Diseño y optimización de medios de cultivo

NUTRICIÓN MICROBIANA

ALEJANDRA BOSCH

Optimización de la expresión celular

Producción de algún producto Aumento de producción de biomasa Mejorar la velocidad o rendimiento de algún

producto

Efectores que intervienen en el crecimiento y formación de productos

Efectores intracelulares se refiere a la información genética que posee el microorganismo. La misma puede ser modificada por el agregado o extracción de genes.

Efectores extracelulares son los factores del entorno que pueden modificar la expresión:

físicos y químicos

Efectores extracelulares

Fisicoquímicos

son los relacionados con las características del sistema de cultivo

agitación, aeración, formación de espuma, nutrientes del medio de cultivo, pH, presión osmótica, estado redox, los

parámetros físicos como T y P.

Clasificación de medios

Por naturaleza química de los componentes Medios sintéticosMedios sintéticos o medios químicamente definidos Medios complejosMedios complejos en cuya composición intervienen

sustancias de origen animal o vegetal suero de leche, hidrolizados de proteínas como peptonas, extracto de levadura, macerado de maíz, harina de soja

Químicamente indefinidos y de composición variable

Clasificación de medios

Por los requerimientos nutricionales Medios mínimosMedios mínimos contienen unicamente los nutrientes

esenciales para el crecimiento Medios ricos Medios ricos son suplementados con nutrientes que

por lo general son intermediarios en la síntesis de componentes celulares: amino ácidos, vitaminas precursores de la síntesis de ácidos nucleicos.

Aumentan la velocidad de crecimiento,Reducen la fase lag

Tipos de nutrientes

MacronutrientesMacronutrientes [ g/l ] > 10-4 M

Tipo I: C H O N (10-2 y 10-3 M)

Tipo II: S, P, K y Mg (10-3 y 10-4 M) Micronutrientes o elementos trazasMicronutrientes o elementos trazas [mg/l o µg/l]

Tipo III: Elementos trazas: (metálicos)

Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co

Tipo IV: Factores de crecimiento

Componentes orgánicos que no son sintetizados ni metabolizados por las células

vitaminas, aminoácidos ácidos grasos no sat.

Requerimientos nutricionales

Macronutrientes Tipo IMacronutrientes Tipo I

Fuentes C (Fuentes C (Fuente de C y energía)

Hidratos de Carbono (glucosa o dextrosa, sacarosa, lactosa)

Lípidos hidrocarburos (alcanos: hexadecano, octadecano) Alcoholes (glicerol y manitol) Melaza Harina de arroz Almidón Suero de quesos

Requerimientos nutricionales

Fuentes NFuentes N El nitrógeno es utilizado para la biosíntesis de proteínas,

ácidos nucleicos y polímeros de la pared celular.

Puede ser de naturaleza inorgánica u orgánica

NH4 (NH42SO4). Acidificación durante el crecimiento Urea, NO3, N2 AminoácidosAminoácidos dan mayores rendimientos Peptonas.Peptonas. Son hidrolizados parciales de proteínas ( H o OH)

Carne, pescado, gelatina, caseína. Extracto de levadura,Extracto de levadura, en forma de pasta o polvo, y puede ser

obtenida mediante autólisis de la levadura Extracto de malta,Extracto de malta, que es el extracto soluble en H2O de la

malta de la cebada Cornsteep Cornsteep maceración de la industria del maíz

Requerimientos nutricionales

Macronutrientes Tipo II

PP y el S S son suministrados en forma de P04H y S04 (o aminoácidos azufrados) El P se incorpora en ácidos nucleicos, y

polímeros celulares. El S es asimilado para la síntesis de

aminoácidos azufrados, y además se necesita para la biotina y otros componentes.

Requerimientos nutricionales

Macronutrientes Tipo II

KK y el Mg Mg son suministrados en forma de P04 y S04 (o aminoácidos azufrados)

El K es un componente intracelular importante,

principal catión inorgánico. El Mg asociado a la función ribosómica, cofactor de

enzimas y componente de pared celular.

Requerimientos nutricionales

Micronutrientes (Tipo III)Micronutrientes (Tipo III)Esenciales para el crecimiento

Fe, Mn, y ZnEsenciales en condiciones particulares

Co, Cu, Mo, CaRaramente esenciales B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se generalmente están presente en suficiente cantidad

como impureza de los componentes principales. Se agregan como sales solubles de Cl-, SO4=, NO3,

MoO4

Requerimientos nutricionales

Factores de crecimiento (Micronutrientes Tipo IV)Factores de crecimiento (Micronutrientes Tipo IV)Se agregan en el orden de 10-6 a 10-12 M

Coenzimas: colina Acido oleico ( lactobacilos) Ácidos grasos BiotinaVitaminas B1,2,3,5,6

LOS MICROORGANISMOS NO CRECEN SIN ELLOSLOS MICROORGANISMOS NO CRECEN SIN ELLOS

AminoácidosPrecursores de ácidos nucleicos u otros intermediarios

INCREMENTAN LA VELOCIDAD DE CRECIMIENTO INCREMENTAN LA VELOCIDAD DE CRECIMIENTO DISMINUYEN LA FASE LAGDISMINUYEN LA FASE LAG

Disponibilidad de los nutrientes

Los nutrientes además de estar presentes en el medio de de cultivo, deben estar disueltos disueltos para estar disponiblesdisponibles para ser usados por la célula.

¿POR QUÉ PUEDEN NO ESTAR ¿POR QUÉ PUEDEN NO ESTAR DISPONIBLES?DISPONIBLES?

la esterilización por calor. Se debe tener en cuenta la temperatura, tiempo de calentamiento, pH del medio

reacciones entre componentes antes, durante o después de la esterilización

Disponibilidad de los nutrientes

Los HPO4 utilizados como fuente de P y buffer deben esterilizarse separados de las sales de Mg, con Na, K y NH4

NaMgPO4NH4MgPO4 poseen baja solubilidad

KMgPO4

Los PO4 deben esterilizarse separadamenteLos PO4 deben esterilizarse separadamente de las sales de Mg y NH4de las sales de Mg y NH4

Disponibilidad de los nutrientes

Los azúcaresazúcares pueden descomponersedescomponerse por la acción del calor en presencia de sales inorgánicas y compuestos amínicos.

sales, H+sacarosa hidroliza

Los grupos carbonilos de los azúcarescarbonilos de los azúcares con los grupos amino grupos amino de las proteínasde las proteínas, aminoácidos, etc., dan productos de condensación (reacción de Maillard), los cuales disminuyen significativamente las cantidades de carbohidratos y N amínico disponible.

azúcares reductores + -NH2 condensación

Los carbohidratos se deben esterilizar por separado de los compuestos nitrogenados orgánicos.

Disponibilidad de los nutrientes

Aminoácido,Factores de crecimiento son lábiles al calorVitaminas

Se los prepara disolviéndolos separadamente en pequeños volúmenes de agua, en soluciones muy concentradas.

Se los esteriliza por filtración. Se los incorpora a los medios de cultivo ya esterilizados (en general 1ml de solución

por cada litro de medio) en condiciones de asepsia.

Fuente de N

Fuente de N utilizada son sales de NH4+ sales de NH4+ Esterilizar a un pH < 7 para evitar su volatilización como NH3.

Si ésta es urea urea debe esterilizarse por filtración Al del calor se descompone en NH3 y CO2,

Disponibilidad de los nutrientes

Es aconsejable entonces, esterilizar los componentes de los medios de cultivo en fracciones separadasfracciones separadas:

Fracción 1Fracción 1: Fte. de C, micronutrientes, sales de Mg, Ca, etc.

Fracción 2:Fracción 2: Fte. de N en caso que se descomponga por calor (urea) debe esterilizarse por filtración, o en caso de que reaccione con la fuente de C puede esterilizarse por calor pero separadamente.

Fracción 3:Fracción 3: Vitaminas y factores de crecimiento. Se preparan soluciones 1000 veces mas concentradas y se esterilizan por filtración.

Fracción 4Fracción 4: Fosfatos, se esterilizan por calor.

Diseño, Formulación, Optimización de medios de cultivo

DiseñoDiseño: Elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos

FormulaciónFormulación: Proporciones, concentraciones de cada componente.

OptimizaciónOptimización: Encontrar la mejor formulación para lograr el objetivo (máx biomasa, producto, etc.)

Optimización

Para organismos aerobios generalmente se utiliza como sistema de cultivo erlenmeyers agitados

Realizar experimentos, en los cuales se varía la concentración de 1 componente manteniendo constante las concentraciones de los demás ingredientes

Se varían más de un componente empelando un diseño factorial

Se analiza el efecto de la/ las variable escogida sobre la velocidad de crecimiento, rendimientos yxs, yps, etc.

Problelma

Tiempo

Lo

g X

CB

E

D

A