utilizando un mezclador de vórtex (6.2) durante un tiempo de5 s a 10 s] para obtener una dilución de orden 10 -1.

Se preparan diluciones sucesivas conforme al capítulo 10.

9.2 Leche en polvo, suero de leche en polvo, suero ácido de leche deshidratado, suero de mantequilla en polvo ylactosa

Se mezcla exhaustivamente el contenido del recipiente cerrado por agitación repetida e inversión.

Si la muestra para análisis se presenta en su recipiente original sin abrir y éste está demasiado lleno como para permitir

una agitación suficiente, se transfiere a un recipiente de mayor tamaño y se mezcla. Se abre el recipiente, se retira la porción para análisis necesaria con una espátula y se procede según se indica a continuación. El recipiente se vuelve acerrar inmediatamente.

Se pesan 10 g de la muestra para análisis y se introducen en un recipiente de vidrio estéril (por ejemplo un vaso de precipitados) y se añade el material en polvo a la botella de dilución que contiene diluyente de uso general (5.2). Para elsuero de leche agrio se utiliza disolución de hidrógeno fosfato dipotásico (5.3.2) a un pH de 8,4 ± 0,2 o, en casonecesario, para leche en polvo obtenida mediante rodillos ( Hatmaker ), se utiliza disolución de citrato sódico (5.3.1) odisolución de hidrógeno fosfato dipotásico (5.3.2) a un pH de 7,5 ± 0,2.

Alternativamente, se pesan 10 g de la muestra para análisis directamente en la botella que contiene el diluyentenecesario.

NOTA Para conseguir una mejor reconstitución, y en particular para leche en polvo obtenida mediante rodillos (Hatmaker), pueden resultarconvenientes las cuentas de vidrio (6.3). Si se utilizan, deberían añadirse a la botella antes de su esterilización.

Para disolver la muestra para análisis, se remueve suavemente para humedecer el producto en polvo y a continuación seagita la botella por ejemplo 25 veces, con un movimiento de aproximadamente 300 mm, durante un tiempo de unos 7 s.Puede utilizarse un agitador peristáltico (6.1) como alternativa a la agitación.

Se deja en reposo durante 5 min, agitando ocasionalmente.

El diluyente puede precalentarse a 45 ºC si no puede conseguirse una suspensión homogénea incluso después demezclar. Dicho procedimiento adicional se menciona en el informe del análisis.


3) Tween 80 es un ejemplo de un producto comercial adecuado disponible en el mercado. Esta información se facilita por su utilidad para losusuarios de este documento sin que ello constituya una recomendación por parte de ISO hacia el producto mencionado.


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ISO 6887-5:2010 - 16 -

9.3 Queso y productos elaborados a base de queso

Se pesan 10 g de la muestra para análisis en una placa y se transfieren al recipiente de un mezclador giratorio o de un

mezclador peristáltico (6.1). Alternativamente, se pesan 10 g de la muestra para análisis directamente en el recipiente.

Se añaden 90 ml del diluyente de uso general (5.2) o, como diluyente para el queso, 90 ml de disolución de citratosódico (5.3.1) o de disolución de hidrógeno fosfato dipotásico (5.3.2) a un pH de 7,5 ± 0,2.

Se mezcla hasta que todo el queso quede bien dispersado.

Se deja que se deshaga toda la espuma.

El diluyente puede precalentarse a 45 ºC si no se puede obtener una suspensión homogénea incluso después de mezclar.Dicho procedimiento adicional se menciona en el informe del análisis.


9.4 Caseína ácida, caseína láctica, caseína al cuajo mediante hidrólisis enzimática (caseína rennet) y caseinatos

9.4.1 Caso general

Se mezcla exhaustivamente el contenido del recipiente cerrado por agitación repetida e inversión.

Se pesan 10 g de la muestra para análisis y se introducen en la bolsa de plástico estéril de un mezclador peristáltico(6.1). Se añaden 90 ml del diluyente adecuado a temperatura ambiente, de la siguiente manera:

a) para caseína ácida y láctica, se diluye con disolución de hidrógeno fosfato dipotásico con agente antiespumante(5.3.3) a un pH de 8,4 ± 0,2 unidades;

b) para caseinato, se diluye con disolución de citrato (5.3.1) o con disolución de hidrógeno fosfato dipotásico (5.3.2) aun pH de 7,5 ± 0,2 o disolución salina de peptona (5.2.1);

c) para caseína al cuajo mediante hidrólisis enzimática (caseína rennet), se diluye con disolución de hidrógeno fosfatodipotásico con agente antiespumante (5.3.3) a un pH de 7,5 ± 0,2 unidades.

Se mezcla bien manualmente y se deja en reposo a temperatura ambiente durante 15 min. En caso necesario se mezcladurante 2 min en el mezclador peristáltico (6.1) utilizando dos bolsas estériles para los productos granulados. Se deja enreposo durante 5 min.


9.4.2 Caso especial: caseína al cuajo mediante hidrólisis enzimática (caseína rennet)La caseína al cuajo mediante hidrólisis enzimática (caseína rennet) puede resultar difícil de disolver. Puede utilizarse un

protocolo alternativo al descrito en el apartado 9.4.1.

El uso de disolución de hidrógeno fosfato dipotásico con agente antiespumante (5.3.3) como diluyente para las caseínasde rennet puede no ser eficaz en la disolución de los granos. Dichos granos de caseína dificultan el recuento demicroorganismos a 30 ºC. Por consiguiente, se recomienda el siguiente procedimiento alternativo.

En caso necesario, se tritura la caseína seca antes de recoger la porción para análisis. Se transfieren aproximadamente20 g de la porción para análisis a un recipiente adecuado. Se trituran utilizando un aparato con cuchillas capaz de girar auna frecuencia de aproximadamente 20 000 r/min, equipado con un sistema que prevenga que la muestra se calientedurante la trituración4).

4) El aparato VirTis es un ejemplo de un producto comercial adecuado disponible en el mercado. Esta información se facilita por su utilidad para losusuarios de este documento sin que ello constituya una recomendación por parte de ISO hacia el producto mencionado.


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Se pesan 5 g de la muestra para análisis preparada de esta forma en una botella estéril de 250 ml. Se añaden cuentas devidrio (6.3) para mezclar y 95 ml de la disolución de tripolifosfato sódico (5.3.4) precalentada a 37 ºC. Se mezcladejando la botella en el sistema de mezclado durante 15 min. A continuación se introduce en el baño de agua (6.4)calentado a 37 ºC durante 15 min mezclando de vez en cuando.


9.5 Mantequilla

Véase la Norma ISO 707|IDF 50 si se considera necesario excluir de la investigación la superficie de una muestra demantequilla.

Se pesan 10 g de la muestra para análisis y se llevan al recipiente para muestras. El recipiente se introduce en el baño deagua (6.4) calentado a 45 ºC. Se mantiene dentro del baño de agua hasta que toda la porción para análisis se acabe defundir. Se añaden 90 ml del diluyente de uso general (5.2) calentado a 45 ºC y se mezcla. Esta operación se realiza más

fácilmente en un mezclador peristáltico (6.1).

Alternativamente, se utiliza solamente la fase acuosa para la dilución, de la siguiente manera.

Se recoge una porción para análisis de 50 g que contenga una proporción volumen:masa de agua del W %. Se añaden(50 – [50 × W /100]) ml del diluyente de uso general (5.2) precalentado en el baño de agua (6.4) a 45 ºC. En estascondiciones, 1 ml de fase acuosa corresponde a 1 g de mantequilla.

EJEMPLO Para 50 g de mantequilla con una proporción volumen:masa de agua de aproximadamente el 16%, la fase acuosa representa 8 ml delíquido. Se añaden (50 – [50 x 16/100]) = 42 ml del diluyente de uso general (5.2) precalentado en el baño de agua (6.4) a 45 ºC.

El recipiente se introduce en el baño de agua (6.4) calentado a 45 ºC hasta que se funda la mantequilla. Se retira del baño de agua, se agita bien y se deja que las fases se separen durante un tiempo no superior a 15 min. En caso necesario,la fase de materia grasa se retira con una espátula o con una varilla de vidrio (6.5).

En caso necesario, para separar las fases, se transfiere la porción para análisis fundida a un tubo de centrífuga estéril (o bien se funde la porción para análisis directamente en el tubo) y se centrifuga a una frecuencia de rotación que permitala separación de fases. Puede ser necesario retirar asépticamente la fase de materia grasa (superior) utilizando un tuboestéril conectado a una bomba de vacío. Se pipetea de la fase inferior.


9.6 Helados

Se pesan 10 g de la muestra para análisis y se introducen en un matraz o en la bolsa de plástico estéril de un mezclador peristáltico (6.1). Se añaden 90 ml de diluyente a temperatura ambiente y se mezcla. El producto se funde a la vez que

se mezcla.


9.7 Natillas, postres y nata (pH > 5)

Se pesan 10 g de la muestra para análisis y se introducen en un matraz que contenga cuentas de vidrio (6.3). Se añaden90 ml del diluyente de uso general (5.2) a temperatura ambiente y se agita para disgregar. Alternativamente, puedeutilizarse un mezclador peristáltico (6.1) siguiendo las instrucciones del fabricante. En este caso, la bolsa no deberíacontener cuentas de vidrio.



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ISO 6887-5:2010 - 18 -

9.8 Leche fermentada y nata agria (pH < 5)

Se pesan 10 g de la muestra para análisis y se introducen en un matraz que contenga cuentas de vidrio (6.3). Se añaden

como diluyente 90 ml de agua de peptona tamponada (5.2.5) o de disolución de hidrógeno fosfato dipotásico (5.3.2) aun pH de 7,5 ± 0,2 unidades a temperatura ambiente y se agita de forma manual. Alternativamente, puede utilizarse unmezclador peristáltico (6.1) siguiendo las instrucciones del fabricante. En este caso, la bolsa no debería contener cuentasde vidrio.


9.9 Alimentos infantiles a base de leche

Se mezcla exhaustivamente el contenido del recipiente cerrado por agitación repetida e inversión. Si la muestra paraanálisis se encuentra en su recipiente original sin abrir y éste está demasiado lleno como para permitir que se mezcle losuficiente, se transfiere a un recipiente de mayor tamaño y se mezcla. Se abre el recipiente, se retira la porción paraanálisis necesaria con una espátula (6.5) y se continúa según se indica a continuación. El recipiente se vuelve a cerrarinmediatamente.

Se pesan 10 g de la muestra para análisis y se introducen en un recipiente de vidrio estéril adecuado (por ejemplo en unvaso de precipitados). Se añade el material en polvo a la botella de dilución que contiene un diluyente de uso general(5.2), o, para muestras con un alto contenido en almidón, un diluyente para casos especiales (5.3.5).

Alternativamente, se pesan 10 g de la muestra para análisis directamente en la botella con el diluyente necesario.

El diluyente puede precalentarse a 45 ºC si no puede conseguirse una suspensión homogénea incluso después demezclar. Dicho procedimiento adicional se menciona en el informe de ensayo.

Para conseguir una mejor reconstitución, podría resultar conveniente el uso de cuentas de vidrio (6.3). Si se utilizan, seañaden a la botella antes de su esterilización.

Para disolver la muestra, se remueve suavemente para humedecer el producto en polvo y a continuación se agita la botella de forma manual, por ejemplo 25 veces, con un movimiento de aproximadamente 300 mm, durante un tiempo deunos 7 s. Alternativamente, puede utilizarse un agitador peristáltico (6.1). Se deja en reposo durante 5 min, agitando devez en cuando. Se preparan diluciones sucesivas conforme al capítulo 10.

Las muestras con un alto contenido de almidón pueden ocasionar problemas debidos a la elevada viscosidad de ladisolución base.

Se utiliza el diluyente de uso general (5.2) con disolución de α-amilasa (5.3.5) para reducir la viscosidad de ladisolución inicial, o bien se utiliza una cantidad doble de diluyente. Esta dilución adicional se toma en consideración enlos exámenes posteriores.

10 DILUCIONES DECIMALES SUCESIVAS


Cuando se transfieren volúmenes de una dilución inicial viscosa, como las de la caseína ácida o de rennet (9.4), la pipeta se enjuaga con diluyente aspirando varias veces, utilizando el diluyente del tubo utilizado para preparar ladilución decimal.

IMPORTANTE Si el proceso mencionado se realiza sin enjuagar la pipeta cuando se transfiere una dilucióninicial viscosa, se transfiere un volumen incorrecto de dilución inicial.

Cuando se han recogido 10 ml más 90 ml, u 11 ml más 99 ml, se agita de forma manual como se describe en el aparta-do 9.1.


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BIBLIOGRAFÍA

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[2] ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs. Guidelines on preparation and production ofculture media. Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in thelaboratory

[3] Webb, E. C. Enzyme nomenclature 1992: Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification ofenzymes. Academic Press, London, 1992, 862p. Update available (2009-09-30) at:http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html


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