Unidad 3 - Nutrición Microbiana

8/17/2019 Unidad 3 - Nutrición Microbiana

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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA NACIONALFacultad Regional Villa María

BI OTECNOLOGÍA

1I ng. Qco. JoséReynoso

UNIDAD 3. NUTRICIÓN MICROBIANA

Para crecer los microorganismos deben tomar del ambiente todas las sustanciasnecesarias para la síntesis desus materiales celulares y parala generación de energía. Estassustancias se denominannutr ientes . El proceso por elcual una célula se construye apartir de nutrientes simples

tomados del exterior sedenomina anabol ismo . Debidoa que el anabolismo da comoresultado la biosíntesisbioquímica de nuevo materialcelular, se lo suele denominarbiosíntesis. La biosíntesis es unproceso que requiere energía y por consiguiente la célula debe generarla. Al conjuntode reacciones bioquímicas que conducen a la producción de energía utilizable (como ATP), se denominan catabol ismo .

Los nutrientes según el destino se los clasifica en: Alimentos Constitutivos: suministran los elementos necesarios para la síntesis de

constituyentes celulares.Según la proporción en que intervengan se los clasifica en:

Macronutrientes: C, H, O, H, S, P, Mg, K

Micronutrientes: Fe, Zn, Cu, Co, etc.

Alimentos Energéticos: su degradación provee la energía necesaria para la

síntesis de constituyentes celulares.De acuerdo a su forma de utilización, se clasifican en:

Fototrofos (foto: luz; trofo: alimentarse) o Fotosintéticos: utilizan la luz comofuente de energía.

Quimiorganótrofo: utilizan compuestos orgánicos como fuente de energía.

Quimiolitótrofos: utilizan compuestos inorgánicos como fuente de energía.


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Alimentos específicos: algunos compuestos no pueden sintetizarse, sino que sedeben hallar preformados. Se los denomina factores de crecimiento (aminoácidos,bases purínicas, pirimidínicas y vitaminas).

Composición química de una célula

Las células contienen grandes cantidades de pequeñas moléculas, así como demacromoléculas. La célula puede obtener la mayoría de las pequeñas moléculas quenecesita del exterior o sintetizarlas a partir de moléculas más sencillas. Lasmacromoléculas, por el contrario, siempre son sintetizadas por la célula. Aunque haynumerosos elementos, la totalidad de la masa celular está formada por cuatro tipos deátomos: carbono, oxígeno, hidrógeno y nitrógeno. Otros elementos menos abundantes

que los anteriores pero igualmente importantes son: K, P, Mg, Ca, S, Fe, Zn, Mn, Cu.El agua representa el 80-90 % del peso total de la célula.En la tabla 1 se muestra la composición elemental aproximada de la célula

microbiana.

Tabla 1: composición química elemental de la célula

Elemento Porcentaje delPeso seco

Funciones fisiológicas

Carbono 50 Constituyente del material celularorgánico.

Oxígeno 20 Aceptor de electrones, constituyentedel agua y compuestos orgánicos

Nitrógeno 14 Constituyente de proteínas, ácidosnucleicos, coenzimas.

Hidrógeno 8 Constituyente del agua y decompuestos orgánicos

Fósforo 3 Constituyente de fosfolípidos, ácidosnucleicos y coenzimas.

Azufre 1 Constituyente de aminoácidos y

coenzimasPotasio 1 Cofactor de enzimasSodio 1 Asociado a la presión osmótica.Calcio 0.5 Estabilizador de la pared celularMagnesio 0.5 Cofactor de reacciones enzimáticas.Cloro 0.5Hierro 0.2 Componente de los citocromos

Todos losdemás

0.3


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Estequiometría Global de Crecimiento: Formulación de medio y Factores deRendimiento

El crecimiento en términos estrictamente macroscópicos, requiere que elambiente celular contenga los elementos necesarios para formar biomasa, como asítambién que la energía libre de los sustratos consumidos exceda la energía libre de lascélulas y los productos.

Los compuestos suministrados como nutrientes deben ser compatibles con lamaquinaria metabólica de la célula.

Una visión macroscópica del crecimiento sería como el descrito en la siguiente

figura:

Células (X)Sustratos

(S)1 Cantidad fija deMaterial celular

(S)2 Productos (Pi)

Las restricciones más simples en la formulación de un medio serían las

siguientes: si queremos que la biomasa alcance un valor X, y si además las célulascontienen una cantidad wi (fracción en peso del elemento i), luego los sustratos debenproveer como mínimo wi(X) de todos los nutrientes. Generalmente, este cálculo esmás convenientemente hecho en base al peso seco de la célula. Para estos cálculos,se dispone de tablas que aportan la composición química porcentual de las diferentesbacterias y levaduras. En general la composición química promedio de las bacteriastiene la siguiente forma: CH1.666N0.20O0.27 de peso fórmula: 20.7 y composiciónporcentual: C:53 %; N:12 %; H: 8%; O:19% y cenizas: 8%.

La formulación de medios se complica por varias razones:

Algunos sustratos se liberan como productos y no se asimilan como materialcelular.

Deben considerarse tanto las limitaciones cinéticas como estequiométricas Nutrientes específicos pueden ser los limitantes o productos específicos

pueden ser inhibitorios, debido a las propiedades metabólicas particularespara el microorganismo.

El número de nutrientes es muy grande para considerarlos a todos, por lo tanto ladescripción del sistema se hace basándose en componentes claves, componentes oelementos limitantes. Podemos encontrar componentes l imi tanteses tequ iométr icamen te , es decir que el crecimiento continúa hasta que algún nutrientese agota. Otro tipo de componente limitante puede identificarse basándose en el efecto


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que la composición del medio ejerce sobre la velocidad de crecimiento celular. Elcom pon ente limitante a la velocid ad de crecimiento puede identificarse para unacepa en particular y ambiente determinado (T, pH, conocimiento de los nutrientes,etc). Suponemos que las células están creciendo en un medio dado, en las condicionesantes prescriptas. Si la concentración de un componente en particular del medio seincrementa súbitamente, se incrementará la velocidad de la misma forma?. A menudoel medio de crecimiento se diseña para que un simple componente sea el limitante; elcambio en la concentración de los restantes no alterará la velocidad de crecimiento delas células. El componente que limita la velocidad de crecimiento puede no ser elmismo que limita desde el punto de vista estequiométrico.

Para los sistemas que se analizarán, consideraremos el limitanteestequiométrico.

Se ha observado que la cantidad de masa celular formada por células encrecimiento es proporcional a la masa de sustrato utilizada (casi siempre fuente decarbono y energía, u oxígeno).

El factor de rendim iento (YX/S), es la relación definida como

)S(

)X(Y S/X

El coeficiente puede expresarse en masa o moles para el sustrato y la biomasa.Si consideramos diferentes sustratos Si en el medio, se definen diferentes coeficientes

de rendimiento YX/Si .Si el factor de rendimiento es aproximadamente constante para una célula

cultivada en un medio particular, el conocimiento del mismo es de gran utilidad paradeterminar los cambios que se producirán en la biomasa al modificar el sustrato. Nohay garantía acerca de la constancia del factor de rendimiento. Variaciones conrespecto a la velocidad de crecimiento son comúnmente observadas. Esto puedeexplicarse reconociendo que el sustrato puede cubrir diferentes necesidades:asimilación en la masa celular; provisión de energía para la síntesis de células yprovisión de energía de mantenimiento. El mantenimiento incluye la energía para eltransporte activo de iones y otras especies y las síntesis de reemplazo deconstituyentes celulares. El mantenimiento se refiere a la colección de requerimientos

energéticos de las células para sobrevivir o preservar a la célula en cierto estado, perono está relacionado con la síntesis de más células.

Para los quimioheterótrofos, un simple sustrato sirve tanto de fuente carbonadacomo de energía, y la utilización total del sustrato puede ser escrita como:

(S)= (S)asimilación + (S)energía de crecimiento + (S)energía de mantenimiento

Dividiendo la ecuación anterior por (X), se obtiene


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)X(

)S(

)X(

)S(

)X(

)S(

Y

1 tenimientoenergíamancimientoenergíacrenasimilació

S/X

Mientras el verdadero factor de rendimiento del crecimiento (X)/(S)asimilación esrelativamente constante, definido estequiométricamente, el coeficiente de rendimientoglobal no lo es. La distribución del sustrato en los tres componentes es variable. Unapoblación en crecimiento rápido usa más sustrato para asimilación y energía, mientrasuna población en fase estacionaria consume sustrato para mantenimiento, sin consumopara crecimiento.

Es común expresar la ecuación anterior de la siguiente forma:

S

teóricoS/X'

medidooexpS/X

m

)Y(

1

)Y(

1

siendo mS el coeficiente de mantenimiento y se utiliza para describir la velocidadespecífica de consumo de sustrato para el mantenimiento y la expresión para el cálculoes la siguente:

X

dt

dS

:m m

S

En el año 1965 Pirt introdujo el concepto de “coeficiente de mantenimiento”. Apesar de la naturaleza empírica de este concepto, se pueden listar varios procesosinvolucrados en la energía de mantenimiento:

a) Mantenimiento de los gradientes y potencial eléctrico: gradiente deprotones a través de la membrana. Este proceso requiere energía y enconsecuencia sustrato, pero no se produce biomasa.

b) Ciclos de corta vida: en el interior de la célula hay pares de reaccioneslas que resultan de una degradación neta de ATP.

c) Regeneración de macromoléculas: muchas moléculas por ejemplo mRNAson degradadas y sintetizadas continuamente en el interior de la célula.

Balances de Masa Elementales para el Crecimiento

A los efectos de describir el crecimiento y las actividades metabólicasrelacionadas de la misma forma a la utilizada para las reacciones químicas, en primerlugar es necesario establecer una fórmula química para el peso celular seco delmicroorganismo en estudio.

Como una simple ilustración, consideremos el crecimiento aeróbico sin formaciónde productos, es decir que los únicos productos serán: biomasa, CO 2 y H2O. Para la


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fuente carbonada definimos la fórmula: CHxOy y para la fuente nitrogenada: HlOmNn. Lafórmula de la estequiometría responde a la siguiente expresión:

a' CHxOy + b' O2 + c' HlOmNn CHON + d' H2O + e' CO2

Los balances para los cuatro elementos serán relaciones útiles en el cálculo delos coeficientes a', b', c', d' y e'.

C: a'= 1 + e'

H: a'x + c'l = + 2 d'

O: a'y + 2 b' + c'm = + d' + 2 e'

N: c'n =

Una relación adicional, coeficiente respiratorio (RQ), que se determinaexperimentalmente se utiliza como la quinta ecuación necesaria.

RQ= Cociente respiratorio=2

2

molesO

molesCO

A los efectos de obtener una fórmula para la biomasa, se toma la composiciónelemental de un “microorganismo promedio” cuya expresión es CH1.6O0.5N0.77. Estafórmula se deduce teniendo en cuenta la composición porcentaje peso en peso de unmicroorganismo promedio: C(46.5), H(6.49), O(31), N(10.85) y un contenido en cenizasde (S, P de 5%). Si dividimos cada elemento por su peso atómico, obtenemos losmoles y finalmente dividiendo por el número de moles de carbono se obtiene labiomasa en C-mol.

De esta forma se pueden calcular todos los coeficientes desconocidos.

Grado de reducciónSi bien los balances elementales son de gran importancia en el desarrollo de unproceso microbiológico, es necesario conocer la energética de la reacción, enconsecuencia se ha desarrollado el concepto de grado de reducción. El grado de

reducc ión ( ) [electrones/C-mol] de un compuesto orgánico se puede definir como elnúmero de electrones disponibles por átomo de carbono. Los electrones disp onib lesson los electrones que se transfieren al O2 durante la oxidación de un compuesto aCO2, H2O y NH3. Por otra parte, el grado de reducción del elemento es igual a lavalencia del mismo. Por ejemplo, la valencia del carbono es 4, la del nitrógeno en elamoníaco es –3 y la del oxígeno es –2 en el agua, por lo que los grados de reduccióndel CO2, H2O y NH3 son cero.


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Durante la oxidación completa de la glucosa la reacción se expresa en C-mol dela siguiente forma:

CH2O + O2 CO2 + H2O

Para calcular el grado de reducción podemos hacerlo de dos formas:

1.- Aplicar el grado de reducción de cada elemento en el compuesto orgánicoexpresado en C-mol: (4 + 2.1 + (-2))= 4 electrones/C-mol.

2.- Multiplicar por 4 el coeficiente estequiométrico del oxígeno: 4.1= 4electrones/C-mol.

En la siguiente tabla se pueden observar los valores de para la oxidación de 1

C-mol de distintos compuestos a CO2 y H2O como así también los calores de reaccióno entalpías de combustión en condiciones estándares de diferentes compuestos:

Compuesto

C-mol

Reacción q

(kcal/C-mol)

q/

CH4 (metano) CH4 + 2O2 CO2 + 2H2O 8 213.4 26.7

CH3O0.5 (etanol)

CH3O0.5 + 3/2 O2 CO2 + 3/2 H2O 6 163.8 27.3

CH2O(glucosa)

CH2O + O2 CO2 + H2O 4 111.9 28

CH2O

(ac. Acético)

CH2O + O2 CO2 + H2O 4 104.8 26.2

CH2O2

(ac. Fórmico)

CH2O2 + ½ O2 CO2 + H2O 2 61.0 30.5

De la tabla anterior se puede concluir que:

a. El valor de corresponde al número de electrones que fueron transferidosdesde el compuesto a oxidar al oxígeno tomando como base 1 C- mol.Por lo tanto expresa la cantidad de “electrones disponibles” por C-mol.

b. La cantidad de calor liberado por cada mol de electrones transferidos al

oxígeno (q/) permanece casi constante en un valor promedio qo: 27.5kcal/mol de electrones.

De la conjunción de ambos puntos, resulta que el valor de es una medida de laenergía contenida en un compuesto. Así, de este modo, 1 C-mol de etanol brinda másenergía que 1 C-mol de glucosa.

Con estos conceptos estamos en condiciones de aplicar balances de masa y

energía a la reacción química que ocurre durante el cultivo de un microorganismo. Para


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simplificar el cálculo, asumiremos que la fuente de carbono y energía no contienenitrógeno.

Estequiometría:

CHs1Os2 + Yn/s NH3 +Yo/s Yx/s CHb1Ob2Nb3 + Yp/s CHp1Op2Np3 +Yco2/S CO2 + Yw/s H2O

+ q (calor)

I.-Balance de Carbono

Yx/s + Yp/s + Yco2/s = 1

II.-Balance de grado de reducción

s – 4 Yo/s = Yx/s x + Yp/s p Recordemos que los grados de reducción del agua, CO2 y NH3 son cero de allí

que no aparezcan en el balance. Reordenando la ecuación anterior nos queda:

1Y4YY

s

s/o

s

ps/p

s

xs/x

De manera similar:

1

Donde , y representan las fracciones de energía transferidas a la biomasa,producto y al oxígeno. Como por cada mol de electrones que se transfieren al oxígenose liberan 27.5 kcal, el calor producido en la reacción viene dado por

Q (kcal/C-mol) = 4 (elec/moles O2) Yo/S (moles O2 /C-mol )27.5 (kcal/elec)

Ejemplo:

Se cultiva C. utilis en medio con glucosa, SO4(NH4)2 y sales. La concentracióninicial de biomasa Xo= 0.53 g/l y la concentración inicial de glucosa So= 15.2 g/l.El crecimiento se detiene después de 9.5 hs, consumiéndose toda la glucosa Sf=

0 g/l, se consumen 0.123 moles O2/l y se producen 0.179 moles CO2/l. Laconcentración final de biomasa es de Xf= 6.07 g/l. Calcular el calor generadodurante la reacción y averiguar si hubo formación o no de producto.

Biomasa promedio: CH1.79 O0.5N0.2 : 25.8 g/C-mol

Biomasa formada: l/molC215.0molC/g)8.25(

l/g)53.007.6(

Glucosa consumida: l/molC506.0molC/g)30(

l/g)2.15(

Dióxido producido: 0.179 C-mol/l


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Balance de carbono para la estequiometría propuesta:

1= Yx/s + Yco2/s + Yp/s

s/pY506.0

179.0

506.0

215.01

Yp/s= 0.221 C-mol P/C-mol S

Para averiguar de qué producto se trata, se plantea un balance de grado dereducción:

s/pps/xxS/2O2Os Y.Y.Y.1.

De la expresión anterior se obtiene un valor de p= 5.6. Por tratarse de unalevadura podría inferirse que el producto producido es etanol, no obstante debe serverificado experimentalmente.

Cálculo del calor generado

Q= 4(ele/mol O2) 27.5 (kcal/Elec.)0.243(mol O2/C-mol)= 26.53 kca/C-mol

Existe un modo alternativo para calcular el calor generado y es mediante elcambio de entalpía de la reacción ya que

iS/i HYQH

Aplicando este procedimiento a la estequiometría propuesta en el problema,encontramos:

CH2O + 0.243 O2 + 0.085 NH3 0.425 CH1.79O 0.5N0.2 + 0.353 CO2 +H2O + 0.221 CH3O0.5

1

1

molC.kJ61.110

)molC.kJ(683x221.0560x425.0383x085.0467QH

Si expresamos en términos de kcal.C-mol-1, el resultado de la cantidad de calorliberada en el proceso es Q= 26.5 kcal.C-mol-1.

Para los procesos anaeróbicos, donde no hay oxígeno como aceptor final deelectrones, es necesario aplicar el procedimiento del análisis entálpico.

Construcción de un medio de cultivo

Al construir un medio de cultivo para un organismo cualquiera, el objetivo principalconsiste en proporcionar una mezcla equilibrada de los nutrientes requeridos, aconcentraciones que permitan un buen desarrollo. Podría parecer razonable a primeravista el agregado en exceso de los nutrientes. Sin embargo, al elevar su concentración,muchos de los nutrientes resultan inhibitorios al crecimiento o tóxicos. Los nutrientes

además de estar presentes, deben estar disponibles para ser usados por la célula.


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Es importante mencionar la disponibilidad de iones metálicos cuya concentraciónes modificada por quelación, ya que muchos constituyentes del medio y productos delmetabolismo actúan como agentes acomplejantes o precipitantes, por ejemplo:aminoácidos, hidroxiácidos y los aniones PO3

- y CO3-. Por lo tanto con el objeto de

controlar su concentración y prevenir la precipitación de los iones metálicos, esesencial quelar el ión mediante el agregado de un quelante como el EDTA.

Los componentes empleados en la industria fermentativa son complejos, siendoimportante considerar diferentes aspectos como el costo de los mismos, ladisponibilidad y la estabilidad de su composición química. Debido a que el costo de losnutrientes representa entre el 10 al 60 % del costo total de muchos productos obtenidospor fermentación, se hace prioritario disminuir el costo.

A nivel industrial, normalmente se deben usar fuentes de nutrientes para preparar

un medio que reúnan la mayoría de los siguientes criterios.1. Debe producir el máximo rendimiento de producto o biomasa por gramo desubstrato usado.

2. Debe producir la máxima concentración de producto o biomasa.3. Debe permitir la máxima velocidad de formación de producto.4. Deberá tener el mínimo rendimiento en productos no deseados.5. Deberá mantener una calidad consistente y deberá poder conseguirse

fácilmente durante todo el año.6. Se deberán causar los mínimos problemas posibles durante la preparación y la

esterilización.7. Se causarán los mínimos problemas posibles en otros problemas del proceso

productivo, particularmente en la aireación y agitación, extracción, purificacióny tratamiento de los desechos.

El uso de melazas de caña o de remolacha, granos de cereales, almidón,sacarosa y lactosa como fuentes de carbono, y sales de amonio, urea, nitratos,macerado de maíz, harina de soja, desechos de mataderos y residuos defermentaciones como fuentes de nitrógeno, ha sido por que estas fuentes satisfacen loscriterios mencionados y son muy baratas. Sin embargo, se pueden elegir otrossubstratos puros más caros si se puede reducir el costo total del proceso completo porla el empleo de procedimientos más simples.

Se debe recordar que el medio seleccionado afectará el diseño del fermentador

que podría utilizarse.También debe considerarse el problema del cambio de escala desde laboratorio a

planta piloto y de allí a escala industrial. Un medio de laboratorio puede no ser el idealen un fermentador grande con una baja transferencia de gases. Un medio de altaviscosidad, necesitará también de una elevada potencia para una agitación efectiva.

Además de reunir los requerimientos para el crecimiento y la formación deproductos, el medio puede también influir en la variación del pH, la formación deespumas, el potencial redox y la morfología del microorganismo. Por otra parte, puederesultar necesario la provisión de precursores o inhibidores metabólicos. El mediotambién podrá afectar la recuperación de productos y el tratamiento de efluentes.

Históricamente, se han usado en les fermentaciones materiales naturales

complejos y muchas veces indefinidos, debido a que resultan mucho más baratos que


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los componentes puros. Sin embargo, se encuentran con frecuencia variaciones entrelos diferentes lotes debido a las variaciones en las concentraciones de loscomponentes y las impurezas de los materiales naturales, lo que causa rendimientosimpredecibles de biomasas o productos. Como consecuencia de estas variaciones,resulta muy difícil detectar cualquier pequeña mejora en los rendimientos. Estos mediosindefinidos, hacen con frecuencia muy problemática la recuperación de productos y eltratamiento de los efluentes ya que los microorganismos no consumen todos loscomponentes de una fuente compleja de nutrientes. Estos componentes residualespueden interferir en la recuperación de productos y contribuyen al aumento de la DBOen los efluentes. De allí que algunas industrias se han inclinado a usar mediosdefinidos ya que, a pesar de ser mas costosos, permiten predecir los rendimientos delas distintas partidas, simplificar la recuperación y purificación de productos y los

tratamientos de efluentes, por lo que el proceso global resulta mas barato. También,cuando se usan substancias puras, son más fáciles de detectar las mejoras en losprocesos.

En la tabla 2 se pueden observar formulaciones típicas de medios utilizados encultivos sumergidos. Esos ejemplos ilustran el rango de los medios en uso, pero no sonnecesariamente los óptimos que se necesitan.

Acido itacónicoMelaza de caña 150 g/lZnSO4 1 g/lZnSO4.7H2O 3 g/lCuSO4.5H2O 0,01 g/l

Acido glutámicoDextrosa 270 g/lNH4H2PO4 1 g/lKH2PO4 2 g/l(NH4)H2PO4 2 g/lMnSO4.7H2O 0,5 g/l

Biotina 12 g/l

Penicilina 11 g/l

Amilasa Autolizado de levadura 1,85 %Harina de soja 1,50 %Solubles de destilería 0,76 %Hidrolizado de caseína 0,65 %Lactosa 4,75 %MgSO4.7H2O 0,04 % Antiespumante 0,05 %

Acido giberélicoGlucosa 20 g/lMgSO4.7H2O 1 g/lNH4H2PO4 2 g/lKH2PO4 5 g/lZnSO4.7H2O 0,01 g/lCuSO4.5H2O 0,01 g/lMacerado de maíz 7,5 g/l

ActinomicinaCerelosa 45 g/lLeche peptonada 24 g/l Autolizado de levadura 2,5 g/lPolietilenglicol 2,5 g/l

Penicilina Melaza 10 %Macerado de maíz 5 % Acido fenil acético 0,8 % Aceite vegetal 0,5 %

Tabla 2

Materias Primas empleadas en los Medios de cultivo

Las materias prim as más importantes corresponden a la fuente de carbono y de

nitrógeno.


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Las fuentes de carbon o pueden ser: Hidratos de carbono como la glucosa, lactosa, sacarosa, almidón, dextrinas. Alcoholes como el glicerol y el manitol Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y otros.

Es una práctica común, emplear polisacáridos como fuente de carbono en losprocesos fermentativos industriales. El polisacárido más disponible es el almidón obtenido de los granos de maíz. También se obtiene de otros cereales y de la papa.

El almidón puede separarse en las dos fracciones más importantes con aguacaliente. El componente insoluble (10 al 25 %) es la amilosa, en tanto que elcomponente soluble es (75 al 90 %) es la amilopectina. La amilopectina, es amilosa

altamente ramificada mediante enlaces (1----6) glucosídicos. La estructura química

del almidón se muestra en la Figura 1.

Fig. 1: Estructura del almidón

La amilosa y la amilopectina pueden ser degradadas por las y amilasas. La -

amilasa, es una endoglucosidasa, pues hidroliza los enlaces (1---4) de la amilosa y

amilopectina al azar. La -amilasa, es un exoglucosidasa, ya que libera unidades demaltosa sucesivamente desde los extremos no reductores finales de la cadena.

Ninguna de las dos enzimas antes mencionadas pueden hidrolizar los enlaces (1---6)de los puntos de ramificación, los que son degradados por las enzimasdesrramificadoras. Finalmente, otra enzima, amiloglucosidasa (también denominadaglucoamilasa), libera glucosa desde los extremos no reductores de la cadena. El jarabede maíz, un subproducto de la extracción del almidón de maíz, es empleadoprincipalmente como fuente de nitrógeno, no obstante contiene ácido láctico, pequeñascantidades de azúcares reductores y polisacáridos complejos.

Dentro de los disacáridos, la sacarosa se obtiene de la caña o remolachaazucarera. Es común emplear en los medios de fermentación, melazas las cuales son

los residuos que quedan después de la cristalización en el proceso de azúcar refinada.


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El costo de las melazas compite con los azúcares refinados, no obstante en algunosprocesos no puede emplearse la melaza pues dificulta los procesos de extracción ypurificación de los productos. La sacarosa es un disacárido no reductor, ya que elgrupo aldehído de la glucosa se une al grupo cetona de la fructosa. Otros disacáridosempleados se pueden observar en la Figura 2.

Fig. 2. Disacáridos de importancia industrial

La lactosa, es el azúcar presente en la leche, es un dímero de la galactosa yglucosa. Es un disacárido reductor. La maltosa, es la unidad repetitiva en el almidón yla hidrólisis de la misma da dos moléculas de glucosa. La celobiosa, es unesteroisómero de la maltosa y se obtiene por hidrólisis de la celulosa. La maltosa ycelobiosa son disacáridos redutores.

Precauciones en el uso de carbohidratos: el calentamiento de las soluciones decarbohidratos puede causar la hidrólisis de los azúcares complejos o la formación deproductos de oxidación. Las soluciones concentradas son susceptibles adescomponerse cuando son calentadas. La descomposición es mayor cuando el pH essuperior a 7. La solución de glucosa es estable cuando se autoclava tamponada conácido cítrico. Evidencia de la descomposición por el calor es el oscurecimiento de lasolución.

Los carbohidratos pueden acomplejarse fácilmente con los fosfatos para formarpigmentos sólidos amarronados. Estos complejos pueden actuar como estimulantes oinhibitorios al crecimiento. La reacción más importante en los medios de cultivo es lareacción de Maillard. Los aldehídos, cetonas y azúcares reductores se combinan conlos amino ácidos, péptidos y proteínas para formar melanoidinas marrones. La reacciónde Maillard puede causar la pérdida de aminoácidos esenciales y no estar éstosdisponibles para el metabolismo. Las condiciones óptimas para la ocurrencia deMaillard son: pH entre 7 y 10 y altas temperaturas.

Grasas y Aceites


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Los aceites fueron los antiespumas empleados en los procesos de producción deantibióticos. Los aceites vegetales de oliva, maíz, soja, algodón son empleados por sucontenido en ácidos grasos: oleico, linoleico y linolénico.

Las fuentes de nit rógeno pueden ser:

Inorgánicas: amoníaco o sales de amonio. De las fuentes inorgánicas, seutilizan principalmente gas amonio o sales de amonio. El sulfato de amoniousualmente produce condiciones ácidas, pues al utilizar el amonio, se liberael ácido libre. Por su parte, los nitratos normalmente tienden a alcalinizar losmedios cuando son metabolizados. El nitrato de amonio, primero ocasionauna caída del pH, y cuando se agota el amonio tiene a subir nuevamente el

pH como resultado de la utilización del nitrato.

Orgánicas: están representadas por una gran variedad como: 1)Hidrolizados de Proteínas (Peptonas) que se obtienen de la hidrólisisácida o enzimática de diferentes fuentes proteicas como carne de diferentesórganos y animales, pescado, caseína, harina de soja, algodón, girasol, etc.Mediante el ajuste de la relación enzima-sustrato y variando el tiempo dehidrólisis, es posible variar el tamaño de la cadena de polipéptidos. Ademásde aportar nitrógeno, las peptonas aportan aminoácidos, vitaminas, fosfatosy micronutrientes como el Ca, Zn, Fe y Cu. 2) Extracto de carne, que seobtiene por extracción acuosa y posterior concentración. 3) Extracto de

levadura, que se obtiene mediante la plasmólisis de la levadura y esbásicamente una mezcla de aminoácidos, péptidos, vitaminas hidrosolublesy carbohidratos. 4) Extracto de malta, que es el extracto soluble en agua dela malta de la cebada. 5) Cornsteep, que es el agua de maceración delmaíz, y es muy utilizado en la producción de antibióticos y enzimas.

Además de los nutrientes antes mencionados, se debe formular una base mineral,que aporte el resto de los ingredientes.

Los medios según la composición se clasifican de la siguiente forma:

Medio sintético: es un medio compuesto por nutrientes químicamentedefinidos.

Medio complejo: contiene ingredientes de los que se desconoce sucomposición química. Derivados de estos medios son los obtenidos por elagregado a los medios de diversos ingredientes según su uso,denominados Medios Enriquecidos. Por ejemplo: agar sangre ( contienecomo medio base agar nutritivo y se lo ha enriquecido con sangre humana oanimal); agar yema de huevo ( agar nutritivo con el agregado de yema dehuevo); agar leche descremada ( agar nutritivo con el agregado de lechedescremada).

Medios selectivos: pueden ser sintéticos o complejos, pero se preparan de

forma de hacerlo selectivo para un determinado micoorganismo. Un medio


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selectivo es aquel al que se le agrega algún componente que inhiba eldesarrollo de algunos microorganismos pero no de todos. Un mediodiferencial es aquel al que se le agregan indicadores, generalmentecolorantes que permite diferenciar durante el crecimiento de las especies.Por ejemplo, el agar eosina azul de metileno (EMB), es utilizado como unmedio selectivo diferencial. El agar EMB es usado para aislar las bacteriaslas bacterias G(-) de las bacterias entéricas. El azul de metileno inhibe laflora G(+). La eosina, es un colorante que responde a los cambios de pH,cambiando de incoloro a negro en condiciones acídicas. El EMB, contienelactosa y sacarosa, pero no glucosa, como fuente de energía, y las coloniasde las bacterias entéricas, fermentadoras de lactosa, tales como E. coli,Klebsiella y Enterobacter , acidifican el medio y las colonias tienen el centro

negro y los bordes verdosos. En cambio, las colonias no fermentadoras delactosa, tales como Salmonella, Shigella o Pseudomonas, son translúcidas.Los medios selectivos a su vez pueden ser: de Aislamiento Directo o deEnr iquec imiento . Cuando un inóculo mixto contenga una cierta variedadde organismos diferentes se extienda sobre la superficie del medio selectivosólido, todas las bacterias que puedan desarrollar sobre él produciráncolonias que pueden tener morfologías particulares. En contraoposición alaislamiento sobre medios sólidos, están los medios selectivos deenriquecimiento que son líquidos y se permite la libre competencia entre losdiferentes microorganismos presentes.

Control del pH en los medios de cultivo

Aunque un medio de cultivo determinado sea adecuado para la iniciación delcrecimiento, el subsiguiente desarrollo puede resultar limitado por los cambios que seproducen debido al crecimiento y metabolismo. Así por ejemplo la oxidación de unamolécula de succinato de sodio, libera dos iones sodio en forma de una sal muyalcalina, el carbonato de sodio. La descomposición de las proteínas y aminoácidos,pueden alcalinizar el medio, como resultado de la producción de amoníaco.

Para evitar cambios excesivos en la concentración del ion hidrógeno, confrecuencia se añaden al medio buffers o tampones, o bien carbonatos insolubles.

Los buffers a base de fosfatos, que constan de mezclas de fosfatos monobásicosy dibásicos, son los más útiles. El PO4H2K, es una sal débilmente ácida, mientras queel PO4HK2 es ligeramente alcalino, por lo que la solución equimolecular de los dos estámuy próxima a la neutralidad con pH de 6.8. Si se añade a esta solución una cantidadlimitada de un ácido fuerte, parte de la sal básica se convierte en sal ligeramente ácida:

PO4HK2 + ClH PO4H2K + ClK

Sin embargo, si se añade una base fuerte, tiene lugar la conversión contraria:

PO4H2K + KOH PO4HK2 + H2O


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Los fosfatos son ampliamente utilizados para la preparación de medios, porqueson los únicos agentes inorgánicos que tienen acción amortiguadora y además son unafuente de fósforo, que es un elemento esencial para el crecimiento. No obstante ello, sedebe utilizar en una cantidad moderada, pues por encima de determinados valores,resulta tóxico para las bacterias. Generalmente, los hongos y las bacterias puedentolerar hasta 5 g de fosfato por litro de medio de cultivo.

Cuando en un cultivo se produce una gran cantidad de ácido, las cantidades debuffers pueden no ser suficientes para mantener el pH en un determinado valor. Entales casos, suele añadirse al medio carbonatos, como "álcalis de reserva", paraneutralizar los ácidos a medida que se producen. En presencia de hidrógeno, elcarbonato es transformado en bicarbonato, y el bicarbonato es convertidoposteriormente en ácido carbónico, que se descompone espontáneamente dando CO2

y agua. Estas sucesiones de reacciones son reversibles y pueden resumirse de lasiguiente forma:

CO32- CO3H

- CO3H2 CO2 + H2O

Debido a que el ácido carbónico es extremadamente débil, y se descomponedando CO2 que se va a la atmósfera, la adición de carbonatos impide el acúmulo deiones hidrógeno. Los carbonatos de calcio son los que normalmente se utilizan. Debidoa su insolubilidad, no crea en el medio condiciones alcalinas.

Precipitación de minerales: un problema que se encuentra con frecuencia en la

preparación de medios sintéticos, es la formación de un precipitado después de laesterilización, especialmente si el medio tiene una alta concentración de fosfatos,debido a la formación de complejos insolubles entre los fosfatos y ciertos cationescomo el hierro y el calcio. Aunque generalmente no afectan el valor nutritivo del medio,pueden hacer difícil la observación y valoración del desarrollo microbiano. Esteproblema puede solucionarse, esterilizando por separado las sales de calcio y dehierro, en solución concentrada y agregarlas al medio esterilizado y frío. Alternativamente puede agregarse un agente acomplejante como EDTA.

Adición al medio de precursores y reguladores metabólicos Algunos de los componentes de los medios de fermentación sirven para regular la

formación del producto mas que favorecer el desarrollo de los microorganismos. Talesaditivos incluyen precursores, inhibidores e inductores, los cuales se pueden usar paramanipular el progreso de la fermentación.

Precursores Algunos compuestos químicos, cuando se agregan a ciertas fermentaciones, se

incorporan directamente a los productos deseados. Probablemente el primer ejemplo loconstituye el mejoramiento de los rendimientos en la producción de penicilina. Sepueden incorporar varios sustituyentes a la molécula de penicilina formando cadenaslaterales. Habiéndose establecido que el factor limitante de la actividad de la penicilinaes la síntesis de estas cadenas laterales, se constituyó en una práctica común el


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agregado de ácido fenil-acético como precursor de esta cadena para la formación de labencil penicilina (Penicilina G).

InhibidoresCuando se añaden ciertos inhibidores a las fermentaciones, puede producirse

más cantidad de un producto específico, o un intermediario metabólico quenormalmente es metabolizado puede acumularse en le medio. Este es el caso de laproducción de glicerol por vía microbiana. La producción de glicerol depende de unamodificación de la fermentación alcohólica por remoción del acetaldehido. La adición debisulfito de sodio al medio de fermentación conduce a la formación de un compuesto deadición aldehido-bisulfito (hidroxi etil sulfito de sodio). Como el acetaldehido no estámás disponible para la re - oxidación del NADH2, su lugar como aceptor de hidrógeno

es tomado por la di hidroxi acetona fosfato, producido durante la glicólisis. El productode esta reacción es el glicerol 3 fosfato que luego se convierte en glicerol.

InductoresLa mayoría de las enzimas de interés industrial son inducibles. Estas enzimas

solamente son sintetizadas en respuesta a la presencia en el ambiente de un inductor.Los inductores son con frecuencia substratos como el almidón o dextrinas para la

amilasa, maltosa para la pululanasa, pectina para la pectinasa o lactosa para la -galactosidasa. Los substratos análogos que no son atacados por la enzima, tambiénpueden servir de inductores

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