UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS

CARACTERIZACIÓN DEL GEN ALS (ACETOLACTATO

SINTASA) Y MUTACIONES QUE CONFIEREN

RESISTENCIA A HERBICIDAS EN QUÍNOA

(Chenopodium quinoa WILLD).

TESIS DE MAGÍSTER

CAMILO ALEXANDER MESTANZA UQUILLAS

VALDIVIA – CHILE

2012

CARACTERIZACIÓN DEL GEN ALS (ACETOLACTATO

SINTASA) Y MUTACIONES QUE CONFIEREN

RESISTENCIA A HERBICIDAS EN QUÍNOA (Chenopodium

quinoa WILLD).

Tesis presentada a la Facultad de Ciencias de la Universidad Austral de Chile en

cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Magíster en

Ciencias mención Genética.

Por:

CAMILO ALEXANDER MESTANZA UQUILLAS

Valdivia - Chile

2012

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS

INFORME DE APROBACIÓN TESIS DE MAGÍSTER

La Comisión Evaluadora de Tesis comunica al Director de la Escuela de Graduados de la

Facultad de Ciencias que la tesis de Magíster presentada por el candidato

CAMILO ALEXANDER MESTANZA UQUILLAS

ha sido aprobada en el examen de defensa de Tesis rendido el día martes 10 de abril del

2012, como requisito para optar al grado de Magíster en Ciencias mención Genética y, para

que así conste para todos los efectos firman:

Profesor Patrocinante de Tesis:

Prof. Ricardo Riegel Sch. Ing. Agrón, M. Sc., Dr. Rer. Silv. ------------------------------------

Facultad de Ciencias Agrarias

Universidad Austral de Chile

Comisión Evaluadora de Tesis:

Prof. Ricardo Fuentes P. Ing. Agrón., M. Sc. -------------------------------------

Facultad de Ciencias Agrarias

Universidad Austral de Chile

Prof. Christian Figueroa C. Lic. Cs. Biol., Dr. -------------------------------------

Facultad de Ciencias

Universidad Austral de Chile

Dedico este trabajo a mi amada esposa Diana Verónica, a mis queridos padres José

Camilo y Ligia Pepina, a mis bellas hermanas Jicel y Tamara. Y de manera muy especial a

dos seres que han guiado mi vida, mis abuelos José Gilberto y Mariana de Jesús†.

Agradecimientos

Quiero expresar mi profundo agradecimiento a todas las personas e instituciones que

hicieron posible mi sueño de estudiar en el extranjero y finalmente culminar con este

trabajo de investigación.

A mi profesor guía y Patrocinante, Dr. Ricardo Riegel S. por su gran amistad, apoyo y

constantes consejos. Quedo muy agradecido de toda su entrega y disposición en beneficio

de la culminación exitosa de este trabajo.

A la Universidad Austral de Chile y Universidad Técnica Estatal de Quevedo, por toda la

ayuda y colaboración brindada.

A la Escuela de Graduados de la Fac. de Ciencias y de la Fac. de Ciencias Agrarias, a Doña

Sandra Cifuentes y Doña. Viviana Riquelme por toda la ayuda y colaboración brindada.

Al Instituto de Ciencias Ambientales y Evolutivas. Al Instituto de Producción y Sanidad

Vegetal. Al Laboratorio Silvoagrícola.

A los profesores informantes, Dr. Christian Figueroa C. y M.Sc. Ricardo Fuentes P, por

toda su disposición a recibir mis visitas y consultas.

A M.Sc. Judith Carrasco P. y Dr. Manuel Muñoz D, por toda su ayuda y colaboración

constante durante mi etapa de desarrollo de estudios y ensayos de laboratorio.

A los laboratorios de Fitoquímica, Fitopatología, Ictiopatología y Producción Animal, por

facilitarme las instalaciones para los experimentos de clonación.

A la Bioquímica Ella Matamala, por su colaboración con los ensayos de clonación.

Al Dr. Herman Silva del Laboratorio de Genómica Funcional & Bioinformática de la

Universidad de Chile, por facilitarnos las secuencias de ARNm de Quínoa.

Finalmente agradezco a la SENESCYT de Ecuador, quien me otorgó la Beca de Magister

con la cual pude realizar mis estudios.

ÍNDICE DE CONTENIDOS

Capítulo Página

1 INTRODUCCIÓN 1

2 MATERIALES Y MÉTODOS 12

2.1 Material vegetal 12

2.2 Selección y diseño de partidores para la amplificación del gen ALS 13

2.3 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplificación del

gen ALS y secuenciación directa 15

2.4 Clonación y secuenciación 16

2.5 Análisis de secuencias 17

2.6 Validación de las copias de genes ALS y mutaciones 17

3 RESULTADOS 19

3.1 Amplificación mediante PCR del gen ALS en C. quinoa 19

3.2 Aislamiento e identificación del gen ALS en C. quinoa 21

3.3 Variación de la secuencia del gen ALS en C. quinoa 24

3.4 Identificación de mutaciones en el gen ALS en C. quinoa 27

3.5 Validación de copias y mutaciones 28

4 DISCUSIÓN 32

5 CONCLUSIONES 44

5 BIBLIOGRAFÍA 45

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla Página

1 Mutaciones que confieren diferentes niveles resistencia a herbicidas

de los grupos Sulfonilureas e Imidazolinonas (inhibidores de la

enzima ALS). 7

2 Partidores empleados para la amplificación de la secuencia del gen

ALS. 14

3 Resultados de las combinaciones de partidores empleados para la

amplificación de la secuencia del gen ALS. 20

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura Página

1 Biosíntesis de cadena de los aminoácidos ramificados: valina, leucina

e isoleucina. 2

2 Plantas de la variedad Regalona-Baer y línea mutante O-10-1.

Respuesta fenotípica 15 días después de la aplicación de herbicida

IMI (Onduty, BASF).

12

3 Esquema del anclaje de los partidores empleados para amplificar el

gen ALS en C. quinoa. 14

4 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) empleada para la

amplificación del gen ALS en C. quinoa. 21

5 Representación esquemática, ubicación y tamaño de los fragmentos

secuenciados con las combinaciones de partidores empleados en la

amplificación del gen ALS en C. quinoa.

22

6 Relaciones filogenéticas hipotéticas entre las secuencias ALS en

plantas incluyendo la nueva secuencia de C. quinoa, inferida por

máxima parsimonia.

22

7 Imagen parcial de un cromatograma del fragmento A del gen ALS

amplificado en C. quinoa. 23

8 Secuencia de nucleótidos (parte superior) y aminoácidos (parte

inferior) de los genes CQALS1, CQALS2 y CQALS3 del fragmento B. 25

9 Secuencia parcial de nucleótidos y aminoácidos de A= CQALS1 (A)

y B= CQALS3 (B) de C. quinoa. 26

10 Relación filogenética hipotética entre las copias de la secuencias ALS

y una de las copias mutadas de C. quinoa, inferida por máxima

parsimonia

27

11 Secuencia parcial de nucleótidos (parte superior) y aminoácidos

(parte inferior) de la ALS en C. quinoa. 28

12 Representación esquemática, ubicación del sitio de corte y tamaño de

los fragmentos ALS en C. quinoa resultantes de la digestión con las

enzimas SexAI (flecha roja), CseI (flecha verde), Mph1103I (flecha

azul) y BspPI (flecha negra) en la variedad Regalona-Baer (superior)

y línea mutante O-10-1 digerida con BspPI (inferior).

29

13 Detección de las tres copias del gen ALS en C. quinoa variedad

Regalona- Baer empleando endonucleasas. CQALS1 con BspPI (A),

CQALS2 con CseI (B) y Mph1103I (C). CQALS3 doble digestión con

BspPI y Mph1103I (D).

30

14 Análisis del patrón de restricción de ALSmutada en C. quinoa

restringida con la enzima BspPI. 31

15 Relaciones filogenéticas hipotéticas entre las secuencias ALS en

plantas incluyendo las nueva secuencias de C. quinoa, inferida por

máxima parsimonia.

36

ÍNDICE DE ABREVIATURAS

ALS Acetolactato sintasa

AHAS Acetohidroxiácido sintasa

PCR Reacción en cadena de la polimerasa (por sus siglas en ingles)

TD touchdown

IMI Imidazolinona

SU Sulfonilurea

CQALS Genes ALS de Chenopodium quinoa

ACCase Acetil-CoA carboxilasa

FOPs Ariloxifenoxipropanoatos

DIMs Ciclohexanodionas

EPSPS 5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfato-sintetasa

CRH Cultivos resistentes a herbicidas

CTAB Cetil trimetil bromuro de amonio

ADN Ácido desoxirribonucleico

MgCl2 Cloruro de magnesio

dNTP Deoxinucleótido tri-fosfato

TAE Tris – ácido acético - EDTA

EDTA Ácido etilendiaminotetraacético

NCBI National Center for Biotechnology Information

aa Aminoácidos

nt Nucleótidos

Taq Thermus aquaticus

S Aminoácido Serina (Ser)

G Aminoácido Glicina (Gly)

T Treonina (Thr)

P Prolina (Pro)

g Nucléotido de Guanina

a Nucléotido de Adenina

t Nucléotido de Timina

c Nucléotido de Citosina

dds Días después de la siembra

RESUMEN

La quínoa (Chenopodium quinoa Willd) es un pseudocereal subutilizado de gran

valor alimenticio cuyas cualidades nutritivas han sido reconocidas en el mundo entero. De

acuerdo a su origen genético C. quinoa es un alotetraploide (2n = 4x = 36), formado por

hibridación interespecífica de dos genomios de especies diploides y una posterior

duplicación del número de cromosomas.

La principal limitante para masificar el cultivo es el control de malezas. Los

herbicidas no son suficientemente selectivos para ser usados en C. quinoa, debido a que

esta se encuentra filogenéticamente emparentada con malezas de las subfamilias

Chenopodioideae y Amaranthoideae

Actualmente, existen especies vegetales con resistencia a herbicidas vinculados con

el gen acetolactato sintasa (ALS o AHAS). La enzima derivada de este gen cataliza el primer

paso en la síntesis de la cadena de los aminoácidos ramificados y es agronómicamente

importante ya que es el blanco de varios herbicidas de amplio espectro como las

imidazolinonas. Diferentes mutaciones puntuales del gen ALS en siete residuos conservados

de aminoácidos generan distintos niveles de resistencia.

El objetivo de este trabajo consistió en caracterizar la familia génica que codifica la

enzima ALS en C. quinoa. Además, identificar las mutaciones puntuales asociadas a la

resistencia a herbicidas en genotipos mutados resistentes a imazapic e imazapyr, con el fin

de desarrollar marcadores moleculares ligados a estos genes para asistir en el mejoramiento

genético de C. quinoa.

Para ello se extrajo ADN de la variedad Regalona Baer y de línea mutante artificial

O-10-1. La línea mutante ha sido seleccionada según sus niveles de resistencia a imazapic e

imazapyr (herbicida del grupo de las imidazolinonas). Para la amplificación del gen ALS se

utilizaron partidores descritos para otras especies y también se diseñaron nuevos partidores

analizando regiones conservadas entre especies emparentadas.

Los resultados obtenidos muestran que el genoma de quínoa presenta al menos tres

copias distintas del gen ALS. Las copias del gen ALS, CQALS1 y CQALS2 son genes

expresados. Estas copias no se encuentran interrumpidas por intrones, con un tamaño de

2001 pb las cuales se traducen en 667 aminoácidos incluidos el codón “stop”. La ausencia

de ARNm y cambio del marco de lectura de CQALS3 sugiere que es una copia silenciada.

La línea mutante O-10-1 en comparación con la variedad original mostró tres

polimorfismos que generan cambios aminoacídicos en la proteína, dos de las cuales se

encuentran en los dominios no conservados de la proteína (nt 299 y nt 392). Mientras que la

tercera sustitución en la copia CQALS2 del gen representa la mutación Thr195Ser. Esta

mutación se ubica en el dominio conservado (dominio A) la cual está asociada con la

resistencia a herbicidas del grupo de las imidazolinonas. La variación nucleotídica del gen

ALS en C. quinoa permitió desarrollar un marcador del tipo PCR-RFLP para la detección

de alelos específicos asociados a la resistencia a herbicida.

Este trabajo genera la base para la rápida identificación de nuevas variantes y la

generación de nuevos marcadores moleculares específicos para cada copia y mutación.

Estos genes serán introgresados en nuevas variedades comerciales, permitiendo la

producción de quínoa a gran escala proporcionando un control químico eficiente de

malezas.

Palabras claves: pseudocereal, ALS o AHAS, resistencia a herbicidas, mutación,

PCR-RFLP.

ABSTRACT

Quinoa (Chenopodium quinoa Willd) is an underutilized pseudocereal highly

nutritious whose qualities have been recognized worldwide. According to their genetic

origin C. quinoa is an allotetraploid (2n = 4x = 36), formed by hybridization of two diploid

genomes of species and a subsequent doubling of chromosomes.

The main limitation for widespread cultivation is weed control. Herbicides are not

sufficiently selective for use in C. quinoa, because this is species is phylogenetically close

related with weedy relatives of the subfamilies and Amaranthoideae Chenopodioideae.

Currently, there are plants species with herbicide resistance linked to the

acetolactate synthase (ALS or AHAS) gene. The enzyme derived from this gene catalyzes

the first step in the synthesis of branched chain amino acids and is agronomically important

since it is the target of several broad spectrum herbicides, as the imidazolinones. Different

mutations of the ALS gene in seven conserved amino acid residues generate different levels

of resistance.

The aim of this study was to characterize the gene family encoding the ALS enzyme

in C. quinoa. Also, identify point mutations associated with resistance to herbicide in

mutant genotypes resistant to imazapic and imazapyr, in order to develop molecular

markers linked to those genes to assist in C. quinoa breeding.

To achieve this, DNA was extracted from the variety Regalona Baer and artificial

mutant line O-10-1. The mutant line has been selected according to their levels of

resistance to imazapic and imazapyr. For the ALS gene amplification, primers were used as

described for other species and new primers were designed by analyzing conserved regions

between related species.

The results show that the quinoa genome has at least three different ALS gene

copies. The ALS gene copies, CQALS1 and CQALS2 are expressed genes. These copies are

not interrupted by introns, with a size of 2001 bp which translate into 667 amino acids

including stop codon. The absence of mRNA and change the reading frame of CQALS3

suggests that a copy is silenced.

The mutant line O-10-1 compared with the original variety showed three amino acid

polymorphisms that lead to changes in the protein, two of which are in non-conserved

domains of the protein (nt 299 and nt 392). While the third substitution in the gene copy

CQALS2 represents the mutation Thr195Ser. This mutation is located in the conserved

domain (domain A) which is associated with resistance to herbicides of the imidazolinone

group. The ALS gene nucleotide variation in C. quinoa marker opportunity to develop a

PCR-RFLP type for the detection of specific alleles associated with resistance to herbicide.

This work creates the foundation for the rapid identification of new variants and

generation of new molecular markers specific for each copy and mutation. These genes will

be introgresados in new commercial varieties, allowing the production of quinoa on a large

scale by providing efficient chemical control of weeds.

Keywords: pseudocereal, ALS or AHAS, herbicide resistance, mutation, PCR-RFLP.

1. INTRODUCCIÓN

La caracterización de genes implicados en la resistencia a herbicidas ha sido

ampliamente descrita tanto en plantas cultivadas como en malezas (Powles y Holtum, 1994;

Powles y Shaner, 2001; Powles y Yu, 2010). El justificativo de estudios en este campo

tienen que ver con que las malezas son una limitación importante para la producción de

cultivos y los herbicidas son elementos claves para su control en la mayoría de los sistemas

mundiales de producción de cultivos (Vila-Aiub y col., 2009).

Además la gran mayoría de los herbicidas empleados inhiben enzimas específicas

de la planta (sitio de destino del herbicida) que son esenciales en el metabolismo por lo cual

ha sido muy importante la descripción de los genes que codifican dichas para enzimas

(Powles y Yu, 2010).

Existen varios genes descritos que codifican enzimas que son el sitio de destino de

los herbicidas. Entre ellos tenemos a: i) psbA, un gen plastídico involucrado en la

resistencia a triazina (Foes y col, 1999; Foes y col 1998; Hirschberg y McIntosh, 1983;

Gronwald, 1994; Yaacoby y col., 1986; Lior y col., 2000). ii) Acetil coenzima A

carboxilasa (ACCase), que codifica una enzima clave en la biosíntesis de lípidos,

involucrada en la resistencia a herbicidas ariloxifenoxipropionatos (FOPs) y

ciclohexanodonas (DIMs) (Heap y Knight, 1982; Llewellyn y Powles, 2001; Owen y col.,

2007; Broster y Pratley, 2006; Delye y col., 2007; Moss y col., 2007). iii) 5-enolpiruvil-

shikimato-3-fosfato-sintetasa (EPSPS), enzima del cloroplasto involucrada en la síntesis de

producción de aminoácidos aromáticos, responsable de la resistencia a glifosato (Powles,

2003; Powles, 2008, Lee y Ngim, 2000; Baerson y col., 2002; Ng y col., 2003; Yu y col.,

2007). iv) Acetohidroxiácido sintasa (AHAS) también conocida como acetolactato sintasa

(ALS) que en los últimos años ha concitado un mayor interés (Heap, 2012; Saari y col.,

1994; Tranel y Wright, 2002; Powles y Yu, 2010).

La acetolactato sintasa (ALS o AHAS) es una enzima esencial en plantas, hongos y

bacterias pero no en mamíferos. Cataliza dos reacciones diferentes en la síntesis de la

cadena de los aminoácidos ramificados: valina, leucina e isoleucina. La primera reacción es

la condensación de dos moléculas de piruvato para formar acetolactato (producto

intermedio en la síntesis de la valina y leucina) y la segunda reacción es la condensación de

piruvato y 2-cetobutirato para formar 2-aceto-2-hidroxibutirato (un producto intermedio en

la síntesis de isoleucina) (Figura 1) (Chipman y col., 1998; Singh y col, 1999; Umbarger,

1978; Duggleby y Pang, 2000; McCourt y Duggleby, 2006).

Figura 1 Biosíntesis de cadena de los aminoácidos ramificados: valina, leucina e isoleucina.

Óvalo rojo muestra ubicación de AHAS o ALS en la ruta biosintética.

FUENTE: Duggleby y Pang, (2000).

Se afirma que la enzima ALS en plantas es un conjunto formado por cuatro

subunidades catalíticas y cuatro reguladoras (Lee y Duggleby, 2001, 2002; Duggleby y col.,

2008). Tanto en procariotas y eucariotas, los niveles de los aminoácidos de cadena

ramificada son moduladas por la inhibición por retroalimentación (Miflin, 1971; Miflin y

Cave, 1972; Umbarger, 1969), mientras que en las bacterias, los niveles de ALS están

regulados por la represión de genes (Umbarger, 1969, 1978).

La ALS se encuentra codificada en el núcleo de la célula, pero la localización

subcelular de la proteína en algunas levaduras y hongos está asociada a la mitocondria

(Ryan y Kohlhaw, 1974) mientras que en las plantas superiores se localiza en el cloroplasto

(Jones y col., 1985; Miflin, 1974). Puesto que genes nucleares codifican la ALS, ésta se

debe trasladar a los organelos después de la síntesis gracias al péptido de tránsito.

Numerosos intrones han sido reportados en los genes ALS de algas verdes y hongos

(Sweigard y col., 1997; Funke y col., 1999) y hasta el año 2002 todas las secuencias

publicadas de genes ALS en plantas mostraban genes no interrumpidos, libres de intrones y

compartían una considerable homología (Duggleby y Pang, 2000; Chipman y col., 1998;

Singh, 1999). Sin embargo, Uchino y Watanabe (2002), encontraron intrones en los dos

loci ALS clonados y secuenciados en Lindernia spp, posteriormente Uchino y col., (2007) y

Scarabel y col., (2010) también hallaron intrones en los loci ALS tanto para Schoenoplectus

juncoides y Schoenoplectus mucronatus respectivamente.

En lo referente al número de copias del gen se ha descrito que las levaduras tienen

una sola copia del gen ALS. En cambio, las bacterias tienen múltiples copias (Keeler y col.,

1993). En plantas superiores el número de copias de este gen es variable, principalmente

asociado al nivel de ploidía de las plantas. Así, especies diploides como Arabidopsis

thaliana tiene una sola copia constitutiva (Mazur y col., 1987). Zea mays definido como

alopoliploide críptico, tiene dos isoenzimas ALS muy similares (Fang y col., 1992). Los

alopoliploides como: Nicotiana tabacum tiene dos loci ALS, cuyas copias se expresan

coordinadamente en todos los órganos (Keller, 1993). En tanto, Gossypium hirsutum tiene

seis loci (Grula y col., 1995), Brassica napus, tiene cinco genes ALS, con las diferentes

isoformas, incluyendo al menos un pseudo gen (Wiersma, 1989; Oullet y col., 1992).

Múltiples genes ALS parecen no ser esenciales para el crecimiento normal de las

plantas superiores ya que muchas de ellas poseen uno solo. La presencia de varias copias

ALS en plantas poliploides refleja el origen genético de la especie en consideración (Keeler

y col., 1993; Lee y col., 1988; Rutledge y col., 1991; Grula y col., 1995; Oullet y col.,

1992). El mantenimiento de más de un gen funcional de ALS parece depender de una

expresión variable en diferentes órganos o durante diferentes etapas de desarrollo de la

planta (Oullet y col., 1992).

Se ha descrito que la duplicación génica juega un papel importante en la evolución

de las funciones de las proteínas. Sin embargo, todavía hay mucho debate acerca de los

mecanismos evolutivos que son responsables del destino de los genes duplicados (Storz,

2009).

Adams y Wendel, (2005) manifiestan que los genes duplicados se convierten en: i)

Una isoforma silenciada siempre y cuando no cumplan alguna función esencial. Las copias

generalmente acumulan mutaciones degenerativas debido a una relajación de la selección

purificadora (Storz, 2009); ii) Conservan su función original, con un mayor nivel de

regulación de la expresión; iii) Son subfuncionalizados particionando la función ancestral;

iv) Adquieren una nueva función (neofuncionalización), sobre la cual actúa principalmente

la selección positiva dado que hay una mejora en la adaptación de las funciones de las

proteínas, tanto ancestral y como derivada (Storz, 2009).

El interés de estudio sobre la enzima ALS se debe a que es el blanco de varias clases

de herbicidas, incluyendo: imidazolinonas (Shaner y col., 1984), sulfonilureas (Ray, 1984),

triazolopirimidina (Gerwick y col, 1990), piridinil benzoatos (Takahashi y col., 1991) y

sulfonylamino-carbonyl-triazolinona (Vencill, 2002). Ellos actúan induciendo la

precipitación o inhibiendo la acción enzimática de la ALS (Subramanian y col., 1990;

Jander y col., 2003). Así, provocan la acumulación de niveles tóxicos de 2-cetobutirato y la

disminución de la síntesis de proteínas que afecta el crecimiento celular y desemboca en la

muerte de la planta (Shaner, 1984, 1991; Singh y col., 1988). La popularidad de los

herbicidas inhibidores de la ALS radica en su empleo a bajas dosis (Saari y col., 1994), su

baja toxicidad para los mamíferos, amplia selectividad hacia los cultivos, control efectivo y

prolongado de un amplio espectro de malezas (Mazur y Falco, 1989).

La notoriedad lograda por los herbicidas inhibidores de la ALS y por lo tanto del uso

repetido de los mismos, ha favorecido la resistencia en poblaciones de muchas especies.

Actualmente están descritas 201 especies (116 dicotiledóneas y 85 monocotiledóneas) con

resistencia a los inhibidores de la ALS (Heap, 2012).

La evolución de ésta resistencia a herbicidas puede basarse en mecanismos de

desintoxicación (Kemp, 1990; Christopher, 1991, 1992; Saari y col., 1994; Veldhuis, 2000;

Preston, 1996; Hidayat y Preston, 2001; Fischer y col., 2000; Nandula y Messersmith,

2000), pero el mayor componente de la resistencia a inhibidores de la ALS está generado

por modificaciones en el sitio de destino del herbicida. En la mayoría de los casos, los

cultivos resistentes tienen una alteración en la enzima ALS que ya no es sensible a los

herbicidas (resistencia de sitio blanco) (Tranel y Wright, 2002), alteraciones que

curiosamente no afectan la función normal de la enzima (Kogan y Pérez, 2004).

En biotipos resistentes a herbicidas inhibidores de la ALS se han encontrado

cambios puntuales principalmente sustituciones que alteran la secuencia de nucleótidos del

ADN. Estas mutaciones provocan una reducción o inhiben la capacidad de unión de los

herbicidas con la enzima.

Un total de 22 mutaciones en el gen ALS dotan de resistencia en doce residuos

aminoacídicos (Tranel y Wright, 2002). Como se muestra en la tabla 1, éstos generan

distintos niveles de resistencia para distintos grupos de herbicidas (Kogan y Perez, 2004;

Powles y Yu, 2010). Las principales posiciones aminoacídicas que conducen a

sustituciones implicadas en la resistencia a herbicidas son: G121, A122, Ml24, P197, A205,

K256, M350, H351, D375, D376, R377, M570, W574, S653 y G654 (Laplante y col.,

2009; Massa y col., 2011; Boutsalis y col., 1999; Tranel y Wright, 2002; Ashigh y col.,

2009; Warwick y col., 2008; Whaley y col., 2007; Oh y col., 2001; Duggleby y col., 2003;

Le y col., 2003, 2005; Kolkman y col., 2004; Preston y col., 2006; Tranel y Trucco, 2009).

Las mutaciones descritas han sido identificadas dentro de cinco regiones altamente

conservadas del gen ALS que se extienden desde 12 a 57 pb (Devine y Eberlein, 1997).

Estas regiones son: C, A y D dentro del dominio α (residuos 86-280); B en el dominio γ

(residuos 463-639), E en la región C-terminal (residuos 646 – 668) (Guttieri y col, 1992;

Guttieri y col., 1995; McCourt y col., 2006), y un dominio β (residuos 281 – 451),

denominado región intermedia.

En ésta región intermedia han sido descritos menor nivel de mutaciones que

generan resistencia, debido a que es un sitio donde los herbicidas no realizan su unión

(Duggleby y Pang, 2000). Además, Yu y col., (2011) al analizar plantas de Raphanus

raphanistrum homocigotas para la mutación D376, encontraron que dicha mutación estuvo

asociada con una reducción notable del crecimiento por una alteración en la función propia

de la enzima. Esta situación genera una reducción en el fitness de la planta y probablemente

sea eliminada por selección purificadora.

Li, (1997), Pal y col., (2006) y Gillespie, (1991) manifiestan que la diversidad de

mutaciones en las distintas regiones del gen pueden ser determinada por dos factores: la

tasa de mutación y la intensidad de la selección que ocurre en las regiones conservadas y no

conservadas del gen. Ésta situación ha sido descrita por Yang y col., (2009) para el caso de

los genes de la biosíntesis de ácido giberélico en la tribu Oryzeae, cuya tasa de sustitución

entre las distintas regiones ofrece una gran variación.

La significante heterogeneidad de las regiones variables y conservadas de los genes

permite la comparación de las mismas, ya que pueden verse afectadas por procesos

evolutivos independientes. El hallazgo de microsatélites en la región del péptido de tránsito

del gen ALS también ofrece información sobre el mecanismo que puede haber contribuido a

su ampliación y diversificación (Kolkman y col., 2004).

Tabla 1 Mutaciones que confieren diferentes niveles resistencia a herbicidas de los grupos

Sulfonilureas e Imidazolinonas (inhibidores de la enzima ALS).

Dominio Aminoácido

y posicióna

Sustitución

Nivel de Resistencia

Sulfonilureas

(SU)b

Imidazolinonas

(IMI)b

(C) VFAYPGGNANSMEIHQALTRS Ala122 Thr

Tyr

S

MR

R

R

(A) AITGQVPRRMIGT Pro197

His R S/MR

Thr R S/MR

Arg R S

Leu R R/MR/S

Gln R S

Ser R S

Ala R S

Ile R MR

Met R ?

Lys R ?

Trp R ?

(D) AFQETP Ala205 Val

Asp

MR/S

R

R/MR

?

Asp376 Glu R/MR R

(B) QWED Trp574 Leu

Arg

R

R

R

R

(E) IPSGG

Ser653

Asp

Thr

Asn

Ile

MR

S/MR

S/MR

MR

R

R

R

R

Gly-654 Glu

Asp

?

S

R

R

a Numeración basada en la secuencia del gen ALS de A. thaliana.

b S: susceptible; R: resistente; MR: moderadamente resistente; ?: no determinado.

Adaptado de: Kogan y Pérez., (2004); Powles y Yu., (2010).

Las pruebas y estudios realizados sugieren que la resistencia a herbicidas

inhibidores ALS es monogénica en especies diploides (Tuesca, 2009; Singh y Shaner,

1995). Los alelos resistentes (R) son dominantes sobre los susceptibles (S) (Penner y

Wright, 2007). Sin embargo, el grado de dominancia varía entre las especies de plantas o

alelos (Foes y col., 1999; Hart y col., 1992; Sebastián y col., 1989; Wright y Penner 1998,

Tranel y Wright, 2002), mostrando un efecto aditivo de la combinación de alelos en una

línea resistente (Falconer y Mackay 1996; Rutledge y col, 1991).

Además está bien documentado que la respuesta varía en función del grupo de

herbicida, ingrediente activo y la dosis aplicada (Sala y col., 2008). El efecto de la dosis

génica sobre el nivel de resistencia a herbicidas en poliploides ha generado una

investigación mayor (Liu y Adams, 2007) ya que, estudios de plantas poliploides muestran

que los niveles de expresión génica varían dado que las copias de genes duplicados por

poliploidía pueden tener diferentes tasas y patrones de expresión (Adams, 2007).

El efecto que tienen los distintos niveles de expresión en relación a la resistencia a

herbicidas en los alopoliploides genera una ventaja dentro del proceso del mejoramiento

genético, ya que el número de alelos ALS-mutantes que puede contener una planta se puede

manejar mediante introgresiones, facilitando el mayor o menor empleo de dosis de

herbicidas en cuanto al nivel de toxicidad o resistencia que muestren.

En resumen, especies cultivadas con resistencia a herbicidas agregan valor a la

agricultura y ofrecen un beneficio económico a los productores, los costos de los programas

de control de malezas han disminuido tanto en los sistemas convencionales como en los

cultivos con cultivos resistentes a herbicidas (CRH) en razón de la reducción del precio de

los herbicidas. Además permiten la sustitución de algunos herbicidas actualmente en uso

por otros menos perjudiciales para el ambiente (Olofsdotter y col., 2000).

La quínoa (Chenopodium quinoa Willd) es un pseudocereal de gran valor

alimenticio cuyas cualidades nutritivas están bien documentados y han sido reconocidas en

el mundo entero (Fleming y Galwey, 1999). Está descrita como el alimento más completo

para la nutrición humana basada en sus proteínas de alta calidad con un balance ideal de sus

aminoácidos esenciales.

El alto valor nutricional del grano de quínoa se debe principalmente a que el

embrión ocupa una mayor proporción de la semilla (25-30%) en relación a los cereales

(Koziol, 1992). Así, su contenido de proteína puede alcanzar un 22%. Se puede considerar

como una de las especies “sub-utilizadas” de mayor potencial en el mundo lo que ha

generado un gran interés en los últimos años en los investigadores por mejorar este cultivo

(Ruales y Nair, 1992; Ruales y col., 2002; Mujica y Jacobsen, 2006).

La quínoa tuvo un papel predominante como base de la alimentación en la historia

de culturas prehispánicas antiguas, ésta especie fue cultivada extensamente por las

civilizaciones Incas, Aymaras, Araucanas y Mapuches desde el norte de Colombia hasta el

sur de Chile (Gandarillas, 1979). Posteriormente los españoles desplazaron éste cultivo por

cereales introducidos como trigo y cebada (Aguerrea, 1998).

La quínoa es un miembro de la familia Amarantaceae (antes Chenopodiaceae, actual

subfamilia Chenopodioideae), que contiene especies de plantas económicamente

importantes, tales como la espinaca (Spinacia oleracea L.) y remolacha azucarera (Beta

vulgaris L.). Este pseudocereal cuenta con numerosas especies silvestres emparentadas con

el número de cromosomas de 2n = 18, 36 y 54, indicativo de su diversidad y nivel de

poliploidía (Mujica y Jacobsen, 2006).

De acuerdo a su origen genético C. quinoa es un alotetraploide (2n = 4x = 36),

formado por hibridación interespecífica de dos genomios de especies diploides y una

posterior duplicación del número de cromosomas (Simmonds, 1971; Gandarillas, 1986).

Sin embargo, la mayoría de los marcadores genéticos (tanto morfológicos como

moleculares) muestran herencia disómica. Mientras que algunos rasgos cualitativos

expresan una herencia tetrasómica mínima (Risi y Galwey, 1984; Maughan y col., 2004;

Ward, 2000, 2001; Bonifacio, 1990; Simmonds, 1971; Gandarillas, 1968).

La alotetraploidía de la quínoa ha sido confirmada por Sederberg (1998) y Maughan

y col., (2006) mediante la caracterización por medio de hibridación in situ de loci

ribosomales 5S y 45S en 23 especies del género Chenopodium. Sin embargo, no se ha

logrado confirmar cuáles serían los parentales diploides, llegando a la conclusión que el

grupo de posibles especies ancestros para la C. quínoa incluye a: C. fremontii, C. incanum,

C. neomexicanum y C. watsonii.

Al igual que muchos cultivos secundarios, la quínoa presenta varias peculiaridades

que impiden masificar su siembra, producción y consumo. Entre estos problemas se

encuentran la presencia de factores anti-alimentarios como saponinas y ácido fítico.

Las saponinas son glicoalcaloides que se encuentran en la cubierta del grano de

quínoa constituyendo aproximadamente un 4%. Este problema puede ser eliminado

mediante vigorosos lavados en agua fría o a través de pulidos con abrasivos (Johnson,

1993) y con la selección de genotipos con bajo contenido de saponinas que en la actualidad

existen.

El control de malezas es otro de los factores que es una limitante para masificar el

cultivo de la quínoa. Aguerrea (1998) concluye que los rendimientos de quínoa se ven

seriamente disminuidos cuando compite con malezas, logrando tan solo el 9% de

rendimiento en comparación con un testigo sin malezas. En la actualidad, no existe un

herbicida que actúe de manera adecuada sobre el cultivo de la quínoa, ya que aquellos que

presentan un buen control de malezas causan fitotoxicidad.

Por ejemplo, Aguerrea (1998) al emplear Alacloro como agente controlador de

malezas obtuvo el mayor rendimiento en quínoa, resultado que equivale al 50% de la

producción en relación a un testigo con control manual. Los herbicidas no son

suficientemente selectivos para ser usados en C. quinoa, debido que esta importante especie

cultivada se encuentra filogenéticamente emparentada con malezas de las subfamilias

Chenopodioideae y Amaranthoideae (Coile y Artaud, 1997).

En este trabajo de investigación, se hipotetiza la existencia de una asociación entre

secuencias modificadas de sitios conservados del gen ALS y la insensibilidad de la planta a

los herbicidas del grupo de las imidazolinonas. Se predice que el mecanismo de resistencia

en mutantes artificiales de C. quinoa se basa en la existencia de al menos una mutación en

los sitios blanco de unión del herbicida de alguna de las copias alélicas del gen ALS.

Teniendo en consideración el potencial nutritivo y económico de C. quinoa, su

condición alotetraploide y la necesidad de contar con un eficiente control de malezas, el

objetivo de este trabajo fue caracterizar la familia génica que codifica la enzima ALS en

plantas susceptibles y resistentes a herbicidas pertenecientes al grupo de las imidazolinonas

(imazapic e imazapyr). Además, identificar las mutaciones puntuales asociadas a la

resistencia a herbicidas en genotipos mutados, con el fin de desarrollar marcadores

moleculares ligados a estos genes para asistir en el mejoramiento genético de C. quinoa.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. MATERIAL VEGETAL

Se emplearon plantas de quínoa de la variedad Regalona-Baer y una línea mutante

(0-10-1) procedentes de un trabajo realizado por Tropa (2010) quien indujo mutaciones con

EMS en semillas de quínoa de la variedad Regalona Baer. Ésta línea mostró mayores

niveles de resistencia a Onduty (Figura 2) un herbicida post-emergente del grupo de las

imidazolinonas (i.a. 525 g kg-1

imazapic + 175 g kg-1

imazapyr) con una dosis equivalente

de 114 g ha-1

. Las plantas mostraron una respuesta fenotípica variada desde: Sin o poco

síntoma (40%), planta con curvatura (20%), planta con curvatura y clorosis (20%), planta

con curvatura, clorosis y marchita (10%) y planta muerta (10%).

Figura 2 Plantas de la variedad Regalona-Baer y línea

mutante O-10-1. Respuesta fenotípica 15 días después

de la aplicación de herbicida IMI (Onduty, BASF).

El crecimiento de las plantas se realizó en forma aislada. Las semillas fueron

sembradas el mes de julio del 2011 en macetas de 300 ml con una mezcla de suelo/arena y

cultivadas en el invernadero de la Universidad Austral de Chile. Las condiciones de

temperatura de crecimiento fueron 20/12 °C día/noche (± 4 C), con un régimen de luz

14/10 h de día/noche y 900 µmol m-2

s-1

de intensidad de la luz.

Los tejidos foliares fueron cosechados a partir de plantas individuales cuando estas

presentaban cuatro hojas verdaderas (aprox. 15 después de la siembra). A partir de ellas se

realizo la extracción de ADN mediante un protocolo basado en el reactivo CTAB

modificado por Arismendi y col., (2010). El ADN aislado se cuantificó midiendo la

absorbancia a 260 nm, y se diluyó con agua destilada a una concentración aproximada de

20 ng µl-1

, almacenándose a -20 °C para futuros análisis.

2.2. SELECCIÓN Y DISEÑO DE PARTIDORES PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL

GEN ALS

Varios partidores fueron seleccionados y diseñados para amplificar el gen ALS

(Tabla 2, Figura 3). En primer lugar, la selección se realizó utilizando información de

publicaciones existentes de especies filogenéticamente relacionadas como Amaranthus spp,

Bassia spp y Salsola spp.

Para el diseño de nuevos partidores se realizó una alineación de las secuencias ALS

de Amaranthus hypochondriacus (Número de accesión GenBank: EU024568.1),

Amaranthus tuberculatus (EF157821.1), Amaranthus retroflexus (AF363369.1),

Amaranthus powellii (AF363370.1), Bassia scoparia (EU517499.1) y Salsola tragus

(GU271215.1) en el programa ClustalW, posteriormente se identificó las regiones

conservadas de la secuencia y finalmente con la ayuda del programa en línea Primer3

(Rozen y Skaletsky, 2000) se efectuó el diseño.

Tabla 2 Partidores empleados para la amplificación de la secuencia del gen ALS.

PARTIDOR SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS (5´-3´) GÉNERO FUENTE

F10 CCTAAACCTAAACCTCCTTC Amaranthus Corbett y Tardif (2008).

F1 TTTTGTTTCCCGATTTAGCCC Amaranthus Corbett y Tardif (2008).

F3 ATTCCTCCGCAATACGCCATT Amaranthus Corbett y Tardif (2008).

R4 AATCAAAACAGGTCCAGGTC Amaranthus Corbett y Tardif (2008).

R1 CCTACAAAAAGCTTCTCCTCTATAAG Amaranthus Corbett y Tardif (2008).

R10 TTATTCAACCCCTGTAATGC Amaranthus Warwick y col., (2010).

RUTH-F-1C CKGGCCGTGTKGGTGTTTG Salsola Warwick y col., (2010).

RUTH-R-3B AACTTGTTCTTCCATCACCTTCG Salsola Warwick y col., (2010).

E-FR GAAATCTTTCAACAATATAGGAAGATC Bassia Foes y col., (1999).

B1-F ATGGCGTCTACTTGTGCAAATCC Bassia Foes y col., (1999).

CHALSF1 GCGTCTACTTGTKCAAAYC Chenopodium Diseñados en este estudio.

CHALSF4 GACCTGGACCTGTTTTGATT Chenopodium Diseñados en este estudio.

CHALS R1 CAAAGTAACAAGCAACATRAMAAC Chenopodium Diseñados en este estudio.

Figura 3 Esquema ilustrativo del anclaje de los partidores empleados para amplificar el gen

ALS en C. quinoa. Detalle de la secuencia de los partidores en la Tabla 2.

2.3. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) PARA LA

AMPLIFICACIÓN DEL GEN ALS Y SECUENCIACIÓN DIRECTA

Se emplearon múltiples combinaciones de partidores para amplificar y secuenciar el

gen ALS (Tabla 3). Las reacciones de amplificación contenían 2 µl de ADN total (20 ng µl-

1), 2 µl de cada partidor (10 ρM), 4 µl de MgCl2 (25 mM), 2 µl de cada dNTP (2.5 mM), 2

unidades de ADN polimerasa Taq Platinum y 5 µl de Buffer 10X suministrado con la

enzima, en un volumen final de 50 ml.

El protocolo de amplificación consistió de una incubación de 3 min a 94 °C, 34

ciclos de 35 seg a 94 °C, 45 seg a X °C, y 1.45 min a 72 °C, y una extensión final de 7 min

a 72 C, donde X es la temperatura de hibridación para cada par de partidores utilizados

(Tabla 3). Los productos de amplificación se analizaron por electroforesis en geles de

agarosa al 1,2% en tampón TAE 1X con bromuro de etidio durante 30 minutos a 100

voltios. Las bandas de ADN fueron visualizadas bajo luz ultravioleta, comparadas con un

marcador de peso molecular conocido y finalmente fotografiadas (Araujo, 1999).

Los fragmentos amplificados y de interés fueron purificados y enviados a Macrogen

Inc., Corea para su secuenciación. Las secuencias fueron analizadas y editadas usando los

programas computaciones Chromas y Bioedit. La confirmación de la identidad de las

secuencias obtenidas y consensuadas se realizó a través del algoritmo nucleotideBlast y

BlastX del portal NCBI. El péptido de tránsito de la ALS se identificó utilizando el software

en línea ChloroP (Emanuelsson y col., 1999, 2000).

Debido que la variedad Regalona-Baer fue obtenida mediante múltiples procesos de

autofecundación y selección, no era esperable encontrar heterocigosidad para la posición de

un solo nucleótido en la secuencia del cromatograma, por lo cual se asumió que la

presencia de polimorfismos de nucleótidos basadas en la aparición de dos picos se trataba

de la presencia de copias distintas y polimorfismos entre ellos, razón por la cual se procedió

a la clonación de las amplificaciones.

2.4. CLONACIÓN Y SECUENCIACIÓN

Los productos de amplificación F1 – R4 (500 pb aprox.), que contiene los dominios

C, A y D; y F4 – RUTH-R-3B (1250 pb aprox.), que contiene los dominios B y E, se

procedieron a clonar en un vector utilizando el kit pGEMT Easy Vector (Promega). Células

competentes de Escherichia coli fueron transformadas con los plasmidios que contenían el

inserto de interés de acuerdo a las especificaciones del kit.

Al menos diez colonias positivas de cada transformación fueron seleccionadas (para

construir la secuencia de consenso ALS) y amplificadas directamente con partidores sp6 y

T7 y posteriormente enviadas a secuenciación por ambos extremos a Macrogen Inc., Corea.

Las secuencias fueron analizadas y editadas usando los programas computaciones

Chromas y Bioedit, confirmando la identidad de las secuencias obtenidas a través del

algoritmo nucleotideBlast y BlastX del portal NCBI.

2.5. ANÁLISIS DE SECUENCIAS

La herramienta de traducción en línea ExPASy se utilizó para determinar las

secuencias de aminoácidos (aa), y a través del programa en línea ClustalW se realizó la

comparación de cambios nucleotídicos y aminoacídicos en las secuencias de ADN y

proteína respectivamente.

Las secuencias de Regalona Baer se analizaron en primer lugar para corroborar las

variantes isoenzimáticas ALS y posteriormente se compararon con las secuencias de la línea

mutante para determinar si un cambio de nucleótido había ocurrido en los sitios descritos

por Kogan y Perez (2004) y Tranel y Trucco (2009), o a su vez si ocurrieron nuevos

cambios.

En base a las nuevas secuencias de C. quinoa y aquellas descritas para otras plantas

se construyeron árboles filogenéticos para inferir las relaciones hipotéticas. Se utilizó el

método de Máxima Parsimonia usando el programa MEGA. El árbol fue obtenido usando

el algoritmo Close-Neighbor-Interchange (CNI). Todas las posiciones que contenían gaps y

datos faltantes fueron excluidas del análisis. Para testear la robustez de la hipótesis de

relaciones filogenéticas se aplicó un análisis de Bootstrap con mil réplicas.

2.6. VALIDACIÓN DE LAS COPIAS DE GENES ALS Y MUTACIONES

Como en la gran mayoría de los casos las variantes de ALS y la resistencia a

inhibidores de ALS se deben a varios polimorfismos en una misma posición nucleotídica

(SNPs, por sus siglas en ingles) en el gen ALS, y para lo cual muchas técnicas que

identifican dichas sustituciones de nucleótidos se han desarrollado (Guttieriy col., 1992;

Tan y Medd, 2002).

Para ratificar la presencia de las copias en la variedad Regalona-Baer y validar la

existencia de mutaciones puntuales que confieren resistencia a herbicidas en la línea

mutante (0-10-1). En este trabajo fragmentos amplificados por PCR fueron digeridos con

enzimas de restricción [SexAI (CsiI) (5'A↓CCWGGT3'), CseI (HgaI) (5'GACGC (N5)↓3'),

Mph1103I (NsiI) (5'ATGCA↓T3'), BspPI (AlwI) (5'GGATC(N)4↓3')] con las condiciones

apropiadas suministradas por el fabricante (Fermentas).

El patrón de restricción para cada enzima/alelo (in silico) fue predicho utilizando

NEBCutter (New England Biolabs, Inc., MA). Los productos de restricción se analizaron

por electroforesis en geles de agarosa al 2% en tampón TAE 1X con bromuro de etidio

durante 60 minutos a 25 voltios. Las bandas fueron visualizadas bajo luz ultravioleta,

comparadas con un marcador de peso molecular conocido y finalmente fotografiadas.

3. RESULTADOS

3.1. AMPLIFICACION MEDIANTE PCR DEL GEN ALS EN C. quinoa

Aunque muchos partidores se seleccionaron y diseñaron para amplificar el

fragmento completo del gen ALS, varios fragmentos obtenidos presentaron una mala

calidad debido principalmente a la inespecificidad de los partidores. Además hubo

combinaciones que no amplificaron (Tabla 3, Figura 4).

Este problema puede deberse al uso de partidores derivados de estudios con otras

especies. Que, al ser similares a la secuencia blanco pueden no amplificar o producir

amplificaciones no específicas.

El uso de partidores degenerados redujo ampliamente la especificidad de la

amplificación por PCR. Aunque, se describen como muy convenientes si se desean

amplificar el mismo gen en distintas especies (Linhart y Shamir, 2004; Ausubel y col.,

1996). Además éste problema tampoco pudo resolverse al usar PCR touchdown (TD) (Don

y col., 1991) (Tabla 3, TD). La figura 4 muestra las bandas de PCR obtenidas a partir de

reacciones optimizadas y no optimizadas.

Las mejores amplificaciones se obtuvieron en los fragmentos B y D. Varias

reacciones que inicialmente mostraron más de una banda amplificada o bandas putativas

ALS amplificadas débilmente, no correspondieron a las secuencia de la ALS debido a una

unión no específica de los partidores.

Tabla 3 Resultados de las combinaciones de partidores empleados para la amplificación de

la secuencia del gen ALS. Detalle de los partidores en la Tabla 2 y anclaje de los mismos en

la Figura 3.

Combinación Tm (°C) empleada Amplificación

F10 – R4 50 - 55 - 60 - TD Inespecífico

F10 – R10 50 - 55 - 60 Negativo

F1 – R4 (Fragmento B) 50 - 55 - 60 Positivo a 58 °C

F1 – R10 50 - 55 - 60 Negativo

F3 – R1 50 - 55 - 60 Negativo

F10 – R1 45 - 48 - 50 Negativo

F1 – R1 45 - 48 - 50 Negativo

F1 – CHALSR1 45 - 48 - 50 - TD Inespecífico

CHALSF1 – R4 (Fragmento A) 50 - 55 - 60 Positivo con inespecificidad a 57 °C

F3 – CHALSR1 50 - 55 - 60 Inespecífico

CHALSF1 – CHALSR1 50 - 55 - 60 Negativo

CHALSF4 – R1 50 - 55 - 60 Inespecífico

CHALSF4 – CHALSR1 50 - 55 - 60 - TD Inespecífico

B1-F – CHALSR1 57 - 61 - 65 Inespecífico

B1-F – R4 57 - 61 - 65 - TD Inespecífico

B1-F – E-FR 57 - 61 - 65 Negativo

CHALSF1 – RUTH-R-3B 53 - 57 - 61 Negativo

CHALSF1 – E-FR 53 - 57 - 61 Negativo

F1 – RUTH-R-3B (Fragmento E) 55 - 58 - 61 Positivo a 58 °C

F1 – E-FR 55 - 58 - 61 Negativo

CHALSF4 – RUTH-R-3B (Fragmento D) 55 - 57 - 60 Positivo a 57 °C

CHALSF4 – E-FR 55 - 57 - 60 Negativo

RUTH-F-1C – CHALSR1 57 - 61 - 65 Negativo

RUTH-F-1C – RUTH-R-3B (Fragmento C) 57 - 61 - 65 Positivo a 60 °C

RUTH-F-1C – E-FR 57 - 61 - 65 Negativo

(TD = PCR touchdown).

En algunos casos la inespecificidad fue solucionada con el empleo de Taq

Polimerasa Hot Start (Figura 4, fragmentos A y D). Un paso de optimización es necesario

para asegurar una amplificación de la banda ALS, y así reducir al mínimo los errores

evitando la aparición de bandas no específicas o ADN falsos.

Figura 4 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) empleada para la amplificación del

gen ALS en C. quinoa. Flechas señalan tamaño esperado. Detalle de los partidores en la

Tabla 2 y de los fragmentos en la Figura 5.

Con los resultados obtenidos se seleccionaron cinco combinaciones de partidores:

A, B, C, D y E (Tabla 3, Figura 5) para la secuenciación directa ya que con ellos se logró

amplificar la región que abarca el péptido de tránsito y los dominios ALS C, A, D, B y E, en

donde se encuentran descritas las mutaciones que confieren resistencia.

3.2. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DEL GEN ALS EN C. quinoa

Los fragmentos de PCR seleccionados para la secuenciación directa abarcaron un

total de 1992 pb (Figura 5). Las secuencias editadas y analizadas mostraron un 87% de

identidad con Bassia scoparia (GenBank: EU517498.1) y un 86% con Salsola tragus

(GU271186.1), todos miembros de la subfamilia Chenopodiaceae y un 84% con

Amaranthus powellii (AF363370.1), Amaranthus retroflexus (AF363369.1) y Amaranthus

tuberculatus (EF157819.1), miembros de la subfamilia Amaranthoideae.

Figura 5 Representación esquemática, ubicación y tamaño de los fragmentos secuenciados

con las combinaciones de partidores empleados en la amplificación del gen ALS en C.

quinoa. Áreas encuadradas indican dominios conservados. Detalle de los partidores en la

Tabla 2 y de los fragmentos en la Tabla 3.

Las relaciones filogenéticas inferidas entre varias secuencias de gen ALS existentes

en las bases de datos agruparon a la secuencia ALS de C. quinoa dentro de la familia

Amaranthaceae y más específicamente dentro de la subfamilia Chenopodiaceae (Figura 6).

Figura 6 Relaciones filogenéticas hipotéticas entre las secuencias ALS en plantas

incluyendo la nueva secuencia de C. quinoa, inferida por máxima parsimonia. El óvalo

muestra los miembros de la subfamilia Chenopodiaceae. Los números en los nodos

representan valores bootstrap (1.000 réplicas).

Con los datos obtenidos mediante la secuenciación directa el tamaño de la secuencia

fue de 1992 pb sin haber logrado amplificar la región del codón inicial y del codón “stop”.

La secuencia conseguida fue corroborada con la base de datos del Laboratorio de

Genómica Funcional y Bioinformática de la Universidad de Chile quienes últimamente han

secuenciado el transcriptoma de C. quinoa. Dicha secuencia posee un tamaño de 2001 pb

en comparación con los 1992 pb de nuestro trabajo, las diferencias se encuentran en las tres

bases iniciales (A – T – G) y en las cinco finales (A – T – T – R – A) que incluyen al codón

“stop”.

Por lo tanto, el tamaño total de la secuencia codificante del gen ALS en C. quinoa

corresponde a 2001 pb similar a Bassia scoparia (GenBank: EU517498.1) y difiere de

Amaranthus powellii (AF363370.1), Amaranthus retroflexus (AF363369.1) y Amaranthus

tuberculatus (EF157819.1) quienes poseen 2010 pb.

Además, el análisis de la secuencia completa del gen ALS en C. quinoa mostró que

es un gen no interrumpido por intrones con un total de 667 aa incluyendo el codón “stop”.

La región estimada del péptido de tránsito tiene un tamaño de 50 aa.

El análisis de los cromatogramas obtenidos en este trabajo reveló la presencia de

dobles picos en una misma posición del cromatograma (Figura 7), señalando la presencia

de polimorfismos y sugiriendo la presencia de más de una copia del gen ALS, reflejando la

estructura poliploide de esta especie

Figura 7 Imagen parcial de un cromatograma del fragmento A del gen ALS amplificado en

C. quinoa. Las flechas señalan dobles picos.

3.3. VARIACIÓN DE LA SECUENCIA DEL GEN ALS EN C. quinoa

Los diez fragmentos B de la variedad Regalona – Baer que fueron seleccionados

para la secuenciación posterior a la clonación mostraron la presencia de seis copias

distintas.

Luego considerando el criterio parsimonioso de que una misma diferencia debía

estar al menos en dos copias con el fin de evitar seleccionar cambios generados por errores

de la Taq durante la PCR (Kobayashi y col., 1999) se obtuvieron tres copias distintas

denominadas en este trabajo como CQALS1, CQALS2 y CQALS3.

El análisis entre CQALS1 y CQALS2 reveló la presencia de 20 nucleótidos (nt)

polimórficos de los cuales 19 resultan en cambios sinónimos (estas mutaciones no dieron

lugar a cambios de aminoácidos en el gen) debido a la redundancia del código genético, y

solo existió una sustitución no sinónima (nt 143, g - a) que genera un cambio aminoacídico

en la proteína (S – G) (Figura 8).

CQALS1 y CQALS3 mostraron 13 sitios polimórficos todos resultantes en cambios

sinónimos. CQALS2 y CQALS3 expresaron 7 polimorfismos del cual solo 1 (nt 143) resulta

no sinónimo para la misma posición y con similar cambio como el encontrado entre

CQALS1 y CQALS2 (Figura 8).

Figura 8 Secuencia de nucleótidos (parte superior) y aminoácidos (parte inferior) de los

genes CQALS1, CQALS2 y CQALS3 del fragmento B. Los sitios polimórficos están

coloreados y las fechas señalan la ubicación del único cambio no sinónimo encontrado.

Los diez fragmentos D de la variedad Regalona – Baer expusieron la presencia de

seis copias distintas y empleando el mismo criterio de B se obtuvieron finalmente dos

copias CQALSA y CQALSB. Estas secuencias presentaron 4 polimorfismos incluyendo una

deleción en la posición 940, generando un cambio en el marco de lectura dado que cinco

codones más adelante se forma un codón “stop” (Figura 9).

Figura 9 Secuencia parcial de nucleótidos y aminoácidos de A= CQALS1 (A) y B=

CQALS3 (B) de C. quinoa. La deleción, cambio de aminoácido (N – I) y condón “stop”

están coloreados amarillo y rojo respectivamente.

El análisis de la secuencia CQALS3 obtenida del fragmento B muestra que hasta el

nucleótido 151 se obtiene un 100% de homología con CQALS1, y que desde 152 hasta 358

muestra 100% con CQALS2, y de ahí en adelante hasta culminar con las secuencia del

fragmento D mantiene una alta homología con CQALS1 (Figura 8 y 9).

Por lo tanto con estos resultados se puede establecer que las copias amplificadas

como fragmento D corresponden a CQALS1 (A) y CQALS3 (B).

3.4. IDENTIFICACIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN ALS EN C. quinoa

La secuencia de nucleótidos ALS del fragmento B y D en la línea mutante O – 10 –

1 que incluyen las regiones de los dominios C, A, D, B y E fueron analizados para

identificar posibles mutaciones puntuales asociadas con la resistencia.

CQALS3 no pudo ser comparado con alguna de las secuencias obtenidas de las

líneas mutantes ya que solo se obtuvieron secuencias similares a CQALS1 y CQALS2. Uno

de los fragmentos clonados y secuenciados de la línea mutante (B10-15) mostró la mayor

homología con CQALS2 de la variedad Regalona-Baer (Figura 10).

Figura 10 Relación filogenética hipotética entre las copias de la secuencias ALS y una de

las copias mutadas de C. quinoa, inferida por máxima parsimonia. Los números en los

nodos representan valores bootstrap (1.000 réplicas).

La comparación entre CQALS2 y B10-15 mostró solo una sustitución nucleotídica

de t – a en la posición 350 lo que genera un cambio no sinónimo de aminoácido T por S

(Figura 11). Por lo tanto esta sustitución ubicada en el dominio conservado (A) puede ser la

base molecular de la resistencia a los herbicidas IMI en la línea mutante de C. quinoa.

Otro de los fragmentos secuenciados en la línea mutante al ser comparado con

CQALS1 mostró dos polimorfismos en los sitios nt 299 y nt 392, mismos que generan

sustituciones aminoacídicas S-T y S-P respectivamente. Estos cambios no están ubicados

en los dominios descritos que generan resistencia a herbicidas por lo tanto podrían no estar

asociados con la resistencia.

Los fragmentos D en las líneas mutantes no presentaron diferencias nucleotídicas

con respecto a las de la variedad original.

Figura 11 Secuencia parcial de nucleótidos (parte superior) y aminoácidos (parte inferior)

de la ALS en C. quinoa. La sustitución nucleotídica (t-a), cambio de aminoácido (S-T) están

coloreados, dominio A remarcado.

3.5. VALIDACIÓN DE COPIAS Y MUTACIONES

Mediante el empleo de enzimas de restricción se logró establecer la presencia de

cada una de las copias y de la mutación que genera la resistencia a herbicidas. Gracias a la

ayuda del programa NEBCutter se pudo establecer los perfiles esperados de cada una de las

copias con las distintas enzimas de restricción (Figura 12).

De manera general en cada una de las digestiones, la aparición de bandas de otro

tamaño corresponde a que las enzimas reconocían otros sitios en las demás copias, así

como también la banda del tamaño similar al control corresponden a la(s) copia(s) que no

son reconocidas por la enzima y que por lo tanto deben mantener el tamaño original.

Figura 12 Representación esquemática, ubicación del sitio de corte y tamaño de los

fragmentos ALS en C. quinoa resultantes de la digestión con las enzimas SexAI (flecha

roja), CseI (flecha verde), Mph1103I (flecha azul) y BspPI (flecha negra) en la variedad

Regalona-Baer (superior) y línea mutante O-10-1 digerida con BspPI (inferior). Áreas

oscuras encuadradas indican dominios conservados.

La digestión con la enzima SexAI fue usada para corroborar la variante CQALS1.

Esta copia contenía un solo sitio de restricción generando dos fragmentos (250 y 249 pb).

Solo un fragmento fue visible por electroforesis en geles de agarosa debido a la falta de

resolución de la técnica (Figura 13 A) que no permite distinguir la diferencia de 1 base.

Las enzimas CseI y Mph1103I fueron usadas para discriminar la variante CQALS2.

Los fragmentos generados fueron de 357 y 142 (Figura 13 B), 358 y 141 pb (Figura 13 C)

respectivamente para cada una de las enzimas.

Las enzimas BspPI y Mph1103I se usaron para poder visualizar la variante

CQALS3. Luego de realizar la doble digestión se pudo observar correctamente esta

variante, mostrando un perfil de bandeo de 112, 246 y 141 pb (Figura 13 D).

Figura 13 Detección de las tres copias del gen ALS en C. quinoa variedad Regalona- Baer

empleando endonucleasas. CQALS1 con BspPI (A), CQALS2 con CseI (B) y Mph1103I

(C). CQALS3 doble digestión con BspPI y Mph1103I (D). CBR (control) fragmento de

PCR de B sin digerir. M, marcador de peso de 100 y 1000 pb. BR fragmento PCR de B

sometido a digestión.

En el fragmento B de la línea mutante O-10-1 solo se empleó la enzima BspPI dado

que era la única endonucleasa que permitía identificar la mutación existente en B10-15

ALS-mutada que correspondía a la copia CQALS2, un solo sitio de reconocimiento para esta

enzima mostró la presencia de dos bandas, una de 144 y otra de 355 pb después de la

digestión (Figura 14).

Figura 14 Análisis del patrón de restricción de ALSmutada en C. quinoa

restringida con la enzima BspPI. CB10, fragmento B de PCR de la línea

mutada, M, marcador de peso 100 pb, B10 fragmento sometido a

restricción.

4. DISCUSIÓN

En este trabajo, la caracterización de la familia del gen ALS fue investigada en C.

quinoa, una especie alotetraploide muy extendida y con un gran potencial económico y

nutricional. A la fecha se han caracterizado genes ALS en muchas especies vegetales

principalmente en malezas y otras plantas cuya constitución genética es diploide. Por el

contrario, son pocas las especies cultivadas y a su vez poliploides que se han estudiado con

mayor profundidad. Como en toda investigación, fue necesario desarrollar y adatar

metodologías para los estudios genéticos del gen ALS en C. quinoa.

El tamaño total de la secuencia codificante del gen ALS en C. quinoa (2001 pb)

mostró un tamaño similar a Bassia scoparia (Warwick y col., 2008) y difiere de las

especies de Amaranthus (Diebold y col., 2003; McNaughton y col., 2005; Patzoldt y

Tranel, 2007) las cuales poseen 2010 pb. Estas diferencias principalmente están dadas por

polimorfismo de inserciones y deleciones (“indels”) que se ubican en las zonas N-terminal

y C-terminal de la proteína. Dichas regiones están involucradas en el tráfico intracelular

más que en la actividad catalítica de la enzima, y por lo tanto pueden tolerar una mayor

variación ya que no forman parte del sitio activo de la proteína (Duggleby y Pang, 2000).

Consecuentemente las zonas N-terminal y C-terminal de la proteína pueden

acumular mayor número de mutaciones en estas regiones del gen que no son degenerativas

ni benéficas. Estos cambios le confieren una característica propia a cada gen las cuales son

mantenidas y, evolucionan de una manera neutral, se mantienen por selección purificadora,

o están en proceso de ser transformada con nuevas funciones beneficiosas (Lynch y col.,

2001).

Los 667 aa, incluido el codón “stop”, que fueron traducidos en C. quinoa generaron

una región del péptido de tránsito estimado de 50 aa. Esta región posee un tamaño similar

al estimado para una especie cercana Amaranthus tuberculatus (Patzoldt y Tranel, 2007) a

diferencia de lo estimado por Rutledge y col., (1991) quienes han propuesto que en tres

copias ALS de Brassica napus el tamaño del péptido de tránsito se ubica entre los 70, 61 y

67 aa, mientras que, en Arabidopsis thaliana está descrita de 97 aa (Sathasivan y col.,

1990).

El tamaño variable y aun no consensuado del péptido de tránsito muestra que esta

región tiene una naturaleza única lo que permite que sea utilizado como una sonda

específica y única de cada variante ALS (Bruce, 2001). Por ejemplo, ha sido útil para

distinguir cada una de las copias de este gen en Brassica napus de la de otros miembros de

la familia Brassica (Wiersma y col., 1989), siendo incluso usada como marcador SSR para

facilitar la selección asistida por marcadores (MAS, por su siglas en ingles) basada en

haplotipos ALS1 en el cultivo de girasol (Kolkman y col., 2004). A pesar del número

creciente de secuencias de plantas disponibles, el mecanismo común subyacente a la

función de las secuencias de direccionamiento aún no ha sido descifrado (Bruce, 2001).

A diferencia de otras investigaciones y dada la particular naturaleza del péptido de

tránsito. En este estudio, es la primera vez que se describen copias del gen ALS para una

misma especie que muestran un tamaño similar para el péptido de tránsito (50 aa) y la

proteína madura (617 aa). En discordancia con las copias activas en Schoenoplectus

juncoides (Uchino y col., 2007) donde el péptido de tránsito corresponde a 80 y 77 aa, y la

proteína madura 565 y 567 aa entre ALS1 y ALS2 respectivamente.

El gen ALS en C. quinoa es un gen no interrumpido por intrones similar a muchas

monocotiledóneas y dicotiledóneas (Reith y Munholland, 1993; Tranel y Wright, 2002;

Vinod y col., 2010; Intanon y col., 2011; Warwick y col., 2010; Delye y col., 2011;

Laplante y col., 2009) aunque estos segmentos se han descrito que se encuentran con

frecuencia entre las regiones que codifican para las unidades estructurales en las proteínas

(Dugaiczyk y col., 1978; Wozney y col., 1981; Cochet y col., 1979).

Casos excepcionales son Lindernia spp (Uchino y Watanabe, 2002), Schoenoplectus

juncoides (Uchino y col., 2007) y Schoenoplectus mucronatus (Scarabel y col., 2010) que

poseen intrones y que por lo tanto presentan el “splicing”. Cabe señalar que numerosos

intrones han sido reportados en los genes ALS de algas verdes y hongos (Sweigard y col.,

1997; Funke y col., 1999).

Numerosos intrones en la secuencia ALS de algas y algunas especies de plantas

superiores sugieren que estos segmentos no codificantes se insertaron después de la

divergencia de las algas en la línea evolutiva que conduce a las plantas superiores. Por lo

tanto si consideramos la “Teoría Endosimbiótica” (Margulis, 1971) los genes ALS deberían

ser de origen bacterial (Funke y col., 1999).

Además la ausencia de estos segmentos no codificantes refuerza el modelo de

“introns-late” que predice que todos los intrones en los genes fueron insertados en genes

previamente continuos que representan las formas ancestrales y que son similares a los

genes actuales procariotas, es decir no tienen intrones en sus formas procariotas, pero si en

sus homólogos eucariotas (Rogers, 1990; Cavalier-Smith 1991; Palmer y Logsdon, 1991;

Patthy, 1991). Esto ha generado especulaciones sobre el papel de los intrones y el estudio

de su historia mediante el análisis de antiguos genes conservados cuya proteína se conserva

entre procariotas y eucariotas (De Souza y col., 1998).

En lo referente a la presencia de intrones en Lindernia spp, Schoenoplectus

juncoides y Schoenoplectus mucronatus (Uchino y Watanabe, 2002; Uchino y col., 2007;

Scarabel y col., 2010), las secuencias presentan sitios de consenso de empalme de intrones

(GT...AG), lo cual es consistente con la conocida regla GT-AG de intrones (Breathnach y

col., 1978; Mount, 1982) e incluso estas secuencias se encuentran en la misma posición

codificante de las copias del gen ALS.

La acumulación de datos de secuencias genéticas (intrones y exones) de ALS puede

suministrar información útil sobre las relaciones filogenéticas entre las especies de plantas

y las distintas fuerzas evolutivas que actúan sobre ellas.

En lo referente a la constitución genética de las especies, la condición tetraploide de

un genoma dificulta la capacidad de las técnicas moleculares para identificar con precisión

los heterocigotos verdaderos (heterocigotos para alelos diferentes en el mismo lugar) vs

individuos con la heterocigosidad fija (homocigotos para alelos diferentes en lugares

diferentes) (Warwick y col., 2010).

Concordante con la condición poliploide de C. quinoa, la presencia de dobles picos

en una misma posición de los cromatogramas no hacen más que confirmar la naturaleza

tetraploide de su genoma (Maughan y col., 2006; Palomino y col., 2008) y por lo tanto la

presencia de más de una variante del gen ALS, conclusión a la que llegaron otros

investigadores al caracterizar genes ALS en especies poliploides (Warwick y col., 2010;

Tan y Medd, 2002).

Las tres copias distintas descritas en este trabajo CQALS1, CQALS2 y CQALS3,

fueron comparadas con las secuencias de ARNm facilitadas por el Laboratorio de

Genómica Funcional y Bioinformática de la Universidad de Chile (secuencias #2238 y

#2237) logrando resaltar que CQALS1, CQALS2 y CQALS3 poseen un 99, 97 y 95% de

identidad respectivamente con respecto a la secuencia #2238; mientras que un 95, 99 y 98%

con respecto a la secuencia #2237. Estos resultados avalarían el criterio que CQALS1

corresponde a la secuencia #2238 y CQALS2 a #2237 (Figura 15).

La comparación de las secuencias nucleotídicas de las copias halladas muestran que

la mayoría de los polimorfismos encontrados en el fragmento B, solo generaron una

sustitución no sinónima (S – G). Este fenómeno, en donde la mayor parte de los cambios de

nucleótidos en un gen son neutrales ha sido explicado por los genetistas como “La teoría

neutral de la evolución molecular” (Kimura, 1983) o “La evolución no-Darwiniana (King y

Jukes, 1969) debido principalmente a la redundancia del código genético para la tercera

posición del codón.

Figura 15 Relaciones filogenéticas hipotéticas entre las secuencias ALS en plantas

incluyendo las nueva secuencias de C. quinoa, inferida por máxima parsimonia. Los

números en los nodos representan valores bootstrap (1.000 réplicas).

Luego de los análisis descritos anteriormente, se estableció que las únicas copias

amplificadas como fragmento D corresponden a CQALS1 y CQALS3, sin haberse

encontrado este fragmento para la copia CQALS2. La imposibilidad metodológica para

amplificar la región CQALS2 fue aclarado al comparar el partidor empleado RUTH-R-3B

(5´aacttgttcttccatcaccttcg3´) con las secuencias de #2238 (CQALS1) y #2237 (CQALS2).Se

observó un polimorfismo en el extremo 3´ (g – a) el cual generó que esa copia

correspondiente a CQALS2 o #2237 no haya sido amplificada, debido a la inespecificidad

del partidor en el extremo 3´.

Sobre esta limitante, Prado y col., (2004) manifiestan que se debe tener mucha

precaución al emplear partidores degenerados para amplificar secuencias no conocidas ya

que las bandas de ADN amplificadas con él, muchas veces deben ser clonados en

plásmidos para ser secuenciados. Presentando un problema serio de no lograr obtener la

información exacta si hay heterocigotos o polimorfismos en plantas que se utilizan como

fuente de ADN.

La existencia de una tercera variante del gel ALS en C. quinoa no era esperable ya

que las especies diploides de la familia Amaranthaceae presentan solo una copia del gen

ALS (Wright y Penner, 1998; Warwick y col., 2008; Diebold, 2003; McNaughton y col.,

2005; Ferguson, 2001; McNaughton y col., 2005; Sibony y col., 2001; Scarabel, 2007;

Maertens y col., 2004;Trucco y col., 2006; Sibony y Rubin, 2003; Patzoldt y Tranel, 2007).

A diferencia de Salsosa tragus (Warwick y col., 2010) única tetraploide descrita en esta

familia mostró la presencia de dos variantes.

Con los antecedentes descritos anteriormente y considerando que Regalona-Baer es

una variedad comercial, la explicación a la existencia de una tercera variante del gen ALS

puede ser realizada de distintos procederes:

Primero, fundamentando la tetraploidía de C. quinoa y que por lo tanto puede

poseer hasta cuatro variantes alélicas de un mismo gen (Segarra-Moragues y col., 2003)

dado que cada genomio contribuye hasta con dos variantes alélicas (Comai, 2005). En este

caso la tercera copia hallada podría tratarse de una variante alélica de uno de los genes

duplicados y que por lo tanto uno de los genomios podría encontrarse en estado

heterocigoto.

Sin embargo, considerando que las plantas empleadas en este estudio corresponde a

una variedad comercial obtenida durante un proceso de mejoramiento genético y sucesivas

autofecundaciones controladas, es esperable que presenten homocigosis en todos los loci.

Segundo, de acuerdo a los análisis de la secuencia de CQALS3, un segmento es

homólogo a CQALS1 y otro a CQALS2. No es una variante que llegue a expresarse, debido

que la secuencia presenta una deleción en la posición nt 1652, lo que genera un cambio en

el marco de lectura formando un codón “stop” cinco codones más adelante. Se podría

aseverar que CQALS1 y CQALS2 son los genes que provendrían de cada uno de los

parentales diploides. Mientras que, CQALS3 sería un pseudo gen generado por duplicación

génica posterior a la hibridación y poliploidización de C. quinoa.

Esta duplicación génica podría haber ocurrido luego de un apareamiento de

cromosomas homeólogos genéticamente equivalentes (cromosomas que pertenecen a los

genomios distintos que conforman el genoma poliploide). Este proceso es una situación

recurrente en organismos poliploides a los cuales se los ha definido como alopoliploides

crípticos (Fang y col., 1992). Debido que son individuos estructuralmente heterocigóticos

no identificables al no mostrar configuraciones anormales en el apareamiento meiótico,

sobre todo si las especies parentales son muy próximas (Lacadena, 1996) lo que implica

variación genética críptica sensu (Phillips, 1996).

El posterior “crossing-over” ocurrido entre cromosomas homeólogos apunta a lo

manifestado por Creighton y McClintock (1931) que cuando ocurre el cruzamiento

citológico (“crossing-over”), es acompañado por un intercambio genético, lo cual habría

ocurrido en C. quinoa.

Además, cabe manifestar que los genes duplicados tienen distintos destinos (Adams

y Wendel, 2005):

i) Mayoritariamente se convierten en una isoforma silenciada siempre y cuando no

cumplan alguna función esencial, ya que si forman parte de la transcripción o

señales de la traducción estos son mantenidos (Blanc y Wolfe, 2004).

ii) Pueden ser retenidos conservando su función original donde la dosis de producto

génico es evolucionariamente limitada y transcripcionalmente regulada.

iii) Son subfuncionalizados es decir, particionan la función ancestral agregada.

iv) O su vez adquieren una nueva función (neofuncionalización) experimentando la

diversificación en la función o regulación de la proteína (Lynch y Conery, 2000;

Lynch y Force, 2000; Lynch y col., 2001).

La tercera variante del gen ALS hallada en C. quinoa sería una copia silenciada, o a

su vez podría tratarse de una nueva variante que se logra expresar en algún tejido

específico. Debido que en la mayoría de los casos la manifestación de los genes en

eucariotes presenta un patrón de expresión específico en tiempo y espacio durante el

desarrollo de los diferentes organismos. Esto se debería corroborar con estudios de

expresión génica.

La presencia de múltiples copias ALS activas, silenciadas, subfuncionalizadas y

neofuncionalizadas está muy bien documentado en las bases de datos sobre todo para

especies alotetraploides. Así, Bidens subalternans, presenta tres isoformas activas (Lamego

y col., 2009), Schoenoplectus juncoides dos copias activas (Uchino y col., 2007),

Schoenoplectus mucronatus con tres copias, una de ellas inactiva que no posee los intrones

como las otras dos (Scarabel y col., 2010).

Por su parte Monochoria vaginalis presenta cuatro variantes de las cuales ALS4 es

inactiva ya que presenta una inserción en el sitio 929 generando un cambio de lectura y la

aparición de un codón “stop” en las posiciones 1003 – 1005 (Ohsako y Tominaga, 2007),

Helianthus annuus con tres loci activos (Kolkman y col., 2004) los cuales han sido

asignados a grupos de ligamiento distintos: 2 (AHAS3), 6 (AHAS2) y 9 (AHAS1) (Tang y

col., 2002; Yu y col., 2003). Gossypium hirsutum tiene seis genes (Grula y col., 1995) de

los cuales tres provienen de cada parental diploide: ALS1, ALS2 y ALS3 del subgenoma A,

ALS4, ALS5 y ALS6 del subgenoma D.

Finalmente una de las mayores y más variadas familias génicas ALS descritas se

presentan en Brassica napus con cinco copias (Rutledge y col., 1991): ALS1 y ALS5 del

genoma C, ALS2, ALS3 y ALS4 del genoma A. Siendo ALS1 y ALS3 constitutivos ALS4 y

ALS5 inactivos, y ALS2 con nueva función detectado exclusivamente en órganos

reproductivos femeninos (óvulo) y que no se acumula en células somáticas (Ouellet y col.,

1992).

Interesantemente, cabe recalcar que la presencia de varias copias del gen ALS

probablemente no sea necesaria para el crecimiento y desarrollo de las especies, ya que

simplemente puede reflejar el origen genético (Keeler y col., 1993). Funciones de múltiples

genes ALS aún no son bien conocidas (Lamego y col., 2009).

El análisis de los sitios de restricción demostró la presencia de las tres copias,

gracias a los polimorfismos detectados y la diferencia de longitud de fragmentos digeridos.

Esta técnica empleada está basada en la secuencia de ADN, lo que permite explorar los

polimorfismos de nucleótidos único entre las secuencias (Sevin, y col., 1998; Sommer y

col., 1989; Newton y col., 1989; Délye y col., 2002).

Por otro lado, el análisis y elucidación de la base molecular del nivel de resistencia a

los inhibidores de ALS (IMI) en la línea mutante O – 10 – 1 de C. quinoa, muestra que la

mutación Thr195Ser hallada en la copia del gen CQALS2 (fragmento B10-15) se ubica en

uno de los dominios conservados de la proteína (dominio A). Sitio en el cual se han

descrito que el cambio de un aminoácido genera insensibilidad de las plantas a los

herbicidas inhibidores de la ALS (Guttieri y col, 1992; Devine y col., 1997; Tranel y

Wright, 2002) por lo tanto reduce la eficacia del herbicida (Lamego y col., 2009).

Es la primera vez que se describe este tipo de sustitución (T – S) en este dominio ya

que normalmente en todas las publicaciones existentes el residuo más reportado como

variable y generador de resistencia es P197 (equivale a P189 en la secuencia de C. quinoa),

(Park y Mallory-Smith, 2004; Uchino y col., 2007; Tranel y Wright, 2002; Whaley y col.,

2007; Scarabel y col., 2010; Ohsako y Tominaga, 2007; Tranel y col., 2012).

Además, cabe mencionar que en los ensayos de invernadero realizados por Tropa

(2010), al aplicar imazapic e imazapyr ingredientes que conforman un solo producto

comercial (Onduty), las plantas mutantes mostraron variación fenotípica como respuesta a

la aplicación del herbicida. Esta sintomatología de resistencia/toxicidad varió

continuamente desde poca clorosis hasta curvatura, clorosis y muerte de las plantas.

Variación fenotípica de esta índole también fue observada por Délye y col., (2011) en

plantas de Papaver rhoeas al aplicar imazamox (IMI) y tribenuron-methyl (SU).

La marcada variación fenotípica de las plantas, puede ser explicada porque la línea

mutante 0-10-1 de C. quinoa solo posee una variante ALS mutada pudiendo ser un efecto de

dominancia parcial o semi-dominancia (Currie y col., 1995; Siehl y col., 1996; Wright y

Penner, 1998). Plantas con el mismo genotipo en la ALS no siempre muestran el mismo

fenotipo. Por ejemplo, las plantas que contienen alelo ALS-Ser197 pueden ser resistentes,

moderadamente resistentes o sensibles a florasulam (SU). Plantas que contienen un alelo

ALS -His197 pueden ser resistentes, moderadamente resistentes o sensibles a imazamox

(IMI) (Délye y col., 2011).

Otra explicación de la amplia respuesta a la aplicación de herbicidas, está basada en

el tipo de herbicida empleado como agente selectivo. La respuesta más común en los

biotipos resistentes que poseen alterado el dominio A es la resistencia principalmente a las

sulfonilureas (SU) y triazolopirimidinas (Guttieri y col, 1992) mas no a imidazolinonas

(IMI). Esto fue observado por Guttieri y col., (1995) en Bassia scoparia donde las plantas

mostraron alta resistencia SU y de moderadamente a baja resistencia a IMI, mientras que

plantas de Helianthus annus mostraron una respuesta variable en función del tipo de

herbicida y dosis aplicada (Sala y col., 2008).

Finalmente, con la ayuda de la enzima de restricción BspPI (5'GGATC(N)4↓3') se

demostró la presencia de la mutación Thr195Ser en la copia del gen CQALS2 que generaría

la resistencia a herbicidas IMI. Esta técnica ha sido muy empleada en la mayoría de los

trabajos en los que se han tenido que validar mutaciones puntuales que dotan de resistencia

(McNaughton, 2001; Kolkman y col., 2004; Grula y col., 1995; Uchino y Watanabe, 2002).

La diversidad existente en el gen ALS en quínoa permitió desarrollar marcadores

moleculares PCR-RFLP. Estos permiten la rápida confirmación e identificación de la base

molecular de la resistencia, transformándose en una herramienta muy útil en los programas

de mejoramiento genético asistido por marcadores. Además, conocer la ubicación de las

mutaciones, es un proceso es clave para la correcta gestión de la resistencia (Corbett y

Tardif, 2008).

Una posible desventaja de la técnica es que las mutaciones espontáneas o inducidas

pueden aparecer y cambiar un sitio de reconocimiento para una enzima de restricción o

alterar un sitio de unión del partidor. Esto podría conducir a un falso diagnóstico de las

variantes, resistentes o susceptibles (Corbett y Tardif, 2008). Sin embargo, la probabilidad

de ocurrencia de mutaciones silentes espontáneas en dentro de los dominios conservados de

este gen en estas especies es pequeña (Corbett y Tardif, 2008).

En definitiva los experimentos realizados pueden elucidar completamente la

existencia de al menos dos copias teóricamente funcionales del gen ALS en C. quinoa. El

gen ALS descrito, comparte varias características en común con otros genes ALS

previamente caracterizados en otras especies. Estas similitudes incluyen una región

conservada de codificación, una región encargada del transporte intracelular, la existencia

de secuencias asociadas con la resistencia a los herbicidas y la inexistencia de intrones.

En trabajos futuros se verificará la expresión del gen ALS en los distintos órganos y

también la identificación de las especies progenitoras de las cuales derivan ambas copias en

C. quinoa. Este trabajo genera la base para la rápida identificación de nuevas variantes y la

generación de nuevos marcadores moleculares específicos para cada copia y mutación.

Estos genes serán introgresados en nuevas variedades comerciales, permitiendo la

producción de quínoa a gran escala proporcionando un control químico eficiente de

malezas.

4. CONCLUSIONES

De acuerdo a los resultados obtenidos y en respuesta a los objetivos e hipótesis

planteadas, se desprenden las siguientes conclusiones:

- El genoma de Chenopodium quinoa presenta al menos tres copias distintas del

gen ALS.

- Las copias del gen ALS, CQALS1 y CQALS2 son genes expresados. La ausencia

de ARNm y cambio del marco de lectura de CQALS3 sugiere que es una copia

silenciada.

- El gen ALS en C. quinoa no se encuentra interrumpido por intrones, con un

tamaño de 2001 pb las cuales se traducen en 667 aminoácidos incluidos el codón

“stop”.

- La línea mutante O-10-1 en comparación con la variedad original mostró tres

polimorfismos que generan sustituciones aminoacídicas, dos de las cuales

encuentran en los dominios no conservados de la proteína (nt 299 y nt 392).

- La línea mutante 0-10-1 presenta la mutación Thr195Ser en la copia CQALS2 del

gen, misma que se ubica en el dominio conservado de la proteína (dominio A) la

cual está asociada con la resistencia a herbicidas del grupo de las

imidazolinonas.

- La variación nucleotídica del gen ALS en C. quinoa permitió desarrollar un

marcador del tipo PCR-RFLP para la detección de alelos específicos asociados a

la resistencia a herbicida.

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