“Universidad Central “Marta Abreu”  de Las Villas 

 Facultad Química‐Farmacia Departamento de Lic. Química 

 

  

Título: “Estudio de Residuales del proceso de obtención de etanol a partir de bagazo”.

Autor: Luis Manuel Peralta González Tutores: Dr. José OrestesGuerra de León 

     M.Sc Edell Jiménez López

Curso 2008‐2009

Pensamiento

Pensamiento

“Nunca consideres el estudio como una obligación sino como una

oportunidad para penetrar en el bello y maravilloso mundo del saber.”

Albert Einstein

Dedicatoria

Dedicatoria

Le dedico mi Tesis de Grado a: La mujer más hermosa y más capaz nacida en la tierra, mi mamá, Susana González Pérez, muchísimas gracias por regañarme, darme tu cariño, tu amor, comprensión y felicidad, guiarme por el camino correcto en este mundo tan difícil de vivir. Para tí recíprocamente todo lo que tú siempre has querido y querrás. “Siempre vivirás convencida que yo viviré para ti”.

El hombre que puso su granito en el lugar y momento preciso, mi padre, Luis Manuel Peralta Suárez, “El mejor en todo y de todos”, sin duda una persona magnífica. Muchísimas gracias por regañarme, darme tu cariño, amor, comprensión y felicidad, guiarme por el camino correcto en este mundo tan difícil de vivir. “Siempre vivirás convencido que yo viviré para ti”.

A mi hermana, mujer que para mi es y será un ejemplo a seguir como persona y profesional. Gracias a todas esas broncas que cuando éramos niños corríamos por toda la casa, que lo menos que surgió desde ese tiempo fue y seguirá siendo el gran cariño y amor que siento por tí. “Siempre vivirás convencida que yo viviré para ti”.

No por ser la última es menos importante en mi vida, sino más especial y es a la mujer que amo, con la cual compartiré mis defectos, virtudes, felicidad y mi vida entera. A ella tan chiquita de tamaño pero con un corazón sin límites, te doy las gracias por permanecer a mi lado en los buenos y malos momentos en estos cuatro años que llevamos juntos, mi chiquitita Yoslainy Echevarría Valdés te amo con todo mi corazón y te deseo lo mejor en esta vida. “Siempre vivirás convencida que yo viviré para ti”.

Agradecimientos

Agradecimientos

Quiero agradecer a todas aquellas personas que de una forma u otra estuvieron presentes en mi

formación académica.

A mi tu tutor José Orestes Guerra de

León por su dedicación y esmero en el desarrollo

de la tesis, así como Edell Jiménez López por

su ayuda incondicional.

Agradezco a todos lo profesores del

departamento de Lic. en Química que

influyeron en mi formación profesional así

como a los técnicos de laboratorio.

A mi Mamá Susana Gonzáles Pérez, mi

Papá Luis Manuel Peralta Suárez, María

Josefa Peralta González y mis abuelos Rafael y

María guías de mi educación y formación en la

vida.

A mi otra familia entre ella a mi

chiquitita Yoslainy Echevarría Valdés que

estuvo presente en cuatro de los cinco años de

la carrera apoyándome en los buenos y malos

momentos, así como también a mis dos suegros

realmente no quiero conocer otros, para mi dos

personas magníficas que siempre me han

ayudado en todo lo que ha estado a su alcance.

No por ser los últimos son menos

importantes para mí sino que son más

especiales, me refiero al grupo que ha sido único

e inseparable en estos cinco años de la carrera,

ellos son: Yoslainy Echevarría Valdes, Lisdelys

González Rodríguez, Yoan Hidalgo Rosa,

Oscar Martínes Santiago, Reinier Tumbarell

Silva y Manuel Alejandro Treto Suárez. Para

ellos mis más humildes agradecimientos y les

deseo lo mejor del mundo tanto en sus vidas

cotidianas como profesional.

Índice

ĺndice

Resumen 1

Abstract 2

Introducción 3

Capítulo I: Revisión Bibliográfica 6

1.1 Hemicelulosa 6

1.1.1 Caracterización de Hemicelulosa 7

1.2 Xilanos 12

1.2.1 Caracterización de xilanos y xilooligosacáridos 15

Capítulo II: Materiales y Equipos 19

2.1. Principales equipos utilizados 19

2.2. Reactivos y disolventes 19

2.3. Tratamiento de los residuales del proceso industrial 20

2.4 Determinación de cenizas 22

2.5 Determinación cualitativa de azúcares 22

2.5.1 Hidrólisis de los polisacáridos 22

2.5.2. Obtención de derivados para la Cromatografía Gaseosa 22

2.5.2.1. Acetilación 22

2.5.2.2. Silalización 23

2.5.2.3 Preparación de los patrones. D-xilosa y D-arabinosa 23

Capítulo III: Resultados y Discusión 24

3.1 Estudio de los residuales acuosos R-1 y R-2 24

3.2. Estudio de los productos R’-1 y R’-2 27

3.3 Estudio de R’-1 y R’-2 mediante la técnica de cromatografía

gaseosa acoplada a un espectrómetro de masas 29

Conclusiones 33

Recomendaciones 34

Bibliografía 35

Anexos

Resumen

Resumen

Resumen

Del proceso de obtención de etanol a partir de bagazo de caña se obtienen

residuales ricos en carbohidratos que fueron sometidos a un proceso de

neutralización y decoloración utilizando una columna de carbón activado,

hasta obtener productos con mayor grado de pureza. Utilizando

procedimientos químicos de hidrólisis y derivatización, en combinación con la

cromatografía gaseosa acoplada a la espectrometría de masas, junto a la

información ofrecida por la espectrometría infrarroja y de resonancia

magnética nuclear, nos permitió una caracterización parcial de uno de estos

productos, el cual está constituido fundamentalmente por polímeros de xilosa

y arabinosa, lo que le confiere a este proceso un valor adicional.

Palabras claves: Bagazo, carbohidratos, derivatización, Resonancia Magnética

Nuclear, Espectrometría IR, Cromatografía Gaseosa.

1

Abstract

Abstract

Abstract

They obtain themselves of the process of obtaining of ethanol as from

bagasse of cane residual rich in carbohydrates that they were subdued to a

process of neutralization and discoloration using a column of coal activated,

to get products with bigger degree from purity. Using chemical procedures of

hydrolysis and derivatization in combination with the gaseous coupled

chromatography to the spectrometry of mass, beside the information offered

by the infrared spectrometry and of magnetic nuclear resonance, you allowed

us to a partial characterization of one of these products, that is constituted

fundamentally from polymers of xylose and arabinose, that you confer this

process an additional value.

Key word: Bagasse, carbohydrates, derivatizatión, Spectrometry NMR,

IR Spectrometry, Gas Chromatography.

Introducción

Introducción

Introducción

El bagazo de caña de azúcar es un desperdicio lignocelulósico abundante

típicamente encontrado en países que procesan caña de azúcar como Brasil,

India, Cuba, y China (Martinez, 2003). En general, las fábricas de azúcar

generan aproximadamente 270 kg de bagazo por tonelada métrica de caña

de azúcar. El Bagazo generalmente contienen celulosa del 40-45% y 30-35%

de hemicelulosas (Sun, 2004). Esta biomasa es, por consiguiente, una

materia prima renovable para la elaboración de productos químicos de

valores agregados a partir de componentes lignocelulósicos, como

hemicelulosas, siendo el bagazo usualmente almacenado, constituyendo un

problema medioambiental, debido al riesgo de combustión espontánea del

bagazo (Baudel, 2005). El proceso de obtención de etanol a partir de bagazo

actualmente en fase de investigación y desarrollo, es una vía promisoria que

aporta soluciones a la problemática medio ambiental y energética. Una ruta

química es la conversión de celulosa y hemicelulosa a azúcares fermentables

a partir de los cuales es posible obtener el etanol por vía fermentativa. Los

azúcares fermentables obtenidos son glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa y

manosa. En el proceso el bagazo transcurre por dos pre tratamientos los

cuales son necesarios para un mejor rendimiento de estos azúcares. La

biomasa se pre trata primeramente con ácido sulfúrico (1.25%) para dar

lugar a un residual ácido y un segundo tratamiento con hidróxido de sodio

(1.5-30 %) y Etanol (10-45 %) obteniéndose un residual básico,

posteriormente se realiza la hidrólisis enzimática y el producto obtenido se

fermenta, como muestra la figura 1.1.

Bagazo Tratamiento Tratamiento Hidrólisis Enzimática

R-1 R-2

Fermentación

Destilación

Figura 1.1. Proceso de obtención de alcohol a partir de bagazo.

H2O H2SO4 H2O EtOH NaOH

3

Introducción

Esta biomasa provee materias primas baratas para la producción biológica de

combustibles y productos químicos, el cual ofrece ventajas económicas,

medioambientales, y estratégicas. Después de la celulosa, la hemicelulosa es

la segunda familia del mundo más abundante de polímeros y así representan

un recurso renovable enorme que permanece casi completamente sin uso.

Sin embargo, en estos últimos años emerge interés para la aplicación de

hemicelulosas como polímeros y otro compuestos (Gatenholm, 2004). Por

ejemplo: xilanos, obtenidos a partir de madera o paja del cereal, han sido

probados como formadores de gel o para materiales termoplásticos (Rajesh,

2001), Además de los polímeros, la xilosa obtenida por la hidrólisis ácida

diluida, pueden ser convertidos a xilitol, un producto de alto valor específico

para la hidrogenación catalítica o enzimática (Mikkola, 2001). En el campo de

la alimentación se emplean como prebióticos, tales azúcares se denominan

ingredientes alimenticios no digestibles, que están presentes en

Xilooligosacáridos, Fructooligosacáridos, Glucooligosacáridos,

Galactooligosacáridos y son aplicados en dietas especiales de antiobesidad.

En el campo farmacéutico se utiliza en la prevención y tratamientos de

infecciones gastrointestinales, es agente activo en contra de Osteoporosis,

Otitis, Enfermedades en la piel y el pelo. En el campo de la agricultura es

utilizado como agente madurante, acelera y estimula el crecimiento,

logrando un aumento del rendimiento (Wang, 2009).

4

Introducción

Estos residuales, deben estar constituidos por alguno de los componentes

que originalmente tiene el bagazo, pero hasta el momento no se les da

ningún uso por tanto estamos en presencia del siguiente problema científico:

No se conoce la naturaleza y composición química de los residuales del

proceso de producción de etanol a partir de bagazo de caña, razón por

la cual estos constituyen un problema medioambiental y no se ha

evaluado la posibilidad de utilización para la obtención de otros

productos, que beneficien el balance económico del proceso.

Para resolver el mismo nos planteamos la siguiente hipótesis de trabajo:

Los residuales generados durante la producción de etanol a partir del

bagazo de caña están constituidos básicamente por polisacáridos de

los que podrían obtenerse productos de interés que confieren a este

proceso un valor adicional a la vez que se reduciría la carga

contaminante.

Para esto nos trazamos el siguiente objetivo general:

Determinar la composición y naturaleza química de los residuales obtenidos del proceso de obtención de alcohol a partir de bagazo.

Como objetivos específicos:

Implementar un procedimiento para el tratamiento de los residuales que permita obtener productos de mayor pureza.

Estudiar las condiciones de trabajo necesarias para la determinación de carbohidratos mediante la técnica de cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas.

Utilizar las técnicas espectroscópicas de IR y RMN en el estudio estructural de los productos obtenidos.

5

Revisión Bibliográfica

Revisión Bibliográfica

Capítulo I

Revisión Bibliográfica

1.1 Hemicelulosa

La hemicelulosa contiene un grupo de polisacáridos complejos, son

biosintetizados en grandes cantidades, en la mayoría de árboles y plantas

terrestres. Una producción anual mundial estimada de hemicelulosas está

en el rango de 60 billones de toneladas. Basados en el estadio del

conocimiento actual, las hemicelulosas pueden estar divididas en cuatro

clases generales de diferentes estructuras de polisacáridos de la pared

celular: xilanos, mannanos, β-glucanos, xiloglucanos. Una estructura de la

hemicelulosa ha sido propuesta (Oraphin Chaikumpollerta, 2004). Ver figura

1.2.

6

Revisión Bibliográfica

1.1.1 Caracterización de Hemicelulosa

Un grupo de investigadores chinos estudiaron la hemicelulosa del bagazo de

caña de azúcar, mediante las extracciones obtenidas por el método de

extracción ultrasónico. Los resultados mostraron que las extracciones con

tratamiento ultrasónico, en medio alcalino y peróxido alcalino bajo las

condiciones dadas dieron para una liberación sobre el 90 % de

hemicelulosas y lignina originales. Este hecho así como también la

composición de azúcar y características estructurales de las siete fracciones

hemicelulósicas aisladas indicaron que la ultrasonificación atacó las paredes

celulares íntegramente, cortó los enlaces de éter entre la lignina y la

hemicelulosa, y aumentó accesibilidad y extracción de la hemicelulosa.

Aumentando la concentración alcalina de 0.5 al 2M y el porcentaje de

peróxido de hidrógeno (pH 11.5) de 0.5 % a 3.0 % dieron como resultado

degradación de la cadena principal hemicelulósica como se muestra por una

disminución en sus pesos moleculares de 43580 hasta 14470 g mol-1 y

30180 hasta 18130 g mol-1, respectivamente. Sin embargo, no hubo

diferencias significativas en las características estructurales de las siete

secuenciales fracciones de la hemicelulosa alcalina y solubles en peróxido,

las cuáles están compuestas principalmente de L-Arabino-(4-O-metil-D-

glucurono)-D-xilanos y se encontró que ácidos Ferúlico y p-coumárico están

químicamente vinculados con la hemicelulosa (Jing-Xia Sun, 2004).

Alrededor del 90 % de la hemicelulosa y lignina original en las paredes

celulares del bagazo fue secuencialmente extraído con agua destilada, 0.5M

de NaOH, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y H2O2 (3.0 %) a pH 11.5, y NaOH (2.0 M) a

55 ºC por 2 h. La composición química, las propiedades físico-químicas, y

las estructuras de las ocho hemicelulosa fueron elucidadas por una

combinación de análisis de azúcar, oxidación con nitrobenceno de lignina

enlazada, determinación molecular, espectroscopía infrarroja con

transformada de Fourier, RMN (1H y 13C) y análisis térmico.

7

Revisión Bibliográfica

Los resultados demostraron que los tratamientos secuenciales fueron muy

efectivos en el fraccionamiento y extracción de la hemicelulosa del bagazo,

la concentración de álcali y peróxido tuvieron gran influencia en las

características químicas y estructurales de la hemicelulosa del bagazo,

contenido de lignina asociado y el peso molecular. La fracción de la

hemicelulosa aislada en H2O2 (0.5%) a pH 11.5 por 2h bajo 55 ºC tiene una

cadena principal de xilosa enlazada β-(1-4) y se encontró residuos de

unidades de arabinofuranosil y 4-O-metilglucopiranosil como cadenas

laterales.

Un estudio comparativo de los polisacáridos de la hemicelulosa del bagazo

de la caña de azúcar en solubilidad alcalina y solubilidad en solvente

orgánico ácido fue estudiado por F. Xu y colaboradores. Se realizó un

tratamiento de dos etapas del bagazo de caña de azúcar en medio

ligeramente básico y 1,4-dioxano en medio ligeramente ácido.

Pretratamiento con solución acuosa NaOH (1 M) a 20, 25, 30, 35, y 40 °C

por 18h resultando 55.5 %, 57.3 %, 59.1 %, 60.9 %, y 62.1 % de la

hemicelulosa original, respectivamente. El post tratamiento del

correspondiente residuo con 1,4-dioxano y HCl (2M) (9:1, v/v) a 87 °C por

2h, respectivamente, degradó 11.6 %, 11.9 %, 11.4 %, 10.9 %, y 10.6 %

de hemicelulosa (% materia seca del material de partida). Fue encontrado

que las cinco preparaciones solubles en álcali de la hemicelulosa, contenía

mayor cantidad de xilosa (78.0-82.2%) y ligeramente alto los ácidos

urónicos (4.8-5.8%), principalmente de ácido 4-O-metil-D-

glucopiranosilurónico, pero fue inferiores en arabinosa (9.3-11.7%) y

glucosa (2.2-4.1%) que las cinco fracciones acídicas correspondientes a la

hemicelulosa degradada en dioxano, en las cuales: xilosa (44.9-46.8%),

arabinosa (35.9-38.1%) y glucosa (13.0-13.7%) fueron los componentes

principales de azúcar. Los estudios revelaron que las cinco preparaciones

solubles en álcali de la hemicelulosa fueron más lineales, tuvieron un peso

molecular más alto (35200-37430 g mol-1) que las fracciones de la

hemicelulosa degradada durante el post tratamiento acídico con dioxano

(12080-13320 g mol-1).

8

Revisión Bibliográfica

Esto demostró que el post tratamiento con dioxano acídico bajo las

condiciones usadas dio como resultado degradación sustancial de los

polímeros de la hemicelulosa. Las 10 muestras de hemicelulosa fueron más

allá caracterizadas por análisis FT-IR, espectroscopía de RMN (1H y 13C) y

análisis térmico (F. Xu, 2006).

La estructura de la hemicelulosa extraída a partir de hierbas Vetiver

(Vetiveria Zizanioides Nash) fue estudiada por Oraphin Chaikumpollert y

colaboradores. Las composiciones de monosacáridos y la posición de los

enlaces entre monosacáridos en la hemicelulosa fueron definidas por

hidrólisis con TFA y análisis de metilación, respectivamente. Los métodos

espectroscópicos 13C RMN y FT-IR dieron detalles de la configuración de los

enlaces anoméricos y confirmaron la estructura de la hemicelulosa. La

estructura propuesta de la hemicelulosa de esta materia prima es un

arabinoxilano principalmente consistente en (1-4)-β-D-xilano de cadena

principal substituida en O-2 y O-3 por residuo de α-L-arabinosa, residuo de

ácido α-D-glucurónico y las cadenas cortas de residuos de azúcares

conteniendo arabinosa, xilosa y galactosa. Además, los enlaces β-(1-4) de

los D-xilopiranosil residuos en la cadena principal pueden contener ácidos

fenólicos substituidos (por ejemplo ácido ferúlico y ácido p-coumárico). Los

ácidos fenólicos substituidos son esterificados por sus grupos carboxilos, por

el hidroxilo del C-5 de los residuos de α-L arabinofuranosil como cadena

lateral (Oraphin Chaikumpollerta, 2004).

Runcang Sun y equipo de trabajo estudiaron seis fracciones

hemicelulósicas, las cuales fueron extraídas sucesivamente de paja de trigo

ya descerada con hidróxido sódico en incremento de fortaleza de 0.25 hasta

2.OOM. La estructura de la fracción hemicelulósica 2 fue investigada usando

hidrólisis ácida, análisis de metilación y experimentos 13C-RMN. Se confirmó

que la hemicelulosa esta formada por (1-4)-β-D-xilanos enlazado con ácido

D-Glucopiranosilurónico (ácido 4-O-metil-α-D-glucopiranosilurónico) grupo

adjunto en posición 2, L-arabinofuranosil y grupos de D-Xilopiranosil

adjunto en posición 3. Para cada 26 residuos de D-Xilopiranosil en la cadena

principal, hubo una unidad de ácido urónico, para 13 residuos D-

xilopiranosil, hubo un grupo de L-Arabinofuranosil, y para 18 residuos de D-

Xilopiranosil, hubo un grupo de D-Xilopiranosil (Runcang Sun, 1996).

9

Revisión Bibliográfica

Youssef Habibi junto a colaboradores lograron aislar xilanos del pericarpio

de semillas de pera de Opuntia Ficus indica (OFI) por extracción alcalina,

fraccionada por precipitación y purificada. Seis fracciones fueron obtenidas

y caracterizadas por análisis de azúcares y espectroscópico de RMN. Fue

asumido para ser (4-O-metil-D-glucurono)-D-xilanos, con grupos de ácido

4-O-α-D-glucopiranosilurónico enlazados en C-2. La composición de azúcar

y los espectros de 1H, 13C RMN demostraron que sus estructuras químicas

fueron muy similares, pero con proporciones diferentes de D-Xilosa y ácido

4-O-Me-D-Glucorónico. Los resultados mostraron que, como promedio, los

xilanos solubles en agua tiene un residuo terminal poco reductor ácido 4-O-

metil-D-glucurónico por cada 11 hasta 14 unidades de xilosa, considerando

los xilanos poco solubles en agua cuando las unidades de xilosa pueden

variar de 18 hasta 65 residuos por un residuo terminal no reductor de ácido

4-O-metil-D-glucurónico (Youssef Habibi, 2002).

El material proveniente de la pared celular de arbustos chino Haloxylon

Ammodendron y Elaeagnus angustifolia fue fraccionado por extracciones

sucesivas con etanol/H2O (60:40, v/v) bajo condiciones acídicas (HCl 0.2N)

a 70 °C por 4h, y 2 % H2O2 a pH 11.5 por 16 h, respectivamente. El

tratamiento secuencial de dos etapas dio como resultado la disolución de

83.9 % y 87.6 % de la hemicelulosa original descerada de H. ammodendron

y E. angustifolia, respectivamente. Xilosa, glucosa, y galactosa fueron los

componentes principales de azúcar en las dos preparaciones acídicas de la

hemicelulosa soluble en solventes orgánicos. Las dos fracciones solubles en

peróxido de la hemicelulosa fueron mostradas para ser compuestas

primordialmente de xilosa, comprendiendo sobre 80 % de los azúcares

totales. Los resultados también mostraron que las dos fracciones

hemicelulósicas soluble en peróxido alcalino fue más lineal, y tuvo masa

molecular y estabilidad térmica mayor que las dos fracciones acídicas de la

hemicelulosa soluble en organosolvente. El post tratamiento de H2O2 (2 %)

no resultó en ningún cambio significativo en la estructura macromolecular

de la hemicelulosa aislada. Es probable que la lignina proteja a la

hemicelulosa y la celulosa fuese atacada por peróxido (Xiao-Feng Sun,

2002).

10

Revisión Bibliográfica

Los polisacáridos de Hemicelulosa fueron aislados de órganos de la palma

de Phoenix Dactylifera L. por extracción alcalina y fraccionados por

precipitación. Las investigaciones estructurales fueron logradas por

espectroscopía RMN y análisis de azúcares. Las fracciones solubles en agua

fueron asumidas para ser arabinoglucuronoxilanos, con grupos de ácido 4-

O-α-D-glucopiranosilurónico enlazado en C-2 y arabifuranosil en C-3. Las

fracciones no solubles en agua fueron asumidas para ser (1-4)-β-D-xilanos

enlazado con un grupo ácido 4-O-metil-α-D-glucopiranosilurónico enlazado

en C-2. La composición de azúcar y los espectros de 1H, 13C RMN

demostraron que sus estructuras químicas fueron muy similares, pero con

proporciones diferentes de 4-O-Me-D-GlcA (Abdelkader Bendahou, 2007).

Los polímeros principales de la matriz hemicelulósica, de la pared celular de

Aristida pungens, una hierba perenne ampliamente distribuida en las

regiones áridas argelinas fueron aislados de las hojas con solución acuosa

KOH (14%). El método de extracción produjo dos fracciones de la

hemicelulosa (A y B) dando razón de 3.5 y 10.1 % del material de partida

respectivamente. Los métodos GC y 13CRMN mostraron la presencia de

xilosa como el componente principal con residuos arabinosil. Ambos análisis

mostraron que la hemicelulosa de las hojas de A. pungens son

arabinoxilanos. Los materiales resultantes fueron caracterizados por FT-IR,

espectroscopía de 1HRMN y análisis termogravimétricos (Lahouari Chaa,

2008).

1.2 Xilanos

Los xilanos están ubicados a lo largo del crecimiento de la pared y forman la

masa de la fracción de la hemicelulosa de las angiospermas. La estructura

general de los xilanos en plantas más altas son de cadena principal de D-

xilopiranosa unidos por enlaces β-(1-4) (Oraphin Chaikumpollerta, 2004, F.

Xu, 2006, Paul Robert and LUC SAULNIER*, 2005). Los xilanos son

moléculas grandes con un grado de polimerización de 150-200. Adjunto a la

cadena carbonada están las cadenas laterales terminales pequeñas.

11

Revisión Bibliográfica

En las angiospermas éstas son unidades de ácido 4-0-metil-D-glucurónico

que están adjuntado a la xilosa de la cadena principal por enlaces α-(1-2), y

estos están distribuidos al azar a lo largo de la cadena principal.

Aproximadamente la relación en que se encuentran es un ácido urónico

para cada diez residuos del xilosa (Youssef Habibi, 2002) y en la mayoría

estos grupos ácidos están presentes como ésteres y no como ácidos libres

(Aline Barbat, 2008, ZHU, 2005). En la naturaleza cerca de la mitad de los

grupos de xilosa en la cadena del polisacárido están acetilados. La mayoría

de la acetilación ocurre en C-3 aunque hay una cierta cantidad en C-2, y

ciertos residuos de xilosa están acetilados en ambos, C-2 y C-3 (Debora

Nabarlatz, 2007). Cuando los xilanos acetilados están aislados se encuentra

que son solubles en agua, especialmente comparado con los polímeros

desacetilados obtenidos a partir de la pared celular por extracción alcalina.

Los grupos de acetilo son lo suficientemente numerosos para impedir

alineación de las cadenas moleculares, y la agregación molecular no puede

tener lugar. Así la presencia de los grupos de acetilo tiene influencia sobre

la asociación de estas cadenas con otras y con otros polisacáridos dentro de

la estructura de la pared celular (NORTHCOTE, 1972). La conformación de

la formación de xilanos han sido investigadas por análisis de rayos X, y la

presencia de enlaces de hidrógenos han sido estudiadas por investigaciones

infrarrojas polarizadas. Ha sido mostrado que las moléculas existen como

las cadenas extendidas en forma de tornillo, pero a diferencia de celulosa

las cadenas no están estabilizadas por enlaces intermoleculares de

hidrógeno. No obstante, los agrupamientos ocurridos de la cadena ha sido

mostrado para estar estabilizado por la inclusión de moléculas de agua en la

estructura cristalina, y hay un rango continuo de xilanos hidratados. La

estructura del hidrato de los xilanos pueden ser representada por un

enrejado cristalino en el cual un sitio dentro del enrejado es ocupado por

una columna de moléculas de agua que estabiliza la estructura

(NORTHCOTE, 1972). Este sitio hidrófilo dentro del enrejado también puede

acomodar el ácido 4-O-metil-D-glucurónico y las cadenas laterales de

arabinofuranosa que pueden sujetar las moléculas de agua en esta posición.

Diferentes tipos de xilanos así como sus oligómeros se han reportado en la

literatura: kenaf, hierbas, frutas, cereales, tallo del tabaco, del algodón, del

girasol. En la figura 4 se ilustran algunos ejemplos.

12

Revisión Bibliográfica

13

Revisión Bibliográfica

1.2.1 Caracterización de xilanos y xilooligosacáridos

Los diferentes desperdicios agrícolas, particularmente el tallo de tabaco

(TS), el tallo de algodón (CS), el tallo del girasol (SS), y la paja de trigo

(WS), sirvieron para la producción de xilooligosacáridos (XOs). La

producción de XOs fue realizada por hidrólisis ácida de xilanos, el cual fue

obtenido por extracción alcalina de estos desperdicios agrícolas. El

componente principal de estos desperdicios agrícolas fue determinado como

celulosa (30-42%), fue seguido por xilanos (20%) y lignina (20-27%). Los

xilanos de estos desperdicios tuvieron principalmente xilosa (85-96%) con

pequeñas cantidades de glucosa, mientras que los xilanos de la paja de

trigo contenían también arabinosa. La mejor conversión de xilanos en XOs

fue lograda con H2SO4 (0.25 M) con tiempo de reacción 30 min. En estas

condiciones, el rendimiento de XOs estaba entre 8 % y 13 %. El

rendimiento de XOs depende de ambos, el tiempo de hidrólisis y

concentración de ácido, pero el rendimiento de monosacárido depende de la

estructura y composición del xilano, además de la concentración de ácido y

el tiempo de reacción. El xilano más ramificado, WSX, dio el rendimiento de

monosacárido más alto (16 %) y furfural (49 mg/100 g xilano) (Ozlem

Akpinar *, 2009).

La producción de Xilooligosacáridos (XOs) fue realizada por hidrólisis

enzimática de xilano que fue obtenido por extracción alcalina del tallo de

tabaco (CS) del tallo de algodón (TS), y paja de trigo (WS). El xilano fue

hidrolizado usando Trichoderma Longibrachiatum Xilanasa, y los efectos de

pH, temperatura, tiempo de hidrólisis, las concentraciones de substrato y de

la enzima en el rendimiento de Xilooligosacáridos y el grado de

polimerización fueron investigados. Fue encontrado que estos tres

desperdicios agrícolas contenían cantidades diferentes de xilano, celulosa y

que la lignina y el xilano obtenido a partir de estas fuentes contenían

cantidades diferentes de azúcar y ácido urónico. Los xilanos de WS tuvieron

cantidades mayores de arabinosa mientras los otros xilanos principalmente

tuvieron xilosa y cantidades pequeñas de glucosa.

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Revisión Bibliográfica

Trichoderma longibrachiatum xilanasa hidrolizó la paja de trigo donde los

xilanos estaban altamente ramificado (WSX) en mayor medida que los

xilanos del tallo de algodón (CSX) y del tallo de tabaco (TSX), bajo

condiciones favorables (tiempo de reacción de 8 h a pH 4.6 y 50 ºC). El

análisis TLC de los productos de hidrólisis indicó que el producto de

hidrólisis de T. longibrachiatum xilanasa contenía cantidades diferentes de

oligosacáridos (X2, X3, X4, X5, X6, X7) con algunos monosacáridos. A pesar

de las diferencias estructurales de los tipos del xilanos, todos generaron

XOs con grados diferentes de polimerización (Bostanci, 2009).

Un análisis de metilación y parcial hidrólisis ácida de xilanos del vástago y

corazón del kenaf (Hibisco cannabinus) mostró que la cadena principal de

estos xilanos consiste en residuos (1-4)-β-D-xilopiranosil (Xilp), algunas

unidades de la cadena principal llevan enlazados ácido α-(1-2)-4-O-metil-D-

glucopiranosilurónico (Me-GlcAp) y residuos de ácido glucopiranoslurónico

(GlcAp) de las cadenas laterales. La hidrólisis parcial de los xilanos del

kenaf le proporcionó dos series de ácidos aldourónico a partir de aldobio

hasta los ácidos aldotetraourónico. Los ácidos de la primera serie

compuesta de residuos de 4-O-Me-D-GlcAp y de D-Xilp: 4-O-Me GlcA-Xil3,

4-O-Me GlcA-Xil2 y 4-O-Me GlcA-Xil. Las segundas series compuestas de D-

GlcAp y D-Xilp: GlcA-Xil3, GlcA-Xil2 y GlcA-Xil. Además para estos ácidos,

otro ácido aldobiourónico, 4-O-(α-D-GalAp)-D-Xil fue encontrado para estar

presente en el parcial hidrolizado. La relación molar de GalA, GlcA, 4-O-Me-

GlcA, y los residuos de Xil calculados fueron 1.0:2.0:9.4:119 para los

xilanos del vástago y 1.0:1.3:7.9:99.4 para los del corazón del Kenaf (H.

Komiyama, 2008).

Seis diferentes residuos agrícolas de origen botánico, particularmente

mazorcas (CC), conchas de almendra (AS), semillas de olivo (OS), cáscaras

de arroz (RH), paja de trigo (WS), y paja cebadaza (BS), fueron probados

como materias primas para la producción de xilooligosacáridos (XOs) por

auto hidrólisis a 179 °C por 23 min. El rendimiento de XOs dependió del

contenido de xilanos y su accesibilidad y fue proporcional para el contenido

de acetilo de las materias primas.

15

Revisión Bibliográfica

El rendimiento fue mayor para CC (60 %) y AS (55 %), mientras RH

proveyó un rendimiento bajo (30 %) de acuerdo con su contenido mínimo

de acetilo. Los análisis de composición de los productos de hidrólisis

mostraron que contenían oligómeros parcialmente acetilados y fragmentos

de polímeros de xilanos, y algunos monosacáridos y productos de

degradación. Combinando los espectros RMN (13C y 1H) de 1D y 2D (HSQC)

de las muestras dializadas de XOs revelaron que los grupos de acetilo

estaban localizados en los residuos del xilosa principalmente en posición 3

(entre 60 y 67 mol%), considerando la ocurrencia de grupos de acetilo en

posición 2 y en ambas posiciones 2 y 3 fueron similares (19-30 mol% y 8-

25 mol%, respectivamente). El análisis de RMN mostró la presencia de

residuos de ácido 4-O-metilglucurónico (MeGA) en todas las pruebas de

XOs, como indicó la relación molar MeGA/Xil, 2.5:100 para CC hasta

9.1:100 para OS. A pesar de las diferencias estructurales de los tipos de

xilanos presente en los materiales de la planta de partida, todos los XOs

mostraron la característica estructural de un parcialmente O-acetilado 4-O-

metilglucuronoxilano (Debora Nabarlatz, 2007).

La zona de la huella dactilar en FT-IR de endosperma de arabinoxilanos de

trigo (AX) fue investigada usando un grupo de polisacáridos exhibiendo

variación de su grado de sustitución y unidades de xilosa que consisten de

xilooligosacáridos mono o disustituido por residuos de arabinosa. La

sustitución de la xilosa de la cadena principal por unidades laterales de

arabinosa fue más profundamente estudiada en la región espectral 1000-

800 cm-1, usando la segunda derivada. La región espectral 1020-920 cm-1

reveló dos bandas de absorción a 984 y 958 cm-1, las intensidades de las

cuales varió conforme al grado de sustitución, aumentando la intensidad de

la banda en 958 cm-1 y decreciendo la banda en 984 cm-1. Los datos

espectrales de la segunda derivada de los xilooligosacáridos señalaron que

estos cambios podrían ser atribuidos a la sustitución del xilano en la cadena

principal por residuos de arabinosa, y la banda en 958 cm-1 fue adscrita a la

presencia de residuos de xilosa disustituida.

16

Revisión Bibliográfica

Los componentes principales del análisis espectral FT-IR de modelos de

mezclas de AX, β-glucans, y arabinogalactanos sugirieron que cabe evaluar

las proporciones relativas de los polímeros y el grado de sustitución de AX

en mezclas complicadas como la pared celular de granos del cereal (Paul

Robert and LUC SAULNIER*, 2005).

De la planta medicinal Rudbeckia Fulgida, var sullivantii (Boynton Et Beadle)

un polisacárido de bajo peso molecular 4-O-metil-α-D-glucurono-D-xilano

fue aislado por extracción alcalina, seguido por precipitación con etanol, por

cromatografía del intercambio de iónico y filtración de gel. Los resultados de

composición y análisis de enlaces, sustentados por mediciones de 1H y 13C

RMN de oligómeros generados en la hidrólisis ácida parcial, mostró los

enlaces β-(1-4) de residuos D-xilopiranosil de la cadena principal con

aproximadamente 18 % de ácido α-(1-2)-4-O-metil-D-glucurónico enlazado

a los residuos de la xilosa. Se determinó que de cada seis unidades de D-

xilosa hay un residuo de ácido 4-O-metil-d-glucurónico (Alzbeta

KardosÏova *, 1998).

17

Materiales y Equipos

Materiales y Equipos

Capítulo II

Materiales y Equipos

2.1. Principales equipos utilizados.

Espectros IR: se realizaron en un equipo WQF-510 FTIR. Las

unidades se expresan en cm-1.

Espectros de RMN: Se registraron en equipos Varian INOVA-400. Los

disolventes utilizados fueron DMSO-d6 y D2O. Para el calibrado de los

desplazamientos químicos δ (expresados en ppm) y las constantes de

acoplamiento J (medidas en Hz) se referencia respecto a los picos

residuales de los disolventes que son 2.5 ppm (DMSO-d6) y 4.8 (D2O)

en 1H-RMN

Cromatogramas gaseosos: Se registraron en un Cromatógrafo gaseoso

acoplado a un espectrómetro de masas (CROM-MAS) SHIMADZU

GC/MSD GP5050 A.

2.2. Reactivos y disolventes

Todos los disolventes y reactivos utilizados son de las firmas MERCK,

Panreac y BDH.

Los disolventes de calidad técnica fueron destilados y secados antes de

ser utilizados.

18

Materiales y Equipos

2.3. Tratamiento de los residuales del proceso industrial.

Los residuales utilizados en el trabajo fueron muestras promedios de las

condiciones de trabajo en que se desarrolló el proceso de obtención de

etanol. Una porción de cada uno de ellos se evaporó a sequedad para realizar

las determinaciones de cenizas, contenido de sólidos y otros análisis

cualitativos.

Con el resto se siguieron los siguientes pasos:

Se ajustó el pH a 7 utilizando solución de NaOH (25%).

Se adicionaron a una columna cromatográfica (30 cm de altura por 5

cm de diámetro) conteniendo carbón activado como fase estacionaria y

se eluyó con agua destilada (proceso de decoloración).

Una vez decolorado, el residual fue evaporado a vacío hasta la

sequedad

De esta forma se obtuvo a partir del residual ácido R-1, el producto R’-1 y

del residual básico R-2, el producto R’-2.

19

Materiales y Equipos

Bagazo Tratamiento Tratamiento

H2O H2SO4 H2O EtOH NaOH

R-1 R-2

Carbón Activado

Bagacillo Bagacillo Residuo

Neutralizado

R’-1 R’-2

Figura 2.1. Diagrama de obtención de R’-1 y R’-2 a partir de los residuales ácido y básico.

Rotovaporador

20

Materiales y Equipos

2.4 Determinación de cenizas

Se determinó mediante la diferencia de peso de la muestra antes (1 g) y

después de la incineración a 500 ºC durante 4h.

2.5 Determinación cualitativa de azúcares.

Se realizó mediante el uso de los ensayos clásicos utilizados en la

determinación de azúcares (Daniel J. Pasto, 1995).

2.5.1 Hidrólisis de los polisacáridos.

0.1g de la muestra fueron suspendidos en 10ml de H2SO4 (0.25M),

calentando a ebullición durante 60 min. en un balón con un condensador en

posición de reflujo.

2.5.2. Obtención de derivados para la cromatografía gaseosa (Knapp,

1979).

2.5.2.1. Acetilación

100mg de la muestra se disolvieron en 3ml de Piridina y 1.5ml de Anhídrido

Acético, calentando a ebullición durante 60 min. en un balón con un

condensador en posición de reflujo. A partir de aquí se emplearon dos

procedimientos:

Procedimiento A: Se evaporó a sequedad y el sólido fue disuelto en

dimetilsulfóxido e inyectado en el CG-MSD.

Procedimiento B: La mezcla de reacción se extrajo con cloroformo y éste fue

inyectado en el CG-MSD.

21

Materiales y Equipos

2.5.2.2. Silalización

10mg de la muestra se disolvieron en 1ml de piridina, se adicionaron 10mg

de ácido tricloroacético y se calentó la mezcla durante 1h a 75 ºC.

2.5.2.3 Preparación de los patrones. D-xilosa y D-arabinosa.

Como patrones se utilizaron las pentosas D-xilosa y D-arabinosa, que fueron

derivatizadas siguiendo los procedimientos anteriormente descriptos.

22

Resultados y Discusión

Resultados y Discusión

Capitulo III

Resultados y Discusión

En este capítulo analizaremos lo concerniente a la purificación y

caracterización de los residuales del proceso de obtención de etanol para lo

cual empleamos procedimientos cromatográficos y espectroscópicos.

3.1 Estudio de los residuales acuosos R-1 y R-2

Del pretratamiento en medio ácido realizado sobre el bagazo en el proceso

industrial obtuvimos un licor oscuro (R-1) rico en hemicelulosa mientras que

del pretratamiento en medio básico se obtuvo un producto con la misma

apariencia (R-2) pero rico en materiales lignocelulósicos. En ambos casos los

resultados fueron positivos para los ensayos con la 2,4-dinitrofenilhidrazina y

el reactivo de Benedit.

Algunas características determinadas en los mismos se muestran en la tabla

3.1

Tabla 3.1 Residuales pH % sólido % cenizas

R-1 2.39 58.69 10.57 R-2 6.16 58.25 10.57

En ambos casos estos productos presentan un alto contenido de cenizas y

casi un 60 % de sólidos. El pH de R-1 resultó muchos más bajo, teniendo en

cuenta que este residual procede de un tratamiento ácido, a diferencia de R-

2, que el residual procedente de la etapa del tratamiento básico.

Estos licores fueron llevados a pH neutro mediante adición de solución de

NaOH (25 %) y posteriormente se rotoevaporaron hasta la obtención de

residuos sólidos (R’-1 y R’-2) de color oscuro que fueron sometidos a un

proceso de decoloración utilizando una columna cromatográfica con carbón

activado. En ambos casos se registraron los espectros IR antes y después de

ser tratados en la columna.

23

Resultados y Discusión

Figura 3.1. Espectro IR de R-1 (rojo) y R’-1 (negro).

Los espectros IR de R-1 y R’-1 resultaron ser característicos de azúcares de

esta biomasa y se asemejan a los encontrados en la literatura (C.F. Liu,

2006, J.X. Sun, 2004), muestran entre las señales más importantes las

correspondientes a las vibraciones de valencia de los grupos hidroxilos (ע O-H

3402 cm-1), la vibración Csp3-H (ע C-H 2933 cm-1), así como el típico patrón de

compuestos aromáticos en 1604 y 1516 cm-1. Además, las señales en 1419

cm-1 y 1363 cm-1 son debidas a las vibraciones de deformación δ C-C y δ C-OH,

( o δ C-H) en el plano respectivamente (M. KacÏuraÂkovaÂ, 1999 ), así como

las bandas de mayor intensidad alrededor de 1120 cm-1 (ע C-O-C ) producto de

las vibraciones de valencia de los enlaces anoméricos y en 1051 cm-1 debido

a las vibraciones de valencia relacionadas con las conformaciones del anillo

hemiacetálico (ע C-C, ע C-O ). En la región anomérica (700-950 cm-1) una

banda resuelta a 897 cm-1 se debe a las vibraciones de deformación (δ C-H)

de los enlaces glicosídicos para la configuración β entre la unidades de

azúcares del polisacárido (Jing-Xia Sun, 2004, R. Singh, 2005, F. Xu, 2006,

C.F. Liu, 2006, J.X. Sun, 2004).

24

Resultados y Discusión

Es de señalar la similitud entre los espectros registrados antes y después del

proceso de decoloración excepto la aparición de una señal 619 cm-1 que

pudiera ser debida a vibraciones C-S (Dahlman, 2002) pero que

contradictoriamente no aparece en el espectro correspondiente a la muestra

antes de ser decolorada.

La banda ancha 1636cm-1 que aparece en el espectro IR de R’-1 y que es

debida al agua residual, pudiera enmascarar a las señales de los grupos

carboxilatos de las unidades de ácido glucorónico y posibles ácido. p-

coumárico o ácido ferúlico que están enlazados a azúcares de la cadena

principal y a azúcares de las cadenas laterales del polisacárido

respectivamente (Oraphin Chaikumpollerta, 2004).

Un análisis similar puede hacerse para el caso de R’-2, destacándose las

señales siguientes

los grupos hidroxilos (ע O-H 3454 cm-1),

grupos carboxílos (ע C=O 1714cm-1),

compuestos fenólicos (δ C-C 1662, 1629, 1448 cm-1)

otras vibraciones típicas de los carbohidratos en 1144, 1398, 1361,

995 y 876 cm-1.

Sin embargo, a diferencia del caso anterior, no hemos encontrado en la

literatura información suficiente que nos permita hacer comparaciones.

Ver figura 3.3.

25

Resultados y Discusión

Figura 3.3. Espectro IR correspondiente a R’-2.

3.2. Estudio de los productos R’-1 y R’-2.

Tanto los productos R’-1 como R’-2 resultaron ser sólidos blancos rindiendo

58.69 % y 58.25 % (m/v) respectivamente, dando resultados positivos para

los ensayos con la 2,4-dinitrofenilhidrazina y el reactivo de Benedit. Estos, al

ser suspendidos en agua, muestran apariencia de dispersión coloidal.

Los espectros de 1H-RMN de ambos productos fueron registrados y los

mismos presentan las características típicas de estos compuestos. Del

análisis de la bibliografía conocemos que las señales más desapantalladas

(por encima de 4 ppm) corresponden a los protones anoméricos,

específicamente desde 4.0 a 4.7 ppm aparecen los protones de configuración

β, mientras que desde 4.7 a 5.6 ppm resuenan los de configuración α para

polisacáridos de la hemicelulosa del bagazo. Entre 2.0 y 4.0 ppm aparecen

los protones ecuatoriales y axiales de los azúcares que constituyen el

polímero (Jing-Xia Sun, 2004, F. Xu, 2006, J.X. Sun, 2004).

26

Resultados y Discusión

Al registrar el espectro de 1H-RMN de R’-1 en DMSO-d6 aparecen las

siguientes señales, que hemos asignado por comparación con datos que

aparecen en la literatura para la misma biomasa. Ver tabla 3.2 y 3.3. (Ver

espectros 1HRMN en el anexo 1).

Tabla 3.2.

R’-1 DMSO-d6

Señales Asignaciones de las señales por comparación

6.6 ppm H aromáticos del ácido p-coumárico o ácido ferúlico

6.2 ppm H aromáticos de residuos de la lignina

5.13 ppm (d, J=3.8) H-1 de α–arabinofuranosa (Señal muy poco intensa)

4.8 ppm (d, J=3.6) H-1 de α-xilopiranosa

4.2 ppm (d, J=7.6) H-1 de β-xilopiranosa

1.6 ppm (s) debido a grupos metoxilos del ácido glucorónico

Tabla 3.3.

R’-2 DMSO-d6

Señales Asignaciones de las señales por comparación

8.4 ppm (s) No ha podido ser asignada

4.8 ppm señal deformada que no ha podido ser asignada.

4.2 ppm (d, J=7.5) H-1 de β-xilopiranosa

1.6 ppm (s) debido a grupos metoxilos del ácido glucorónico

27

Resultados y Discusión

De acuerdo a estos resultados se evidencia, además de otros restos, la

presencia de xilosa en ambos productos y arabinosa en R’-1 pero a través de

una señal muy poco intensa por lo que decidimos repetir el espectro para

esta muestra, en este caso utilizando agua deuterada como disolvente; los

resultados fueron los mismos pero la señal en 5.13 ppm se intensificó.

3.3 Estudio de R’-1 y R’-2 mediante la técnica de cromatografía

gaseosa acoplada a un espectrómetro de masas.

Con el objetivo de conocer características estructurales de estos polímeros

realizamos un estudio utilizando el procedimiento de cromatografía gaseosa

acoplada a un espectrómetro de masas y combinando procesos de

derivatización e hidrólisis. (Ver todos los cromatogramas correspondientes a

los diferentes experimentos en el anexo 2).

Inicialmente y con el objetivo de ir buscando las condiciones de trabajo,

utilizamos la reacción con anhídrido acético en piridina para obtener

derivados acetilados antes de la inyección en la columna del cromatógrafo.

En un primer experimento, este proceso se realizó directamente sobre los

productos (R’-1 y R’-2) y los resultados se muestran en la figura 3.4.

5.50 5.75 6.00 6.25 6.50 6.75 7.00 7.25

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

(x100,000)

Figura 3.4. Cromatograma correspondiente a R’-1 acetilado (rosado), R’-2 en las mismas condiciones (negro) utilizando como disolvente DMSO.

28

Resultados y Discusión

Para R’-1 se observan dos picos cuyos espectros de masas corresponden a

pentosas peracetiladas (probablemente isómeros alfa y beta) que se

encuentran en forma libre en la muestra (ver anexo 3). Para R’-2, en la

región de trabajo no se apreció señal alguna. Teniendo en cuenta los

resultados obtenidos hasta el momento y la poca cantidad que disponíamos

de este último producto, continuamos el trabajo solamente con R’-1.

En otro experimento, este compuesto fue primeramente hidrolizado y

posteriormente acetilado y el producto de reacción fue disuelto en DMSO

antes de ser inyectado en la columna. Por otra parte, patrones de D-xilosa y

D-arabinosa fueron derivatizados y cromatografiados utilizando el mismo

procedimiento. En la figura 3.5 aparecen de forma superpuesta los

cromatogramas de muestra y los patrones. Ver espectros de masa en el

anexo 4.

5.8 5.9 6.0 6.1 6.2 6.3

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

(x1,000,000)

Figura 3.5. Cromatogramas de los patrones de D-xilosa, D-arabinosa y producto de hidrólisis de R’-1 peracetilados. Producto de hidrólisis (negro), patrón de D-xilosa (azul) y patrón de D-Arabinosa (rojo) usando como disolvente DMSO.

29

Resultados y Discusión

Para cada patrón aparecen varios picos, comportamiento éste que ha sido

anteriormente reportado (SARAH L. VALLANCE, 1998); estos son

coincidentes con los de la muestra por lo que de esta forma se confirma la

presencia de xilosa y arabinosa como constituyentes del polímero y que estos

se encuentran en una relación 0.38 (Ara/Xil) según la determinación relativa

de las áreas bajo la curva.

Con el objetivo de buscar una mayor calidad en los cromatogramas

repetimos éste último procedimiento pero, en lugar de utilizar DMSO como

disolvente, los productos de reacción fueron extraídos con cloroformo y éste

fue inyectado en la columna. Los resultados son similares a los descritos

anteriormente pero en este caso puede apreciarse una mejor resolución de

los picos así como mayor facilidad de comparación con los patrones

correspondientes. Se puede ver que la muestra está compuesta

fundamentalmente por dos azúcares, arabinosa y xilosa. Ver figura 3.6.

5.6 5.7 5.8 5.9 6.0 6.1 6.2 6.30.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

(x100,000)

Figura 3.6. Cromatogramas correspondientes a R’-1 (hidrolizado y peracetilado) (rojo), patrón de xilosa peracetilada (negro) y patrón de Arabinosa peracetilada (azul) realizado después de extracción con CHCl3.

30

Resultados y Discusión

Por último, repetimos este procedimiento pero utilizando como derivado los

trimetilsilanos (TMS) en lugar de la acetilación.

La sililación es el método de derivatización más usado actualmente para

análisis por GC. Los reactivos son de fácil manejo en la formación de los

derivados. En la sililación, un hidrógeno activo es reemplazado por un grupo

del alquilsilil, como trimetilsilil. Comparados con otros derivados son más

volátiles, menos polares, y más termoestables. Como consecuencia, la

separación y detección es óptima.

El cromatograma de la figura 5.7 muestra el resultado del uso de este

derivado sobre el producto de hidrólisis de R’-1, en este caso los resultados

son similares a los mostrados anteriormente aunque la relación Ara/Xil fue de

O.55, aspecto éste en que debemos seguir profundizando. (Ver espectros de

masas en el anexo 5).

Por otra parte, a un tiempo de retención de alrededor de 5.46 aparecen dos

picos muy unidos que no hemos podido asignar.

5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6.0

0.5

1.0

1.5

2.0(x1,000,000)

Figura 3.7. Cromatograma correspondiente al producto de hidrólisis de R’-1 TMS (negro), patrón de D-xilosa TMS (rojo) y patrón de D-Arabinosa TMS (azul).

31

Conclusiones

Conclusiones

Conclusiones:

Se estableció un procedimiento para el tratamiento de los

licores oscuros residuales (neutralización-decoloración) hasta

obtener los productos R’-1 y R’-2 de color blanco.

Utilizando el método de cromatografía gaseosa acoplada a la

espectroscopía de masas se montaron técnicas de

determinación de pentosas mediante el uso de derivados

acetilados y sililados.

Mediante el uso combinado de las técnicas de espectrometría

IR, RMN 1H y CROM-MASS se determinó en el residual ácido

(R’-1) la presencia de xilosa y arabinosa libres o formando

parte de sustancias poliméricas.

32

Recomendaciones

Recomendaciones

Recomendaciones.

Profundizar en los estudios para las determinaciones

cuantitativas de los azúcares encontrados.

Trabajar en el tamizaje de los polímeros de acuerdo a sus masas

moleculares.

Estudiar el uso de otras técnicas instrumentales en la

determinación de carbohidrato.

33

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37

Anexos

Anexos

Anexo 2

Espectro HRMN de R’-1 en DMSO

ppm (t1)0.05.0

0

50

100

150

200

250

Espectro HRMN de R’-2 en DMSO

ppm (f1)0.05.0

0

50

100

Anexos

Espectro HRMN de R’-1 en D2O

ppm (t1)0.05.010.0

0

50

100

Anexos

Anexo 2

Cromatogramas de R’-1 y R’-2 en los diferentes experimentos.

DMSO

R’-1 peracetilado

5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5

0.5

1.0

1.5

2.0

(x1,000,000)

R’-2 peracetilado

5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

(x1,000,000)

Anexos

Producto de la hidrólisis peracetilado

5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25(x1,000,000)

CHCl3

Producto de hidrólisis de R’-1 peracetilado

5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25(x1,000,000)

Anexos

TMS

Producto de hidrólisis de R’-1 TMS

5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0(x1,000,000)

Anexo 3

Espectro de Masa de R’-1 acetilado.

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.00.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

68

128

63115

6086

977873

57 103 170114 157

Anexos

Anexo 4

Espectros de masa de R’-1 (hidrolizado y acetilado) para los picos 3 (xilosa) y

5 (arabinosa)

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.00.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

68

128

115

8660

97

73 10317057 157114

63 139100 14578 87

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.00.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

12869

11586

6097

1036373

17057 11478

139 157100

Anexos

Espectro de masa del patrón de D-Arabinosa peracetilada

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.00.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

128

115

6986 170

103

9773 157636157 78 139100 145113 17187

Espectro de masa del patrón de D-xilosa peracetilada

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.00.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

128

68114

9685

102

170

1577260 9956 139

6214577 19981 1711308652 111

Anexos

Anexo 5

Espectros de masa del producto de hidrólisis de R’-1 de los picos 4

(arabinosa) y 8 (xilosa) TMS

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.00.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

73

217147 204191756959 133 245103 218117 18983 23120614389 246134 305171155 259 333291

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.00.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

73

204

147 191 21775

103 1336959 189 218206117 143 292 30516989 243 259134 33315779 231 279194

Anexos

Espectro de masa del patrón de D-xilosa TMS

50 100 150 200 250 3000.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

73

204

191 217147456940 12959 192101 14811655 305259169 22176 23189 291243 27912767 333

Espectro de masa del patrón de D-arabinosa TMS

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.00.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

73

217

191 20445 14712959 10369 192117 1485561 2158976 97 169 305243231157 259