UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA-IZTAPALAPA /DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

PROYECTO DE SERVICIO SOCIAL

JPRESENTADO POR: GONZALEZ RAM~RU CLAUDIA

MATRíCULA: 88340941.

TELÉFONO: 5527-2035.

TRIMESTRE:97-I

/LICENCIATURA: BlOLOGíA EXPERIMENTAL.

TíTULO DEL PROYECTO: "ESTUDIOS h v h E /,q V&Q DE CINCO PLANTAS UTILIZADAS

MÉXICO PARA EL TRATAMIENTO DE LEUCEMIAS EN

-

T¡TULO DEL TRABAJO: . 4EVALUnCi6N DE LAS PROPIEDADES HEMATOPOYÉTICAS

DEL EXTRACTO METANÓLICO DE Anemor, sis califomica Nuti. - In V&Q IJ

LUGAR DE REALIZACI~N: LABORATORIO DE HEMATOLOG~A EXPERIMENTAL. (S-254)

UAM-IZTAPALAPA

F"ADEIHcI0: FEcHADETERMM& IdeDiaembede1999

PROFESOR TITULAR "C" DE T.C. DEPTO. DE CIENCIAS DE LA SALUD.

PROFESOR TITULAR "A" DE T.C. DEPTO. DE CIENCIAS DE LA SALUD

ALUMNA: G /

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México, D.F. 7 de junio del 2000

Dr. Gerard0 Saucedo Castañeda Director de la D.C.B.S-lztapalapa P r e s e n t e

Por este conducto manifestamos haber leído el informe final que presenta la Srita. Claudia González Ramírez, egresada de la Licenciatura en Biología Experimental (matrícula No. 88340941) y que estamos de acuerdo con su presentación y contenido. Dicho informe respalda el trabajo de Servicio Social desarrollado por la Senorita González, quien realizó el proyecto de investigación " Evaluación de las Propiedades Hematopoyeticas del Extracto Metanólico de Anemopsis califomica Nuff' in vitro" el cual forma parte de la línea de investigación "Estudio de Cinco Plantas Utilizadas en México para el Tratamiento de Leucemias".

Es necesario mencionar que el trabajo experimental se concluyó en el tiempo establecido, sin embargo el retraso en la entrega del informe final escrito, se debe a que la Senorita González adquirió compromisos de trabajo y personales que le impidieron realizar el informe inmediatamente después de concluir la fase experimental.

A t e n t a m e n t e .

Q. B. P. Rafaela Tapia Aguilar Profesor Titular "C" de T. C. Depto. de Ciencias de la Salud

Profesor Titular " A de T. 6. Depto. de Ciencias de la Salud

UNIDAD IZTAPALAPA AV. Michoacán y la Purísima, Col. Vicentina, 09340 Mllxico, D.F., Tel.: 724-4600, Telefax: (5) 612-0885

F O R M A T O PARA SER L L E N A D O POR EL (LOS) ASESOR(ES) I N T E R N O O EXTERNO PARA EL I N F O R M E F I N A L DE S E R V I C I O SOCIAL.

1. Noii ibre Y :idscriliciuii del asesor. M.en B.E. Rodolfo Velasco Lezama - Prof. Tit. "C" de Tiempo Completo Depto. Ciencias de la Salud

Q.B.P. Rafaela Tapia Aguilar - Prof. Tit, "A" de Tiempo Completo Depto. Ciencias d ela Salud

L a iiniur;ilci:i tlrl Proyecto del que procede el Servicio Social es: 2.

:I) t'riiteciii de Servicio Soci:il :isuci:ido n In iiivestigación que se realiza en las Areas ~le~i:ii'i:iiiiciii:iles.

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I I t'iir convenio.

n h) I'riiveciii de Servicio Soci:il :isoci:ido n nctividndes disciplinarias realizadas por el :lsPslIl..

3. Noit ihre &*I Proyecio del que derivii el Servicio Social e i i istitucióii u orgniiisnio que lo avaln. Estudio de Cinco Plantas Utilizadas en México para el tratamiento

de la Leucemia.

4. Desglosar I:is nctividndes que desnrrolló el asesor para íavorecer el cumpliiniento de los objetiviis Ih i ie : idos en el Proyecto 1iiici:il de Servicio Social. Trabajar con el estudiante

para asegurar eldominio de la metodología, reuniones de revisión bibliográfica y discusión de resultados y planeación de actividades. Otorgar las facilidades de instalaciones, material y equipo necesarios. 5. ~Cóiiiii r~:ilii:i rl deseiiilieíiu del iiliiiiiiio prestndor de Servicio Social? ;Considera que la

foriiiniióii que el :iliiiiiiio recibe en la UAMI es adecuada y suficiente para su desempeíio profesioii:il? ;,Por que?

Muy bueno. Sf, porque tiene la formación necesaria para un buen desempeiid académico.

6. Aiioie I:is (<iri:ilcz:is y (lebili(lndes tleiect:i&~s por usted con respecto n In formación del estudi:iiiir. Fortalezas Debilidades Capacidad intelectual. Destreza manual En ocasiones no disponía Comprensión y manejo de la informa- del tiempo suficiente. ción.

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CLAUDIA GONZALEZ RAMIREZ. Matricula 88340941 .Lic. BlOLOGlA EXPERtMENTAL.EVALUACI0N DE LAS PROPIEDADES HEMATOPOYETICAS DEL EXTRACTO METANÓLICO DE AnemODis caiifomicg f&(& in vitro. Clave de Registro BE 032.97.Fecha de entrega 7 junio del 2000. M. en B.E. RODOLFO VELASCO LEZAMA. Profesor Titular C de T.C. Q.B.P. RAFAELA TAPIA AGUILAR. Profesor Titular A de T.C. Departamento de Ciencias de la Salud. D.C.B.S.- lztapalapa

Anemopsis califomice Nuft (Hierba del Manso) es una planta originaria de California y Baja California. En nuestro pais las etnias Kumial, Cochimi, Pa¡ Pai, ingieren la infusión de la planta completa o de la raiz contra la tos, inflamaciones, cáncer, anemia y como cicatrizante. En trabajos previos el grupo de investigación en Hematología Experimental, encontró que el extracto metanólico de la raíz de A. califomica Nuft estimula la proliferación y& de células de médula ósea de ratones sanos. El objetivo del presente trabajo es obtener mediante cromatografia en columna la fracción o fracciones responsables de la actividad hematopoyética del extracto metanólico. Desarrollo: Se utilizó 1 Kg de la raiz de la planta, se trituró y calentó con metanol a temperatura de reflujo por 3 horas, el extracto se evaporó a sequedad y se fraccionó repetidamente en columnas de 2 x 90 cm empaquetadas con Silica gel 60, se eluyó con mezclas porcentuales de acetato de etilo-metano1 y cloroformo- metanol. Las fracciones se concentraron por evaporación. Se prepararon disoluciones con 0.2 glmLifracción y se adicionó un volumen de la fracción o extracto de prueba a un volumen de 2.0 x Id células viables de médula ósea y de bazo de ratones CDl , de 8 a 12 semanas y ocho volúmenes de medio Leibovitz (médula ósea ) y Alfa MEM (bazo), complementados con 10% de suero de caballo y se incubaron 72 horas a 37°C en ambiente húmedo y 5 56 de COZ . Se incluyeron cultivos testigo a) con extracto metanólico sin fraccionar y libres de libre de extracto o fracción. Los cultivos se cosecharon a las 48 horas y las células se contaron en cámara cuentaglóbulos. Resultados: Las concentraciones 0.4 y 0.2 g/mL del extracto crudo indujeron 0.8 y 1.25 incrementos en cultivos de médula ósea y 4.1 y 2.6 en cultivos de bazo a las concentraciones 0.2 y 0.1 gímL respectivamente. Con acetato de etilo-metanol, se colectaron 10 fracciones, únicamente las fracciones 4,8,9 y 10 estimularon la proliferación de células de médula ósea en cultivo. Con la mezcla cloroformo- metanol se obtuvieron 8 fracciones, de ellas la 4 y 8 estimularon la proliferación celular. El extracto metanólico no fraccionado presentó menor actividad significativa que las fracciones mencionadas anteriormente. Discusión y Concluslones: Bajo las condiciones experimentales, la actividad hematopoyética del extracto está asociada a las fracciones de polaridad química alta, donde habitualmente se encuentran carbohidratos, aminoácidos, alcaloides y péptidos o proteínas, que podrían actuar como mitógenos promoviendo la proliferación celular, actividad respaldaria su uso popular como cicatrizante. Quedan por conocerse los componentes de las fracciones hematopoyéticas, as¡ como el tipo y nivel de maduración de las dlulas estimuladas.

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La hematopoyesis es el proceso dinámico de producción y desarrollo

de las células sanguíneas a partir de un grupo de células precursoras

primitivas (stem), que se encuentran en la médula ósea y que bajo la

influencia de agentes humorales y el rnicroambiente se diferencian y dan

origen a las líneas de eritrocitos, leucocitos y plaquetas.

En el hombre, las células madre hematopoyéticas (Stem) hacen su

primera aparición en el saco vitelino del embrión, se desplazan al hígado

donde aumenta el número de líneas celulares que se producen,

posteriormente migran al bazo y finalmente a la médula ósea, lugar que se

mantiene como sitio de producción de sangre a lo largo de la vida del

individuo. ( 1 )

La célula madre hematopoyetica totipotencial (STEM) se encuentra en

una poza de células con diferentes capacidades de replicación y

diferenciación. De esta manera mientras unas células se replican, otras se

limitan a diferenciarse. El principal miembro de esa familia es la célula madre

totipotencial; que es la base de los sistemas hematopoyético e inmune (2).

Las células derivadas de la célula STEM hematopoyética constituyen los

elementos formes de la sangre, en la que cada una está disefiada para

cumplir su propia función vital

ERITROCITOS:

La función primaria de los eritrocitos es transportar oxígeno desde los

pulmones a los tejidos y devolver el CO, de los tejidos a los pulmones para

su eliminación mediante la actividad de la enzima anhidrasa carbónica, la

cual acelera la reacción entre bióxido de carbono y agua, permite así la

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absorción de grandes cantidades de bióxido de carbono en la sangre así

ayuda a mantener el pH de la sangre (3).

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De este modo los eritrocitos contribuyen a mantener el equilibrio

ácido-base del organismo.

LEUCOCITOS:

Los leucocitos se clasifican en neutrdfilos, eosinófilos, basófilos,

monocitos y linfocitos. Los nombres de los tres primeros se deben a su

afinidad ante los colorantes de Romanovsky.

Los monocitos y linfocios son células mononucleares. Los primeros

son fagocíticos y se transforman en macrdfagos en drganos del sistema

fagocítico mononuclear.

Los linfocitos son producidos en ganglios linfáticos, bazo, timo,

amígdalas y tejido linfoide del intestino, junto con los neutrófilos constituyen

la mayoría de los leucocitos en la sangre. En la inmunidad celular los

linfocitos derivados del timo, esto es los T sensibilizados, se unen a r L

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antigenos heterólogos específicos y los destruyen. La inmunidad humoral

implica la producción de anticuerpos circulantes por parte de los linfocitos B,

esta letra se les ha concedido por la semejanza remota con los que se

originan en la bolsa de Fabricio de las aves(4).

PLAQUETAS

Los trombocitos o plaquetas derivan de los megacariocitos de la

médula ósea, protegen las superficies vasculares y permiten a la sangre

formar un coágulo para detener la hemorragia, estimulan la coagulación al

aportar fosfolipidos en la via intrínseca de tromboplastina. Además son de

gran importancia ya que se adhieren a las &lulas tumorales promoviendo

que sean fagocitadas y eliminadas por los macrófagos.(5).

La producción de las células sanguíneas puede ser alterada por

agentes físicos, químicos e infecciosos, dando origen a distintas

enfermedades hemaíológicas; las que afectan primariamente a eritrocitos,

leucocitos, plaquetas y producen trastornos de la coagulación. Las

enfermedades de la médula ósea pueden ser del tipo hipo o

hiperproliferativas.(6). Respecto a los agentes causantes de hipoplasia

mieloide pueden ser de dos tipos: a) Los que regularmente producen lesión

en la médula ósea al darse en dosis suficientes: radiación, isótopos

radiactivos, radiación de explosiones nucleares, benceno, quimioterapeúticos

utilizados en en el tratamiento de los procesos malignos, b) Los agentes que

ocasionalmente se asocian a insuficiencia medular, algunos de estos

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compuestos son el cloranfenicol. benceno, quinacrina (Atebrina),

fenilbutazona, trinitrotolueno, arsenobenzoles y preparados en OrO.(7)

El Cloranfenicol es el agente que mas frecuentemente se ha asociado al

desarrollo de aplasia de la médula Ósea en los últimos anos. En el registro de

reacciones adversas del Consejo de Medicamentos, (Asociación Médica de

Norteamérica) se reportan 771 casos de pancitopenia el 44% de estos

pacientes habían tomado cloranfenicol entre otros medicamentos y en 15%

fue el único medicamento administrado durante los Últimos seis meses.

En contrapartida, la leucemia es una enfermedad hiperproliferativa de la

médula ósea,en la que se producen cambios cualitativos y cuantitativos en

la morfología y fisiologia de leucocitos en sangre periférica.

Para el control del cáncer, anemia aplástica y leucemia , la medicina

alopática utiliza tratamientos con quimioterapia, radioterapia y más

recientemente el transplante heterólogo de médula ósea estos tratamientos

en ocasiones resultan inaccesibles a la rnayoria de la población, por lo que

vanos sectores de la población recurren al empleo de la herbolaria como

alternativa para el tratamiento de estas enfermedades, que en nuestro pais

son mortales para la mayoría de los adultos que las padecen (8).

En la literatura de plantas medicinales, se cita gran variedad de

plantas a las que se les atribuyen propiedades contra la anemia, cáncer y

leucemia. De ellas se ha seleccionado Anemomis califomica Nuff (Hiedm de/

manso), por ser una de las plantas más frecuentemente utilizadas

empíricamente para el tratamiento de estas enfermedades.(g)

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ETNOBOTANICA DE AnemoDsis califomica ~utt . (Yerba Mansa

o Hierba del manso).

Es una planta originaria de México a Honduras, se desarrolla en climas

calidos, semicálidos y templados, está asociada a bosques tropicales

caducifolios, subcaducifolios, bosque espinoso, bosque mesófilo de

montañas, bosque de encinos y pinos

Por las propiedades medicinales que popularmente se le atribuyen a

esta planta, se le utiliza para resolver transtornos ginecol6gicos como dolores

menstruales (Puebla), contra la sífilis (Michoadn y Veracruz), y en

enfermedades gastrointestinales como la disentería.

El cocimiento de la raíz administrada por vía oral es la forma mas

frecuentemente empleada, se toma como agua de uso en caso de

hinchazón.

También se le utiliza contra la pulmonía fulminante, reumatismo,

tumores, para purificar la sangre, curar llagas, como diurético y

depurativo(9).

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Considerando que los seres humanos se exponer) ampliamente al

benceno por la contaminación del ambiente con hidrocarburos, consumo de

frutas y verduras contaminados con plaguicidas, el uso indiscriminado de

antibióticos (cloranfenicol),es posible que en un futuro aumenten los casos de

anemia aplástica, cáncer y leucemia tanto en países industrializados como

en países en vías de desarrollo.(lO)

En la medicina alopática los tratamientos contra estas enfermedades se

basan en la radioterapia y quimioterapia. que provocan efectos secundarios

graves y el transplante de médula ósea (11). Sin embargo este último es un

proceso costoso e inaccesible para la mayoría de los pacientes, por lo que

recurren al empleo de las plantas como un tratamiento alternativo o paralelo

al de la medicina alopática. Por lo que estudiar las plantas con propiedades

medicinales además de ayudar a conocer los recursos biológicos del país,

permitirá validar experimentalmente el conocimiento popular y la probable

aplicación de materiales de origen vegetal para el tratamiento de

enfermedades hematológicas.

De comprobarse la actividad estimulante del extracto metanólico de

AnemoDsis califomica p&.f.f se podría utilizar en modelos experimentales

- vivo e in vitro para el tratamiento de anemia aplástica y otras hipoplasias

medulares, para las que la medicina alopática aún no tiene un tratamiento

accesible para la mayoria de los pacientes.

En estudios preliminares del grupo de trabajo se obtuvieron los extractos

acuoso, metanólico. clorofórmico y hexánico de la raíz de AnemoDsis

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califomica Nutt y se determinó su actividad hematopoyética in vitro. De ellos

.el extracto metanólico estimuló más intensamente la proliferación de dlulas

de bazo y de médula ósea de ratones sanos (12). Sin embargo quedo por

determinar que fracción o fracciones tienen tal propiedad por lo que en el

presente proyecto se pretende obtener el extracto metanólico de AnemoDsis

califomica Nutt ,fraccionarlo mediante cromatografia en colurnna,hacer un

seguimiento biológico in vitro de las fracciones para determinar las

fracciones estimulantes de la hematopoyésis.

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NATURALEZA DEL PROYECTO:

El presente proyecto de investigación est& incluido en el campo de la

biología de células sanguíneas, orientado principalmente a conocer los

agentes físicos , químicos e infecciosos que modifican la hematopoyésis.

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En la medicina tradicional mexicana se utiliza la decocción de la raíz de

AnemoDsis californica kff para el tratamiento de anemia apiástica y

leucemia, es posible que esta planta presente componentes que estimulen la

proliferación de células hematopóye!icas normales, que inhiba el crecimiento

de células transformadas o ambas actividades, por lo que ensayos in vWQ

con los extractos de esta planta permitirán conocer si pose6 las propiedades

curativas que el conocimiento popular le atribuye.

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OBJETIVO GENERAL

Determinar el efecto del extracto metanólico de AnemoDsis califomca

- Nutt y sus fracciones cromatográficas sobre la proliferación in vitro de

células hematopoyéticas de ratones sanos.

OBJETIVOS ESPECíFICOS:

I. Obtener el extracto metanólico de AnemoDsis califomica Nutt..

2. Evaluar el efecto del extracto metanólico de Anemopsis califomica Nutt.

sobre la proliferación de células de médula ósea y de bazo de ratones sanos

-- in vitro.

3.Fraccionar el extracto metanólico mediante cromatografía en columna en

mezclas porcentuales de Acetato de etilolmetanol, cloroformolmetanol y

evaluar su actividad hematopoyética en cultivos de médula ósea de ratón.

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MATERIAL Y METÓDOS:

MATERIAL BIOLÓGICO:

Ratones machos CD,, de 8 a 12 semanas de edad.

AnemoDsis califomia u t .

SOLUCIONES, REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO:

Medio alfa MEM con glutamina (GIBCO)

Medio de Leibovitz (L- 15) (GIBCO)

Azul tripan al 0.4% (SIGMA CHEM.)

Suero de caballo (MICROLAB)

Silica gel 60 (MERCK)

Metano1 absoluto (BAKER)

Acetato de etilo (BAKER)

Solución salina fisiológica

Solución de Turk

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Material estéril desechable (NUNC) de uso en laboratorio de cultivo de

tejidos.

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-Placas multipozos

- Membranas Millipore de 0.22 y 0.45 rnilimicras

Pipetas de Thomas para: Glóbulos rojos y g16bulos blancos.

Equipo de disección.

EQUIPO:

Incubadora con entrada para CO,(National)

Campana de flujo laminar (Veco).

Potenciómetro (Beckman).

Balanza analítica (Ohaus)

Centrifuga para microhematocrito (Herrnle).

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Centrifuga (Solbat).

Canastillas de calentamiento y equipo de destilación.

Autoclave. (Presto)

Agitador de pipetas(Cavitr0n)

Bomba de vacio (Koblenz)

Cámara cuentaglóbulos (Boeco)

Microscopio óptico (Zeiss).

Espectrofotómetro (Perkin Elmer).

Microscópio invertido (Zeiss).

Rotavapor ( Büchi)

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MÉTODOS

OBTENCIÓN DEL EXTRACTO:

-La planta fue adquirida en el mercado de Zumpango, Mex. Se depositó un

ejemplar para su autentificación en los herbarios de la Universidad Autónoma

de Chapingo y de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.

- La raiz se dejó secar a temperatura ambiente durante 7 días protegidas del sol y del polvo.

- Se cortaron las raíces de la planta en trozos pequeños.

- Se pesó 1 Kg y se colocó dentro de un matraz de 10 I al que se le

agregaron 5 I de metanol absoluto.

- Se calentó a temperatura de reflujo durante aproximadamente 4 horas,

se filtró y el líquido (Extracto metanólico) se concentró por evaporación

hasta sequedad en baño maría . Una porción del polvo se disolvió en un

volumen mínimo de metanol y se mezcló con silica gel 60 (malla 76-230

mm). Se dejó secar 24 horas a temperatura ambiente y posteriormente

se colocó sobre columnas de 4 x 90 cm empacadas con silica gel 60 y se

resolvió con la mezcla de acetato de etilo/metanol en las si proporciones

siguientes:

Acetato de etilo 100%

Acetato de etilo 90%

Acetato de etilo 80%

Metanol 10%

Metanol 20%

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Acetato de etilo 70% Metanol 30%

Acetato de etilo 60 Metanol 40%

Acetato de etilo 50% Metanol 50%

Acetato de etilo 40% Metanol 60%

Acetato de etilo 30% Metanol 70%

Acetato de etilo 20% Metanol 80%

Acetato de etilo 10% Metanol 90%

Metanol 100%

Agua

1 .- El fraccionamiento por cromatografía se realizó por tripiicado,la igualdad

de las fracciones en los procesos de separación se determinó mediante

cromatografía en capa fina,aquellas fracciones que eran iguales, se

mezclaron.

2.-Se eliminó el solvente de cada fracción a presión reducida y a una

temperatura 40°C en un rotavapor. Posteriormente las fracciones fueron

concentradas por evaporación en baño maría.

3.- Se prepararó una disolución de 0.4 g/mL de cada fracción para

determinar su efecto sobre la proliferación de células de médula ósea de

ratón (15).

4.-EI proceso de separación se repitió al mezclar cloroformo/metanol y se

probó la actividad hematopoyética de la fracción obtenida.

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CULTIVO DE MÉDULA ÓSEA DE RATÓN

1. Se sacrificó un ratón macho por dislocación cervical y se obtuvieron los fémures en condiciones de esterilidad.

2. Se eliminó el músculo, se eliminaron sus epitelios y a través del canal

medular se introdujo una aguja del número 24, moviéndola hacia adelante

,se inyectó 1 ml de medio Alfa-MEM con 2% de suero de caballo.La

suspención celular se recogió en un tubo de plástico, las células se

dispersaron mediante pipeteo lento.

3. Se cuantificaron las células nucleadas totales en un hematocitómetro

utilizando solución de Turk . Además se determinó viabilidad con solución de

azul tripan al 0.4 YO. 4. Se ajustó la concentración celular a 2 X 10' células ImL con medio de

Leibovitz pH 7.6 . Se tomó 0.1 ml de la suspensión celular y se colocó en un

tubo que contenía los siguientes componentes; mismos que se adicionan en

el orden escrito(l6,17)

Medio de Leibovitz (L-I 5) 0.6 rnl

Suero de caballo 0.2 rnl

Extracto de prueba 0.1 ml

Suspención 2 X 106céiulas/mL O. 1 mi

En cultivos testigo se sustituyó el extracto de prueba por 0.1 ml de medio

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5. La mezcla de medioíextractoicélulas se distribuyó en los pozos de la placa,

paralelamente a las 1 O fracciones probadas se incluyeron cultivos testigos

libres de extracto y con extracto no fraccionado.

&Los cultivos se incubaron tres días a 37°C con humedad relativa de 90 % y

concentración de 5 YO de CO,

7.Las células se cosecharon, se lavaron con 1 ml de medio Leibovitz y se

centrifugaron a 2500 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente.

8.Se desechó el sobrenadante y se resuspendió el botón celular en 0.5 ml de

medio de Leibovitz, y las células se contaron en hemocitómetro. (18)

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CULTIVO DE BAZO DE RATON

- Se sacrificó por dislocación cervical un ratón macho CD1 de 8 a 12

semanas de edad. Se asiló el bazo en condiciones de esterilidad , se

dispersaron mecanicamente las celulas, se lavaron con 30 ml de medio

Alfa-MEM frío con pH 7.2. Se determinó la viabilidad celular con azul

tripan al 0.4 % y se ajustó la concentración a 2.0 x 10' célulasiml en

cámara cuentaglóbulos. Se cultivó un volumen de la suspensión celular

con 8 volúmenes de medio Alfa-MEM con suero de caballo al 10% y se

adicionó 0.1 ml del extracto de prueba.

- Se colocaron 0.5 ml de la mezcla anterior en pozos de placas Nunc de 1

cm2 e incubaron durante 48 horas a 37°C en cámara con húmedad

relativa de 90% y 5% de CO, ,

- Las células se recuperaron lavando las placas de cultivo con 1 ml de

medio Alfa-MEM pH 7.2, la suspensión celular se centrifugó a 2500 rpm

durante 1 O minutos a temperatura ambiente,se desechó el sobrenadante

y el botón celular se resuspendió en 0.5 ml del medio Alfa-MEM y se

cuantificaron las células con un hematocitómetro mediante microscopía

de luz. También se prepararon cultivos testigos libres de extracto.

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OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS

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1) Se cumplieron los objetivos planteados para el desarrollo del trabajo.

2) Se conocieron las fracciones del extracto metanólico con actividad hematopoyetica. oarticularrnente con posibles propiedades inmuno- estimulantes

3 ) Se avanzó en el conocimiento de las propiedades hematopoyeticas de la planta, lo que resoaldaría experimentalmente, el uso popular de esta contra la anemia.

4) El desarrollo del presente trabajo, permitió a la alumna adquirir conocimientos teorices, habilidades experimentales y dominio de algunas técnicas que le serán útiles en sii desempeño profesional.

5) Con base en los rssultadcs obtenidos se identificarán los compuestos responsables de !a actividad hernatopoyetica.

6) En trabajos futuros se intentará profundizar en el conocimiento de las propiedades inmiinoestimulantes del extracto crudo y de las fracciones obtenidas.

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ANALISIS ESTADISTICO DE LOS RESULTADOS.

Los resultados se expresan como la media de la cuenta celular incluida la

desviación estándar y la prueba de t para datos no agrupados(l9).

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RESULTADOS:

La concentración 0.2 glmL del extracto presentó la mayor actividad

hematopoyética en los cultivos de médula ósea seguido de la concentracibn

0.4 g h L , mientras que las concentraciones 0.1 y 0.05 no presentaron

diferencia significativa respecto al cultivo testigo . (Gráfica 1).

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La población celular aumentó 0.8 y 1.25 veces su concentración en los

cultivos con 0.4 , 0.2 glmL del extracto respecto al testigo, el cual aumentó

su concentración celular 4.05 veces con relación al número de células

colocadas al inicio del cultivo ( 2.0 X 10' cels/mL), lo que muestra que las

condiciones de cultivo son adecuadas ya que permite la proliferación celular.

Por otra parte, el extracto al ser adicionado a cultivos de bazo de ratdn en

las concentraciones 0.2 y O. 1 estimuló la proliferación celular, causando

incrementos de 4.1 y 2.6 en la cuenta final de células respecto al testigo el

cual a su vez aumento su concentración celular 5.0 veces (Gráfica 2).

En la gráfica 3 se puede observar el número de fracciones que se

obtuvieron al separar el extracto metanólico por cromatografia en la mezcla

acetato de etilo-metanol, de las fracciones 4,8,9 y 10 estimularon la

proliferación de células de médula ósea en cultivo.

Con la mezcla cloroformo-metano1 se obtuvieron 8 fracciones, pero solo

las fracciones 4 y 8 estimularon la proliferación celular.

21

I

El extracto metanólico no fraccionado present6 menor actividad

significativa que las fracciones estimulantes Gráficas 3 y 4.

22

DISCUSI~N

Los resultados mostrados en las gráficas 1 y 2 confirman la actividad

hematopoyética del extracto metanólico de A califomica detectada en

trabajos previos, en los cuales dicho extracto presentó mayor actividad

hematopoyetica que los extractos obtenidos con agua, cloroformo y hexano

(12 ) '

Se corroboró también que la concentración 0.2 glmL presenta la mayor

actividad estimulante de la proliferación celular in vitro, por lo que para los

ensayos con las fracciones cromatográficas estas se prepararon a dicha

concentración.

Es importante mencionar que con la concentración 0.2 glml del extracto

crudo, la población celular aumenta su número 1.25 veces en cultivos de

médula ósea. mientras que en cultivo de bazo dicho incremento es 4.1, lo

cual puede atribuirse a que en el primero se incluye todo tipo de células

presentes en la médula Ósea, Sin embargo únicamente las células stem

totipotenciales, multipotenciales y otras células primitivas tienen capacidad

proliferativa (constituyen 30% del total celular), por lo que los incrementos en

el número de células al final del cultivo son discretos (20). Por otra parte,

en los cultivos de bazo las mayoría de las células (linfocitos T y 6) tienen

amplia capacidad de replicación y produce incrementos mayores en la

población celular (21)

23

I

En las gráficas 3 y 4 pdede observarse que el extracto crudo presenta

menor actividad estimulante que las fracciones consideradas como

hematopoyeticas, lo cual podria atribuirse a la presencia de agonistas y

antagonistas que presentan las mayoría de las plantas, mientras que en

fracciones al encontrarse por separado dichas actividades, algunas

fracciones son estimilantes y otras no (22).

En las gráficas 3 y 4 se observa que la fracción 4 presenta actividad

hematopoyética on ambos iistemas. esta fracción corresponde a moléculas

poco polares qdimicarnentc, del tipo de terpenoides y fenil propanoides

como; Eugenol, elimicicin y esdragol, como los aislados por Sanvordeker

(23) y Tutupaili (24). de u n extracto de raíz obtenido por calentamiento de

la raíz durante 15 minutos, es posible que la actividad obtenida en nuestro

extracto sea atribuida a productos de oxidación del compuesto antes

mencionado ya que en nuestro diseno el calentamiento de la raíz fue de 3.30

hrs.

En las gráficas 3 y 4 se observa también que otro grupo de fracciones

con actividad hematopoyét:x son las colectadas con 80, 90 y 100% de

metanol, lo que sugiere qüe son moléculas altamente polares, entre las

cuales podrían encontrarse carbohidratos, aminoácidos, polipéptidos y ácidos

carboxílicos como el caféico ciorogénico, cinámico y oleánico, que han sido

reportados en esta planta y a los que se les atribuyen propiedades

antineoplásicas (25),

24

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En relación a las propiedades antineoplásicas de la planta nuestro grupo

preparó un extracto metanólico de la raíz de A. califomica, el cual al

adicionarse a culltivos de células humanas transformadas (líneas OVCAR.

USO, KB HCT-15 derivadas de carcinoma de ovario, cervix, esófago y colon

respectivamente) no inhibió la proliferación de estas células (25). Es

posible que el efecto antineoplásico que se atribuye empíricamente a la

planta no sea por inhibir el desarrollo de células cancerosas, sino por

promover la respuesta inmune mediante la estimulación de la proliferación de

células del bazo (linfocitos), como se muestra en la Gráfica 2.

Respecto a la actividad Iinfopoyética del extracto crudo, probablemente

contenga compuestos (proteínas) que actúen como mitógenos, ya que

cuando se utilizan cultivos testigos estimulados con el mitógeno de

Phytolacca americana (Preparación comercial GIBCO) en igual

concentración que el extracto metanólico, este tiene mayor efecto

estimulante sobre la proliferación de células de médula ósea (Resultados no

incluidos). Sin embargo, es posible que las moléculas responsables de la

actividad hematopoyética (estimulantes de la proliferación celular), no sean

constituyentes normales de la planta, sino productos de oxidación formados

durante el tratamiento térmico para obtener el extracto.

Es importante resaltar que las fracciones con franca actividad

hematopoyetica son altamente polares, por lo que las mezclas empleadas en

la separación del extracto en trabajos futuros deberán ser del tipo metanol-

agua, metanol-ácido, que son mas polares que las empleadas en este

trabajo y que podrían separar mas eficientemente los componentes de la

planta.

25

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CONCLUSIONES

1) Las fracciones con actividad hematopoyética corresponden a aquellas en las que el metano1 se encuentra en mayor proporción, por lo tanto las moléculas presentes en ellos son de polaridad químicamente alta.

2) El método de separación empleado produce mezclas complejas,por lo que deberá ser modificado para complementarlo con otras técnicas o con mezclas de solventes con iiiayor polaridad.

3) Queda por conocer la estirpe y e l nivel de maduración de las células estimuladas in vitro por el extracto inetanólico o sus ffaccciones.

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CRITERIOS DE EVALUACI~N

Presentación de seminarios ante el grupo de investigación en Hematologia Experimental

Presentación de resultados en el 2 Congresos Nacionales

Los resultados aqui obtenidos junto con los de trabajos anteriores se presentaron en Congreso Internacional de Descubrimiento de Drogas. Llevado a cabo Spring Silver MD. USA. En noviembre de 1999.

31

I

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