UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

INFORME FINAL DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

Construcción de rutas metabólicas y cálculo de velocidades de reacción para la biosíntesis de trehalosa en Saccharomyces cerevisiae

Director del proyecto: Dr. Juan Silvestre Aranda Barradas

Sección de Estudios de Posgrado e Investigación Departamento de Bioingeniería UPIBI

Profesor participante: Dr. Edgar Salgado Manjarrez Sección de Estudios de Posgrado e Investigación Departamento de Bioingeniería UPIBI

Estudiantes participantes: Iliana Barrera Martínez Estudiante PIFI 2º semestre del Doctorado en Bioprocesos UPIBI

Juan Leonardo Martínez Hurtado Estudiante PIFI 7º semestre de Ingeniería Biotecnológica UPIBI

José Israel Hernández Oropeza Estudiante PIFI y Tesista 7º semestre de Ingeniería Biotecnológica UPIBI

Laboratorio de Investigación en Bioingeniería

UPIBI-IPN, Av. Acueducto s/n, Col. La Laguna Ticomán, Del. G.A. Madero, D.F., C.P. 07340, México. Tel/Fax 5729-6000 ext. 56338, jaranda@acei.upibi.ipn.mx. CLAVE SIP 20071195 AVANCE 98%

- 1 -

RESUMEN

En la producción de activos biológicos mediante las redes bioquímicas que componen el

metabolismo celular, y con el avance continuo en la secuenciación de genomas, se utilizan cada

vez más conocimientos de genómica funcional, proteómica y metabolómica. Estos conocimientos

deben ser complementados por un enfoque matemático para poder generar una estimación

cuantitativa de los flujos metabólicos que, en última instancia, son el punto del metabolismo en

donde se producen en términos reales los compuestos de interés.

El análisis de las velocidades de reacción en una red metabólica simplificada ofrece una

opción en la estimación cuantitativa de producción de metabolitos.

La levadura Saccharomyces cerevisiae es un insumo biológico importante de diversos

procesos de producción de alimentos como la elaboración de pan, la producción de bebidas

alcohólicas y la producción de complementos nutricionales para consumo animal y humano. En

particular, la calidad de la levadura implica un elevado nivel de viabilidad celular, la cual

depende de la concentración intracelular de trehalosa alcanzada en el proceso de propagación del

microorganismo.

En el presente proyecto se propone la aplicación de la construcción de una red metabólica

simplificada y del análisis de velocidades de reacción en esa red para estimar, con bases

bioquímicas, el contenido intracelular de trehalosa en la levadura durante un proceso de

producción de biomasa en cultivo continuo.

- 2 -

I. INTRODUCCIÓN Ingeniería metabólica, análisis de velocidades de reacción y generación de redes metabólicas simplificadas

El metabolismo celular es resultado de la totalidad de reacciones bioquímicas –catalizadas por

enzimas– que conforman una compleja red de interacciones químicas dentro de la célula. Esa

complejidad del metabolismo se caracteriza por el acoplamiento de reacciones para desarrollo de

las funciones celulares. Cada reacción transforma uno o más compuestos dentro de la red

metabólica, y los productos de esa reacción constituyen intermediarios que podrán ser

reconvertidos a otros compuestos metabólicos en distintas reacciones del metabolismo celular.

Cada conversión química de los intermediarios del metabolismo es catalizada por una enzima,

cuya estructura molecular se determina por la secuencia de información codificada en el material

genético celular. Así, el funcionamiento de la célula se estructura en tres niveles diferentes:

1) Información genética celular.

2) Biocatálisis citoplásmica.

3) Redes de reacciones metabólicas.

La información genética se agrupa en unidades llamadas genes que en conjunto componen

el genoma de la especie, y la secuenciación del genoma junto con el estudio de las interacciones

entre los genes y sus productos se denomina genómica. En los genes se encuentra definido el

orden del encadenamiento de aminoácidos de cualquier proteína celular, incluidas las enzimas

necesarias para la catálisis de las reacciones bioquímicas del citoplasma. La elucidación de

estructuras proteicas y de sus funciones es el domino de estudio de la proteómica. La acción

catalítica de las enzimas implica la regulación de las velocidades de reacción dentro de una

secuencia de reacciones bioquímicas en citoplasma, lo cual controla al metabolismo celular de

forma integral. El estudio del metabolismo, o de un módulo metabólico simplificado, corresponde

a la metabolómica (Nielsen, 2001).

La ingeniería metabólica se define como el mejoramiento de la actividad celular mediante

la manipulación de funciones enzimáticas, de transporte o regulatorias con el uso de tecnologías

de ADN recombinante (Bailey y col., 1996). La aplicación de técnicas de biología molecular para

la recombinación de material genético implica un cierto conocimiento del genoma, y la

disponibilidad de genomas secuenciados se incrementa continuamente, de manera que los

- 3 -

propósitos de la ingeniería genética se han convertido en el centro de una gran cantidad de

esfuerzos científicos y para el desarrollo de tecnologías biológicas (Fiehn y Weckwerth, 2002).

Sin embargo, el planteamiento de la manipulación del metabolismo por medio de recombinación

genética ha resultado infructuoso en muchos casos (Bailey y col., 1996). Se requiere evaluar los

efectos de la sobreexpresión de genes que codifican para cierta enzima en una determinada red

metabólica completa, y no únicamente en la reacción cuya velocidad modifica directamente la

manipulación genética en cuestión. Existen al menos dos estrategias para el cálculo de la

actividad metabólica en una red de reacciones bioquímicas, la teoría de sistemas bioquímicos y el

análisis metabólico de velocidades de reacción (Cornish-Bowden, 1990). Ambas son estrategias

de modelación que persiguen la descripción en términos simbólico-matemáticos de los aspectos

esenciales de una red de reacciones bioquímicas (Giersch, 2000). El marco conceptual más

difundido por sus resultados es el análisis de velocidades de reacción (Nielsen y Viladsen, 1994),

el cual requiere de un esquema bioquímico de las reacciones más importantes en la red

metabólica (Stephanopoulos y col., 1998). Por tanto, antes de plantar el análisis de las

velocidades con que transcurren las reacciones bioquímicas del metabolismo, es necesario

generar una ruta metabólica que incluya un número reducido de las reacciones más importantes

de la ruta, esto es, una ruta metabólica simplificada. Las características que debe reunir una ruta

metabólica simplificada para ser utilizada en el análisis de velocidades de reacción incluyen:

1) La reducción del número de reacciones respecto al efectivamente encontrado en la ruta

bioquímica real (propiedad de simplificación).

2) El número de reacciones de la ruta simplificada debe garantizar la invariabilidad de los

coeficientes estequiométricos (propiedad de robustez).

3) El principio de conservación de la masa se debe cumplir en la ruta metabólica simplificada

(propiedad de consistencia).

4) La ruta metabólica simplificada debe representar cambios en los flujos iniciales de la ruta

bioquímica real (propiedad de flexibilidad).

La construcción de rutas o redes metabólicas simplificadas que reúnan las mencionadas

características requiere de un procedimiento sistemático y de un método de validación.

- 4 -

Ingeniería metabólica de la biosíntesis de trehalosa en Saccharomyces cerevisiae

Las especies microbianas, y en general las células de cualquier especie, representan un amplio

potencial metabólico utilizable en la obtención de productos con actividad biológica para

consumo humano (Bailey y col., 1996). En particular, el funcionamiento metabólico de

Saccharomyces cerevisiae ha sido ampliamente estudiado debido a dos razones básicas:

1) Es un microorganismo muy utilizado en diversos procesos de producción de alimentos para

consumo tanto humano como animal (Aranda y Salgado, 2002).

2) Es un microorganismo muy utilizado como modelo de estudio del metabolismo eucariótico

(Gancedo, 1998).

Un aspecto importante en el metabolismo de Saccharomyces cerevisiae es su contenido

intracelular de trehalosa. La acumulación de este metabolito genera un mejoramiento en la

viabilidad celular de la levadura cuando es tratada en procesos de secado (Slaughter y Nomura,

1992). La trehalosa sustituye moléculas de la esfera de solvatación de proteínas cuando

disminuye la actividad acuosa circundante, con lo que la levadura se mantiene viable aún después

de pasar por algún proceso de deshidratación (Elbein, 1974). Por otro lado, la hidrólisis de la

trehalosa aporta moléculas energéticas para el mantenimiento del metabolismo en condiciones

basales, dado que el disacárido está constituido por dos moléculas de glucosa (Silljé y col., 1999).

Las funciones celulares descritas explican que la calidad de una levadura utilizada en la

producción de pan esté estrechamente relacionada con la concentración intracelular de trehalosa

que tenga. Si la trehalosa rebasa el 10 % del peso de biomasa seca, la levadura se mantiene viable

como buen insumo biológico para la elaboración de pan, y su vida de anaquel se incrementa

significativamente. Con menores contenidos citoplásmicos de trehalosa, la levadura no resiste los

procesos de acondicionamiento que la transforman en insumo para la panificación, y su vida de

anaquel es considerablemente corta (Slaughter y Nomura, 1992). Lo anterior determina la

importancia de la acumulación de trehalosa durante los procesos de producción de levadura para

panificación.

Se ha reportado (Eturgay y col., 1997; Parrou y col., 1999) que el dímero trehalosa es un

metabolito intracelular que se sintetiza en la levadura Saccharomyces cerevisiae al ser cultivada

bajo limitación de carbono, fósforo o nitrógeno. Sin embargo, aunque existen propuestas de

modelación matemática de la biosíntesis de trehalosa (Aranda y col. 2004; Voit, 2003), aún no se

ha desarrollado un esquema teórico confiable para representar los eventos bioquímicos que se

- 5 -

presentan en el metabolismo celular y que conducen a la acumulación de trehalosa en la levadura

bajo limitación en el suministro de carbono, fósforo o nitrógeno.

Las reacciones de biosíntesis de la trehalosa están asociadas al metabolismo energético de

Saccharomyces cerevisiae, de modo que un planteamiento de la interacción entre intermediarios

de ambas rutas metabólicas permitiría explicar la acumulación citoplásmica de trehalosa en

términos de las velocidades de consumo de sustratos (y producción de metabolitos excretados)

medibles en el medio de cultivo. La representación de éstos fenómenos bioquímicos en una red

metabólica simplificada es el inicio del análisis de las velocidades de reacción en la red. Este

análisis determina la distribución de flujos de carbono entre las reacciones bioquímicas de la red

que conllevan al incremento de la biosíntesis de trehalosa en las células de levadura, lo cual

representa un potencial interés de explotación industrial en procesos de producción de levadura.

II. MÉTODOS EXPERIMENTALES Y DE CÁLCULO Construcción de redes metabólicas simplificadas

Partiendo de la base de datos sobre rutas bioquímicas y secuenciación de genomas KGEE

(Kanehisa y Goto, 2000) es posible ensamblar una red metabólica completa inicial y

simplificarla. El algoritmo de simplificación ya ha sido descrito en detalle (Aranda y col., 2006).

En términos generales, la simplificación de la red metabólica consiste en reducir el número de

reacciones y de intermediarios metabólicos a los estrictamente necesarios para explicar la

acumulación de la trehalosa en el citoplasma de la levadura.

Análisis de velocidades de reacción y estimación teórica de la trehalosa intracelular

Cuando se dispone de una red metabólica simplificada y consistente (véase pág. 3), se posibilita

el análisis de las velocidades de reacción del conjunto de reacciones implicadas en la red. El

análisis parte de la estequiometría de la general de la transformación microbiana pxs +→ ,

donde s representa a los sustratos necesarios para la formación de los componentes de la biomasa

estructurada x y de los metabolitos extracelulares p, se escribe en términos generales (Nielsen y

Villadsen, 1994) como:

- 6 -

( ) 0Xps

TXps

ΓBAΓXBpAs =⎟⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜⎜

⎝

⎛=

⎟⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜⎜

⎝

⎛⋅=++ (1)

siendo A, B y Γ las matrices de coeficientes estequiométricos correspondientes a los sustratos

agrupados en el vector s, a los productos incluidos en el vector p y a los componentes de la

biomasa del vector X. Las matrices estequiométricas permiten definir una matriz T denominada

estequiométrica total, que relaciona a las velocidades volumétricas de reacción extracelulares q

con las velocidades de reacción intracelulares r, mediante la ecuación:

txrTq T= (2)

donde xt es la concentración total de biomasa en el cultivo. Puede mostrarse (Nielsen y Viladsen,

1994) que descomponiendo a q de la ecuación (2) en un conjunto de velocidades medidas (qm),

uno de velocidades calculadas (qc) y otro de velocidades internas no detectables en el medio de

cultivo (qI), [ ]TIcm qqqq = (siendo qI = 0), con la correspondiente partición de r en [ ]Tcm rrr = ,

es posible hallar los valores de todas las velocidades desconocidas, tanto de las extracelulares

(qc), como de las velocidades de reacción involucradas en una ruta metabólica intracelular (rm y

rc). La partición de los vectores de velocidades q y r hace necesaria una descomposición de la

matriz estequiométrica total observable (T ) de la manera siguiente:

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛

⎟⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜⎜

⎝

⎛=

⎟⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜⎜

⎝

⎛⇒=

t

tt x

xx

c

m

65

43

21

c

mT

rr

TTTTTT

0qq

rTq (3)

Con la ecuación (3) se derivan las expresiones para hallar qc, rm y rc:

m1m qAr =tx ; mc qAr 2=tx ; m3c qAq = (4)

donde A1, A2 y A3 se calculan a partir de la matriz estequiométrica total T, bajo el supuesto de

que se cumplen las condiciones de observabilidad del sistema reacciones metabólicas-reacciones

extracelulares (Nielsen y Villadsen, 1994). -1

71 TA =

-175

-162 TTTA −=

-175

-16433 TTTTTA )( −= , donde:

(5)

5-1

6217 TTTTT −= (6)

La condición de observabilidad se establece en la ecuación (6) indicando que la partición T6 de la

matriz T se pueda invertir. Para esto se requiere que el rango de T6 sea igual a los grados de

libertad del sistema, dado por la resta del número de reacciones intracelulares y el número de

- 7 -

metabolitos considerados en estado seudo-estacionario. La utilidad de las ecuaciones (5) y (6)

reside en que permiten encontrar las velocidades de reacción de una red metabólica a partir de

ciertas velocidades volumétricas medidas en algún cultivo experimental.

Protocolo experimental para producción de levadura enriquecida en trehalosa

El desarrollo experimental de los cultivos celulares para la producción de levadura por lote

alimentado es el mismo que el utilizado previamente (Aranda y col., 2006). Las velocidades

volumétricas qm necesarias para el análisis de los flujos metabólicos en la ruta de biosíntesis de la

trehalosa han sido determinadas en cultivos de levadura por lote alimentado. Las ecuaciones de

balance para el cultivo alimentado tienen la forma:

( )ssqsas −+= D

dtd , para los sustratos.

pqpp D

dtd

−= , para los productos extracelulares.

txt Dxq

dtdx

−= , para la biomasa.

(7)

en donde D es la tasa de dilución, sa es la concentración de los sustratos en el medio alimentado

al cultivo y qs, qp y qx son velocidades volumétricas medidas experimentalmente. Nótese que las

velocidades medidas [ ]TCOEOG qqqqm 22

=mq , con [ ]TOG qqm 2

=sq y [ ]TCOE qq2

=pq , pueden

obtenerse fácilmente a partir de las ecuaciones (7) aplicadas en las condiciones de operación del

cultivo. Los cultivos por lote alimentado fueron efectuados en un reactor tanque agitado de 15 L

con un volumen inicial de 6 L, y a condiciones controladas de 30 oC, pH 5 y concentración de

oxígeno disuelto a 20 % de saturación. El medio de cultivo utilizado es un medio sintético con

40 g/L de sustrato carbonado (Aranda et al., 2004). La figura 1 muestra el dispositivo

experimental para el cultivo de Saccharomyces cerevisiae en lote alimentado utilizado en la

determinación de las velocidades medidas qm.

La acumulación de trehalosa se indujo en diferentes experimentos mediante la limitación

del sustrato carbonado o nitrogenado en la fase final del cultivo. Los suministros fueron

controlados para evitar la doble limitación (Baltzis y Frederickson, 1988).

Las técnicas de análisis cuantitativo aplicadas para el seguimiento de los cultivos

(determinación de glucosa residual, cuantificación de biomasa, cuantificación de nitrógeno

suministrado y residual, extracción y cuantificación de trehalosa intracelular) se incluyen en el

anexo.

- 8 -

III. RESULTADOS Redes metabólicas (completa y simplificada) para la biosíntesis de trehalosa en Saccharomyces

cerevisiae

La red metabólica completa de las rutas metabólicas involucradas en la biosíntesis de trehalosa

fue construida a partir de la base de datos KEGG y ya ha sido reportada con anterioridad (Aranda

y col., 2006). Aplicando los criterios de simplificación (Hatzimanikatis y col., 1998;

Stephanopoulos y col., 1998) se determinaron cuatro vías más probables para la biosíntesis de

trehalosa en citoplasma celular de Saccharomyces cerevisiae.

CO2

O2

Solution de sels

Solution de glucose

NH3

ouNaOH

Analyseursdes gaz en sortie

OrdinateurAcquisition des données (CO et O )Commande de la pompe (glucose)

2 2

BiocontrolerContrôle du pHContrôle de l’O2 dissous

Bioréacteur

Air

Bainthermostaté

Pompe

Pipettes pourmesurer les débits

Pipetas para medición del flujo

alimentado

Sales Glucosa

Bombas de adición

Aire

Analizadores de gas

Adquisición de datos y control del suministro de glucosa

Biorreactor Control de pH

y oxígeno disuelto

Solución alcalina

Figura 1. Dispositivo experimental para cultivos en lote alimentado de Saccharomyces cerevisiae.

α-D-Glucosa-6P

Piruvato

ATP

α,α-Trehalosa

Aceti l-CoA

UTP

ATP, NADH

ATPOxígeno

NADH

r1α-D-Glucosa

r2

UDP-Glucosa

r4

r9Etanol

CO2

r19r20

NADH

r3

Acetato inCO2, NADPH

CO2, NADHr10

r12ATP

r14

OxaloAcetato

CO2,ATP

r21CO2,NADPH

2-Oxo-Glutarato

r16

r17CO2,ATP,NADH

L-Glutamato

Amonio,NADPH

r18

Acetato exr13

α-D-Glucosa-6P

Piruvato

ATP

α,α-Trehalosa

Aceti l-CoA

UTP

ATP, NADH

ATPOxígeno

NADH

r1α-D-Glucosa

r2

UDP-Glucosa

r4

r9Etanol

CO2

r19r20

NADH

r3

Acetato inCO2, NADPH

CO2, NADHr10

r12ATP

r14

OxaloAcetato

CO2,ATP

r21CO2,NADPH

2-Oxo-Glutarato

r16

r17CO2,ATP,NADH

L-Glutamato

Amonio,NADPH

r18

Acetato exr13

Figura 2. Red metabólica simplificada (A) para la biosíntesis de trehalosa

- 9 -

α-D-Glucosa-6P

Piruvato

ATP

α,α-Trehalosa

Acetil-CoA

UTP

ATP, NADH

ATPOxígeno

NADH

r1α-D-Glucosa

r2

UDP-Glucosa

r4

r9Etanol

CO2

r18r19

NADH

r3

Acetato

CO2,NADH

r10

r11ATP

r13

OxaloAcetato

CO2,ATP r20

CO2,NADH

2-Oxo-Glutarato

r14

r16CO2,ATP,NADH

L-Glutamato

Amonio,NADPH

r17

α-D-Glucosa-6P

Piruvato

ATP

α,α-Trehalosa

Acetil-CoA

UTP

ATP, NADH

ATPOxígeno

NADH

r1α-D-Glucosa

r2

UDP-Glucosa

r4

r9Etanol

CO2

r18r19

NADH

r3

Acetato

CO2,NADH

r10

r11ATP

r13

OxaloAcetato

CO2,ATP r20

CO2,NADH

2-Oxo-Glutarato

r14

r16CO2,ATP,NADH

L-Glutamato

Amonio,NADPH

r17

Figura 3. Red metabólica simplificada (B) para la biosíntesis de trehalosa

α-D-Glucosa-6P

Piruvato

ATP

α,α-Trehalosa

Acetil-CoA

UTP

ATP, NADH

ATPOxígeno

NADH

r1α-D-Glucosa

r2

UDP-Glucosa

r4

r9Etanol

CO2

r19r20

NADH

r3

Acetato inCO2, NADPH

CO2, NADHr10

r12ATP

r14

OxaloAcetato

CO2,ATP r21

CO2,NADPH

2-Oxo-Glutarato

r16

r17CO2,ATP,NADH

L-Glutamato

Amonio,NADPH

r18

Acetato exr13

α-D-Glucosa-6P

Piruvato

ATP

α,α-Trehalosa

Acetil-CoA

UTP

ATP, NADH

ATPOxígeno

NADH

r1α-D-Glucosa

r2

UDP-Glucosa

r4

r9Etanol

CO2

r19r20

NADH

r3

Acetato inCO2, NADPH

CO2, NADHr10

r12ATP

r14

OxaloAcetato

CO2,ATP r21

CO2,NADPH

2-Oxo-Glutarato

r16

r17CO2,ATP,NADH

L-Glutamato

Amonio,NADPH

r18

Acetato exr13

Figura 4. Red metabólica simplificada (C) para la biosíntesis de trehalosa

α-D-Glucosa-6P

Piruvato

ATP α,α-Trehalosa

Aceti l-CoA

UTP

ATP, NADH

ATPOxígeno

NADH

r1α-D-Glucosa

r2

UDP-Glucosa

r4

r9Etanol

CO2

r19r20

NADH

r3

CO2, NADHr10

OxaloAcetato

CO2,ATP r21

CO2,NADPH

2-Oxo-Glutarato

r16

r17CO2,ATP,NADH

L-Glutamato

Amonio,NADPH

r18

ATPr5

α-D-Glucosa-6P

Piruvato

ATP α,α-Trehalosa

Aceti l-CoA

UTP

ATP, NADH

ATPOxígeno

NADH

r1α-D-Glucosa

r2

UDP-Glucosa

r4

r9Etanol

CO2

r19r20

NADH

r3

CO2, NADHr10

OxaloAcetato

CO2,ATP r21

CO2,NADPH

2-Oxo-Glutarato

r16

r17CO2,ATP,NADH

L-Glutamato

Amonio,NADPH

r18

ATPr5

Figura 5. Red metabólica simplificada (D) para la biosíntesis de trehalosa

- 10 -

Las cuatro redes metabólicas (figuras 2-5) representan vías teóricamente posibles para la

biosíntesis de trehalosa en Saccharomyces cerevisiae. Cada una de ellas requiere de un aparato

enzimático (proteómico) específico, es decir, para que la red metabólica A (figura 2) se realice en

el citoplasma celular se requiere un determinado conjunto de enzimas para catalizar el total de

reacciones de la red, mientras para el caso B (figura 3), otro conjunto enzimático sería necesario.

La factibilidad enzimática mínima necesaria en el fenotipo de Saccharomyces cerevisiae se

encuentra contenida en la red metabólica simplificada D. Esta red simplificada incluye la

reacción de hidrólisis de la trehalosa, útil en la explicación de la degradación dinámica del

dímero. Por tanto, la ruta metabólica más consistente es la red D (figura 5).

Análisis de velocidades de reacción y estimación de flujos metabólicos en la biosíntesis de trehalosa

Con una red metabólica simplificada definida y congruente con el fenotipo celular de la levadura,

es posible desarrollar un análisis estequiométrico para definir la matriz T. La matriz

estequiométrica total para el esquema de red metabólica D se muestra en la figura 6.

Figura 6. Matriz estequiométrica total de la red metabólica simplificada (D)

- 11 -

En la matriz de la figura 6, las columnas representan a cada una de las velocidades de

reacción mientras los renglones son los compuestos de la red metabólica. Los compuestos

marcados con el color azul son sustratos o productos cuya velocidad volumétrica de consumo o

producción se midió experimentalmente en los cultivos lote alimentado de Saccharomyces

cerevisiae. Para los compuestos en color rojo las velocidades de reacción se calculan sin

considerar que esos metabolitos se encuentran en estado pseudo-estable, y los compuestos

marcados en amarillo se consideran en estado pseudo-estable.

La descomposición de la matriz T mostrada en la ecuación (3), se aplica a la red metabólica

para calcular las velocidades de reacción r (figura 5). Como lo indica la ecuación (4), las

velocidades intracelulares r implicadas en la red metabólica son calculadas a partir de las

velocidades volumétricas extracelulares medidas, las cuales son:

1) La velocidad volumétrica de consumo de glucosa.

2) La velocidad volumétrica de consumo de amonio.

3) La velocidad volumétrica de producción de CO2.

4) La velocidad volumétrica de consumo de O2.

Durante una serie de cultivos en lote alimentado de levadura, se realizaron mediciones

instantáneas (cada hora o cada dos horas) de estas velocidades. Con esa información

experimental resultó posible la estimación de cada velocidad intracelular r y de las velocidades

de reacción calculadas qc, entre las cuales las de mayor importancia son las de biosíntesis e

hidrólisis de la trehalosa.

Cuadro 1. Comparación de la determinación experimental de la concentración intracelular de trehalosa y

la estimación del modelo de red metabólica para la biosíntesis del dímero

- 12 -

El cuadro 1 muestra los flujos metabólicos de síntesis (r4) e hidrólisis (r5) de la trehalosa

dentro del citoplasma de la levadura, así como los datos experimentales y las estimaciones del

modelo de red metabólica propuesto.

En la figura 7 se observa que la red metabólica y su análisis de velocidades de reacción

correspondiente proporcionan una adecuada predicción de la concentración de trehalosa en las

células de levadura durante el tiempo del proceso.

IV. CONCLUSIONES E IMPACTO DEL PROYECTO

La explotación del metabolismo celular se ha potenciado con el descubrimiento y secuenciación

de genomas de cada vez más especies biológicas. La comprensión del funcionamiento del

genoma, de los procesos bajo los que el genoma posibilita la síntesis de biocatalizadores de

actividad regulable y de la afectación en los flujos metabólicos debida a tal actividad enzimática

conllevan a un uso mejor dirigido del potencial metabólico de las especies. Sin embargo, dentro

de la genómica funcional y de la metabolómica, la cuantificación de los flujos es necesaria para la

producción de algún metabolito de interés. Esa cuantificación de flujos metabólicos sólo es

factible mediante la modelación de las reacciones y las velocidades de reacción que ocurren en el

conjunto de las redes bioquímicas que constituyen el metabolismo. Sin embargo el modelo tiene

distintos niveles de aplicabilidad:

1) Descripción de resultados experimentales obtenidos en un cultivo.

2) Representación de datos obtenidos en un conjunto de cultivos.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

14 16 18 20 22 24 26 28

Tiempo (h)

Datos experimentales

Modelo Metabólico

Con

teni

do d

e tr

ehal

osa

cito

plás

mic

a (%

)

Figura 7. Evolución del contenido intracelular de trehalosa en levadura experimental y estimado mediante el modelo de red metabólica.

- 13 -

3) Predicción de la acumulación de trehalosa en la producción de biomasa por cultivo en lote

alimentado.

La red metabólica construida permitió realizar estimaciones del contenido intracelular de

trehalosa en la levadura con buena precisión, puesto que el coeficiente de variación promedio

entre las estimaciones teóricas y las mediciones experimentales de la concentración intracelular

de trehalosa es de 7.7 %.

Con ciertos ajustes aún requeridos en el modelo, se podrá utilizar en la planeación de

protocolos de producción industrial de levadura enriquecida en trehalosa. Por otra parte, permitió

la formación de tres estudiantes PIFI. Iliana Barrera se encuentra iniciando su segundo año del

Doctorado en Bioprocesos de la UPIBI. Juan Leonardo Martínez, estudiante egresado de la

carrera de Ingeniería Biotecnológica de la UPIBI actualmente cursa una Maestría en

Bionanotecnología en la Universidad de Sheffield, UK. Isreael Hernández se encuentra en la fase

final de escritura de tesis de licenciatura para egresar de la carrera de Ingeniería Biotecnológica

de la UPIBI. El proyecto fue presentado en varios congresos nacionales.

V. PROSPECCIÓN DE LA INVESTIGACIÓN

El modelo metabólico generado en el presente proyecto permite una adecuada representación de

los datos experimentales para el contenido intracelular de trehalosa en Saccharomyces cerevisiae,

sin embargo requiere de otras características suplementarias para alcanzar el propósito final de la

predicción que permitiría su uso en procesos de producción industrial. Se requiere incorporar al

análisis de velocidades de reacción de la red metabólica simplificada un modelo de circuitos

génicos para el control de la síntesis de las principales enzimas en cada ruta bioquímica (Varner y

Ramkrishna, 1999).

VI. REFERENCIAS DOCUMENTALES Aranda J.S. y Salgado E. (2002). Producción de biomasa de Saccharomyces cerevisiae y usos en el sector alimentario, Tecnología de Alimentos, 37, 7-15. Aranda J.S., Salgado E. y Taillandier P. (2004). Trehalose accumulation in Saccharomyces cerevisiae cells: Experimental data and structured modeling, Biochemical Engineering Journal, 17 (2), 129-140.

- 14 -

Aranda J.S., Salgado E., Urban A.P., Medina M.M., Martínez J.L y Hernández J.I. (2006). Control metabólico de la biosíntesis de trehalosa en Saccharomyces cerevisiae, Informe de Proyecto de Investigación 20060154, Secretaría de Investigación y Posgrado, Instituto Politécnico Nacional. Bailey J., Sbularti A., Hatzimanikatis V., Lee K., Renner W.A. y Tsai P. (1996). Inverse metabolic engineering: A strategy for direct genetic engineering os useful phenotypes, Biotechnology and Bioengineering, 5, 109-121. Baltzis B.C. y Frederickson A.G. (1988). Limitation of growth rate by two complementary nutrients: Some elementary but neglected considerations, Biotechnology and Bioengineering, 31, 75-86. Cornish-Bowden A. (1990). Metabolic control theory and biochemical systems theory: different objectives, different assumptions, different results, Journal of Theoretical Biology, 136, 365-377. Elbein A.D. (1974). The metabolism of α,α-trehalose, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, 30, 227-256. Ertugay N., Hamamci H. y Bayindirli A. (1997). Fed-batch cultivation of backer’s yeast: effect of nutrient depletion and heat stress on cell composition, Folia Microbiologica, 42, 214-218. Fiehn O. y Weckerth W. (2002). Deciphering metabolic networks, European Journal of Biochemistry, 270, 579-588. Gancedo C. (1998). Reflections on yeast metabolism, Proceedings del 19o Symposium ISSY, 30 de agosto – 3 de septiembre, Braga, Portugal. Giersch C. (2000). Mathematical modeling of metabolism, Current Opinion in Plant Biology, 3, 249-253. Hatzimanikatis V., Emmerling M., Sauer U. y Bailey J.E. (1998). Application of mathematical tools for metabolic design of microbial ethanol production, Biotechnology and Bioengineering, 58, 154-161. Kanehisa M. y Goto S. (2000). KEGG: Kyoto Enciclopedia of Genes and Genomes, Nucleic Acid Research, 28, 27-30. Nielsen J. (2001). Metabolic engineering, Applied Microbiology and Biotechnology, 55, 263-283. Nielsen J. y Villadsen J. (1994). Analysis of reaction rates. En: Bioreaction Engineering Principles. Plenum Press, U.S.A., 97-162. Parrou J.L., Enjalbert B., Ploudre L., Bauche A., Gonzalez B. y François, J. (1999). Dynamic responses of reserve carbohydrate metabolisme under carbon and nitrogen limitations in Saccharomyces cerevisiae, Yeast, 15, 191-203. Silljé H. H. W., Paalman J.W.G., ter Schure E.G., Olsthoorn A.J., Verkleij A.J., Boonstra J. y Verrips C.T. (1999). Function of trehalose and glycogen in cell cycle progression and cell viability in Saccharomyces cerevisiae, Journal of Bacteriology, 181, 396-400.

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Slaughter J.C. y Nomura T. (1992). Intracellular glycogen and trehalose contents as predictors of yeast viability. Enzyme Microbiology and Technoogy, 14, 64-67. Stephanopoulos G., Aristidou A.A. y Nielsen J. (1998). Metabolic Pathway Synthesis. En: Metabolic Engineering, Principles and Methodologies, Academic Press, U.S.A., 288-308. Varner J. y Ramkrishna D. (1999). Mathematical models for metabolic pathways, Current Opinion in Biotechnology, 10, 146-150. Voit E. (2003). Biochemical and genomic regulation of the trehalose cycle in yeast: review of observations and canonical model analysis, Journal of Theoretical Biology, 223, 55-78.

- 16 -

VII. NOMENCLATURA Símbolo Significado Unidades

A Matriz estequiométrica de los sustratos moli/C-mol A1...3 Matrices definidas por la ecuación (5) ─

B Matriz estequiométrica de los productos moli/C-mol D Tasa de dilución del cultivo h-1

p Vector que agrupa a las concentraciones variantes en el tiempo de los productos gp/L

q Vector de velocidades volumétricas extracelulares gi/L h qc Vector de velocidades volumétricas calculadas gi/L h

qI Vector de velocidades volumétricas para reacciones intracelulares no detectables en el medio gi/L h

qi Velocidad volumétrica del compuesto i especificado en el cuadro de metabolitos de la red metabólica gi/L h

qm Vector de velocidades volumétricas medidas gi/L h qs Vector de velocidades volumétricas de consumo de sustratos gi/L h

qp Vector de velocidades volumétricas de producción de metabolitos gi/L h

qx Velocidad volumétrica de producción de biomasa gxt/L h r Vector de velocidades específicas de reacciones intracelulares gi/gxt h

rm , rc Particiones del vector r

s Vector que agrupa a las concentraciones variantes en el tiempo de los sustratos gs/L

sa Vector de concentraciones de los sustratos en el flujo de alimentación al cultivo gs/L

T Matriz estequiométrica total definida en la ec. (1) ─ T1...6 Particiones de la matriz T ─ T7 Matriz definida por la ecuación (6) ─ t Tiempo h

X Vector que agrupa las concentraciones de los metabolitos componentes de la biomasa gi/L

xt Concentración total de biomasa en el cultivo gxt/L Γ Matriz estequiométrica de las reacciones intracelulares

- 17 -

VIII. ANEXO Cuantificación de carbohidratos totales con el reactivo de antrona La curva tipo para la determinación de azúcares totales por el método de la antrona se construyó de acuerdo al cuadro mostrado a continuación:

Cuadro A-1. Cantidades utilizadas para la elaboración de la curva tipo de antrona Sacarosa (mL) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 Agua destilada (mL) 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 KOH (mL) 0.1 Reactivo de antrona (mL) 3.0 Concentración de sacarosa mg/mL 0 20 40 60 80 100

Agregar KOH e incubar durante de 10 minutos a ebullición. Dejar enfriar a temperatura ambiente y adicionar el reactivo de la antrona, incubar a 40º C durante 10 minutos. Determinar la absorbancia a 620 nm. Realizar el trabajo estadístico para obtener la ecuación de recta y los intervalos de confianza.

y = 0.0106x - 0.0164R2 = 0.9931

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

0 20 40 60 80 100 120

mg/L sacarosa

Abs

620

nm

y = 0.0096x - 0.0499R2 = 0.9992

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 20 40 60 80 100 120

mg/L sacarosa

Abs

620

nm

Figura A-1. Curvas tipo obtenidas para la determinación de sacarosa por el método de la antrona, se

presenta la recta calculada por regresión lineal y las bandas de confianza. Cuantificación de carbohidratos reductores con el reactivo DNS La curva tipo para la determinación de azúcares reductores el método del DNS la se construyó de acuerdo al cuadro mostrado a continuación:

Cuadro A-2. Cantidades utilizadas para la elaboración de la curva tipo de DNS Glucosa (mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Agua destilada (mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 DNS (mL) 2.0 Agua (mL) 5.0 Concentración de glucosa g/L 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Agregar el reactivo de DNS incubar durante de 5 minutos en ebullición. Adicionar el agua y determinar la absorbancia a 575 nm. Realizar el trabajo estadístico para obtener la ecuación de recta y los intervalos de confianza.

- 18 -

y = 1.0018x - 0.0182R2 = 0.9991

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Glucosa (g/L)

Abs

575

nm

y = 1.5575x - 0.0046R2 = 0.9975

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

g/L glucosa

Abs

575

nm

Figura A-2. Curvas tipo obtenidas para la determinación de azúcares reductores por el método del DNS,

se presenta la recta calculada por regresión lineal y las bandas de confianza Extracción de glucógeno Colocar en un tubo para centrifuga de 4-10 mg de levadura (peso seco). En caso de tener levadura en suspensión, medir el volumen que contenga 4-10 mg de biomasa seca, de acuerdo con la densidad óptica de la suspensión y la correlación de biomasa Centrifugar durante 3 minutos a 5000 g y temperatura entre 0-4 ºC. Desechar el sobrenadante y resuspender el paquete celular con 0.25 mL de NaCO3 0.25 M. Incubar a 95 ºC por 4 horas. Ajustar el pH a 5.2 adicionando 0.15 mL de ácido acético 1 M y 0.6 mL de acetato de sodio 0.2 M. Agregar la cantidad necesaria de aminoglucosidasa de A. niger de tal manera que la concentración final sea de 1.2 U/mL e incubar toda la noche con agitación. Centrifugar 3 minutos a 5000 g y determinar glucosa al sobrenadante. Se determinó el glucógeno de cuatro muestras y los resultados son los siguientes:

Cuadro A-3. Resultados de la extracción de glucógeno Muestra mg glucógeno/mg biomasa

1 0.0018 2 0.0029 3 0.0019 4 0.0020

Extracción de trehalosa Colocar en un tubo de centrifuga con fondo redondo o cónico (30 mL) 0.02g de levadura seca. En caso de tener levadura en suspensión, medir el volumen que contenga 0.02g de biomasa seca, de acuerdo con la densidad óptica de la suspensión y la correlación de biomasa. Agregar a cada tubo 3 mL de ácido tricloroacético (TCA) 0.5 M y mezclar fuertemente con agitador vortex. Incubar a temperatura ambiente durante 40 minutos en agitación reciprocante continua. Centrifugar durante 10 minutos a 5000 rpm y recuperar el sobrenadante en un matraz aforado de 25 mL, con cuidado de no verter biomasa del fondo. Al sedimento adicionar otros 3mL de TCA 0.5 M y repetir la extracción durante 40 minutos en agitación reciprocante continua. Recuperar nuevamente el sobrenadante y juntarlo con el primero en el matraz aforado de 25 mL. Completar con agua el volumen del matraz aforado y determinar azúcares totales por la técnica de la antrona. Se llevaron a cabo tres extracciones de trehalosa a la misma muestra. Se trataron 5 muestras, una de ellas se sometió a inactivación celular de acuerdo al protocolo descrito en seguida.

- 19 -

Cuadro A-4. Resultados de la extracción de trehalosa mg trehalosa/mg biomasa Muestra

1ra extracción 2da extracción1 7.14 1.89 2 8.02 2.98 3 10.19 5.62 4 10.35 4.94

Inactivada 14.39 4.44 Inactivación celular de Saccharomyces cerevisiae Preparar una solución de ácido perclórico 0.66 M (57 mL, 70% p/v de ácido se diluye en 1000 mL de agua destilada). Para inactivar las células, tomar la muestra en tubos para centrifuga que contengan el ácido perclórico frío, a una razón de 1:1. Correlaciones lineales para la estimación de la concentración de biomasa En el cuadro A-5 se presenta la compasión de los medios utilizados en las cinéticas de crecimiento para obtención de las correlaciones de peso seco – densidad óptica, así como de peso seco – viabilidad celular.

Cuadro A-5. Composición de los medios de cultivo utilizados en las cinéticas de crecimiento de S. cerevisiae

Compuesto (g/L) Medio semilla Medio para cinética Glucosa 50 30 Extracto de levadura 1 KH2PO4 5 (NH4)2SO4 2 MgSO47H2O 0.4

El pH se ajusta a 5.0 con ácido sulfúrico. Se prepararon 100 mL de medio semilla y 1000 mL de medio para la cinética. El medio semilla se inoculó con una asada de S. cerevisiae y se incubó toda la noche a 30 ºC y 150 rpm. El medio para la cinética se inoculó con 50 mL del medio semilla y se incubó a 30 ºC y 150 rpm. El tiempo de duración de la cinética fue de 10 h, y se realizó por triplicado. Se tomó muestra para determinar biomasa por peso seco, cuenta viable y absorbancia a 620 nm.

y = 37986x - 2322.4R2 = 0.9209

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

5.00E+04

6.00E+04

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

DO (Abs 620 nm)

Cél

ulas

Via

bles

y = 44189x - 3114.9R2 = 0.9596

0.E+00

1.E+04

2.E+04

3.E+04

4.E+04

5.E+04

6.E+04

7.E+04

8.E+04

9.E+04

0 0.5 1 1.5 2

DO (Abs 620 nm)

Cue

nta

viab

le

- 20 -

y = 34147x - 124.03R2 = 0.96

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

5.00E+04

6.00E+04

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

DO (Abs 620 nm)

Cél

ulas

Via

bles

Figura A-3. Curvas de correlación densidad óptica-células viables de Saccharomyces cerevisiae

obtenidas en las tres cinéticas realizadas. Se presenta la ecuación de la recta obtenida por regresión lineal.

La recta promedio es: Células viables = 38774x – 1853.7, donde x es la absorbancia a 620 nm.

y = 0.859x + 1.0273R2 = 0.9026

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

0 0.5 1 1.5 2DO (Abs 620 nm)

Bio

mas

a (g

/L

y = 0.9085x + 0.4472R2 = 0.9188

0

0.20.4

0.6

0.81

1.2

1.4

1.61.8

2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

DO (Abs 620 nm)

Bio

mas

a (g

/L)

y = 0.8599x + 0.4026R2 = 0.9355

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

DO (Abs 620 nm)

Bio

mas

a (g

/L)

Figura A-4. Curvas de correlación densidad óptica-peso seco de Saccharomyces cerevisiae obtenidas en

las tres cinéticas realizadas. Se presenta la ecuación de la recta obtenida por regresión lineal. La recta promedio es: Peso seco = 0.8758x – 0.6857, donde x es la absorbancia a 620 nm.