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UNIVERSIDAD DE CONCEPCION DIRECCIÓN DE POSTGRADO

FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES-PROGRAMA DE DOCTORA DO EN CIENCIAS FORESTALES

VALIDACIÓN DE RUTAS MORFOGÉNICAS PARA LA CLONACIÓN DE RAULÍ (Nothofagus alpina (poepp. et endl.) oerst) A PARTIR DE TEJIDOS EMBRIONARIOS

Y ADULTOS.

PRISCILA NATALIA CARTES RIQUELME CONCEPCIÓN – CHILE

2012

Profesor Guía: Manuel Sánchez Olate Dpto. de Silvicultura

Facultad de Ciencias Forestales Universidad de Concepción

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UNIVERSIDAD DE CONCEPCION DIRECCIÓN DE POSTGRADO

FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES-PROGRAMA DE DOCTORA DO EN CIENCIAS FORESTALES

VALIDACIÓN DE RUTAS MORFOGÉNICAS PARA LA CLONACIÓN DE RAULÍ (Nothofagus alpina (poepp. et endl.) oerst) A PARTIR DE TEJIDOS EMBRIONARIOS

Y ADULTOS.

PRISCILA NATALIA CARTES RIQUELME CONCEPCIÓN – CHILE

2012

Profesor Guía: Manuel Sánchez Olate Dpto. de Silvicultura

Facultad de Ciencias Forestales Universidad de Concepción

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VALIDACIÓN DE RUTAS MORFOGÉNICAS PARA LA CLONACIÓN DE RAULÍ (Nothofagus alpina (poepp. et endl.) oerst) A PARTIR DE TEJIDOS EMBRIONARIOS

Y ADULTOS.

COMISIÓN EVALUADORA:

MANUEL SÁNCHEZ OLATE (Profesor. Guía)

Ing. Forestal, Dr. __________________________________

DARCY RÍOS LEAL (Profesor Co-guía)

Bióloga, Dra. __________________________________

RODRIGO HASBÚN ZAROR (Comisión evaluación)

Ing, Forestal, Dr. __________________________________

CRISTIAN GÓMEZ HERNÁNDEZ (Comisión evaluación)

Biólogo, Dr. __________________________________

DIRECTORA DE POSTGRADO:

DARCY RÍOS LEAL

Bióloga, Dra. __________________________________

DECANO FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES:

MANUEL SÁNCHEZ OLATE

Ing. Forestal, Dr. __________________________________

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DEDICADO

A Dios A mi familia y seres queridos

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AGRADECIMIENTOS

Creo que para la mayoría, el término de la Tesis Doctoral genera sentimientos encontrados, por un lado “alivio” de culminar satisfactoriamente una etapa de mucho esfuerzo e interrogantes, y “tristeza” de saber que culminan tantos momentos satisfactorios y logros obtenidos durante esta etapa. No obstante, estos momentos fueron posibles gracias al apoyo de muchas personas que me han ayudado en el desarrollo científico de mi tesis doctoral o que han sabido estar a mi lado en los momentos buenos y malos. Por ello quiero expresar mi gratitud: A Dios, quien me brindo la fuerza interior necesaria para llegar al final de este camino A mis padres Victoria y Benjamín por su confianza, cariño, apoyo y es esfuerzo constante para permitirme ser una mejor persona y profesional cada día. A mis hermanos Carlos, Cristhopher y mi abuelita Victoria por su apoyo y confianza contribuyendo a ser más grata mi vida universitaria. A Boris por su infinito amor, apoyo, compresión y compañía en este proceso. A mi amiga y socia Catherine Delaveau a quien estimo mucho y forma parte activa del término de este proceso. Proceso que no culmina hoy, ya que comenzamos juntas otro camino como amigas, empresarias e investigadoras independientes que espero se consolide con el tiempo. (Como no agradecer al doctorado de haber reunido a semejantes complementos jajja). A mis profesores tutores Manuel Sánchez y Darcy Ríos por su confianza y apoyo incondicional. Además por darme la oportunidad de comenzar a trabajar en el laboratorio de biotecnología vegetal en mi carrera de pregrado y desarrollar mis sueños en los estudios de postgrado. A la profesora Matilde Uribe y profesor Rodrigo Hasbún, por su apoyo como docentes y benefactores de mi tesis doctoral (jaja). A las secretarias y funcionarios, Patricia, Margarita, María Isabel, Blanquita, Pamela, Luchito, Guardias entre otros del Cetro de Biotecnología y de la Facultad de Ciencias Forestales de la Universidad de Concepción, por el saludo diario y por ayudarme siempre que lo necesité. En especial a la Sra Libet Alarcón por sus retos y risas o carcajadas diarias (jaja) y estar disponible siempre ayudar, no tan solo a mí, sino al que lo necesitara. No creo ser la única que la extraño en el laboratorio durante los últimos años.

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A todos mis compañeros del laboratorio de biotecnología vegetal por su paciencia y ayuda, en especial a mi “alumna-amiga” Francisca Beltrán a quien más de una vez moleste con mis exigencias y preguntas, no obstante, siempre tuvo buena disposición para ayudarme y escuchar. A CONICYT -Gobierno de Chile y la Dirección de Postgrado de la Universidad de Concepción por haber financiado mis estudios y pasantías durante el doctorado. A todos ellos que se quedan en el tintero (profesores y amigos) y no es mi intención olvidar y que sin su ayuda no habría sido posible concluir satisfactoriamente esta etapa. ………….A TODOS USTEDES GRACIAS

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ABREVIATURAS.

ABA: (±)-cis, trans-ácido abscísico.

ADN: Ácido desoxiribonucleico.

AFLPs: Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados

AIB: ácido indolbutírico.

AIA: ácido indol 3 acético.

ANA: ácido α-naftalenacético.

BAP: 6-bencilaminopurina.

BE: brote epicórmico.

BTM: Broadleaved Tree Medium.

CNE: callo no embriogénico.

2,4-D: ácido 2,4-diclorofenoxiacético.

EcoRI: Endonucleasa de digestión

ES: Embriogénesis somática

Es: embrión somático.

ESS: embriogénesis somática secundaria.

Ec: embrión cigótico.

GA3: ácido giberélico.

HPLC: cromatografía líquida de alta eficacia e Alta Resolución.

IPF: incremento en peso fresco.

MPE: masas pro-embriogénicas.

MS: Murashige y Skoog.

PCR: Reacción en cadena de la ADN polimerasa.

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INDICE GENERAL.

TEMA

INTRODUCCIÓN GENERAL………………………………………………...

CAPÍTULO 1. CUANTIFICACIÓN ENDÓGENA DE ÁCIDO

ABSCÍSICO Y ÁCIDO INDOL-3 ACÉTICO EN EMBRIONES

SOMÁTICOS Y CIGÓTICOS DE Nothofagus alpina.

…………………………………………….........................................................

CAPÍTULO 2 . REVIGORIZACIÓN DE MATERIAL ADULTO DE N.

alpina: ASPECTOS HORMONALES E HISTOLÓGICOS

…………………………………………………………………………………

CAPÍTULO 3 . COMPARACIÓN DE EMBRIONES SOMÁTICOS Y

CIGÓTICOS DE Nothofagus alpina: MADURACIÓN, MORFOLOGÍA E

HISTOLÓGIA.

…………………………………………………………………………………

CAPÍTULO 4 . ANALISIS DE VARIACIÓN SOMACLONAL EN

EMBRIONES SOMATICOS Y BROTES ADVENTICIOS ADULTOS DE

N. alpina, MEDIANTE AFLP.

…………………………………………………………………………………

DISCUSIÓN GENERAL……………………………………………………...

CONCLUSIONES……………………………………………………………..

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INDICE DE TABLAS .

TITULO TABLA:

2.1 Tratamientos de inducción organogénica.………………………………

2.2. Tratamientos de inducción rizogénica aplicados a microtallos de N.

alpina, según concentraciones de AIB y ontogenia……………………………...

3.1 Concentración de ABA aplicada en tratamientos de frío para la

maduración de embriones somáticos de Nothofagus alpina.…………………...

3.2 Reguladores del crecimiento aplicados en los tratamientos de

germinación de embriones somáticos de Nothofagus

alpina.…………………......................................................................................

4.1. Partidores selectivos de AFLPS ensayados en N. alpina……………..

4.2. Calidad y concentración promedio de ADN de material embriogénico

y organogénico de N. alpina ……………..........................................................

4.3. Número de bandas y grado de polimorfismo revelado por las

combinaciones de AFLP para embriones somáticos y brotes adventicios de

N. alpina.………………………………………………………………………

4.4. Análisis de varianza molecular (AMOVA) para embriones somáticos

y brotes adventicios de N. alpina según dos niveles jerárquicos: entre

subcultivos y dentro del subcultivo …………..………………………………

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INDICE DE FIGURAS.

TITULO FIGURA:

1.1. Diferentes aspectos de las MPE de Nothofagus alpina. A) MPE

sometidas a los tratamientos de maduración. B) MPE presentando

Embriogénesis somática secundaria. C) Embrión somático en estado

cotiledonar.………………………………….......................................................

1.2. Efecto de tratamientos con ABA sobre el Incremento en peso fresco

(IPF) de las MPE somáticos de N. alpina.……………………………………...

1.3. Efecto de tratamientos con ABA sobre la embriogénesis somática

secundaria MPE de raulí (Ess), en embriones somáticos de N. alpina ………...

1.4. Número de embriones somáticos presentando un polo caulinar y

radicular desarrollado (Plántula) y solo desarrollo caulinar …………………...

1.5. Embriones somáticos germinados y sometidos a los tratamientos de

maduración. (A) Embrión somático presentando desarrollo caulinar. (B)

Embrión somático presentando sólo desarrollo caulinar después de 3 semanas

de cultivo. (C) Embrión con desarrollo caulinar y radicular. (D) Plántula……..

1.6. Cromatogramas que indican el tiempo de retención de AIA y ABA,

según standard utilizado (a) y concentraciones de AIA y ABA obtenidas

desde muestras de embriones cigóticos inmaduros (Ei) de N.alpina (b)………

1.7. Niveles endógenos de AIA y ABA contenida en Embrión inmaduro

(Ei), Embrión cigótico maduro (Ec) y Eje embrionario (Eec) de N. alpina……

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TITULO FIGURA:

1.8. Niveles endógenos de AIA y ABA contenida, en embriones somáticos

en comparación con embriones cigóticos maduros (Ec) de N. alpina …............

2.1. Respuesta organogénica por tratamiento de inducción (I), proliferación

(P) y árbol ensayado (A)………………………………………………………..

4.2. Gramos de callo fresco, según ontogenia del árbol (BE: brote

epicórmico y copa) y concentración hormonal…………………………............

2.3. Número de brotes por gramos de peso fresco, según ontogenia del

árbol (BE: brote epicórmico y copa) y concentración

hormonal.………………………………………………………………………

2.4. Cortes histológicos longitudinales de brotes adventicios de N. alpina. A)

Callo organogénico con brotes adventicios. B) Flechas indican la formación de

brotes adventicios y zonas meristemáticas. C) Domo meristemático con activa

división celular periclinal………………………………………………………

2.5. Porcentaje de enraizamiento según ontogenia (BE: brote epicórmico y

copa) y concentración auxínica (A). Porcentaje de supervivencia en condiciones

ex vitro según ontogenia (BE: brote epicórmico y copa) y concentración

auxínica (B)……………………………………………………………………

2.6. . Respuesta rizogénica en condiciones in vitro y ex vitro según

ontogenia (BE: brote epicórmico y copa) y concentración auxínica ………….

3.1. . Efecto del frio y ABA sobre el Incremento en peso fresco (IPF) de

embriones somáticos de N. alpina ………..………………………..................

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TITULO FIGURA:

3.2. . Efecto del frio y ABA sobre la embriogénesis somática secundaria

(Ess), en embriones somáticos de N. alpina.…...................................................

3.3. Efecto de los tratamientos de germinación aplicados a los embriones

somáticos de N. alpina. A) Porcentaje de embriogénesis somática secundaria

(Ess) según tratamiento de germinación aplicado. B) porcentaje de embriones

somáticos con presencia solo caulinar. C) porcentaje de embriones somáticos

con presencia solo radicular. D) porcentaje de conversión a

plántula…………………………………………………………………………

3.4. Embriones somáticos sometidos a los tratamientos de maduración y

germinación. (A) Flechas indican embrión somático con presencia de Ess.

(B) Embrión somático presentando sólo desarrollo caulinar. (C) Embrión con

sólo desarrollo radicular. (D) Plántula.…………………………......................

3.5. Morfología e histología de estructuras embriogénicas y no-

embriogénicas.…………………………………………………………………

3.6. Escáner de estructuras embriogénicas cigóticas y somáticas de N.

alpina. A) Embrión cigótico B) Masa Proembriogénica (MPE) C) Embrión

somático en estado globular, D) Embrión somático en estado torpedo con

protuberancias globulares………………………………………………………

4.1. Análisis de Componentes Principales (PCA) representando la

variación encontrada entre los subcultivos S0: Subcultivo cero y S6:

Subcultivo 6 para embriones somáticos (A) y brotes adventicios

(B).……………………………………………………………………………..

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RESUMEN

Raulí (Nothofagus alpina ((Poepp. et Endl.) Oerst.) es considerada la principal

especie maderera del grupo de los Nothofagus y debido a su excesiva tala en bosques

naturales, ha entrado en franco deterioro, quedando escasos individuos de alto valor,

siendo imprescindible estudiar las alternativas de micropropagación y la aplicación de

herramientas biotecnológicas para la clonación de estos ejemplares.

Entre las vías de propagación vegetativa, la micropropagación permite lograr una

vía regenerativa de plantas a partir de una célula o tejido donante (rutas morfogénicas),

pero esta vía de propagación debe ser confiable, reproducible y productiva. Por lo tanto

es necesario generar un material sin variabilidad intraclonal y que sea susceptible a la

automatización. En tal sentido este estudio tiene por objetivo validar las rutas

morfogénicas, obtenidas desde material embrionario y adultos de N. alpina, a través de

análisis hormonales, histológicos y genéticos, con el fin de obtener plantas con

fidelidad clonal. El tejido embrionario o de inicio corresponde a masas

proembriogénicas de la línea embriogénica existente (Línea RaC-01), además del tejido

adulto que corresponde a yemas extraídos desde varetas forzadas a brotar in vitro

colectadas desde árboles adultos en fase madura o reproductiva.

Los resultados histológicos y hormonales obtenidos desde el material adulto

indican presencia de brotes adventicios de origen multicelular, vía organogénesis

indirecta, es decir, a partir de la formación de células indiferenciadas (callo) con un alto

grado de proliferación de brotes por callo organogénico. Por otro lado, la aplicación de

acido abscísico al medio de cultivo aumentó significativamente el número de embriones

somáticos germinados lo que permite optimizar el proceso de conversión a planta de

embriones somáticos. A su vez, mediante AFLP se pudo comprobar fidelidad clonal en

la línea embriogénica y determinar el grado de variación somaclonal presente en brotes

adventicios de material adulto. Estos resultados aportan información valiosa para

desarrollar a futuro protocolos eficaces que permitan la multiplicación confiable de

genotipos selectos de raulí.

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ABSTRACT.

Raulí (Nothofagusalpina ((Poepp. etEndl.) Oerst.)is considered the main timber

species of Nothofagus group and due to excessive logging in natural forests, has entered

deteriorating, leaving few high-value individuals, being essential to study micropropagation

alternatives and application of biotechnology tools for cloning these species.

Vegetative propagation like micropropagation can achieve plants from a cell or a

donor tissue (morphogenic routes), but this way must be reliable, reproducible and

productive. Therefore it is necessary to generate a material without intraclonal variability

and which is susceptible to automation. The aim of this study is validate morphogenic

routes, obtained from embryonic and adult materials of N. alpina through hormonal

analysis, histological and genetic to obtain fidelity clonal plants. The embryonic tissue or

proembryogenic masses correspond to embryogenic existing line (Line RaC-01). The adult

tissue belongs to sprout buds forced in vitro collected from mature or reproductive adult

trees.

The results obtained from histological and hormonal adult material indicates the

presence of adventitious shoots from multicellular origin, via indirect organogenesis from

undifferentiated cell formation (callis) with a high proliferation degree of organogenic

callus buds. On the other hand, application of abscisic acid to the culture medium

increasedsignificantly the number of somatic embryos germinatedwhich optimizes the

changefrom somatic embryos into a plant. In turn, by AFLP it was found embryogenic

clonal fidelity and the somaclonal variation degree of adult adventitious shoots was

determined. These results provide valuable information to develop future protocols

multiplication of selected genotypes of raulí.

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INTRODUCCION GENERAL

Raulí, Nothofagus alpina ((Poepp. et Endl.) Oerst, (= N. nervosa,= N. procera) es una especie

de la familia Nothofagáceae y una de las diez especies del género Nothofagus que vegetan en

Chile, distribuyéndose a lo largo de la Cordillera de la Costa desde la región del Bío Bío (río

Itata, 36º 30’ S) hasta la región de Los Lagos (provincia de Llanquihue, 41ºS), y a través de la

Cordillera de los Andes desde la región del Maule (provincia de Curicó, 35º S) hasta la región

de Los Ríos (Valdivia, 40º 30’ S). Su nicho altitudinal se sitúa entre los 300 y los 1.200

m.s.n.m, especialmente en laderas interiores y en valles cordilleranos (Donoso et al., 2006).

Esta especie, junto con otros Nothofagus, tales como roble y coigüe, es componente principal

de variados tipos forestales del bosque nativo chileno. Raulí presenta cualidades madereras

que lo han hecho muy solicitado para, entre otros usos, la construcción y mueblería (Loewe et

al., 1997). El empleo de la madera de raulí va muy de la mano con el establecimiento de

asentamientos poblacionales en el centro y sur de Chile en los siglos XIX y XX (Burschel et

al., 1976; Grosse y Quiroz, 1998). Esta demanda histórica, sumado a la ausencia de políticas

claras para la extracción de madera de la especie, ha provocado una merma alarmante en su

existencia como componente fundamental del bosque nativo templado, tanto en su cantidad y

distribución, como en la calidad de los individuos hoy existentes (INFOR, 1996).

Además, la propagación de N. alpina presenta dificultades que radican en características

intolerantes de la especie, mediante siembra directa, sólo es exitosa en lugares donde el suelo

mineral se encuentra expuesto a la luz (Donoso y Lara 1995; Loewe et al., 1997), sumado a la

baja viabilidad de las semillas, periodicidad en la producción de semillas (alta producción en

ciclos cortos de 2 a 3 años) y ataque de insectos, factores que dificultan el desarrollo de esta

especie (Burschel et al., 1976).

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Por esta razón, con la promulgación de la Ley de Recuperación del Bosque Nativo y Fomento

Forestal que pretende incentivar el manejo de bosques naturales y de plantaciones con

especies nativas, se precisa de información respecto de los métodos de regeneración y

multiplicación de las distintas especies que conforman estos bosques

Considerando las actuales demandas de la sociedad por productos y servicios procedentes del

bosque, raulí se constituye como una fuente de diversificación de la producción forestal

(Cabrera, 2000). Lo anterior queda avalado por el potencial de producción que poseen los

renovales de raulí, las características tecnológicas de su madera, así como por sus hábitos y

potencial de crecimiento similares a los que presentan especies exóticas como Pinus radiata,

características que la convierten en una especie apta para ser establecida y manejada bajo

regímenes de silvicultura clonal, en esquemas de manejo similares a los aplicados hoy en pino

y eucalipto (Ipinza y Gutíerrez, 2000; Sabja et al., 2008). Sin embargo, por tratarse de

esquemas de manejo en etapas iníciales (Gezan et al., 2007), aun no existe un flujo continuo

en abastecimiento y calidad, lo cual ha impedido generar una demanda industrial rentable y

sostenible en el tiempo.

PROPAGACION CLONAL DE NOTHOFAGUS ALPINA

Las diversas técnicas de propagación vegetativa, ya sea in vitro o ex vitro, ofrecen la ventaja

común de transferir toda la ganancia genética desde el árbol donante hacia la descendencia. La

totipotencia de las células vegetales, mediante un manejo adecuado, hace posible la generación

de diversos órganos de una planta, para obtener de esta manera un individuo completo,

genéticamente idéntico al material de origen (Márgara, 1988; Pierik, 1990). Es así como

mediante la clonación de material seleccionado, se han obtenidos logros con los cuales se han

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duplicado las ganancia genéticas respecto al mejoramiento por vía sexual (Sánchez-Olate et

al., 2005).

Pese a las múltiples ventajas de las técnicas de propagación vegetativa, se pueden mencionar

algunas trabas que se oponen muchas veces al éxito de un esquema de propagación a nivel

operacional (Orellana, 1998). La dificultad para generar raíces funcionales que permitan el

desarrollo de la planta, adecuada aclimatación a las condiciones de vivero y establecimiento en

terreno, clonación de material adulto por pérdida de la capacidad regenerativa y competencia

morfogénica, son algunas de ellas (Fraga et al., 2002). No obstante, clonar individuos adultos

nos permite conocer ciertas características de interés como calidad de los frutos, volumen y

calidad de la madera lo que hace interesante su propagación mediante técnicas de

revigorización (Rodríguez et al., 2005).

En N. alpina se han obtenido modestos resultados en enraizamiento adventicio a partir de

material juvenil mediante macroestacas (Santelices, 1993), por lo cual ha sido necesaria la

revigorización del material a emplear, mediante la aplicación de técnicas de

micropropagación, a partir de la cual se han obtenido resultados auspiciosos en embriogénesis

somática, rescate de embriones y organogénesis adventicia a partir de material juvenil (Jordan

et al., 1996; Martinez-Pastur y Arena, 1996; Castellanos et al., 2005).

Los tejidos de individuos juveniles poseen cierta facilidad de ser propagados a diferencia de

individuos adultos o los que ya han experimentado el cambio de fase (Rodríguez et al., 2005),

no obstante aún no pueden ser evaluadas sus características fenotípicas (Greenwood, 1995;

Fraga et al., 2002). Por lo tanto, el éxito de la micropropagación va a depender de la facilidad

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que presentan los individuos para propiciar la desdiferenciación de sus tejidos o del grado de

madurez en la que se encuentren.

REJUVENECIMIENTO Y /O REVIGORIZACIÓN DE NOTHOFAGUS ALPINA,

MEDIANTE CULTIVO IN VITRO.

La capacidad morfogénica o facilidad con que cuentan los individuos para propiciar la

desdiferenciación de sus tejidos va a depender del grado de madurez o fase de desarrollo en la

que se encuentren; es decir, los tejidos de individuos juveniles poseen cierta facilidad de ser

propagados, no obstante aún no pueden ser evaluadas sus características fenotípicas

definitivas, a diferencia de individuos adultos o los que ya han experimentado el cambio de

fase (Greenwood, 1995; Fraga et al., 2002). Los procesos de desdiferenciación en cultivo in

vitro están influenciados por la exposición de los tejidos a reguladores del crecimiento vegetal

(auxinas y citoquininas principalmente) que permiten la división y elongación celular

(Margara, 1988; Azcon y Talón, 2000).

Normalmente, se consideran dos aspectos del envejecimiento vegetal o madurez: a) el

envejecimiento cronológico, que se expresa en cambios morfológicos paralelos a la pérdida de

competencia morfogénica, la que aumenta con el tiempo a medida que se desarrolla el ciclo

vital de un individuo. Por otro lado, b) el envejecimiento fisiológico, que hace referencia a

cambios intrínsecos y específicos originados por un incremento de la complejidad de la planta

o árbol. En la actualidad, ambos son relacionados al envejecimiento ontogénico (Rodríguez et

al., 2005)

Algunos autores plantean que el desarrollo ontogénico en leñosas abarca varias etapas,

caracterizadas por la expresión de diferentes competencias morfogénicas (Greenwood, 1995;

Hasbún, 2006; Valledor et al., 2007).

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i) Fase embrionaria, comienza con la formación del eje embrionario a partir del cigoto y

finaliza con la maduración del embrión que se mantiene en dormición hasta su

germinación.

ii) Fase juvenil, a partir de la germinación del embrión hasta la adquisición de la

capacidad de floración tras el cambio de fase juvenil-adulto.

iii) Fase adulta reproductiva, determinada principalmente por la adquisición y

mantenimiento de la capacidad de floración.

Mediante la aplicación de técnicas de micropropagación en individuos adultos, es posible,

recuperar el vigor característico de etapas juveniles sin que medie reproducción sexual para la

revigorización in vivo o in vitro del material adulto. Sin embargo, en este caso no se debe

hablar de rejuvenecimiento total sino de revigorización, la recuperación total de las

características juveniles, fenómeno denominado rejuvenecimiento, implicaría la reversión

completa del proceso de maduración (Fraga et al., 2002) simulando la reproducción sexual

(Pennel y Bell, 1987) y lograda en cultivo de tejidos vegetales a través de la embriogénesis

somática (Pierik, 1990).

Embriogénesis somática

A comienzos del siglo XX Haberlandt predijo que si todas las células de un organismo tenían

la misma información genética que la célula inicial, el cigoto, sería posible una «marcha atrás»

en su expresión génica, de tal forma que volvieran a expresar el patrón de desarrollo

embriogénico hasta formar auténticos embriones de origen somático, expresando la

totipotencia celular. Esta posibilidad se verificó en células del parénquima de raíz de zanahoria

20

a finales de los años 50, y desde entonces se ha ampliado a cientos de especies diferentes

(Celestino et al., 2005)

Entre las estrategias de mejoramiento y propagación masiva, la embriogénesis somática es

considerada por algunos autores como la vía más poderosa de micropropagación (Bueno y

Manzanera, 1992; Mauri et al., 2001; Cevallos et al., 2002; Celestino et al., 2005). Esta vía de

regeneración tiene su origen en células somáticas de la planta donante las cuales se

“reprograman” y siguen un patrón de desarrollo idéntico al del embrión de origen cigótico

(bipolar) sin conexión con el tejido materno, pero conservando el genotipo de la planta

donadora (Merkle y Dean, 2000; Mauri et al., 2001).

La embriogénesis somática, presenta ventajas como su elevado potencial de multiplicación en

cultivo semisólido, líquido o en biorreactores, la opción de aplicar técnicas de encapsulación

para fabricar semillas sintéticas y la posibilidad de utilizar los cultivos embriogénicos como

dianas adecuadas para la transformación genética (Celestino et al., 2005).

En el proceso de embriogénesis somática la maduración de los embriones es el problema

principal, debido a que la mayoría de los embrioides necesitan de la aplicación de agentes

inductores de maduración, que permitan un completo desarrollo hasta su conversión a planta

(Corredoira et al., 2003; Miguel et al., 2004). En general, se busca obtener una producción

sincrónica y de calidad de los embriones; es decir, que se asemejen o tengan un desarrollo

similar a los embriones cigóticos (Ec) maduros de la especie (Celestino et al., 2005).

Organogénesis (caulogénesis adventicia)

La organogénesis es una vía eficaz para la propagación de genotipos seleccionados y, a

diferencia de la embriogénesis somática, presenta un desarrollo unipolar a partir de un

primordio o brote vegetativo, existiendo siempre una conexión con el tejido materno o callo

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(organogénesis indirecta) (Jiménez, 1998). Diversos estudios señalan que tejidos iníciales de

origen embrionario (cotiledones y eje embrionario) reaccionan con mayor facilidad para

generar embriogénesis somática (Bueno y Manzanera, 1992; Fernández et al., 1997; Onay,

2000; Mauri et al., 2001; Zegzouti et al., 2001; Cangahuala et al., 2007). No obstante, tejidos

adultos más diferenciados como pecíolos, yemas y hojas generalmente siguen una ruta

organogénica generando una estructura caulinar y/o rizogénica (Lara et al., 2003; Concepción

et al., 2004; Larson et al., 2006).

Independiente de la ruta morfogénica a seguir, existen limitaciones dentro de sus etapas de

desarrollo que pueden explicarse por condiciones de cultivo, genotípicas y ontogénicas entre

otras (Orellana, 1998). Para obtener plantas completas y viables en condiciones ex vitro, la

caulogénesis adventicia necesita pasar por una fase de enraizamiento que es clave para tener

éxito en este sistema de propagación (Gómez et al., 2007).

CERTIFICACIÓN CLONAL DE NOTHOFAGUS ALPINA, MEDIANTE

MARCADORES MOLECULARES.

¿Clonación y estabilidad genética?

Las diferentes rutas morfogénicas utilizadas como sistema de propagación en cultivos de

tejidos, suponen una rápida sucesión de divisiones celulares, durante las cuales las

microplantas en desarrollo están sometidas a una amplia variedad de situaciones estresantes

(Larkin y Scowcroft, 1981). Estas condiciones con frecuencia afectan la estabilidad del

genoma, con lo cual es posible obtener variación de origen nuclear y/o citoplasmática, por lo

tanto, encontrar individuos fenotípicamente y/o genéticamente distintos a la planta madre

(Smýkal et al., 2007), los cuales podrían ser inducidos por las condiciones de cultivo, aunque

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las causas más comunes de variación se asocian a modificaciones en el ADN o cambios

epigenéticos que podrían ser útiles en programas específicos de mejora, pero en la clonación

de individuos la variación de cualquier tipo es indeseada (Phillips et al., 1994; Rani y Raina,

2000). Este fenómeno se denomina “variación somaclonal” y se define como la variación

fenotípica y genética entre plantas propagadas clonalmente a partir de un clon donador simple

(Larkin y Scowcroft, 1981; Medina et al., 2007).

El cultivo de tejidos vegetales in vitro, como proceso de producción de plantas conlleva una

serie de riesgos que implica generar a corto o largo plazo individuos fenotípicamente y/o

genéticamente distintos a la planta madre. Por lo tanto, antes que las diferentes rutas

morfogénicas puedan ser explotadas como sistemas de propagación masivos, es necesario

evaluar mediante el uso de marcadores moleculares, los regenerantes no fieles al genotipo,

previo a su manifestación fenológica (Merkle y Dean, 2000; Botta et al., 2004).

Un marcador molecular es cualquier fenotipo molecular que proviene de la expresión de un

gen o de segmentos específicos de ADN, que puede ser detectado y su herencia monitoreada.

En un cruzamiento genético, las características de interés seguirán generalmente unidas a los

marcadores moleculares. Por lo tanto, se pueden seleccionar individuos en los que el marcador

molecular esté presente (Semagn et al., 2006) También son utilizados para detectar la

variación somaclonal con gran precisión y en menos tiempo que los análisis fenotípicos

(Medina et al., 2007).

A pesar de su importancia ecológica y económica dentro de las especies nativas, aún son

pocos los estudios moleculares (Marchelli et al., 1998; Mattioni et al., 2002), filogenéticos

(Hill y Jordan, 1993; Manos, 1997; Setoguchi et al., 1997) y de variación genética entre

23

poblaciones mediante marcadores genéticos isoenzimaticos que se han llevado a cabo en

especies del género Nothofagus (Marchelli y Gallo, 2000a, b; Gallo et al., 2006).

Marcadores como los RAPD (Amplificación aleatoria de fragmentos polimórficos de DNA) e

ISSR (Inter-microsatelites) han sido utilizados en la caracterización de N. nervosa, N. obliqua

y N. dombeyi, evaluado el grado de polimorfismo generado y la detección de polimorfismos en

el inter-loci, utilizando un cebador diseñado a partir de dinucleótido o trinucleótidos de

secuencia repetitiva (Mattioni et al., 2002). Sin embargo, no se reportan estudios de su

aplicación en detección de variación somaclonal en N. alpina, a pesar de que sí han sido

utilizados en otras especies y particularmente, durante embriogénesis somática de Quercus

robur (Wilhelm et al., 2005).

Los RAPDs, polimorfismos derivados de amplificación aleatoria de PCR de sitios específicos

e identificables del ADN, han mostrado ser una herramienta efectiva para detectar variación

somaclonal en un gran número de especies (Hashmi et al., 1997; Santana et al., 1999;

Linacero et al., 2000), sin embargo, algunos estudios los han reportado como problemáticos y

poco claros en comparación con otros marcadores como los AFLPs (Polimorfismo de

Longitud de los Fragmentos Amplificados), al momento de detectar variación somaclonal

(Fourré et al., 1997). Los AFLPs, permiten la identificación de un gran número de

polimorfismos con respecto a otras técnicas como los RFLPs (polimorfismos de longitud de

fragmentos de restricción) o los RAPDs (Gonzaga, 2004). Consisten en polimorfismos

derivados de la digestión de ADN genómico, ligación de pequeños oligonucleótidos a los

extremos de corte y amplificación utilizando iniciadores homólogos al adaptador. Es una

técnica relativamente fácil de ejecutar, es reproducible y utiliza pequeñas cantidades de ADN

(Medina et al., 2007).

24

Visto así, todas estas herramientas biotecnológicas, son hoy una realidad en varias especies y

pueden ser aplicadas para rescatar lo mejor de la micropropagación en N. alpina, de manera de

experimentar un salto definitivo desde la eterna promesa de ésta especie con potencial

silvícola, hacia la consolidación como alternativa real con aplicación industrial en el sector

forestal. Sin embargo, y tal como se analiza en los apartados anteriores, es necesario disponer

de metodologías eficaces que permitan la multiplicación de árboles juveniles y adultos de

manera de prever de un modo fiable el comportamiento de los individuos propagados

(Rodríguez et al., 2005; Sánchez-Olate et al., 2005).

HIPÓTESIS

Debido a lo expuesto anteriormente, en esta Tesis Doctoral se postula las siguientes hipótesis

de trabajo:

a) La maduración de los embriones somáticos, regulada por condiciones hormonales es

determinante para obtener plantas in vitro, y mediante la técnica molecular AFLP es

posible determinar su fidelidad clonal.

b) La respuesta morfogénica de material adulto implica revigorización y está regulada

por condiciones hormonales que permiten obtener plantas in vitro, y mediante la

técnica molecular AFLP es posible determinar su fidelidad clonal.

OBJETIVO GENERAL

Estudiar el efecto ontogénico y validar las rutas morfogénicas, obtenidas desde material

embrionario y adultos de N. alpina, a través de análisis hormonales, histológicos y genéticos,

con el fin de obtener plantas con fidelidad clonal.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

25

1. Evaluar el efecto de ABA exógeno sobre la maduración de embriones somáticos en

comparación con niveles endógenos de embriones somáticos y cigóticos de Nothofagus

alpina

2. Establecer metodologías de cultivo in vitro de material adulto evaluando tipo de tejido a

introducir y respuesta de inducción morfogénica (organogénesis y/o embriogénesis

somática).

3. Caracterización histológica de los estados embriogénicos y respuestas morfogénicas

obtenidas, para determinar revigorización y/o rejuvenecimiento del material adulto.

4. Evaluar la estabilidad genética de las líneas morfogénicas obtenidas a través de la técnica

molecular AFLP.

26

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34

CAPITULO 1

CUANTIFICACIÓN ENDÓGENA DE ÁCIDO ABSCÍSICO Y ÁCIDO INDOL-3

ACÉTICO EN EMBRIONES SOMÁTICOS Y CIGÓTICOS DE Nothofagus alpina

(Poepp. & Endl.) Oerst.

Priscila Cartes Riquelme1*, Darcy Rios Leal1, Kátia Sáez Carrillo1, Matilde Uribe Moraga1, Sofia

Valenzuela Aguilar1, Stephen Joseph Bolus2, Manuel Sánchez Olate1

1Universidad de Concepción, Facultad Ciencias Forestales, Casilla 160-C, Concepción, Chile. *Autor para correspondenciar (pcartes.r@gmail.com). 1Universidad de Concepción, Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas, Av. Esteban Iturra s/n - Barrio Universitario, Concepción, Chile. 2Clemson University, Department of Biochemistry, 100 Jordan Hall Clemson, SC 29634 USA.

RESUMEN

El acido abscísico (ABA) y el ácido indol 3 acético (AIA) participan en el proceso de

propagación de plantas mediante embriogénesis somática, ya que permiten la diferenciación

de la estructura polar del embrión, órganos y regiones meristemáticas de éste. En este estudio

se llevó a cabo un ensayo de maduración de masas proembriogénicas en estado cotiledonar

con la adición de diferentes concentraciones de ABA exógeno para luego comparar niveles

endógenos de ABA y AIA en embriones somáticos (Es) y cigóticos (Ec) de Nothofagus

alpina, previa determinación de niveles endógenos entre embrión cigótico inmaduro, embrión

cigótico maduro y eje embrionario aislado desde el embrión maduro. La cuantificación se

realizó mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC). Los tratamientos de

maduración estudiados incrementan los niveles endógenos de ABA en Es no existiendo

diferencias significativas entre las diferentes concentraciones estudiadas. Al comparar los

niveles de ABA y AIA endógeno entre Es sometidos a los diferentes tratamientos de

maduración y los embriones cigóticos maduros de N. alpina, se observan niveles

significativamente mayor en los Ec. La aplicación de ABA exógeno al medio de cultivo

35

aumentó significativamente el número de embriones somáticos germinados lo que permite

optimizar el proceso de conversión a planta de embriones somáticos de raulí.

Palabras clave: embriogénesis somática, maduración, germinación, ácido abscísico.

ABSTRACT

Abscisic acid (ABA) and indole-3-acetic acid (IAA) participate in the propagation of plants by

somatic embryogenesis, causing polar structural differentiation of the embryo. The goal of the

assay was to compare endogenous levels of ABA and IAA between somatic embryos (SE) and

zygotic embryos (ZE) of N. alpina. In this study, a somatic embryo maturation assay involving

the addition of varying concentrations of exogenous ABA was performed on cotyledonary-

stage of Nothofagus alpina (Poepp. & Endl.) Oerst. Furthermore, the endogenous levels of

ABA and IAA were quantified in the immature ZE, the mature ZE, and the embryonic axis of

a mature embryo of N. alpina. The current study utilized high performance liquid

chromatography (HPLC) for quantification. The maturation treatments performed did not

present significant differences in the endogenous ABA levels in SE. However, significant

differences did exist in the levels of ABA and IAA between SE submitted to the different

maturation treatments and mature ZE of N. alpina. The application of exogenous ABA to the

culture medium increased endogenous ABA levels, therefore, increasing the number of

germinated somatic embryos. Thus, the plant conversion process was also successfully

completed in somatic embryos of N. alpina.

Keywords: Somatic embryogenesis, maturation, germination, HPLC.

36

INTRODUCCION

Nothofagus alpina (Poepp. et Endl.) Oerst, raulí, es una de las especies integrantes del bosque

nativo con mayor potencial de uso comercial por su rápido crecimiento y calidad de su madera

(Gutiérrez 2000). En la actualidad ésta especie cobra gran importancia como factor de

diversificación de la producción forestal. Sin embargo, el deterioro y reducción dramática de

su superficie por la implementación de sistemas agroganaderos y sustitución por plantaciones

con especies exóticas de rápido crecimiento (Donoso y Lara 1995) establecen la necesidad de

aplicar herramientas biotecnológicas, con el fin de potenciar caracteres y cualidades internas

de las plantas que aumenten la productividad y sostenible del recurso en el tiempo (Pérez

1998).

Entre las técnicas de propagación masiva, la embriogénesis somática es considerada por

algunos autores como la vía más poderosa de micropropagación basada en el cultivo de tejidos

vegetales in vitro (Cevallos et al. 2002). Esta vía de regeneración tiene su origen en células

somáticas de la planta donante las cuales se “reprograman” y siguen un patrón de desarrollo

idéntico al del embrión de origen cigótico, conservando el genotipo de la planta donadora

(Merkle y Dean 2000; Celestino et al. 2005).

En raulí se ha logrado obtener embriones somáticos a partir de semilla madura, previa

generación de masas proembriogénicas condicionado por la aplicación de altas dosis de

auxinas y citoquininas en la fase de inducción. La multiplicación y mantenimiento de la línea

clonal se ha realizado mediante embriogénesis somática secundaria (Ess), la cual es

aparentemente ilimitada en el tiempo y proporciona un potencial multiplicativo a esta técnica

(Castellanos et al. 2005).

37

En el proceso de embriogénesis somática la maduración deficiente de los embriones es el

problema principal, por lo tanto es necesaria la aplicación de tratamientos de maduración que

permitan el desarrollo de los embriones a etapas posteriores (Corredoira et al. 2003; Miguel et

al. 2004). En general, se busca obtener una producción sincrónica y de calidad de los

embriones; es decir, que se asemejen o tengan un desarrollo similar a los embriones cigóticos

(Ec) maduros de la especie (Celestino et al. 2005).

Se han reportado numerosas similitudes morfológicas y bioquímicas entre un proceso

embriogénico de origen somático y cigótico (Tereso et al. 2007). Sin embargo, se presentan

diferencias encontradas principalmente en el proceso de desarrollo y maduración de los

embriones somáticos, por lo tanto, generalmente deben practicarse secuencias de cultivo que

incluyan una fase que promueva la maduración de embriones somáticos, previo a la

germinación, simulando el proceso cigótico (Palada-Nicolau y Hausman 2001).

En general, los estudios señalan al ácido abscísico (ABA) como el regulador principal de la

maduración de embriones somáticos (Es), observando un efecto positivo en el control de la

Ess en Quercus suber (García–Martin et al. 2005) y la acumulación de sustancias de reserva

(Gupta y Grob 1995).

El desarrollo de la semilla consta de tres fases; embriogénesis o fase temprana, maduración o

fase media y desecación o fase tardía, dentro de estas fases el ABA juega un papel

fundamental (Azcon y Talón 2000). Tanto en la embriogénesis somática como cigótica el

incremento en los niveles de ABA al principio y durante la etapa media del desarrollo de la

semilla controla y regula la síntesis de proteínas implicadas en la tolerancia a la desecación.

38

Estas proteínas son abundantes en los estados medios y avanzados de las semillas acumulando

ARNm que codifican proteínas de reserva conocidas como proteínas LEA (Late–

embryogenesis-abundant) (Dodeman et al. 1997; Azcon y Talón 2000; Finkelstein et al. 2002;

Von Arnold et al. 2002; Pandey et al. 2008).

Algunos estudios señalan al ácido indol 3-acético (AIA) como un factor importante para

describir el comportamiento que presenta el ABA en el proceso de embriogénesis. La

biosíntesis de AIA aumenta durante el desarrollo del embrión cigótico hasta llegar a la fase de

maduración temprana (Von Arnold et al. 2002). Sin embargo, Hansen y Grossman (2000)

reportan que la auxina puede inducir la síntesis de novo de ABA endógeno en Galium aparine.

En este sentido, Miller et al. (1994) postulan que la diferencia de desarrollo observada entre Es

y Ec, expresada en las tasas de germinación, debería atribuirse a la falta de señales maternales

por parte del tejido somático, las que permitan la síntesis de novo de ABA y de otros

reguladores necesarios para el desarrollo, lo cual es un aspecto clave en la fase de maduración

del embrión.

De acuerdo a lo anterior, este estudio tiene como objetivo evaluar el efecto de la aplicación de

ABA exógeno, sobre la maduración de embriones somáticos en comparación con niveles de

ABA endógenos de embriones somáticos y cigóticos maduros de N. alpina, con el fin de

obtener embriones somáticos de calidad para la germinación.

39

MATERIALES Y MÉTODOS. Material vegetal.

Se empleó material vegetal procedente de la línea embriogénica de N. alpina RaC-01 (raulí

explanto cotiledonar 01), inducida desde cotiledones aislados de semillas maduras, las cuales

fueron obtenidas a través de polinización controlada (Castellanos et al. 2005). Luego de la

inducción de callo embriogénico y manifestación de embriones somáticos, el cultivo se

dispuso en medio de mantención, consistente en la solución mineral y vitaminas Broadleaved

Tree Medium (BTM) (Chalupa 1983), más los reguladores del crecimiento 6-

bencilaminopurina (BAP) y ácido indolbutírico (AIB) a concentraciones de 0,1 mgL-1

suplementado con 30 gL-1 de sacarosa y 7,0 gL-1 de agar. Se practicaron subcultivos a medio

fresco cada 28 días, los subcultivos en medio nutritivo se alternaron conteniendo reguladores

del crecimiento y en medio base BTM, sin reguladores. Los explantos permanecieron en estas

últimas condiciones hasta el comienzo de los ensayos.

Material de inicio.

El material de inicio para cada uno de los ensayos de maduración consistió en masas pro-

embriogénicas (MPE) de la línea clonal RaC-01, con presencia de embriones somáticos en

estado cotiledonar. Se seleccionaron MPE, cuyo peso fresco al inicio de los tratamientos de

maduración fuera entre a 40 -70 mg. El peso fresco inicial de cada explanto fue registrado.

Para la cuantificación de ABA se extrajo desde semillas colectadas durante el mes de

diciembre, el embrión inmaduro y de semillas colectadas durante el mes de marzo, el embrión

maduro. Además para evaluar el almacenamiento de ABA dentro del embrión maduro se aisló

40

el eje embrionario y los cotiledones, con el fin de obtener el mejor parámetro al comparar los

niveles endógenos de ABA entre embriones somáticos y cigóticos.

Ensayo de Maduración de Embriones somáticos

Se llevaron a cabo cuatro tratamientos de maduración con la aplicación de ABA al medio de

cultivo incluyendo al testigo en concentraciones de 0, 2, 3 y 5 mgL-1 (T1, T2, T3 y T4,

respectivamente). En todos los casos, se empleó la solución mineral BTM como medio base,

más 60 gL-1 de sacarosa y 7,0 gL-1 de agar. El cultivo se mantuvo en oscuridad continua a una

temperatura de 25 ± 1ºC de día y 22 ± 1ºC de noche. Después de tres semanas de cultivo se

procedió a evaluar el incremento en peso fresco (IPF) de las MPE, registrando el peso final.

Además se evalúa presencia de embriogénesis somática secundaria (Ess) por cada tratamiento.

Ensayo de Germinación de Embriones somáticos

Posterior a la fase de maduración, se procedió a subcultivar las MPE en BTM base sin

reguladores del crecimiento, por un periodo de tres semanas. Luego se procede a la fase de

germinación, aislando 10 muestras al azar de MPE sometidos a los tratamientos de

maduración, se procura dejar en la MPE embriones somáticos en estado cotiledonar y luego

son cultivados en medio BTM con los macronutrientes diluidos a un 25% (v/v), suplementado

con 30 gL-1 de sacarosa, 7,0 gL-1 de agar y 0,1 mg l-1 GA3, ésta última fue esterilizada

mediante filtración y aplicada al medio después de ser autoclavada a 121ºC y 1 atmósfera de

presión, durante 20 min. El cultivo se mantuvo durante los primeros 7 días en oscuridad y

posteriormente bajo condiciones de fotoperíodo de 16 h, temperatura de 25 ± 1ºC en el día y

22 ± 1ºC en la noche, durante tres semanas.

Cuantificación de ABA y AIA.

41

Extracción de ABA y AIA

La extracción de ABA y AIA libre se realizó según la metodología propuesta por Valenzuela

et al. (1998) con algunas modificaciones. Para realizar la comparación de niveles endógenos

de ABA entre embriones somáticos y cigóticos se tomaron como muestra 100 mg de tejido

fresco para embriones cigóticos maduros (Ec), embriones cigóticos inmaduros (Ei), eje

embrionario aislado desde el embrión maduro (Eec). Luego se cuantificaron los niveles de

ABA y AIA de embriones somáticos (Es) en estado cotiledonar de N .alpina aislados desde las

MPE sometidas a los diferentes tratamientos de maduración.

El tejido fue homogenizado en nitrógeno líquido y resuspendido en 10 ml de metanol al 80%

(v/v) en agitación constante de 150 rpm a 4°C durante 12 h. Posteriormente las muestras

fueron filtradas con papel hidrofóbico de 0,22 µm de porosidad y el extracto concentrado en

rotavapor a 50 °C para eliminar el metanol. Luego se agregaron 5 mL de agua des-ionizada y

se ajustó el pH a 2.0 para realizar una nueva extracción con 10 mL de acetato de etilo, la cual

fue repetida tres veces formando una fase acuosa que contenía ABA y AIA conjugado y otra

orgánica que contenía ABA y AIA libre. Nuevamente las muestras de la fase orgánica (ABA y

AIA libre) fueron concentradas en rotavapor a 50°C hasta obtener un residuo completamente

seco. Finalmente el residuo fue resuspendido en 300 µl de metanol absoluto y mantenido en

frío (-80°C) hasta la cuantificación.

Calibración de la curva Standard de ABA y AIA

Para realizar la curva standard de ABA y AIA se preparó una solución de ABA Sigma® y AIA

Merk® con un 99% de pureza a una concentración de 25 µg mL-1. Para la calibración de la

42

curva se prepararon diluciones sucesivas de 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 µg mL-1 de ABA y 0.5, 1.0, 1.5

y 2.5 µg mL-1 de AIA.

Cuantificación de ABA y AIA mediante HPLC.

El extracto resuspendido en 300 µL de metanol absoluto en la fase de extracción fue filtrado

en papel hidrofóbico de 0,22 µm para luego realizar la cuantificación en HPLC Shimadzu con

detector arreglo de diodo SPD- M 10 A vp, sistema controlador SCL-10 AVP y bomba FCV-

10 AL vp. ABA y AIA fueron separados mediante BioRad HPLC columna RP -18

Lichrospher® 100 (250 mm) a una temperatura de 30 °C con un flujo de 0,8 mL min-1.

Finalmente fueron comparados los cromatogramas obtenidos desde la cuantificación de las

muestras con los cromatogramas de los standard de ABA y AIA.

Variables Evaluadas

Para la fase de maduración se registró el peso inicial y final de las MPE sometidas a los

tratamientos de maduración (Figura 1.1 A), obteniendo el incremento en peso fresco (mg) al

cabo de tres semanas de cultivo. Además se evaluó por tratamiento la incidencia de

embriogénesis somática secundaria (Ess) (Figura 1.1 B) expresada en porcentaje (%). La fase

de germinación de Es en estado cotiledonar (Figura 1.1 C), se evaluó al cabo de cuatro

semanas

Como la germinación de embriones somáticos se ve alterada por las condiciones de cultivo

(inducción y maduración de los embriones) se presentan diferentes grados de germinación o

desarrollo a plántula. Para ello se utilizó una adecuación de los criterios de clasificación de la

germinación de Es descrita por (Vahdati et al. 2008), por lo cual se evaluó la germinación

según:

43

- Solo presencia caulinar

- Solo presencia radicular

- Presencia caulinar y radicular (plántula)

Figura 1.1 Diferentes aspectos de las MPE de Nothofagus alpina. A) MPE sometidas a los tratamientos de maduración. Barra 2 mm B) MPE presentando Embriogénesis somática secundaria. Barra 5 mm C) Embrión somático en estado cotiledonar. Barra 2 mm. Diseño Experimental.

En todos los casos se estableció un diseño experimental completamente aleatorio. En la etapa

de maduración, la unidad experimental estuvo constituida por una placa petri de 9 cm de

diámetro, conteniendo 6 MPE. En fase de cuantificación de ABA y AIA se realizaron 3

extracciones por tratamiento de maduración, Ec, Ei y Eec.

Del mismo modo, en la fase de germinación, la unidad experimental estuvo constituida por un

tubo de ensayo conteniendo MPE con embriones somáticos en estado cotiledonar. Se

realizaron 10 réplicas por tratamiento.

En todos los casos, los efectos de los tratamientos se evaluaron mediante ANDEVA, seguido

del test de Tukey al nivel p≤0,05 para comparar medias en fase de maduración. Previo al

A B C

44

análisis, los datos de cuantificación para ABA fueron transformados mediante la raíz

cuadrada; sin embargo, en los resultados se muestran los datos originales sin transformar.

Además para la fase de cuantificación se aplicó el test Dunnett de comparaciones múltiples,

para ver el efecto del ABA en los tratamientos de maduración en comparación con el ABA

endógeno encontrado en la Ec (control).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Ensayo de Maduración de Embriones somáticos

Durante la fase de maduración de las MPE se obtuvo una disminución significativa (p<

0,0019) del incremento en peso fresco (IPF) con respecto al control en las tres concentraciones

de ABA exógeno aplicado al medio de cultivo (Figura 1.2). Estos resultados coinciden con lo

planteado por García–Martin et al. (2005) que señalan una disminución significativa del peso

fresco a medida que aumenta la concentración de ABA exógeno al medio de cultivo. Esto se

fundamenta en que el ABA no influye de manera concluyente como regulador osmótico del

medio en que se encuentran los embriones somáticos. El aumento del peso fresco (IPF) según

estudios realizados en Quercus ilex y Juglans regia estaría relacionado con las condiciones de

cultivo y principalmente con la aplicación de altas concentraciones de sacarosa al medio (entre

30 y 90 g l-1) que se expresaría en la acumulación de sustancias de reservas por parte de los

embriones contribuyendo a la maduración de éstos (Mauri y Manzanera 2003; Vahdati et al.

2008).

45

Figura 1.2. Efecto de tratamientos con ABA sobre el Incremento en peso fresco (IPF) de las MPE somáticos de N. alpina. Tratamientos: T1: sin ABA; T2: ABA 2 mg l-1; T3: ABA 3 mg l-1; T4: ABA 5 mg l-1. Distintas letras indican diferencias significativas de acuerdo a test Tukey (P < 0.05).

Figura 1.3. Efecto de tratamientos con ABA sobre la embriogénesis somática secundaria (Ess), en embriones somáticos de N. alpina. Tratamientos: T1: sin ABA; T2: ABA 2 mg l-1; T3: ABA 3 mg l-1; T4: ABA 5 mg l-1. Distintas letras indican diferencias significativas de acuerdo a test Tukey (P < 0.05). La respuesta de la embriogénesis somática secundaria, como se aprecia en la Figura 1.3 no

presenta diferencias significativas en los tratamientos donde se adicionó ABA al medio de

46

cultivo, sin embargo, existen diferencias con el control que indican la disminución en la

frecuencia de Ess con la aplicación de ABA. Esto se reporta en diversos estudios realizados en

Quercus ilex (Mauri y Manzanera 2004), Castanea dentata (Robichaud et al. 2004), Quercus

suber (García–Martin et al. 2005) y Juglans regia (Vahdati et al. 2008) donde se busca

controlar la Ess para entrar en una fase de maduración o acumulación de sustancias de

reservas. La disminución del IPF y de la Ess en los tratamientos donde se aplicó ABA se

puede explicar por el efecto osmótico sumado a la capacidad del ABA de inhibir la

germinación precoz y control de la Ess (Manoj et al. 2008). Esto genera un mayor número de

divisiones y formación de embriones inmaduros en el tratamiento control, por lo tanto, se ve

reflejado en un mayor IPF en ausencia de ABA (T1), coincidiendo con resultados encontrados

en Quercus ilex (Mauri y Manzanera 2004).

Ensayo de Germinación de Embriones somáticos. La germinación de embriones somáticos se ve alterada por las condiciones de cultivo

(inducción y maduración de los embriones) por lo tanto generalmente se presentan diferentes

grados de desarrollo (germinación) y conversión a plántula. Al evaluar el número de

embriones somáticos germinados por gramo de peso fresco, según las categorías descritas en

la metodología se puede apreciar (Figura 1.4), que no se obtienen Es con presencia radicular y

que el mayor número de Es presenta solo desarrollo caulinar (Figura 1.5A y 1.5B) no

existiendo diferencias significativas en las concentraciones de ABA aplicados al medio de

cultivo.

47

Figura 1.4. Número de embriones somáticos presentando un polo caulinar y radicular desarrollado (Plántula) y solo desarrollo caulinar. T1: sin ABA; T2: ABA 2 mg l-1; T3: ABA 3 mg l-1; T4: ABA 5 mg l-1. Distintas letras indican diferencias significativas de acuerdo a test Tukey (P < 0.05).

A B C D

Figura 1.5. Embriones somáticos germinados y sometidos a los tratamientos de maduración. (A) Embrión somático presentando desarrollo caulinar. Barra 2mm. (B) Embrión somático presentando sólo desarrollo caulinar después de 3 semanas de cultivo. Barra 3 mm (C) Embrión con desarrollo caulinar y radicular. Barra 3mm (D) Plántula. Barra 8 mm. El mayor numero de Es con presencia radicular y caulinar (Figura 1.5C) fueron obtenidos al

aplicar 5 mgL-1 de ABA al medio de cultivo, esto coincide con lo reportado en Juglans regia,

donde se obtuvo 41% de los embriones somáticos con conversión a plántula (Vahdati et al.

2008). Sin embargo, el mayor número de Es obtenidos en este estudio presentó sólo desarrollo

48

caulinar lo que puede estar causado por una inhibición de la germinación de los embriones,

sometidos a altas concentraciones de ABA, por lo cual la literatura sugiere que es más

adecuado aplicar solo pulsos cortos de ABA en estados tempranos del desarrollo del embrión

con el fin de lograr una adecuada maduración y posterior conversión a planta (Figura 1.5D)

(Manoj et al. 2008).

Cuantificación de ABA y AIA.

Las numerosas similitudes morfológicas y bioquímicas entre un proceso embriogénico de

origen somático y cigótico, indica que se deben aplicar secuencias de cultivo que incluyan una

fase que promueva la maduración de embriones somáticos, para lo cual se debe contar con

información del embrión cigótico al cual se quiera homologar (Schmidt et al. 2006).

Los resultados de HPLC (Figura 1.6a) muestran la curva standard obtenida para AIA y ABA

con un tiempo de retención de 5.9 y 7.3 min, respectivamente. Aunque se registraron algunas

impurezas en los extractos, el proceso de extracción fue adecuado para las características del

tejido y comprobado en cada cuantificación definiendo los picos (Figura 1.6b).

b a

49

Figura 1.6. Cromatogramas que indican el tiempo de retención de AIA y ABA, según standard utilizado (a) y concentraciones de AIA y ABA obtenidas desde muestras de embriones cigóticos inmaduros (Ei) de N.alpina (b). Los resultados de cuantificación endógena de ABA y AIA obtenida desde Ei, Ec, y Eec de N.

alpina (Figura 1.7), corroboran lo planteado por Karssen et al. (1983) en Arabidopsis thaliana

y diversos autores, que señalan menores niveles de ABA y mayores de AIA durante la

embriogénesis (Ei) (Quatrano 1997; Finkelstein et al. 2002). Este comportamiento se revierte

con el comienzo de la maduración y la inhibición de la germinación precoz, aumentando el

ABA en el desarrollo medio de la semilla (Ec) para luego disminuir nuevamente en el periodo

de desecación.

Figura 1.7. Niveles endógenos de AIA y ABA contenida en Embrión inmaduro (Ei), Embrión cigótico maduro (Ec) y Eje embrionario (Eec) de N. alpina. Distintas letras indican diferencias significativas de acuerdo a test Dunnett (P < 0.05). Los mayores niveles de AIA (24 ug g-1PF) durante la fase inmadura de la semilla o

embriogénesis se explica por una mayor división y expansión celular que disminuye cuando la

semilla entra en la fase media de desarrollo y permite la inducción de proteínas de reserva

50

(Azcon y Talón. 2000; Von Arnold et al. 2002) e inhibición de la germinación precoz como se

señala en Hevea brasilensis mediada por el aumento en los niveles de ABA en el endosperma

más que en el embrión (Etienne et al. 1993).

Al comparar los niveles endógenos de ABA entre embrión cigótico maduro y eje embrionario

aislado, podemos observar que los niveles tanto de ABA como AIA descienden

significativamente (Figura 1.7). Similares resultados reportan Bianco et al. (1997) en

Pseudotsuga menziesii donde los ejes embrionarios presentaron niveles de ABA endógeno 20

veces menor en comparación con la semilla completa. Esto se atribuye a que los reguladores

se sintetizan en mayor proporción en las zonas cercanas al eje embrionario (cotiledones)

impidiendo la pérdida y la degradación oxidativa del ABA lo que contribuye a la disminución

de esta hormona en embriones aislados (Kong et al. 1997).

Como se determinó anteriormente el embrión cigótico maduro (Ec) que se compone del eje

embrionario más los cotiledones, es el indicador más idóneo para comparar los niveles

endógenos de ABA y AIA con los embriones somáticos.

Según los resultados obtenidos, existen diferencias significativas entre los niveles de ABA

alcanzados en Ec (22 µg g-1) y los niveles de ABA obtenidos en Es provenientes del

tratamiento con la aplicación de 5 mgL-1 (T4) (Figura 1.8). Esto coincide con autores que

postulan que la inmadurez de los Es se basa en los deficientes niveles de ABA endógeno y por

ende en un déficit de proteínas de reserva que permitan la madurez y posterior germinación de

los embriones (Alemanno et al. 1997).

51

Figura 1.8. Niveles endógenos de AIA y ABA contenida, en embriones somáticos en comparación con embriones cigóticos maduros (Ec) de N. alpina. Tratamientos: T1: sin ABA; T2: ABA 2 mg L-1; T3: ABA 3 mg L-1; T4: ABA 5 mgL-1. Distintas letras indican diferencias significativas de acuerdo a test Dunnett (P < 0.05).

En Quercus suber, se determinó que la adición de 0,25 mg L-1 de ABA al medio de cultivo,

promueve la maduración de embriones somáticos, presentando un patrón de variación similar

a lo observado en el ABA de carácter endógeno (García- Martín et al. 2005). Así, se determinó

que el contenido de ABA endógeno, durante la embriogénesis secundaria es muy similar al

observado en un estado inmaduro, demostrándose que los embriones secundarios son

producidos desde embrioides primarios con bajos niveles de ABA.

Las diferencias entre Ec y Es pueden ser un resultado de la ausencia de una fuente maternal,

que emita señales que induzcan la síntesis de ABA en el cultivo in vitro (Miller et al. 1994).

Por lo tanto la adición de ABA al medio de cultivo en los estadios iniciales de los embriones

somáticos, puede inferir ciertas señales que permitan la acumulación de proteínas de reserva

generando embriones similares a los obtenidos de manera cigótica.

52

Como se aprecia en la Figura 1.8 no existen diferencias significativas en la cuantificación de

ABA entre el control (T1) y los tratamientos T2, T3 y T4 donde se aplicó ABA. Esto es

reportado en algunos estudios realizados en coníferas, donde se indica que embriones

somáticos son capaces de sintetizar ABA endógeno en concentraciones bajas, en respuesta a

ABA exógeno o en ausencia de éste (Kong and Yeung 1995; Kong and Von Aderkas 2007).

Por lo tanto el momento de la adición de ABA exógeno al medio de cultivo, es vital en el

proceso de inducción a la maduración de los Es.

En consecuencia, el proceso de maduración de embriones somáticos debe estudiarse para cada

especie y/o sistema embriogénico, en particular en cada estado embriogénico (globular-

torpedo –cotiledonar), con el fin de manejar las concentraciones que permitan homologar, en

lo posible, las condiciones naturales que promueven la maduración embrionaria para lograr

tasas de germinación y conversión a planta a niveles aceptables.

CONCLUSIONES

De este trabajo se concluye que es necesaria la aplicación de ABA al medio de cultivo para

disminuir la incidencia de embriogénesis somática secundaria. Por otra parte, se encuentran

bajos niveles de ABA endógeno en los embriones cigoticos inmaduros (embriogénesis) de N.

alpina, para luego aumentar significativamente en embriones cigoticos maduros. A su vez, los

embriones cigoticos maduros presentan niveles endógenos de ABA significativamente mayor

en comparación con los embriones somáticos en estado cotiledonar y sometidos a las

diferentes concentraciones de ABA exógeno. Finalmente, el número de embriones somáticos

53

germinados por gramo de tejido, aumenta significativamente al aplicar ABA al medio de

cultivo.

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57

CAPITULO 2.

REVIGORIZACIÓN DE MATERIAL ADULTO DE N. alpina: ASPECTOS

HORMONALES E HISTOLOGICOS

Priscila Cartes R1; Katia Sáez2; María Francisca Beltrán1. Darcy Ríos1; Manuel

Sánchez1

1Universidad de Concepción. Facultad Ciencias Forestales, Departamento Silvicultura y Centro de Biotecnología, casilla 160-C, Concepción, Chile, teléfono (56) 41-2207241, fax: (56) 41-2207310, pcartes.r@gmail.com 2Universidad de Concepción, Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas, Avda. Esteban Iturra s/n - Barrio Universitario, Concepción, Chile.

RESUMEN

El Raulí (Nothofagus alpina (Poepp. et Endl.) Oerst.), es una especie endémica de los bosques

subantárticos de Chile y Argentina. Posee potencial comercial en Chile por la calidad de su

madera. Para aumentar la productividad del recurso, hoy en día, se enfatiza en la aplicación de

herramientas biotecnológicas, con el fin de obtener un beneficio sostenible en el tiempo. El

presente estudio plantea como objetivo evaluar el efecto de componentes hormonales en el

proceso de inducción organogénica y rizogénico de N. alpina a partir de material adulto y

realizar estudios histológicos del proceso de regeneración in vitro, con el fin de caracterizar el

origen de los brotes obtenidos. Se obtuvieron yemas provenientes de varetas forzadas a brotar

in vitro de árboles adultos de raulí. Estas yemas fueron dispuestas en medio Broadleaved Tree

Medium (BTM) con reguladores del crecimiento 6-bencilaminopurina (BAP) y ácido

indolbutírico (AIB) a diferentes concentraciones en la fase de inducción y proliferación, en

esta última se practicaron subcultivos a medio fresco cada 28 días, se alternaron conteniendo

reguladores del crecimiento y en medio base BTM, sin reguladores. Los cortes histológicos de

10µm de espesor fueron realizados al cabo del segundo subcultivo fijando las muestras en

FAA y se incluyeron en parafina. La tinción se realizó con Fast green y safranina acuosa. La

mayor respuesta organogénica se obtuvo a partir de la superficie adaxial de la hoja,

principalmente sobre la nervadura. El estudio histológico permitió corroborar la presencia de

brotes adventicios de origen multicelular, vía organogénesis indirecta, es decir, a partir de la

formación de células indiferenciadas (callo) con un alto grado de proliferación de brotes. La

confirmación del origen de brotes adventicio y el porcentaje de enraizamiento obtenido a partir

58

de material adulto, indica la posibilidad de desarrollar un sistema de propagación viable para

la especie.

Palabras clave: Raulí; organogénesis adventicia; histología; cultivo in vitro.

INTRODUCCIÓN

La propagación natural de Nothofagus alpina (Poepp. et Endl.) Oerst.) se produce a través de

semillas, aunque debido a las características intolerantes de la especie esta sólo es exitosa en

lugares donde el suelo mineral se encuentra expuesto y en presencia de luz (Donoso et al,

2006). A su vez, la propagación mediante siembra directa no se encuentra exenta de

dificultades debido a factores como baja viabilidad, condiciones especiales requeridas para la

germinación, producción cíclica de semillas y ataque de insectos consumidores del embrión

(Loewe et al, 1997).

En cuanto a su propagación asexual, en diversas especies de Nothofagus se ha aplicado la

micropropagación por vía organogénica, principalmente con material juvenil de roble

(Martínez-Pastur y Arena, 1995), raulí (Jordan et al, 1996; Martínez-Pastur y Arena, 1996;

Sánchez-Olate et al, 2004), ñirre (N. antarctica) (Martínez-Pastur et al, 1997) y lenga (N.

pumilio) (Martínez-Pastur y Arena, 1999), obteniéndose desarrollo adventicio de brotes y

raíces in vitro. En general, las tasas de proliferación caulinar y niveles de enraizamiento son

bajas, presentándose la mayoría de las limitantes de la propagación organogénica, entre ellas,

falta de funcionalidad de las nuevas raíces generadas y una alta variación de las respuestas

entre especies.

Dentro de la propagación in vitro y revigorización del material vegetal, la organogénesis se

utiliza en la producción comercial de diversas especies forestales por la alta capacidad de

59

multiplicación, revigorización y/o mantención del estado juvenil ( Sabja et al 2008; Aggarwal

et al, 2010).

La organogénesis puede generar brotes adventicios apicales y radiculares vía directa o

indirecta, es decir, directamente del explanto o indirectamente a partir de un callo (Pierik,

1990). Si bien la vía directa se considera más estable desde el punto de vista de estabilidad

genética, la producción de plantas vía indirecta posee la ventaja de generar una fuente

inagotable de explantos (Orellana, 1998; Lara et al, 2003). No obstante, la propagación vía

organogénesis posee limitantes que se acentúan en la fase adulta del árbol, además de

manifestarse las características de interés tales como volumen de madera, cantidad de lignina,

calidad de madera, cantidad y calidad de frutos entre otras, se produce un descenso

generalizado de la capacidad regenerativa y competencia morfogénica (Greenwood, 1995).

La capacidad morfogénica o facilidad con que cuentan los individuos para propiciar la

desdiferenciación de sus tejidos va a depender del grado de madurez o fase de desarrollo en la

que se encuentren (Greenwood, 1995; Fraga et al., 2002) sin embargo, existe una diferencia

clara entre los conceptos de maduración y envejecimiento. Mientras que el envejecimiento

implica la pérdida gradual de vigor, y eventualmente senescencia y muerte, la maduración se

refiere a cambios específicos relacionados, sobre todo, con el estado fisiológico que permite la

inducción de la evocación floral (Fraga, 2000). Por lo tanto, la maduración no siempre está

relacionada necesariamente con la pérdida de vigor.

60

La revigorización de material adulto durante el cultivo está influenciada por factores como

genotipo, reguladores del crecimiento y tipo o estado fisiológico del explanto entre otros

(Gómez, 1998). El efecto del genotipo en la respuesta organogénica, también ha sido

reportado por diversos autores en una amplia gama de especies (Orellana, 1998; Shen et al,

2008). Algunos genotipos de la misma especie exhiben una alta capacidad de regeneración,

mientras que otros, son recalcitrantes o no muestran la capacidad de regenerar órganos

(Nontaswatsri et al, 2002; Landi y Mezzetti, 2006).

Hasbún, (2006) señala que los explantos de Castanea sativa como brotes epicormicos o

explantos desde la base del árbol, independiente de la edad cronológica de la planta madre,

responden con facilidad frente a los tomados desde la copa, ya que han sido generados a partir

de tejidos meristemáticos latentes los cuales son cronológicamente más antiguos, pero por su

estado de quiescencia sus meristemos han experimentado menor número de divisiones

celulares, manteniendo su identidad juvenil. Sin embargo, el tipo de explanto no es único

factor que determina el éxito de la respuesta morfogénica.

Por otro lado, reguladores del crecimiento como auxinas y citoquininas juegan un papel

fundamental en el proceso de revigorización, formación y desarrollo de las plantas (Su et al,

2011). Las citoquininas son moléculas de señalización hormonal que puede jugar un papel

esencial en la regulación de la citocinesis, el crecimiento y el desarrollo de las plantas (Azcon

y Talón, 2000; Howell et al, 2003). Estudios realizados en Castanea sativa y Actinidia

deliciosa señalan el efecto positivo de 6-bencilaminopurina (BAP) en la formación de raíces y

la proliferación de brotes, especialmente cuando se utiliza en conjunto con otros reguladores

como ácido indolbutírico (AIB) y ácido giberélico respectivamente (Giovannelli et al, 2004;

Ariguita et al, 2005).

61

Durante la revigorización de los tejidos, los procesos morfogénicos que ocurren son muy

variados; de allí que se requiera de un estudio histológico con el fin de comprender los

procesos morfogénicos que están ocurriendo y diseñar estrategias de micropropagación como

conocer la estabilidad genética de los materiales producidos y en última instancia determinar

los posibles usos de los tejidos generados mediante esta técnica. (Puigderrajol et al, 2000; Lara

et al, 2003)

El presente estudio plantea como objetivo evaluar el efecto de componentes hormonales en el

proceso de inducción organogénica y rizogénico de N. alpina a partir de material adulto y

realizar estudios histológicos del proceso de regeneración in vitro, con el fin de caracterizar el

origen de los brotes obtenidos.

MATERIALES Y MÉTODOS.

Establecimiento in vitro.

Se utilizaron varetas de N. alpina, obtenidas desde 5 árboles adultos en etapa reproductiva. Las

varetas fueron recolectadas en época de invierno, desde la copa del árbol y desde brotes

epicórmicos (BE). El tamaño de éstas varió entre 25 y 35 cm de largo y de 1,0 cm de diámetro

basal aproximadamente, importando que el número de yemas en cada vareta fuera homogéneo.

A las varetas se les efectuó una asepsia superficial con captan y benomilo (2 gL-1) durante 1 h.

Luego se realizaron 3 lavados frecuentes en agua destilada estéril (5, 15 y 20 minutos) en

cámara de flujo laminar. Posteriormente se colocaron en un recipiente de vidrio conteniendo

150 ml de agua destilada estéril y cubiertas con una bolsa de polietileno, ajustándola con cinta

adhesiva en la base. Para evitar condensación, se realizaron pequeñas perforaciones en la parte

superior de la bolsa. La estimulación se llevó a cabo en cámara de incubación con fotoperiodo

de 16 h, temperatura de 25 ±1ºC y densidad de flujo fotónico de 30 µmol m-2 s-1.

62

Inducción Organogénica.

Trascurridas dos semanas de estimulación de las varetas, se comenzaron a obtener las primeras

yemas abiertas que fueron transferidas a los tratamientos de inducción organogénica (Figura

2.1-A1I 0). Se empleó como medio base la solución mineral BTM, suplementado con 30 gL-1

sacarosa y solidificado con 7,0 gL-1 de agar agar, adicionando los reguladores del crecimiento

BAP y AIB como se muestra en la Tabla 2.1.

Tabla 2.1: Tratamientos de Inducción Organogénica

Tratamiento BAP (mgL-1) AIB (mgL -1)

I0 0 0

I1 0,5 0,1

I2 1 0,1

Proliferación de Brotes.

Posteriormente, los brotes organogénicos obtenidos en la fase de inducción se llevaron a la

fase de proliferación. Se utilizaron brotes que respondieron a la inducción organogénica desde

la copa y BE. Fueron sometidos a tratamientos de proliferación conteniendo la solución

mineral base BTM, suplementado con 30 gL-1 sacarosa y solidificado con 7,0 gL-1 de agar

agar, adicionando los reguladores del crecimiento a concentraciones de 0,1 mL-1 de BAP más

0,01 mL-1 de AIB (P1) y 1 mL-1 de BAP más 0,1 mL-1 de AIB (P2). Se utilizo una cámara de

crecimiento controlado (Famure Ltda.) a una temperatura de 25 ± 2 °C, con una humedad relativa

del 60%, fotoperiodo de 16 horas luz y densidad de flujo fotónico de 30 µmol m-2 s-1.

63

Histología.

Las muestras fueron fijadas en FAA 70 % durante 48 horas y posteriormente en etanol al 70%

v/v. Las muestras fueron embebidas en parafina luego de la deshidratación. Se cortaron

secciones transversales de callo y secciones longitudinales de embriones somáticos, de 10 µm

de espesor, siendo teñidas con hematoxilina.

Enraizamiento.

Tras el establecimiento de cadenas proliferativas vía organogénesis indirecta, se seleccionaron

microtallos provenientes del sexto subcultivo de origen copa y BE que poseían un diámetro de

tallo de aproximadamente 2 mm y 4 cm de longitud. Se dispusieron en medio base BTM con pH

ajustado a 5,8 suplementado con 30 gL-1 de sacarosa y 7 gL-1 de agar-agar® Merck durante 20

días. Después los microtallos fueron sometidos a una inducción lenta en medio BTM a diferentes

concentraciones de AIB (Tabla 2.2), mantenidos durante 15 días. Todo el proceso de

proliferación e inducción rizogénica se realizó en una cámara de crecimiento controlado (Famure

Ltda.) a una temperatura de 25 ± 2 °C, con una humedad relativa del 60%, fotoperiodo de 16

horas luz y densidad de flujo fotónico de 30 µmol m-2 s-1. Finalmente los microtallos fueron

dispuestos en sustrato de compost de corteza de pino, esterilizado a lo menos 3 veces y posterior

a un mes de cultivo en condiciones ex vitro se evaluó supervivencia según ontogenia y

concentración auxínica.

Tabla 2.2: Tratamientos de inducción rizogénica aplicados a microtallos de N. alpina, según

concentraciones de AIB y ontogenia.

Ontogenia Tratamiento AIB BAP

(mgL-1)

T0 0,0 0,1

64

BE T1 1,0 0,1

T2 3,0 0,1

T3 5,0 0,1

T0 0,0 0,1

COPA T1 1,0 0,1

T2 3,0 0,1

T3 5,0 0,1

Diseño Experimental

En la fase de proliferación se utilizó un diseño completo aleatorio con arreglo factorial de

contrastes específicos con dos factores y dos niveles. Se realizaron 16 repeticiones compuestas

por un frasco con un brote homogenizado por callo. Posterior a un mes de cultivo se evaluó: peso

fresco del callo y número de brotes nuevos por callo en relación a un gramo de peso fresco, se

considero el número de brotes mayores a 5mm. Los datos fueron analizados mediante ANDEVA

y para establecer los tratamientos en los que existieron diferencias estadísticas se aplicó la prueba

de Tukey para comparaciones múltiples con nivel de significancia de P < 0,05. Para ello se utilizó

el software estadístico SAS (SAS Institute, 2002).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Establecimiento in vitro e inducción organogénica.

Las respuestas se evidenciaron luego de 1 mes de cultivo en medio de inducción, comenzó con

el proceso de desdiferenciación desde los bordes y zona de central de la yema. Conforme

transcurrió la etapa de inducción y principalmente al final de ésta, luego de 2 meses de cultivo,

se pudo identificar de manera macromorfológica nula respuesta en el tratamiento control, tanto

para los genotipos como tipo de material vegetal ensayados (Figura 2.1-A2I0: A4I 0). Solo se

65

observo apertura de la yema, con a lo más un par de hojas abiertas en algunos de los genotipos

ensayados y que no prosperó en desarrollo caulinar. Estos resultados son esperados, ya que

diversos estudios señalan necesaria la aplicación de citoquininas al medio de cultivo para

activar un complejo de genes que se traduce en la formación de brotes (Howell et al, 2003; Su

et al, 2011). Si bien la presencia de BAP en menor concentración aplicada permitió observar

estructuras organogénicas a mediados del proceso de inducción (Figura 2.1 a-A5I 1),

finalmente, las estructuras no prosperaron, presentándose una callo necrosado, disgregándose

con facilidad en pequeños fragmentos al ser manipulado y sin capacidad de proliferación

(Figura 2.1 b-A5I 1). Sin embargo, al aplicar el tratamiento I2, con mayor concentración de

BAP, se obtuvo menor desarrollo callogénico y aparición de estructuras organogénicas desde

la base del callo (Figura 2.1 a-A5I2) que se fueron multiplicando hasta finalizar la etapa de

inducción generando un callo compacto y reducido en proporción a la masa organogénica

generada (Figura 2.1 b-A5I 2). En la literatura es conocido el papel de las citoquininas

exógenas en la inducción y desarrollo de brotes “ectópicos” o “adventicios” y generalmente su

acción está relacionada con la concentración aplicada en el cultivo (Ramage y Williams, 2004;

Hwang et al, 2012). Estudios realizados en especies de importancia comercial como

Eucalyptus globulus, Eucalyptus tereticornis, (Larson et al, 2006; Aggarwal et al, 2010),

reportan necesaria la aplicación de BAP acompañado de una auxina para obtener

organogénesis adventicia. Incluso en especies más relacionadas como Quercus suber

(Puigderrajols et al, 2000), C. sativa (Hasbún, 2006) y Juglans sp (Payghamzadeh y

Kazemitabar, 2011), obtienen una respuesta organogénica exitosa al aplicar al medio de

cultivo concentraciones de BAP en rangos de 0,5 a 2 mg L-1 (Figura 2.1-A5P1: A5P2), y

siempre acompañado de auxina exógena. Esto se explicaría por la función antagonista que

poseen ambas hormonas, en el proceso de formación de brotes la citoquinina promueve la

66

proliferación de células madre e inhibe su diferenciación, mientras que la auxina provoca la

iniciación de órganos a través de la represión de la citoquinina (Su et al, 2011).

Es importante señalar que solamente se obtuvo respuesta organogénica en el genotipo A5. Es

por esto que se decidió realizar sólo una observación macromorfológica en la etapa de

inducción. Se ha informado de la respuesta genotipo dependiente que poseen diversas especies

cultivadas in vitro (Landi y Mezzetti, 2006; Aggarwal et al, 2010) específicamente en raulí

Sabja et al, (2008) señala las diferentes tasas de multiplicación de brotes obtenidas según el

genotipo ensayado. Como se observó en este estudio, el genotipo es un factor de gran

importancia, ya que la respuesta morfogénica obtenida o índice de propagación a obtener

puede variar entre especies e incluso entre clones de la misma especie (Orellana, 1998), por lo

tanto es necesario aumentar el número de individuos a muestrear y establecer condiciones de

cultivo especificas, ya que en algunos genotipos los genes implicados en la organogénesis

adventicia pueden verse suprimidos por un cultivo inadecuado (Shen et al, 2008).

Actualmente no se ha reportado la obtención de organogénesis adventicia a partir de material

adulto en el género Nothofagus, algunos acercamiento han reportado Sabja et al, (2008) con la

multiplicación de brotes in vitro provenientes de arboles adultos y organogénesis directa a

partir de material juvenil (Jordan et al, 1996; Martínez-Pastur y Arena, 1996).

67

Figura 2.1: Respuesta organogénica por tratamiento de inducción (I ), proliferación (P) y árbol ensayado (A): I0: sin BAP y AIB; I1: (0,5 mg l-1BAP y 0,1 mg l-1AIB) ; I2: (1 mg l-1BAP y 0,1 mg l-1AIB) . P1: (0,1 mL-1 de BAP y 0.01 mL-1 de AIB) P2: (1 mL-1 de BAP más 0.1 mL-1 de AIB) A1:Genotipo1; A2: Genotipo 2; A3: Genotipo 3; A4: Genotipo 4; A5:Genotipo5.

Proliferación de Brotes.

La proliferación obtenida desde el genotipo A5 estuvo modulada por la concentración de BAP

utilizada. En la Figura 2.2 se aprecia el peso de callo fresco obtenido según ontogenia y

concentración hormonal, de estos resultados podemos observar un peso fresco de callo

significativamente mayor en la concentración de P2 que en P1, independiente del origen

ontogénico del material (brote epicórmico o copa). La literatura plantea que un tejido

ontogénicamente más joven debería tener una mejor respuesta morfogénica debido a que han sido

generados a partir de tejidos meristemáticos latentes los cuales son cronológicamente más

68

antiguos, pero sus meristemos han experimentado menor número de divisiones celulares,

manteniendo su identidad juvenil (Sánchez et al, 2005; Hasbún, 2006). Sin embargo, en este

estudio no se presentaron diferencias significativas entre el material vegetal de BE y copa.

Estudios realizados en Quercus petraea por Morisset et al, (2012), señalan que la importancia de

los brotes epicórmicos como material morfogénico radica no tan solo en su edad ontogénica, sino

que en la cantidad de agua, luz y carbohidratos que percibieron desde el material parental durante

su desarrollo.

En la etapa de proliferación se obtuvo una respuesta inversa en relación a la concentración de

BAP aplicada. Ambas respuestas fueron positivas, ya que la aplicación de una alta

concentración de BAP (P2) refleja un aumento significativo en gramos de callo morfogénico

Figura 2.3. Número de brotes por gramos de peso fresco, según ontogenia del árbol (BE : brote epicórmico y copa) y concentración hormonal. Distintas letras indican diferencias significativas de acuerdo a test Tukey (P < =0.05).

Figura 2.2. Gramos de callo fresco, según ontogenia del árbol (BE: brote epicórmico y copa) y concentración hormonal. Distintas letras indican diferencias significativas de acuerdo a test Tukey (P <= 0.05).

69

(Figura 2.2) en comparación con la concentración menor BAP (P1) que produjo un número

de brotes por gramo de peso fresco significativamente mayor (Figura 2.3) en comparación

con la alta concentración de BAP aplicada. El número de brotes promedio obtenido de 1:12 en

un mes de cultivo es superior al reportado por Sabja et al, (2008) en la especie de 1: 12 en dos

meses de cultivo.

A nivel macromorfológico, la respuesta morfogénica obtenida con mayor concentración de

BAP se caracterizó por presentar forma de roseta con gran cantidad de callo circundante

(Figura 2.4A), a diferencia de los brotes en presencia de menor concentración hormonal que

se caracterizaron por ser elongados y con una altura promedio de 3 cm (datos no mostrados).

Características similares presentan brotes organogénicos obtenidos en Persea lingue por Cob

et al, (2010), sometidos a las mismas concentraciones de BAP.

Histología de brotes adventicios.

La secuencia histológica de la diferenciación del brote corrobora el proceso de regeneración in

vitro en N. alpina vía organogénesis indirecta (Figura 2.4). Particularmente en la Figura 2.4B,

que corresponde a una sección longitudinal, se aprecia un nivel de organización mayor por la

presencia de las células que están en continua división o proliferación, dando formación a los

domos meristemáticos y primordios foliares (flechas) constituyendo de esta forma un meristemo

caulinar. Asimismo, el tejido vascular del brote estableció conexión con el tejido materno (callo),

lo que indica que son brotes de origen organogénico adventicio originados desde la cara adaxial

del explanto de origen, comportamiento similar se describe en Actinidia deliciosa por Popielarska

et al, (2006).

70

Figura. 2.4. Cortes histológicos longitudinales de brotes adventicios de N. alpina. A) Callo organogénico con brotes adventicios. B) Flechas indican la formación de brotes adventicios y zonas meristemáticas. C) Domo meristemático con activa división celular periclinal. En diversos estudios histológicos se ha logrado corroborar el proceso de regeneración de plantas

vía organogénesis adventicia evidenciando la división celular y los procesos que implican la

formación de brotes (Lara et al, 2003; Popielarska et al, 2006; Cob et al, 2010), observándose

que la principal actividad morfogenética de las células que conforman la región meristemática

(Figura 2.4C), presentan divisiones anticlinales y periclinales (Flecha).

Enraizamiento de brotes adventicios.

La respuesta rizogénica se manifestó de manera positiva en presencia de AIB, el mayor

porcentaje obtenido de raíces alcanzo el 50 % para los brotes de origen ontogénico BE (Figura

2.5A). En cambio la menor respuesta rizogénica para ambos tipo de brotes alcanzo el 10 % en el

tratamiento control Esto indica que la edad ontogénica con la concentración de AIB y de BAP

usada no afecta significativamente el potencial de enraizamiento de los brotes epicórmicos

(p=0,0671) y de copa (p=0,1571).

El procedimiento usado para el cultivo ex vitro permitió alcanzar porcentajes que bordearon el 90

% de supervivencia de plantas de origen BE (P=0,1895) y copa (p=0,8893) (Figura 2.5B). Sin

embargo no existieron diferencias significativas en los tratamientos ensayados.

71

Figura. 2.5. Porcentaje de enraizamiento según ontogenia (BE: brote epicórmico y copa) y concentración auxínica (A). Porcentaje de supervivencia en condiciones ex vitro según ontogenia (BE: brote epicórmico y copa) y concentración auxínica (B). Donde T0: 0,0 mgL-1 de AIB y 0,1 mgL-1 de BAP, T1: 1,0 mgL-1 de AIB y 0,1 mgL-1 de BAP, T2: 3,0 mgL-1 de AIB y 0,1 mgL-1 de BAP, T3: 5,0 mgL-1 de AIB y 0,1 mgL-1 de BAP. Estudios similares se han reportado por Jordan et al, (1996) en presencia de AIB a una

concentración de 0,5 y 1,0 mgL-1, el material juvenil de 2 años de cultivo in vitro de N. alpina

alcanzó un 45% y 35 % de enraizamiento respectivamente. Caro et al, (2003) reportó un 33% de

enraizamiento en brotes juveniles en presencia de 5 mgL-1 de AIB. Mayores porcentajes fueron

reportados por Martínez- Pastur et al, (2003), en material juvenil obteniendo un 95% de

enraizamiento en presencia de 0,125 mgL-1 de AIB, flavonoides y oscuridad.

72

Figura. 2.6. Respuesta rizogénica en condiciones in vitro y ex vitro según ontogenia (BE: brote epicórmico y copa) y concentración auxínica A) brote organogénico sometido al T0. B) brote organogénico de origen de copa sometido al T3. C) brote organogénico de origen brote epicórmico (BE) sometido al tratamiento T3 D) respuesta rizogénica de brotes adventicios de origen de copa tras un mes de cultivo en condiciones ex vitro E) supervivencia de brotes adventicios de origen de BE tras un mes de cultivo en condiciones ex vitro. Tratamientos: T0: 0,0 mgL-1 de AIB y 0,1 mgL-1 de BAP, T1: 1,0 mgL-1 de AIB y 0,1 mgL-1 de BAP, T2: 3,0 mgL-1 de AIB y 0,1 mgL-1 de BAP, T3: 5,0 mgL-1 de AIB y 0,1 mgL-1 de BAP. A nivel morfológico como se observa en la Figura 2.6A el tratamiento control presentó una base

callosa sin un número significativo de raíces, tanto para material de origen BE y copa. En

aspecto, las raíces originadas en presencia de AIB y el número de raíces obtenido (datos no

mostrados) fue homogéneo para ambas edades ontogénicas ensayadas (Figura 2.6B y 2.6C). Sin

embargo, cabe señalar que en presencia de lupa estereoscópica se aprecia una gran cantidad de

primordios radiculares en todos los tratamientos aplicados. Lo anterior se puede ver representado

en la fase de supervivencia a condiciones ex vitro (Figura 2.6D y 2.6E) la cual alcanzo

porcentajes cercanos al 90 %. Esto se explicaría por el cultivo sucesivo realizado durante la fase

de proliferación, sometiendo los brotes adventicios a altas concentraciones de BAP y AIB por

73

periodos prolongados lo cual pudo conllevar a una inhibición de los tratamientos rizogénicos

utilizados y provocar una respuesta rizogénica tardía que se observó en condiciones ex vitro.

En la actualidad se reporta solo un trabajo realizado en revigorización de material adulto de N.

alpina (Sabja et al, 2008), el cual permite obtener niveles de enraizamientos superiores a los

obtenidos en este estudio (cercanos al 80 %), pero con tasas de proliferación inferior, debido

principalmente a que al origen de sus brotes no es adventicio.

CONCLUSIONES

El cultivo in vitro de Nothofagus alpina a partir de yemas, reflejó resultados exitosos,

permitiendo la revigorización del material vegetal adulto. Mediante la presencia de BAP en el

medio de cultivo se obtuvo organogénesis adventicia corroborada por los análisis histológicos.

Asimismo, este estudio, evidencia la viabilidad en las fases de proliferación, elongación caulinar

y enraizamiento como etapas clave en el proceso de propagación vía organogénesis in vitro. Si

bien este estudio aporta con datos científicos que ayudan a aminorar algunas de las problemáticas

de propagación que afronta esta especie nativa chilena, también plantea nuevas interrogantes que

deben ser incorporadas en estudios futuros.

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77

CAPITULO 3.

COMPARACIÓN DE EMBRIONES SOMÁTICOS Y CIGÓTICOS DE Nothofagus

alpina: MADURACIÓN, MORFOLOGÍA E HISTOLÓGIA.

Priscila Cartes1; Katia Sáez2; Darcy Ríos1; Manuel Sánchez1

1Universidad de Concepción. Facultad Ciencias Forestales, Departamento Silvicultura y Centro de Biotecnología, casilla 160-C, Concepción, Chile, teléfono (56) 41-2207241, fax: (56) 41-2207310, pcartes.r@gmail.com. 2Universidad de Concepción, Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas, Avda. Esteban Iturra s/n - Barrio Universitario, Concepción, Chile

RESUMEN

Obtener embriogénesis somática en el género Nothofagus, establece la necesidad de

comprender los cambios morfológicos y estructurales que sufren los tejidos, para generar un

embrión somático maduro y viable en el tiempo. Con el fin de validar la vía morfogénica

obtenida, comparar y caracterizar embriones somáticos sometidos a los tratamientos de

maduración frente a embriones cigóticos maduros de N. alpina. Se realizaron estudios

anatómicos y ultraestructurales (microscopía electrónica de barrido) a callos embriogénicos y

no embriogénicos, así como a embriones somáticos (Es) en diferentes estados de desarrollo,

sometidos a tratamientos de maduración. Se llevó a cabo un ensayo de maduración de masas

proembriogénicas en estado cotiledonar con la adición de diferentes concentraciones de ABA

exógeno. Para la histología los tejidos fueron fijados en FAA 70 % durante 48 horas y

posteriormente en etanol al 70% v/v. Las muestras fueron embebidas en parafina luego de la

deshidratación. Se cortaron secciones transversales de callo y secciones longitudinales de

embriones somáticos, de 10 µm de espesor, siendo teñidas con Safranina-Fast Green. Para los

estudios ultraestructurales, las muestras fueron fijadas en FAA 70%, deshidratadas en una

serie creciente de etanol, realizándose un cubrimiento iónico-metalización con oro. Tras ser

sometidos a tratamientos de maduración y germinación, las MPE presentaron embriones

somáticos globulares con células de forma redondeada, pared gruesa, citoplasma denso y

núcleo prominente. También se visualizaron estados torpedo y cotiledonar, caracterizados por

el alargamiento del eje hipocótilo-radícula. Los resultados obtenidos demostraron las

similitudes entre embriones somáticos y cigóticos, posibilitando de esta manera obtener

embriones somáticos viables, y así lograr optimizar el proceso de conversión a planta en raulí.

Palabras clave: embriogénesis somática, histología, maduración, conversión a planta.

78

INTRODUCCIÓN

La embriogénesis somática (ES) o formación de embriones somáticos (embrioides) tiene su

origen en células somáticas de la planta donante, las cuales se “reprograman” y siguen un

patrón de desarrollo idéntico al del embrión de origen cigótico, conservando el genotipo de la

planta donadora (Merkle y Dean. 2000; Celestino et al. 2005; Peña et al. 2010). En el cultivo

de tejidos vegetales in vitro la ES es considerada por algunos autores como la vía más

poderosa de micropropagación (Cevallos et al. 2002). Sin embargo, la necesidad de

comprender el proceso de formación de los embriones somáticos (Es) está empezando a

emerger, ya que los detalles de los mecanismos de señalización implicados en los procesos de

inducción siguen siendo desconocidos (Rose et al. 2010; Wang et al., 2011).

Estudios han demostrado que los Es tienen las mismas etapas de desarrollo que sus homólogos

cigóticos, estas etapas en especies dicotiledóneas se denominan estadio globular, corazón,

torpedo y cotiledonar (Dodeman et al. 1997; Lopes et al. 2011). Sin embargo, en algunos

casos el éxito del proceso embriogénico para llegar a conversión a planta, va a depender del

grado de maduración que los Es desarrollen durante su cultivo, debido a que pocos genotipos

responden positivamente frente a los tratamientos de maduración y los que responden en

algunos casos no se desarrollan o presentan anormalidades (Corredoira et al. 2003; Miguel et

al.2004). Por lo tanto, se busca obtener una producción sincrónica y de calidad de los

embriones, es decir, que se asemejen o tengan un desarrollo similar a los embriones cigóticos

(Ec) maduros de la especie (Celestino et al. 2005).

A pesar que el desarrollo de los embrioides transcurre a través de sucesivas etapas, tal como se

observa en la embriogénesis cigótica, éstos no experimentan dormancia (Zimmerman. 1993).

Tejidos importantes como los tegumentos y el endospermo, los cuales son requeridos para

79

conservación y germinación, respectivamente, no se forman (Dodeman et al. 1997; Vales et

al. 2007). Si bien, los productos de reserva y los compartimentos subcelulares a los cuales son

dirigidos estas sustancias son análogos en ambos casos (Von Arnold et al. 2002). La cantidad

de almacenamiento de una sustancia en particular, así como el momento de tal acumulación,

puede variar entre Es y Ec (Merkle et al. 1995; Bandyopadhyay y Hamill. 2000; George et al.

2008).

En el proceso de maduración embriogénica, período de desarrollo del embrión en el cual

ocurre la expansión celular y la acumulación de reservas, se han evaluado diferentes

componentes del medio de cultivo que desempeñan un papel importante en este proceso, entre

los que se encuentran principalmente fuentes nitrogenadas, carbonadas, reguladores del

crecimiento, así como tratamientos a bajas temperaturas sobre estados embriogénicos

avanzados (Cuenca et al. 1999; Corredoira et al. 2003; Robichaud et al. 2004).

En condiciones naturales, la aplicación de bajas temperaturas como sistema de estratificación

también ha sido reportado como necesario en Nothofagus (Donoso et al. 1998), en donde las

semillas reciben un prolongado período de frío en el suelo antes de recibir las condiciones de

temperatura y humedad necesarias para gatillar la germinación.

En laboratorio, se ha empleado ácido abscísico (ABA) en un amplio rango de concentraciones

para mejorar la maduración de las masas proembriogénicas (MPE) que contienen los Es,

observando a su vez un efecto positivo en el control de la embriogénesis somática secundaria

(Ess) en Quercus suber y N. alpina (García-Martin et al. 2005; Cartes et al. 2011). Además el

ABA desempeña un papel fundamental en la maduración de los embriones y su posterior

germinación. Actúa en la acumulación de reservas nutritivas, la inducción de la dormancia y la

adquisición de la tolerancia a la desecación, mediante la acumulación de proteínas LEA (Late–

embryogenesis-abundant) (Ooms et al. 1993; Finch-Savage et al. 1994; Pandey et al. 2008),

80

aunque los mecanismos de estos procesos todavía no están del todo claros. También inhibe la

germinación precoz y promueve la latencia de las semillas (Singh y Browning. 1991; Rock y

Quatrano. 1995; Hernández et al. 2010).

Los procesos implicados en la ES, explican la posibilidad de las células vegetales de lograr la

desdiferenciación de los tejidos y como consecuencia cambiar su destino o re-diferenciarse en

vías de desarrollo, tales como, crecimiento no organizado (callo no morfogénico) o generar

órganos y un crecimiento organizado (callo morfogénico) (Wang et al. 2011). Generalmente,

la localización de la diferenciación de los tejidos en Es coincide en diferentes especies como

Feijoa sellowiana y Psychotria acuminata, donde los eventos morfogénicos conducentes a la

micropropagación, ocurren únicamente en la superficie adaxial de los cotiledones y hojas

respectivamente (Canhoto y Cruz 1996; Lara et al. 2003).

Hasta ahora, no se ha reportado una descripción del origen y desarrollo de los Es en raulí. Un

estudio ontogénico y comparativo entre la embriogénesis somática y cigótica puede

determinar cuáles tejidos en particular se derivan en meristemos embriogénicos o en cuáles

estados posteriores de desarrollo se detiene el proceso. Esta información podría servir para

aumentar o manipular la respuesta embriogénica en el tiempo que se requiera (Vidal et al.

2000; Tereso et al. 2007; Moura et al. 2008).

En ocasiones la distinción entre Es y órganos dentro del las MPE puede ser difícil de

identificar. Determinar las características histológicas más distintivas de los Es tales como el

polo caulinar y radicular, existencia de conexión vascular con los tejidos maternos, similitudes

de tejidos cigóticos y somáticos entre otros, es vital para validar el proceso embriogénico de

toda especie (Lara et al. 2003; Celestino et al. 2005).

De acuerdo a lo afirmado anteriormente, es necesario establecer un modelo para estudiar los

mecanismos involucrados que subyacen no sólo a la embriogénesis somática, sino también a la

81

embriogénesis cigótica y la totipotencia de las células vegetales. En tal sentido, este estudio

tiene como objetivo validar la vía morfogénica obtenida, comparar y caracterizar embriones

somáticos sometidos a los tratamientos de maduración frente a embriones cigóticos maduros

de N. alpina.

MATERIALES Y MÉTODOS. Material vegetal.

Se empleó material vegetal procedente de la línea embriogénica de N. alpina (raulí cotiledonar

01 RaC-01), inducida desde cotiledones aislados de semillas maduras, las cuales fueron

obtenidas a través de polinización controlada. Luego de la inducción de callo embriogénico y

manifestación de embriones somáticos el cultivo se dispuso en medio de mantención,

consistente en la solución mineral y vitaminas Broadleaved Tree Medium (BTM) (Chalupa.

1983), más los reguladores del crecimiento 6-bencilaminopurina (BAP) y ácido naftalén

acético (ANA) a concentraciones de 0,1 mgL-1 ambos reguladores suplementado con 30 gL-1

de sacarosa y solidificado con 7,0 gL-1 de agar. Se practicaron subcultivos a medio fresco cada

28 días, alternando dos subcultivos en medio con reguladores del crecimiento con un

subcultivo en medio base BTM, sin reguladores. Los explantos permanecieron en estas últimas

condiciones hasta el comienzo de los ensayos.

Material de inicio.

El material de inicio para cada uno de los ensayos de maduración consistió en MPE de la línea

clonal RaC-01, con presencia de embriones somáticos en estado cotiledonar. Se seleccionaron

MPE, cuyo peso fresco al inicio de los tratamientos de maduración fuera entre a 80 a 100 mg.

82

Maduración de embriones somáticos

Se llevaron a cabo cuatro tratamientos de maduración con distintas concentraciones de ABA al

en el medio de cultivo incluyendo al testigo en concentraciones de 0, 2, 3, y 5 mg L-1 (T0, T1,

T2 y T3, respectivamente) y dos condiciones de temperatura 4ºC y 25ºC durante 4 semanas

(Tabla 3.1), En todos los casos, se empleó la solución mineral BTM como medio base, más

60 gL-1 de sacarosa y 7,0 g L1 de agar. El cultivo se mantuvo en oscuridad continua a una

temperatura de 25 ± 1ºC de día y 22 ± 1ºC de noche. Después de cuatro semanas de cultivo se

procedió a evaluar el incremento en peso fresco (IPF) de las MPE, registrando el peso final.

Además se evaluó la presencia de embriogénesis somática secundaria (Ess) por tratamiento.

Tabla 3.1. Concentración de ABA aplicada en tratamientos de frío para la maduración de embriones somáticos de Nothofagus alpina.

Tratamiento

Temperatura

(ºC)

ABA (mg L-1)

T0 4 25 0

T1 4 25 2

T2 4 25 3

T3 4 25 5

Germinación de embriones somáticos in vitro Luego de la fase de maduración, se procedió a subcultivar las MPE en BTM base sin

reguladores del crecimiento, por un período de tres semanas. Luego se procedió a la fase de

germinación, aislando 10 muestras al azar de MPE sometidas a los tratamientos de

maduración, con ayuda de pinzas y lupa estereoscópica se procuró dejar en la MPE embriones

83

somáticos en estado cotiledonar, siendo transferidos a 5 tratamientos de germinación, los que

consistieron en la aplicación de GA3, BAP y AIB a diferentes combinaciones en medio BTM

con macronutrientes diluidos a un 25%, durante 4 semanas (Tabla 3.2). En todos los casos, la

hormona GA3 fue esterilizada mediante filtración y aplicada al medio después del

autoclavado. En este caso, luego de 7 días de oscuridad, el cultivo fue transferido a la luz con

un fotoperiodo de 16 horas, temperaturas de 25 ± 1ºC en el día y 20 ± 1ºC en la noche.

Se evaluó por tratamiento la presencia de Ess expresada en porcentaje (%). La fase de

germinación de Es en estado cotiledonar, se determinó al cabo de cuatro semanas. Puesto que

la germinación de embriones somáticos se ve alterada por las condiciones de cultivo

(inducción y maduración de los embriones) se presentan diferentes grados de germinación o

desarrollo a plántula. Para ello se utilizó una adecuación de los criterios de clasificación de la

germinación de Es descrita por (Cartes et al. 2011), por lo cual se evaluó la germinación

según: solo presencia caulinar, solo presencia radicular, presencia caulinar y radicular

(plántula).

Tabla 3.2. Reguladores del crecimiento aplicados en los tratamientos de germinación de

embriones somáticos de Nothofagus alpina.

Tratamiento BAP(mgL -1) AIB (mgL -1) GA3 (mgL-1)

G0 0 0 0

G1 0 0 1,0

G2 0,1 0 1,0

G3 0 0,01 1,0

G4 0,1 0,01 1,0

Diseño Experimental.

84

En todos los casos se estableció un diseño experimental completamente aleatorio. En la etapa

de maduración, la unidad experimental estuvo constituida por una placa petri de 9 cm de

diámetro, conteniendo 6 MPE. Del mismo modo, en la fase de germinación, la unidad

experimental estuvo constituida por un tubo de ensayo conteniendo MPE con embriones

somáticos en estado cotiledonar. Se realizaron 10 réplicas por tratamiento. En todos los casos,

los efectos de los tratamientos se evaluaron mediante ANDEVA, seguido del test de Tukey al

nivel p≤0,05 para comparar medias.

Histología y ultraestructura de embriones somáticos y cigóticos.

Para los estudios anatómicos, se llevó a cabo una caracterización histológica tanto de las MPE

como de los embriones somáticos generados mediante embriogénesis secundaria. Para tal

efecto, las muestras fueron fijadas en FAA 70 % (formaldehido 5%- ácido acético 5%-alcohol

90%) durante 48 horas y posteriormente en etanol al 70% v/v. Las muestras fueron embebidas

en parafina luego de la deshidratación. Se cortaron secciones transversales de callo y secciones

longitudinales de embriones somáticos, de 10 µm de espesor, siendo teñidas con hematoxilina.

Para los estudios ultraestructurales, las muestras fueron fijadas en FAA 70%, deshidratadas en

una serie creciente de etanol, realizándose un cubrimiento iónico-metalización con oro.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

Maduración de Embriones somáticos

En este estudio queda de manifiesto que la exposición de las MPE a bajas temperaturas (4°C)

por un periodo de cuatro semanas no afecta significativamente el IPF y la variable Ess. Sin

embargo, el efecto de las crecientes concentraciones de ABA aplicadas en los tratamientos

85

muestra una disminución del IPF (control: 23 mg; T3: 15 mg) y de la variable Ess (control: 60

%; T3: 25 %) con respecto al control (p<0,05) (Figura 3.1 y 3.2). Estos resultados corroboran

lo reportado en la especie por Cartes et al (2011), bajo condiciones similares y obteniendo una

disminución del IPF y Ess, sumado a lo expuesto por García–Martin et al. (2005) que señalan

una disminución significativa del peso fresco a medida que aumenta la concentración de ABA

exógeno al medio de cultivo por el control de la Ess. El aumento de IPF estaría relacionado

con la aplicación de altas concentraciones de fuentes de carbono más que la aplicación ABA

(George et al. 2008).

Diversos autores señalan a la Ess como una limitante para que el embrión somático complete

su desarrollo y germine hasta lograr su conversión a planta (García –Martín et al. 2005).

Estudios realizados indican que los niveles de ABA durante la Ess es similar a lo observado en

un estado inmaduro demostrándose que los embriones somáticos secundarios son producidos

desde embriones somáticos primarios con bajos niveles de ABA, lo cual indica que altas a

Figura 3.1. Efecto del frio y ABA sobre el Incremento en peso fresco (IPF) de embriones somáticos de N. alpina. Tratamientos: T0: sin ABA; T1: ABA 2 mg L-1; T2: ABA 3 mg L-1; T3: ABA 5 mg L-1 sometidos a 4°C y 25°C. Distintas letras indican diferencias significativas de acuerdo a test Tukey (P < 0.05).

Figura 3.2. Efecto del frio y ABA sobre la embriogénesis somática secundaria (Ess), en embriones somáticos de N. alpina. Tratamientos: T0: sin ABA; T1: ABA 2 mg L-1; T2: ABA 3 mgL-1; T3: ABA 5 mg L-1 sometidos a 4°C y 25°C .Distintas letras indican diferencias significativas de acuerdo a test Tukey (P < 0.05).

86

concentraciones es un indicador de madurez, pero el momento de ser expuestos los Es a la

presencia de ABA es vital para no ocasionar respuestas adversas en la germinación de los Es

(Garcia –Martín et al. 2005; Vega y Prehn. 2005; George et al. 2008).

En la figura 3 se muestra los resultados obtenidos de los Es en estadio cotiledonar sometidos a

la adición de GA3 posterior a la fase de maduración. En la Figura 3.3A se aprecia que la

temperatura solo tuvo un efecto significativo en la variable Ess cuando se aplicaron las

mayores concentraciones de ABA al medio de cultivo e incluso obteniendo mejores resultados

cuando los Es no se sometieron a bajas temperaturas. Estudios realizados en Juglans nigra

señala que una exposición a periodos de frío provoca una disminución en los niveles

disponibles de ABA endógeno, generando un aumento de la sensibilidad a GA3, que en

algunos casos puede promover el desarrollo de embriones secundarios (Figura 3.4A) (Deng y

Cornu. 1992).

Germinación de Embriones somáticos in vitro

Figura 3.3. Efecto de los tratamientos de germinación aplicados a los embriones somáticos de N. alpina. A) Porcentaje de embriogénesis somática secundaria (Ess) según tratamiento de germinación aplicado. B) porcentaje de embriones somáticos con presencia solo caulinar. C) porcentaje de embriones somáticos con presencia solo

87

radicular. D) porcentaje de conversión a plántula. Tratamientos: G0: sin reguladores del crecimiento; G1: BAP 0 mg l-1+ AIB 0 mg l-1 + GA3 1,0 mg l-1; G2 BAP 0,1 mg l-1+ AIB 0 mg l-1 + GA3 1,0 mg l-1; G3: BAP 0 mg l-1+ AIB 0,01 mg l-1 + GA3 1,0 mg l-1 G4: BAP 0,1 mg l-1+ AIB 0,01 mg l-1 + GA3 1,0 mg l-1.sometidos a 4°C y 25°C El rol del ABA y la GA3 en el proceso maduración y germinación respectivamente, ha sido

reportado por un gran número de autores en el proceso de ES (Tang et al. 2000; Robichaud et

al. 2004; Vahdati et al. 2008; Peña et al. 2010; Quainoo y Dwomon. 2012). La finalidad es

obtener mejores resultados en las tasas de conversión a plántula. La germinación de los Es en

especies recalcitrantes se presenta asincrónica en los polos, generando en algunos casos el

desarrollo solo del polo apical o radicular. (Tang et al. 2000; Cartes et al. 2011). La Figura

3.3B y 3.3C muestra la alta y baja respuesta obtenida de los Es presentando desarrollo caulinar

(hasta el 100%) (Figura 3.4B) y radicular (40%) (Figura 3.4C), respectivamente. Sin

embargo, el porcentaje de conversión a plántula obtenido fue nulo en casi todos los

tratamiento aplicados, excepto, en aquellos Es sometidos a 4 °C y 5mg L-1 de ABA en la etapa

de maduración y aplicando la acción combinada de BAP, AIB y GA3 en el proceso de

germinación, obteniendo niveles de conversión a plántula del 50% (Figura 3.3D) y (Figura

3.4D). Si bien existen autores que señalan que la exposición de ABA y periodos de frío ayuda

a las MPE en el proceso de maduración y posterior germinación de los Es (Von Arnold et al.

2002; Vahdati et al. 2008), estudios realizados en Juglans regia señalan que periodos de frío

no ayudaron a la germinación de Es, presentado solo un 6% de desarrollo caulinar, 18% de

solo desarrollo radicular y 19% de ambos (Tang et al. 2000). Este comportamiento se podría

explicar debido a que periodos prolongados de frío estimulan la actividad de GA3 y por

consiguiente la inhibición de ABA endógeno, estimulando la germinación precoz de los Es y

perjudicando la maduración de estos (Deng y Cornu. 1992). Además George et al, (2008)

indica que exponer a los Es a tratamiento de maduración o germinación cuando no han

completado su desarrollo con la presencia de auxina en la etapa de inducción, puede ser la

88

respuesta a los bajos niveles obtenidos en conversión a planta. Por otra parte, en Pinus taeda

Pullman et al. (2003) señala que en contraste con los Ec, al germinar los Es primero

desarrollan su parte caulinar y más tarde la radicular, solo si han alcanzado el nivel de

maduración requerido para ello.

Figura 3.4. Embriones somáticos sometidos a los tratamientos de maduración y germinación. (A) Flechas indican embrión somático con presencia de Ess. (B) Embrión somático presentando sólo desarrollo caulinar. (C) Embrión con sólo desarrollo radicular. (D) Plántula. Histología y ultraestructura de embriones somáticos y cigóticos de N. alpina

En la figura 3.5 se observa la secuencia de los diferentes estados celulares y tisulares del

desarrollo de un Es de raulí en comparación con un Ec. De la figura 3.5 A) y Aa) se muestra

la morfología e histología de callo no-embriogénico (CNE). En la literatura y en este estudio el

CNE se presenta de un color traslucido, acuoso, poco compacto de superficie lisa y sin

evidencia de formación de estructuras morfogénicas (Cevallos et al. 2002; Yang et al. 2012).

Además presenta células grandes alargadas con grandes espacios intercelulares y

89

fundamentalmente del tipo parenquimatoso, esto coincide con lo reportado por Popielarska et

al. (2006) en Actinidia deliciosa.

En la Figura 3.5B se evidenció la presencia de un callo compacto con estructuras globulares y

torpedo característico de una MPE (Gómez. 1998). En la Figura 3.5Ba se observó el tejido

circundante de células pequeñas, compactas e isodiamétricas, con alto contenido

citoplasmático, característico de células pro-embriogénicas (Claret et al. 2003; Yang et al.

2012). Además como muchos estudios en los subcultivos sucesivos de las MPE la

proliferación de estructuras se sitúa en dirección adaxial del callo y experimentan un

desarrollo directo e indirecto, es decir, directamente de embriones primarios o directamente

desde el callo (Cevallos et al. 2003; Corredoira et al. 2006)

La morfología de un embrión cigótico maduro (Figura 3.5C- Ca) se caracteriza por ser

compacto, con tejido epidérmico formado y procambial definido en su ápice y base

(Beeckman et al. 2000). La Figura 3.5Cb muestra la proyección apical del Ec con células de

núcleo grande, bien organizadas de citoplasma denso y vacuolas pequeñas, idénticas

características se han reportado en la literatura (Beeckman et al. 2000; Danial et al. 2011).

Con divisiones en dirección periclinal para el desarrollo caulinar del embrión y hacia su base

con divisiones anticlinales para el desarrollo radicular, características similares han sido

descritas en Psychotria acuminata y Pinus pinaster (Lara et al. 2003; Tereso et al. 2007). El

tejido vascular o xilema primario consistió en 4 a 6 “hebras celulares” con engrosamiento de

sus paredes (Figura 3.5Cc), necesario para ser utilizados en la germinación (Fras et al. 2008).

Durante la ES conforme las divisiones celulares aumentan en las MPE las estructucturas

globulares proliferan y se diferencian embrioides en estado globular avanzado, con zonas

tisulares diferenciadas en tejidos vasculares primarios, iniciándose la vascularización de las

nuevas estructuras embriogénicas, a diferencia de zonas tisulares cercanas que permanecen

90

indiferenciadas (Figura 3.5D-Dc). Subsecuentemente a la fase globular, el embrioide tiende a

aplanarse, formar una concavidad en uno de sus lados y desconectarse del tejido materno, la

fase continua con el estadio corazón, que es donde se inicia la polarización de las zonas

caulinar y radical, para culminar en el estadio torpedo- cotiledonar (Figura 3.5E-Eb). Al

comparar éstos estadios con el Ec, se puede observar que ambos poseen similitudes en cuanto

a organización tisular, presencia de células pequeñas con núcleos prominentes, proceso de

división periclinal y anticlinal, desarrollo de células epidérmicas y bandas procambiales desde

fases iníciales (estadio globular). Resultados con características morfológicas e histológicas

similares entre Es y Ec se han reportado en una gran variedad de especies como: Eucalyptus

nitens; Musa sp; Pinus pinaster; Pinus taeda Acrocomia aculeata; Passiflora edulis entre

otras (Bandyopadhyay y Hamill. 2000; Vidal et al. 2000; Pullman et al. 2003; Tereso et al.

2007; Moura et al. 2008; Lopes et al. 2011)

En la Figura 3.5Ec se presenta la zona apical de un Es estado torpedo. Se observan células

típicas del tejido meristemático (meristemo central o domo meristemático) que dará origen a

las hojas iníciales. En esta etapa los embrioides muestran sus polos apical y radical definidos,

sin ningún nexo con el tejido vascular materno. Iguales características fueron descritas en

Coffea canephora por Cevallos et al. (2002).

Los Ec se consideran germinados, cuando emerge la radícula. Sin embargo, estudios

realizados en P. taeda y N. alpina (Pullman et al. 2003; Cartes et al. 2011) se presenta con

mayor frecuencia de manera inversa, parte con la emergencia caulinar y luego radicular. No

obstante, a nivel histológico (Figura 3.5F-Fa) se puede visualizar un meristemo apical y un

meristemo radical desarrollado, caracterizado además, por poseer conexión vascular entre

estas dos zonas (Figura 3.5Fb-Fc), células procambiales que generan los elementos

traqueales, que se formaron probablemente a partir de células con división periclinal y

91

predeterminadas para diferenciarse en xilema. Como se señala en estudios realizados en A.

aculeata; (Moura et al. 2008).

Figura 3.5. Morfología e histología de estructuras embriogénicas y no-embriogénicas. Callo no embriogenico (A-Aa), embrión cigótico (C-Cc) y embriones somáticos (D-Fc) de N. alpina. A) Masa no embriogénica (MNE), Aa) Células grandes e irregulares con poca presencia de núcleos B) Masa Proembriogénica (MPE), Ba) Masa embriogénica con diferentes estadios en desarrollo. C) Embrión cigótico, Ca) Embrión cigótico con presencia visible de

92

bandas procambiales Cb) Zona apical de embrión cigótico que muestra división celular organizada en forma periclinal y anticlinal. Cc) Zonal apical de embrión cigótico que muestra bandas procambiales desarrolladas D) Embrioide en estado globular, Da) Embrioide en estado globular sin conexión vascular al tejido materno Db) Embrión somático en cambio de fase globular a corazón- torpedo. Dc) Zona epidérmica con actividad meristemática. E) Embrioide en estado corazón- torpedo. Ea) Corte de embrioide en estado corazón. Eb) embrioide en estado corazón- torpedo con presencia de bandas procambiales en desarrollo. Ec) Domo meristemático (DM). F) Germinación de embrión somático. Fa) Corte de Es germinado que muestra el tejido vascular de ápice a raíz Fb) Parte aérea de Es germinado con presencia de tejido conductor. Fc).Células del tejido vascular en ordenamiento y desarrollo. Las observaciones en microscopio de barrido superficial (Figura 3.6A) evidencian un Ec de

superficie compacta y lisa con ordenamiento celular definido hacia el polo radical. En cambio,

en la Figura 3.6B se presenta una MPE con embriones somáticos fusionados y asincrónicos

en diferentes etapas de desarrollo de manera simultánea, comunes en la etapa de inducción y

proliferación de las MPE, pero poco deseadas para la fase de maduración (Canhoto et al.

1996; Bandyopadhyay y Hamill. 2000)

Figura 3.6. Escáner de estructuras embriogénicas cigóticas y somáticas de N. alpina. A) Embrión cigótico B) Masa Proembriogénica (MPE) C) Embrión somático en estado globular, D) Embrión somático en estado torpedo con protuberancias globulares. El análisis de ultraestructuras permitió visualizar la formación de estructuras globulares en

forma continua (Figura 3.6C), lo que sugiere la presencia de un proceso de embriogénesis

93

somática repetitivo, esto coincide con la presencia de grupos de células embriogénicas de 30 a

40 µm de longitud de forma isodiamétricas en continua división reportadas en C. odorata

(Peña et al. 2010). En la Figura 3.6D se observa el grado de organización celular de un

embrión somático en estado torpedo, el más similar al Ec en ordenamiento celular por su

estado avanzado de desarrollo, presentando múltiples zonas meristemáticas, incluyendo

grupos globulares con conexiones vasculares entre el embrión emergente y el tejido original,

generando un posible embrión secundario, reportes similares se presentan en el estudio

realizado a P. edulis por Lopes et al. (2011)

Por su parte, la similitud entre Es y Ec de N. alpina permite avanzar hacia la automatización

del proceso de ES y la encapsulación de embriones somáticos de raulí (Cartes et al. 2009). No

obstante, antes de considerar a gran escala la aplicación de esta tecnología, es necesario seguir

trabajando para comprender el proceso de desarrollo que conduce a la producción de

embriones somáticos sincrónicos y optimizar el proceso de conversión a planta.

CONCLUSIONES

El presente estudio ha demostrado la necesidad de modificar las condiciones de cultivo en una

fase previa a la germinación, donde las horas de frío son necesarias para alcanzar niveles de

germinación que se manifiesten en mejores tasas de conversión a planta. Lo anterior, sumado

al efecto positivo del ABA en el control de la germinación precoz, permitirá por medio de

estudios sucesivos mejorar el protocolo de multiplicación de clones de N. alpina mediante

embriogénesis somática.

A pesar de no existir reportes acerca de la morfohistología de embriones somáticos en N.

alpina, este estudio permitió validar el proceso morfogénico de embriogénesis somática

conducentes a la micropropagación de la especie, mediante las similitudes encontradas en el

94

proceso embriogénico entre los homólogos cigóticos de N .alpina y de otras especies

relacionadas. Además se logro la diferenciación de los tipos celulares con capacidad

embriogénica y no embriogénica. Estos hallazgos abren el camino para futuras investigaciones

relacionadas con el mejoramiento del proceso de embriogénesis somática en N. alpina.

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CAPITULO 4.

ANALISIS DE VARIACIÓN SOMACLONAL EN EMBRIONES SOMAT ICOS Y

BROTES ADVENTICIOS ADULTOS DE N. alpina, MEDIANTE AFLP

Priscila Cartes R1;María Francisca Beltrán1. Darcy Ríos1; Rodrigo Hasbún1; Manuel

Sánchez-Olate1

1Universidad de Concepción. Facultad Ciencias Forestales, Departamento Silvicultura y Centro de Biotecnología, casilla 160-C, Concepción, Chile, teléfono (56) 41-2207241, fax: (56) 41-2207310, pcartes.r@gmail.com

RESUMEN

La variación somaclonal es un evento que puede aparecer durante el cultivo in vitro, mediante

modificaciones genéticas en las células y los tejidos cultivados. Esta variación se ha usado en

procesos de mejoramiento genético y para ampliar la variación genética natural; sin embargo,

cuando el objetivo es la propagación clonal, como en el caso de la micropropagación del

Nothofagus alpina no es deseada. El objetivo de este estudio fue determinar estabilidad

genética o variación somaclonal en regenerantes de embriones somáticos y brotes adventicios

de N. alpina, obtenidos desde cultivos sucesivos, mediante la técnica molecular de AFLP.

Utilizando 6 combinaciones de partidores se obtuvo un 5,2% y un 14,8 % de fragmentos

polimórficos para embriones somáticos y brotes adventicios respectivamente. Estos resultados

contrastantes permiten determinar estabilidad genética en la línea embriogénica e inestabilidad

para la línea organogénica, sin embargo, en ambos cultivos no se presentan individuos con

características fenotípicas anómalas.

Palabras clave: marcadores moleculares, cultivo in vitro, variación somaclonal,

embriogénesis somática.

100

INTRODUCCIÓN.

Considerando las actuales demandas de la sociedad por productos y servicios procedentes del

bosque, Nothofagus alpina, constituye una fuente de diversificación en la producción forestal

nacional (Cabrera 2000, Gutiérrez 2003), ya que actualmente el 92% de la superficie plantada

corresponde Pinus spp. (Pino) y Eucalyptus spp. (Eucalipto) (INFOR 2009).

En la actualidad en Nothofagus se han obtenido importantes resultados de propagación

mediante micro o macroestacas (Santelices, 1993) entre las que se destacan las ventajas de las

técnicas de micropropagación, en la cual se pueden emplear diversos tipos de tejido vegetativo

o somático (Jordan et al., 1996; Martinez-Pastur y Arena, 1996; Castellanos et al., 2005; Sabja

et al, 2008).

Los procesos que ocurren durante el cultivo in vitro están ayudados por la exposición de los

tejidos a reguladores del crecimiento (auxinas y citoquininas principalmente) que permiten la

división y elongación celular (Margara, 1988; Azcon y Talón, 2000). Las diferentes rutas

morfogénicas utilizadas como sistema de propagación en cultivos de tejidos, suponen una

rápida sucesión de divisiones celulares, durante las cuales las microplantas en desarrollo están

sometidas a una amplia variedad de situaciones estresantes (Larkin y Scowcroft, 1981). Estas

condiciones con frecuencia afectan la estabilidad del genoma, con lo cual es posible obtener

variación de origen nuclear y/o citoplasmática, por lo tanto, encontrar individuos

fenotípicamente y/o genéticamente distintos a la planta madre (Smýkal et al., 2007), los cuales

podrían deberse a errores operacionales, aunque las causas más comunes de variación se

asocian a modificaciones en el ADN o cambios epigenéticos que podrían ser útiles en

programas específicos de mejora, pero en la clonación de individuos la variación de cualquier

tipo es indeseada (Phillips et al., 1994; Rani y Raina, 2000). Este fenómeno se denomina

101

“variación somaclonal” y se define como la variación fenotípica y genética entre plantas

propagadas clonalmente a partir de un clon donador simple (Larkin y Scowcroft, 1981;

Medina et al., 2007). Es importante aclarar que durante el cultivo in vitro, el material vegetal

sufre de cambios hormonales y morfológicos temporales (como aparición o desaparición de

raíces, callo, ramificaciones, morfología de la hoja, etc.), esto se debe al proceso de

rejuvenecimiento, promovido en muchos casos por reguladores de crecimiento, y no a causa

de variación somaclonal (Sánchez y Jiménez, 2009).

La variación somaclonal generalmente es espontánea y los cambios pueden ser heredables,

asociados a “rearreglos” cromosomales, delecciones y mutaciones (Larkin y scowcroft 1981,

Kaeppler et al. 2000, Anu et al. 2004, Sánchez y Jiménez, 2009) o variación somaclonal

asociada a factores epigenéticos que puede ser resultado de un cambio en la expresión de los

genes asociado a cambios en los patrones de metilación del ADN, que puede ser o no

reversible (Kaeppler et al. 2000, Jain 2001; Baránek et al. 2010)

En programas de mejoramiento genético, la variación somaclonal ha sido utilizada para

obtener características agronómicas deseables y heredables en una diversidad de especies

como por ejemplo ajo (Allium sativum L) (Al-Zahim et al. 1999), arroz (Oryza sativa)

(Araújo et al. 2004), chile dulce (Capsicum annuum) (Anu et al. 2004), palma aceitera (Elaeis

guineensis) (Tregear et al. 2002) y crisantemo (Chrysanthemum sp.) (Martín et al. 2002).

Otras variantes somaclonales han sido utilizadas comercialmente por sus características de

resistencia a enfermedades, mejora en la apariencia de la planta, flores y frutos, tamaño, sabor,

fragancia y presencia de metabolitos de interés. Tal es el ejemplo de variantes somaclonales de

fresa (Fragaria x ananassa), resistentes a antracnosis (Hammerschlag et al. 2006).

102

Sin embargo, durante la micropropagación y en bancos de germoplasma in vitro, donde es

necesario conservar la estabilidad del material vegetal y las características fenotipicas de la

especie, este tipo de variación es indeseable (Sánchez y Jiménez, 2009).

Es posible detectar variación somaclonal mediante la comparación de cambios fenotípicos

entre el material parental y en cual se produjo el cambio. Además en los últimos años los

marcadores moleculares utilizados en estudios de evolución genética, poblaciones, ecología,

mapeo genético, clonación de genes entre otras han sido una herramienta útil para detectar

variación somaclonal a nivel de ADN (Cassells y Curry 2001; Gupta y Roy, 2002, Martín et

al. 2002).

Un marcador molecular es cualquier fenotipo molecular oriundo de la expresión de un gen o

de segmentos específicos de ADN, que puede ser detectado y su herencia monitoreada. En un

cruzamiento genético, las características de interés seguirán generalmente unidas a los

marcadores moleculares. Por lo tanto, se pueden seleccionar individuos en los que el marcador

molecular esté presente (Semagn et al., 2006) También son utilizados para caracterizar la

variación somaclonal con gran precisión y en menos tiempo que los análisis fenotípicos

(Medina et al., 2007).

A pesar de su importancia ecológica y económica dentro de las especies nativas, hasta ahora

pocos estudios moleculares (Marchelli et al., 1998; Mattioni et al., 2002), filogenéticos (Hill y

Jordan, 1993; Manos, 1997; Setoguchi et al., 1997) y de variación genética entre poblaciones,

mediante isoenzimas (Marchelli y Gallo, 2000a, b) se han llevado a cabo en especies del

género Nothofagus. Marcadores como los RAPD (Amplificación aleatoria de fragmentos

polimórficos de DNA) e ISSR (Inter-microsatelites) han sido utilizados en la caracterización

de N. nervosa, N. obliqua y N. dombeyi, evaluando el grado de polimorfismo generado y la

103

detección de polimorfismos en el inter-loci, utilizando un cebador diseñado a partir de

dinucleótido o trinucleótidos de secuencia repetitiva (Mattioni et al., 2002).Sin embargo, no se

reportan estudios de su aplicación en detección de variación somaclonal en N. alpina , a pesar

de que si han sido utilizados en otras especies familiarizadas como Quercus robur (Wilhelm et

al., 2005) durante el proceso de embriogénesis somática.

Los RAPDs, polimorfismos derivados de amplificación aleatoria de PCR de sitios específicos

e identificables del ADN, han mostrado ser una herramienta efectiva para detectar variación

somaclonal en un gran número de especies (Hashmi et al., 1997; Santana et al., 1999;

Linacero et al., 2000), sin embargo, algunos estudios los han reportado como problemáticos y

poco claros en comparación con otros marcadores como los AFLPs (Polimorfismo de

Longitud de Fragmentos Amplificados), al momento de detectar variación somaclonal (Fourré

et al., 1997). Los AFLPs, permiten la identificación de un gran número de polimorfismos con

respecto a otras técnicas como los RFLPs (polimorfismos de longitud de fragmentos de

restricción) o los RAPDs (Gonzaga, 2004). Consisten en polimorfismos derivados de la

digestión de ADN genómico, ligación de pequeños oligonucleótidos a los extremos de corte y

amplificación utilizando iniciadores homólogos al adaptador. Es una técnica relativamente

fácil de ejecutar, es reproducible y utiliza pequeñas cantidades de ADN (Medina et al., 2007).

Numerosos estudios de AFLP se han llevado a cabo con la aplicación del protocolo publicado

por Vos et al, (1995), pero sin duda que varias modificaciones se han debido implementar

según la complejidad del genoma de la especie en estudio. Hasbún et al, (2011) plantea para

especies complejas en su genoma como Pinus radiata y entre ellas N. alpina la aplicación de

un protocolo de AFLP utilizando fluorescencia con el fin de lograr una alta reproducibilidad y

sensibilidad junto con detección de una amplia gama de fragmentos utilizando un

secuenciador capilar.

104

En síntesis el cultivo de tejidos in vitro, como proceso de producción de plantas conlleva una

serie de riesgos que implica encontrar a corto o largo plazo individuos fenotípicamente y/o

genéticamente distintos a la planta madre. Por lo tanto, antes que las diferentes rutas

morfogénicas puedan ser explotadas como sistemas de propagación masivos, es necesario

evaluar mediante el uso de marcadores, los regenerantes no fieles al genotipo previo a su

manifestación fenológica (Merkle y Dean, 2000; Botta et al., 2004).

En relación a lo expuesto anteriormente el objetivo de este estudio fue determinar estabilidad

genética o variación somaclonal en regenerantes de embriones somáticos y brotes adventicios

de N. alpina, obtenidos desde cultivos sucesivos, mediante la técnica molecular AFLP.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material Vegetal Embriogénico Se empleó material vegetal procedente de la línea embriogénica de N. alpina RaC-01 (raulí

explanto cotiledonar 01), inducida desde cotiledones aislados de semillas maduras, las cuales

fueron obtenidas a través de polinización controlada (Castellanos et al., 2005). Luego de la

inducción de callo embriogénico y manifestación de embriones somáticos, el cultivo se

dispuso en medio de mantención, consistente en la solución mineral y vitaminas Broadleaved

Tree Medium (BTM) (Chalupa 1983), más los reguladores del crecimiento 6-

bencilaminopurina (BAP) y ácido indolbutírico (AIB) a concentraciones de 0,1 mgL-1

suplementado con 30 gL-1 de sacarosa y 7,0 gL-1 de agar. Se practicaron subcultivos a medio

fresco cada 28 días, los subcultivos en medio nutritivo se alternaron conteniendo reguladores

del crecimiento y en medio base BTM, sin reguladores. Los explantos permanecieron en estas

últimas condiciones hasta el comienzo de los ensayos. El material de inicio para la extracción

105

de ADN consistió en masas pro-embriogénicas (MPE) sometidas a tratamientos de

maduración con presencia de embriones somáticos en estado cotiledonar. Para determinar si

existe variación somaclonal en los embriones somáticos, se denominó de manera arbitraria un

subcultivo 0 y un subcultivo 6 ambos pertenecientes al mismo clon donde se realizaron las

mediciones. En cada caso se extrajo ADN a 10 muestras con tres repeticiones por muestra.

Material Vegetal Organogénico El material organogénico se obtuvo desde yemas y hojas obtenidas de varetas forzadas a brotar

in vitro. La inducción y proliferación organogénica se realizó en medio de cultivo Broadleaved

Tree Medium (BTM) (Chalupa 1983) más los reguladores del crecimiento 1 mgL-1 6-

bencilaminopurina (BAP) y 0,1 mgL-1 ácido indolbutírico (AIB). Para la etapa de elongación

de los brotes se utilizó BTM con la adición de 0,1 mgL-1 BAP y 0.01 mgL-1 de AIB. Se

realizaron 6 subcultivos sucesivos a medio fresco cada 20 días, alternando un sub-cultivo para

proliferación de explantos; y un subcultivo para elongación de las plantas. Para determinar la

frecuencia de variación somaclonal en los brotes adventicios, se denominó de manera

arbitraria un subcultivo 0 y un subcultivo 6 ambos pertenecientes al mismo clon, donde se

realizaron las mediciones. En cada caso se extrajo ADN a 10 muestras con tres repeticiones

por muestra.

Extracción de ADN Se tomaron porciones de entre 100-120 mg de peso fresco del material embriogénico y

organogénico, que fueron homogenizados empleando el equipo de lisis celular (Precellys 24)

adicionándole microesferas de cerámica a una velocidad de vibración de 6000rpm durante

106

15s, posteriormente, se siguió el protocolo de extracción de DNeasy Plant Mini Kit

(QIAGEN®) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La calidad y concentración del

ADN obtenido fue medido por el espectrofotómetro ND-1000, Nanodrop®. La pureza de las

muestras se determinó a través de los índices de absorbancia OD260/280 y OD260/230, donde se

realizaron dos mediciones analíticas. La integridad del ADN fue medida mediante

electroforesis (cámara electroforesis Cole-Parmer, modelo Submarine Horizontal Gel System)

en gel de agarosa al 1% corrido durante 30min a 70V visualizado en un trasiluminador

Vilberlourmat (modelo Rainbow CCTV RMB92).

Analisis AFLPs.

La técnica de AFLP se desarrolló según el protocolo reportado por Hasbún et al. (2011),

utilizando fluoróforos adheridos a los partidores de la amplificación selectiva, con el fin de ser

separados por electroforesis capilar y reconocidos con un secuenciador automático.

La técnica consta de tres pasos: 1) Digestión- ligación: se realizó la digestión a 10 ng µL-1 de

ADN de N. alpina con las enzimas EcoRI y MseI, posteriormente se ligó el producto de la

digestión con adaptadores de doble cadena, específicos para cada enzima, 2) Amplificación

preselectiva: con el producto del paso anterior se realizó una reacción en cadena de la

polimerasa (PCR) utilizando partidores del tipo EcoRI +0 y MseI +0, 3) Amplificación

selectiva: se probaron 16 combinaciones de partidores selectivos del tipo EcoRI+2 o +3 /

MseI+2 o +3 marcados con fluoróforos.

Para realizar el análisis genético de todos los individuos, se procedió primero a elegir las

combinaciones más informativas (Tabla 4.1). Esta selección se realizó según los siguientes

107

criterios; capacidad de amplificación, cantidad de fragmentos polimórficos (entre 50 y 500 pb)

y nitidez de banda. El producto de amplificación fue visualizado en un gel de agarosa al 1 %

(p/v) con 2 µL de bromuro de etidio, posteriormente se realizó la electroforesis capilar con el

secuenciador automático ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer.

Tabla 4.1. Partidores selectivos de AFLPS ensayados en N. alpina

EcoRI MseI CC / CC

CC / CAG

CC / CCA

CC / CCC

CC / CCG

TC / CCG

Análisis de datos.

Los datos fueron analizados utilizando el software GeneMapper v4.0 con el cual se

confeccionó una matriz binaria (1/0) representando la presencia o ausencia del fragmento. Para

esto, se realizó un análisis de varianza molecular (AMOVA) con dos criterios de

jerarquización de los grupos de poblaciones, a priori y a posteriori.

Para el análisis se utilizó el programa GenAlex v. 6.4 (Peakall y Smouse 2006) se realizó una

matriz de distancia genética, que fue utilizada para el análisis de varianza molecular

(AMOVA) entre los subcultivos del material embriogénico y organogénico, realizado según el

método de Michalakis y Excoffier (1996). El análisis AMOVA se realizó con los datos

binarios de todas las combinaciones, mediante permutaciones al azar y significancia de 95%.

A partir del análisis AMOVA se estimó la proporción de varianza atribuida entre y dentro de

108

las muestras; y se realizó el test de significancia de FST entre los tejidos (Michalakis y

Excoffier 1996). Para visualizar el patrón de diferenciación de los tejidos, se construyó un

Análisis de Coordenadas Principales (PCA) a partir de la matriz de distancia usando GenAlex

6.4, basado en el algoritmo de Orloci (1978).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Extracción de ADN El ADN obtenido del material vegetal en estudio poseía la calidad y concentración de ADN

requerida para el procedimiento de AFLP (Tabla 4.2). No obstante, en algunas muestras el

índice de absorbancia 260/230 se encontró fuera de rango óptimo (NanoDrop Technologies

2007). Esto probablemente se debió a la presencia de restos de azúcares en las muestras o

presencia de compuestos aromáticos que afectan la extracción de ADN en muchas especies

(Kundu et al. 2011). La pureza del ADN inicial es clave para la técnica de los AFLP

(Pompanon et al. 2005; Benjak et al. 2006), ya que sólo así se garantiza la completa digestión

por parte de las enzimas de restricción. De lo contrario, la amplificación podría generar

polimorfismo falso (Vos et al. 1995).

Tabla 4.2. Calidad y concentración promedio de ADN de material embriogénico y

organogénico de N. alpina.

Subcultivo Embriones somáticos Brotes adventicios

[ng µL-1] A260/A280 A260/A230 [ ng µL-1] A260/A280 A260/A230

S0 16,1 2,01 2,69 41,2 1,74 1,40

S6 35,7 1,80 1,70 28,1 1.88 1,63

Análisis de AFLP. AFLP es conocida por su aplicabilidad universalidad (no requiere oligonucleótidos específicos

para cada especie), posee una alta reproducibilidad y poder discriminativo entre y dentro

109

especies (Hasbún et al. 2011). Ha demostrado en un gran número de especies ser una

herramienta muy eficaz para la caracterización de variación somaclonal o validación de

fidelidad genética (Gagliardi et al, 2007; Mehta et al, 2011). En el presente estudio de un total

de 288 fragmentos amplificados para el tejido embriogénico, el 2,1 % fue polimórfico para el

subcultivo 0 y un 9,8 % polimórfico para el subcultivo 6, generando un 97,9 % y 90, 2% de

fragmentos monomórficos respectivamente. El en caso de los brotes adventicios se obtuvo un

total de 334 fragmentos amplificados, de los cuales el 8,3% fue polimórfico para el subcultivo

0 y un 21,2% polimórfico para el subcultivo 6, generando un 91,7 % y 78,8% de fragmentos

monomórficos respectivamente. El número de fragmentos detectados por combinación de

partidores osciló entre 26 (E-CC/M-CCG) a 98 (E-CC/M-CC) en ambos tejidos estudiados

(Tabla 4.3). En promedio se registro una frecuencia de polimorfismo en tejido embriogénico

de 5,2 % y en tejido organogénico de 14,8%.

Tabla 4.3: Número de bandas y grado de polimorfismo revelado por las combinaciones de AFLP

para embriones somáticos y brotes adventicios de N. alpina.

Embriones somáticos Brotes adventicios

Partidores Subcultivo 0 Subcultivo 6 Subcultivo 0 Subcultivo 6

EcoRI MseI Total Fragmentos / Bandas

polimórficas

Total Fragmentos / Bandas

polimórficas

E-CC M-CAG 34 (2) 34 (3) 40 (0) 40 (7)

E-CC M-CCA 51(4) 51(8) 60 (5) 60 (13)

E-CC M-CCC 45(0) 45(9) 54(4) 54 (6)

E-CC M-CCG 26(0) 26(3) 38 (9) 38 (18)

E-CC M-CC 92(0) 92(0) 98 (1) 98 (12)

E-TC M-CCG 40(0) 40(10) 44 (9) 44 (15)

Número de bandas 288 (6) 288 (33) 334 (28) 334(71)

110

total

Porcentaje de

polimorfismo

2,1% 9,8% 8,3 % 21,2 %

Los resultados referentes a variación somaclonal en embriones somáticos de raulí en este

estudio alcanzaron un 3% de variación somaclonal al ser comparados entre subcultivo (S0 vs

S6) con un valor- p no significativo (P=0,080) como se presenta en la Tabla 4.4. En cambio,

la variación obtenida entre los subcultivos de los brotes adventicios alcanzo el 19% con un

valor-p significativo (p=0,000).

Tabla 4.4: Análisis de varianza molecular (AMOVA) para embriones somáticos y brotes adventicios de N. alpina según dos niveles jerárquicos: entre subcultivos y dentro del subcultivo.

Fuente de

variación

Embriones somáticos Brotes adventicios

gl SC Variación gl SC Variación

Entre subcultivo 1 1,464 3% 1 10,839 19%

Dentro del

subcultivo 40 35,464 97% 40 84,684 81%

Total 41 36,929 100% 41 95,524 100%

PhiPT o FST 0,034 0,187

Valor- p 0,080 0,000

gl: grados de libertad; SC: suma de cuadrados; V: varianción somaclonal.; valor-p: nivel de significancia.

La ocurrencia de variación somaclonal en los procesos morfogénicos estudiados, se determinó

por comparación de los perfiles moleculares de los subcultivos propagados en forma

convencional, de tal modo que la presencia o ausencia de productos de amplificación

diferentes puede considerarse como una alteración inducida por el cultivo de tejidos, sumado a

los errores de la técnica (Sánchez y Jimenez. 2009).

111

Los resultados del Análisis de Componentes Principales (PCA) mostraron que los dos

primeros componentes para la variable embriones somáticos (Figura 4.1A) fueron

capaces de recoger el 76,6% de la varianza. Dentro del 3% de variación somaclonal

obtenida en los embriones somáticos el 59, 7% estaría explicado por la diferencia que se

produce entre los subcultivos y un 16, 9 % se explicaría por la variación presente dentro

del subcultivo. En el caso de los brotes adventicios dentro del 19 % de variación

somaclonal obtenido las dos componentes principales abarcan el 50,1% de variabilidad,

por lo cual se produce un 30,4% de variación entre los subcultivos y un 19,9% dentro del

subcultivo. En síntesis la vía organogénica entrega mayor variabilidad en comparación

con los embriones somáticos, ya sea entre subcultivo o dentro de este. Esto se refleja en

la dispersión de los datos graficados y puntos atípicos (5-22) presentados en la Figura

4.1B

Figura 4.1. Análisis de Componentes Principales (PCA) representando la variación encontrada entre los subcultivos S0: Subcultivo cero y S6: Subcultivo 6 para embriones somáticos (A) y brotes adventicios (B). Si bien no existen reportes a la fecha de estudios moleculares referentes a variación

somaclonal en raulí. En otras especies la literatura reporta información variada respecto a los

resultados obtenidos en variación somaclonal. En Hevea brasiliensis (Medina et al. 2007) y

Saccharum officinarum (Perera et al. 2010) se reporta variación genéticas en sus líneas

112

estudiadas tanto para sistemas embriogénicos como organogénicos. En cambio en especies

como Quercuas suber (Homero et al. 2001), Bactris gasipaes (Steinmacher et al. 2007),

Arachis retusa (Gagliardi et al, 2007), Secale cereale (Puente et al. 2008) y Bambusa nutans

(Metha et al. 2011), se demostró su estabilidad genética en el tiempo.

Hasta el momento, a pesar de existir variación somaclonal en la línea organogénica de material

adulto de N. alpina, no se presentan alteraciones fenotípicas visibles. Sánchez y Jiménez,

(2009) plantean que además de la tasa normal de variación, propia de las células vegetales en

condiciones normales, formando parte de un tejido en un órgano, hay factores externos,

propios del cultivo in vitro, como medio de cultivo, patrón de desarrollo, edad y número de

subcultivo, entre otros que pueden inducir a la acumulación de variaciones genéticas como por

ejemplo inserción o deleción de un nucleótido, mutaciones puntuales, metilación del ADN etc

(Kaepple et al, 2000), y se pueden manifestar o no, en el fenotipo. La variación significativa

obtenida en el clon de brotes adventivios puede estar directamente relacionada con las

condiciones de cultivo, ya que es una línea que se encuentra en la fase más activa de

proliferación y acumulación de reguladores del crecimiento, principalmente BAP. En

comparación con los embriones somáticos que ya constituye una línea de 6 años de cultivo por

lo cual puede haber alcanzado un grado de adaptabilidad al medio.

CONCLUSIONES

La técnica de marcadores moleculares AFLP permitió obtener productos de amplificación en

la totalidad de las muestras, con 6 combinaciones de partidores utilizados. Los perfiles

moleculares obtenidos posibilitaron caracterizar y diferenciar entre el subcultivo y dentro del

subcultivo, tanto para embriones somáticos como brotes adventicios. Esta información permite

concluir que la línea embriogénica es más estable en comparación con la organogénica, ya que

113

presenta una variación somaclonal despreciable y propia del cultivo. En cambio la vía

organogénica presenta una variación somaclonal significativa, aunque sin anormalidades

visibles en cultivo.

.LITERATURA CITADA

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120

DISCUSION GENERAL

Los estudios existentes a la fecha, referentes a técnicas de propagación en raulí con fines

productivos, se han basado en el establecimiento de áreas productoras y huertos semilleros

clonales para la producción de plantas por vía generativa (Emhart et al., 2000),

macropropagación, a través del enraizamiento de estacas (Santelices, 1993) y

micropropagación mediante organogénesis in vitro, induciendo la formación de brotes

adventicios, multiplicación y posterior enraizamiento de los microtallos juveniles (Jordán et

al., 1996; Martínez-Pastur et al., 2003; Sánchez-Olate et al. 2004), y adultos (Sabja et al.,

2008). Considerando las actuales demandas de la sociedad por productos y servicios

procedentes del bosque, Nothofagus alpina, constituye una fuente de diversificación en la

producción forestal nacional (Cabrera 2000; Gutiérrez 2003), ya que actualmente el 92% de la

superficie plantada corresponde Pinus spp. (Pino) y Eucalyptus spp. (Eucalipto) (INFOR

2009).

Estos aspectos motivaron gran parte del trabajo desarrollado en esta Tesis, en la que se planteó

como objetivo fundamental la propagación y validación de las rutas morfogénicas obtenidas

desde material embrionario y adultos de N. alpina, a través de análisis hormonales,

histológicos y genéticos, con el fin de obtener plantas con fidelidad clonal. Los resultados

obtenidos aportan información valiosa para en el futuro generar o dinamizar el desarrollo

sostenible del raulí en Chile. Conjuntamente desde el punto de vista teórico se obtuvieron

importantes conclusiones relacionadas con la propagación y revigorización de material adulto.

El relación al proceso de embriogénesis somática estudiado a nivel histológico y hormonal, y

comparado con el proceso cigótico muestra numerosas similitudes no tan solo en la especie,

sino que con otras especies relacionadas (Corredoira et al. 2003; Robichaud et al. 2004;

121

Prewein et al. 2004), los resultados obtenidos en las fases de maduración, germinación y

conversión a planta, mostraron cómo mediante la modificación de las condiciones de cultivo,

especialmente en lo referente a la aplicación de reguladores exógenos como ABA y

exposición de las MPE a bajas temperaturas (4°C), fue posible, lograr la proliferación

sostenida de embriones somáticos e incorporar nuevos criterios de germinación con el fin de

mejorar los niveles de germinación como se ha desarrollado en otras especies (Pullman et al.

2003;Vahdati et al. 2008), mostrando parámetros de desarrollo normales e incluso el proceso

de conversión a planta bajo condiciones in vitro.

Adicionalmente, la similitud entre Es y Ec de N. alpina permite avanzar hacia la

automatización del proceso de ES y la encapsulación de embriones somáticos de raulí (Cartes

et al. 2009) o conseguir la complementación de esta técnica de propagación con un sistema de

transformación genética y realizar mejoramiento genético forestal, mediante la transferencia

de caracteres específicos a genotipos seleccionados, sin afectar la riqueza genética de la

especie, como se ha conseguido con éxito en Quercus suber, (Álvarez et al. 2004). No

obstante, antes de considerar a gran escala la aplicación de esta tecnología, es necesario seguir

trabajando para comprender el proceso de desarrollo que conduce a la producción de

embriones somáticos sincrónicos y optimizar el proceso de conversión a planta.

En cuanto a la edad del explanto inicial en este estudio se ha demostrado la posibilidad de

multiplicar in vitro y producir plantas a partir de tejidos juveniles y adultos de raulí, esto es

importante ya que en determinados esquemas de producción y mejora, se requiere retener la

memoria fisiológica del tejido de procedencia. (Gallo et al. 2006). Sin embargo, no es

suficiente con lograr un protocolo de propagación exitosos, es necesario evaluar las posibles

variaciones que se puedan presentar durante y posterior al cultivo in vitro que se desarrolla.

122

Detectar variación somaclonal mediante la comparación de cambios fenotípicos o moleculares

entre el material parental y en cual se produjo el cambio es necesario hoy en día en todo

esquema de propagación clonal (Sánchez y Jimenez. 2009). Además en los últimos años los

marcadores moleculares utilizados en estudios de evolución genética, poblaciones, ecología,

mapeo genético, clonación de genes entre otras han sido una herramienta útil para homologar

en el cultivo in vitro (Cassells y Curry 2001; Gupta y Roy, 2002, Martín et al. 2002). Esto

queda demostrado en este estudio que se puedo determinar el porcentaje de variación

somaclonal obtenida desde regenerantes de un clon embriogénico y otro organogénico

mediante la técnica de AFLP y generar una aproximación valida de certificación genética para

la especie.

La importancia de los resultados obtenidos en esta investigación, radica en generar los

antecedentes de un nuevo modelo de propagación en la especie Nothofagus alpina, ésta vez

por medio de embriogénesis somática de material selecto o propagación de material vegetal

adulto de de características fenotípicas conocidas generando una nueva ventana en la

propagación de una especie leñosa de interés forestal. Producto de lo anterior, queda

establecida la factibilidad técnica de su empleo futuro como una alternativa de masificación de

clones selectos, mediante su certificación con marcadores moleculares, incorporando a la

especie dentro del marco de un programa de mejoramiento genético y del mismo modo, su

empleo como modelo experimental en la investigación científica de procesos de diferenciación

celular en plantas.

123

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126

CONCLUSIONES.

• En relación al efecto de ABA exógeno sobre la maduración de embriones somáticos de

Nothofagus alpina.

La exposición a bajas temperaturas de los embriones somáticos y la aplicación de ABA

exógeno al medio de cultivo tiene un efecto positivo sobre el control de la embriogénesis

somática secundaria y germinación precoz de los embriones somáticos, reduciendo su

incidencia y permitiendo mejorar los niveles de conversión a planta de los embriones

somáticos. A su vez, los embriones cigóticos maduros presentan niveles endógenos de ABA

significativamente mayor en comparación con los embriones somáticos en estado cotiledonar

y sometidos a las diferentes concentraciones de ABA exógeno, lo cual explica la brecha en

conversión a planta que todavía existe entre embriones somáticos y cigóticos.

• En relación a la revigorización de material adulto y establecer metodologías de cultivo

in vitro de Nothofagus alpina.

La revigorización de material vegetal adulto a partir de yemas es una alternativa válida de

propagación para genotipos seleccionados de N. alpina, independiente de la edad ontogénica.

Mediante la presencia de BAP en el medio de cultivo se obtuvo organogénesis adventicia

corroborada por los análisis histológicos, que permitió establecer cadenas proliferativas y dar

viabilidad al proceso de propagación in vitro en las fases de proliferación, elongación caulinar y

enraizamiento, etapas claves en el proceso de propagación vía organogénesis in vitro.

127

• En relación a la caracterización histológica de los estados embriogénicos y respuestas

morfogénicas de Nothofagus alpina.

A pesar de no existir reportes acerca de la morfohistología de embriones somáticos en N.

alpina, este estudio permitió validar el proceso morfogénico de embriogénesis somática

conducentes a la micropropagación de la especie, mediante las similitudes encontradas en el

proceso embriogénico entre los homólogos cigóticos de N .alpina y de otras especies

relacionadas. Además se logro la diferenciación de los tipos celulares con capacidad

embriogénica y no embriogénica. Por otro lado, la secuencia histológica de brotes adventicios

permitió corroborar el proceso de regeneración in vitro en N. alpina vía organogénesis indirecta,

evidenciado a través de la formación de domos meristemáticos y conexión al tejido materno

(callo).

• En relación a evaluar posibles variaciones somaclonales de las líneas morfogénicas en

Nothofagus alpina.

La variación somaclonal se ha usado en procesos de mejoramiento genético y para ampliar la

variación genética natural; sin embargo, cuando el objetivo es la propagación clonal, como en

el caso de la micropropagación del Nothofagus alpina no es deseada. Este estudio permitió

determinar variación somaclonal en regenerantes de embriones somáticos y brotes adventicios

de N. alpina, obtenidos desde cultivos sucesivos. Independiente del resultado obtenido,

presencia de estabilidad genética para embriones somáticos y una variación considerable para

la línea organogénica. La importancia radica en generar un acercamiento entre las

herramientas moleculares y el cultivo de tejido que permita en el tiempo trabajar de manera

masiva con la certificación genética de los individuos propagados.

128