UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS...
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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE QUÍMICA Y FARMACIA SEMESTRAL TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO PARA OPTAR POR EL GRADO DE QUÍMICOS Y FARMACÉUTICOS TEMA: OBTENCIÓN DE UNA FRACCIÓN RICA EN OMEGAS A PARTIR DEL ACEITE DE SEMILLAS DE NARANJA (Citrus sinensis) AUTORES: CARLOS LUIS ALVAREZ ALVAREZ NARCISA DESIREE VILLÓN ÁLVAREZ TUTOR Ph.D. ADONIS BELLO ALARCÓN GUAYAQUIL – ECUADOR 2019
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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE QUÍMICA Y FARMACIA
SEMESTRAL
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO PARA OPTAR POR EL GRADO DE QUÍMICOS Y FARMACÉUTICOS
TEMA:
OBTENCIÓN DE UNA FRACCIÓN RICA EN OMEGAS A PARTIR DEL ACEITE DE SEMILLAS DE NARANJA (Citrus sinensis)
AUTORES: CARLOS LUIS ALVAREZ ALVAREZ
NARCISA DESIREE VILLÓN ÁLVAREZ
TUTOR Ph.D. ADONIS BELLO ALARCÓN
GUAYAQUIL – ECUADOR 2019
XI
DEDICATORIA
Quiero dedicar este esfuerzo de mi trabajo y dedicación a Dios, quien me ha
guiado durante mi carrera, a mi padre Luis Alvarez Cedeño, que desde el cielo está
feliz de verme cumplir uno de mis sueños y de él, te he cumplido padre.
A mi abnegada madre Esilda Alvarez Lavayen por ser mi pilar fundamental, quien
siempre me anima y se alegra de mis éxitos, a mis amadas abuelas Grecia Lavayen
Vera y Araceli Cedeño Coronel. Gracias por todo el apoyo, a mis hermanos Oliver,
Eduardo, Jenniffer, por ustedes también luché incansablemente para que se sientan
orgullosos de mí.
Por último, pero no menos importantes a mis familiares, gracias a ustedes hoy
soy un hombre exitoso con humildad y don de servicio.
Carlos Luis Alvarez Alvarez
XII
DEDICATORIA
Ángela Álvarez, mi vida. Sin tu apoyo, confianza y fe no lo habría logrado. Todo
lo que he sido, soy y seré, es por ti.
Normanda Pisco e Ismael Álvarez, mi todo. Son el motivo principal por el cual he
logrado esto, les daré solo lo mejor porque no merecen menos.
María José Briones, prima, hermana, madre. Mi soporte en el cambio de vida
necesario para lograr este objetivo. Siempre te necesitaré a mi lado.
Jeannine Álvarez, mi compañera. Jamás olvidaré la acogida, el amor y la
paciencia brindada durante estos largos años. Este logro también es suyo.
César Briones, mi padre. Las aspiraciones que junto a otras personas tiene para
mi las haré realidad, esta es una de ellas, y es para usted.
Christian Montoya, mi amor. El apoyo que me diste durante cuatros años, en
tiempos cuando todo parecía derrumbarse, siempre será recordado.
Narcisa Desiree Villón Álvarez.
XIII
AGRADECIMIENTOS
La gratitud es uno de los valores que siempre demuestro a quienes están a mi
lado, quiero agradecer al Todopoderoso por bendecirme cada día, a mis padres por
guiarme, protegerme por darme su apoyo constante para hacer de mí una persona
de bien, a mis hermanos por su valioso tiempo que compartimos, gracias familia por
estar para mí en cada decisión y proyecto que decido tomar.
A mi compañera de proyecto Narcisa Villón Álvarez, con quien compartí logros
en todo este tiempo de amistad, gracias por demostrar que somos un gran equipo.
A mis amigos: Madelyne, Ximena, Angie, Jennifer, Henry, gracias por hacer este
camino más fácil y mantenernos juntos durante toda la carrera universitaria.
Al PhD. Adonis Bello Alarcón, Tutor académico, por brindarnos sus valiosos
conocimientos y orientación en este proyecto.
Agradezco al Director del Laboratorio de Investigaciones de la Facultad de
Ciencias Químicas, Q.F. Oswaldo Pesantez por permitirme utilizar las instalaciones
durante el proceso y desarrollo de mi tesis.
Agradezco al Grupo de químicos que laboran en el área de Bromatología en el
Laboratorio de referencia de la Agencia Nacional de Regulación, Control y Vigilancia
Sanitaria, por todas las atenciones y apoyo brindado para realizar parte de mi tesis
en sus instalaciones.
De igual manera, agradezco a la Ing. Ileana Herrera Morán, Subgerente
comercial del laboratorio WSS Ecuador, quien me facilitó con la obtención de mis
resultados en el tiempo estipulado.
Ahora puedo decir con convicción que soy una persona ordinaria haciendo cosas
extraordinarias.
Carlos Luis Alvarez Alvarez.
XIV
AGRADECIMIENTOS
Romina Briones, mi otra mitad, gracias por ser la que siempre atiende mi llamado
cuando necesito ayuda. Viviana Álvarez y Cecibel Álvarez, muchas gracias por
todos los momentos a mi lado, palabras de apoyo, abrazos y celebraciones. Marcos
Bartels, gracias padrino por ser parte de esta familia y brindarme consejos para mi
desarrollo profesional.
A mi amigo, con quien realicé este viaje lleno de sabiduría, Carlos Alvarez.
Gracias por esta maravillosa experiencia y por estar conmigo en las buenas, en las
malas y en las peores.
A mis compañeros de todo. Jennifer, Angie, Madelyne, Ximena y Henry, gracias
por hacer esta experiencia más divertida y por empujarme a ser mejor cada día.
Imposible haber encontrado a mejores personas.
A mi tutor, Adonis Bello. Gracias por ser la guía que necesitaba para realizar este
proyecto y por regalarme más conocimiento del que pude haber imaginado.
Al director del Laboratorio de Investigaciones de la Facultad de Ciencias
Químicas, Q.F. Oswaldo Pesantez. Gracias permitirme utilizar las instalaciones
durante el proceso y desarrollo del proyecto.
Al grupo de químicos que laboran en el área de Bromatología en el Laboratorio
de referencia de la Agencia Nacional de Regulación, Control y Vigilancia Sanitaria,
por todas las atenciones y apoyo brindado para realizar parte de este proyecto en
sus instalaciones.
A la Ing. Ileana Herrera Morán, Subgerente comercial del laboratorio WSS
Ecuador. Gracias por facilitar la obtención de resultados necesarios para este
proyecto.
Narcisa Desiree Villón Álvarez.
XV
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN .............................................................................................................. XXII
ABSTRACT ............................................................................................................ XXIII
INTRODUCCIÓN.......................................................................................................... 1
CAPÍTULO I: PROBLEMA .......................................................................................... 3
I.1 Planteamiento y Formulación del Problema .............................................................. 3
I.1.1. Planteamiento del Problema. ............................................................................. 3
I.1.2. Formulación del Problema ................................................................................. 4
I.2. Justificación e Importancia ....................................................................................... 5
I.3. Hipótesis .................................................................................................................. 7
I.4. Objetivos .................................................................................................................. 7
I.4.1 Objetivo general .................................................................................................. 7
I.4.2 Objetivos específicos .......................................................................................... 7
I.5. Variables ................................................................................................................. 8
I.5.1. Operacionalización de las variables. .................................................................. 8
CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO ............................................................................... 9
II.1. Aspectos generales de la naranja (Citrus sinensis). ................................................ 9
II.1.1. Taxonomía. ....................................................................................................... 9
II.1.2. Origen. .............................................................................................................. 9
II.1.3. Características. ............................................................................................... 10
II.1.4. Composición. .................................................................................................. 10
II.1.5. Propiedades, usos y beneficios. ...................................................................... 11
II.1.6. Aceites Esenciales de Naranja. ....................................................................... 11
II.1.7. Semillas de Naranja (Citrus sinensis). ............................................................. 12
II.2. Extracción de Aceites en Semillas. ........................................................................ 12
II.2.1. Aceites vegetales. ........................................................................................... 13
XVI
II.2.2. Extracción de prensa manual. ......................................................................... 13
II.2.3. Extracción mecanizada temprana. .................................................................. 14
II.2.4. Extracción con prensa hidráulica. ................................................................... 14
II.2.5. Extracción con prensa de tornillo. ................................................................... 15
II.2.6. Extracción con solvente. ................................................................................. 16
II.2.7. Extracción con fluidos supercríticos. ............................................................... 17
II.3. Parámetros fisicoquímicos estudiados en el aceite. .............................................. 17
II.3.1. Densidad relativa. ........................................................................................... 17
II.3.2. Índice de refracción. ........................................................................................ 18
II.3.3. Pérdida por calentamiento. ............................................................................. 18
II.3.4. Índice de yodo. ............................................................................................... 18
II.3.5. Índice de acidez. ............................................................................................. 18
II.3.6. Índice de saponificación. ................................................................................. 19
II.3.7. Índice de peróxido. .......................................................................................... 19
II.3.8. Materia insaponificable. .................................................................................. 19
II.4. Ácidos grasos. ....................................................................................................... 19
II.4.1. Ácidos grasos saturados. ................................................................................ 20
II.4.2. Ácidos grasos insaturados. ............................................................................. 20
II.5. Cromatografía Líquida de Ultra-Alta Resolución. ................................................... 20
CAPÍTULO III: MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................. 22
III.1. Tipo de Investigación: ........................................................................................ 22
III.2. Equipos, Materiales y Reactivos: ....................................................................... 22
III.2.1. Equipos .......................................................................................................... 22
III.2.2. Reactivos ....................................................................................................... 23
III.3. Muestra: .............................................................................................................. 24
III.4. Metodología Experimental: ................................................................................ 24
III.4.1. Material vegetal. ............................................................................................. 24
XVII
III.4.2. Preparación de la muestra de semillas de naranja. ........................................ 25
III.4.3. Extracción del aceite. ..................................................................................... 25
III.4.4. Control de calidad del aceite de los residuales de semillas de naranja. ......... 26
III.4.5. Determinación del perfil lipídico de ácidos grasos y omegas presentes en el
aceite de las semillas de naranja. ............................................................................. 31
III.4.6. Separación de ácidos grasos saturados e insaturados que forman parte del
aceite de la semilla por diferencia en el punto de fusión. .......................................... 33
CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIONES: .................................................... 35
IV.1. Material Vegetal ................................................................................................. 35
IV.2. Obtención del aceite .......................................................................................... 35
IV.3. Parámetros Fisicoquímicos del Aceite. ............................................................. 36
IV.4. Perfil lipídico ........................................................................................................ 38
IV.5. Obtención de la fracción rica en omegas. ......................................................... 39
CONCLUSIONES ....................................................................................................... 42
RECOMENDACIONES .............................................................................................. 43
BIBLIOGRAFÍA.......................................................................................................... 44
ANEXOS .................................................................................................................... 48
XVIII
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I Operacionalización de las variables. .................................................................. 8
Tabla II. Valor nutricional de la naranja (Citrus sinensis) ................................................. 10
Tabla III. Contenido de semillas de naranja ..................................................................... 12
Tabla IV. Equipos utilizados en los ensayos realizados junto a su marca, modelo y serie.
........................................................................................................................................ 22
Tabla V. Reactivos, marca y cantidad de consumo utilizados en los ensayos realizados. 23
Tabla VI. Condiciones cromatográficas ........................................................................... 32
Tabla VII. Puntos de fusión de ácidos grasos saturados e insaturados. .......................... 33
Tabla VIII. Rendimiento de las semillas de naranja (Citrus sinensis) y aceite obtenido. .. 35
Tabla IX. Parámetros fisicoquímicos del aceite de semillas de naranja. .......................... 36
Tabla X. Perfil lipídico del aceite obtenido a partir de semillas de naranja. ...................... 38
Tabla XI. Perfil lipídico totalitario del aceite obtenido a partir de semillas de naranja. ...... 38
Tabla XII. Resultados, promedio y desviación estándar del ensayo para determinación de
índice de yodo en fracción rica en omegas. ..................................................................... 40
XIX
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Obtención de aceite por prensa manual. .......................................................... 13
Figura 2. Molino de borde asistido por caballo. ............................................................... 14
Figura 3. Prensa hidráulica ............................................................................................. 15
Figura 4. Prensa de tornillo. ............................................................................................ 15
Figura 5. Equipo Soxhlet. ................................................................................................ 16
Figura 6. Diagrama de extracción por fluido supercrítico. ................................................ 17
Figura 7. Cromatograma de análisis de la muestra de aceite de semilla de naranja. ...... 39
Figura 8. Certificación taxonómica de la planta utilizada para la extracción de aceite de
semillas............................................................................................................................ 48
Figura 9. Medición de ancho y largo de semillas individuales. ........................................ 49
Figura 10. Peso de semillas individuales. ........................................................................ 49
Figura 12. Secado de semillas en la estufa. .................................................................... 49
Figura 11. Triruración de la nuez de las semillas. ........................................................... 49
Figura 14. Peso de cartucho con muestra. ...................................................................... 50
Figura 13. Extracción del aceite. ..................................................................................... 50
Figura 16. Aceite de Semillas. ......................................................................................... 50
Figura 15. Rotaevaporación. ........................................................................................... 50
Figura 17. Índice de refracción. ....................................................................................... 51
Figura 18. Densidad relativa. .......................................................................................... 51
Figura 20. Índice de yodo. ............................................................................................... 51
Figura 19. Perdida por calentamiento. ............................................................................ 51
Figura 21. Índice de acidez. ............................................................................................ 51
Figura 22. Índice de saponificación. ................................................................................ 51
Figura 25. Índice de peróxido. ......................................................................................... 52
Figura 24. Baño de vapor materia insaponificable. .......................................................... 52
Figura 23. Materia insaponificable. .................................................................................. 52
Figura 26. Informe de ensasyo del perfil lípidco por UPLC - PDA. .................................. 53
Figura 27. Informe de ensayo del perfil lípidico por UPLC - PDA. ................................... 54
Figura 28. Información de metodología empleada en la determinación delperfil lípidico de
Ácidos Grasos. ................................................................................................................ 55
Figura 29. Información de metodología empleada en la determinación delperfil lípidico de
XX
Ácidos Grasos. ................................................................................................................ 56
Figura 30. Cromatograma de análisis de la muestra de aceite de semillas de naranja. ... 57
Figura 35. Acidulación de la muestra. ............................................................................. 58
Figura 33. Baño maría en la separación de Ácidos Grasos. ............................................ 58
Figura 34. Toma de pH. .................................................................................................. 58
Figura 32. refrigeración del precipitado. .......................................................................... 58
Figura 31. Formación de prescipitado. ............................................................................ 58
XXI
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo A. Certificación taxonómica de la plata utilizada para la extracción de
aceite de semillas..…….………………………………………………………………………… 48
Anexo B. Parámetros realizados en las semillas……………………………………………. 49
Anexo C. Caracterización fisicoquímica del aceite de semillas de naranja Citrus
sinensis…………………………………………………………………………………………… 50
Anexo D. Resultados de análisis del perfil lipídico al aceite de semillas de naranja
Citrus sinensis…………………………………………………………………………………… 53
Anexo E. Separación de los ácidos grasos insaturados en el aceite de semillas de
naranja Citrus sinensis…………………………………………………………………………. 58
Anexo F. Concentraciones del gradiente utilizado para la determinación del perfil
lipídico……………………………………………………………………………………….. 59
XXII
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA QUÍMICA Y FARMACIA
UNIDAD DE TITULACIÓN
“OBTENCIÓN DE UNA FRACCIÓN RICA EN OMEGAS
A PARTIR DEL ACEITE DE SEMILLAS DE NARANJA
(Citrus sinensis)”
Autores: Carlos Luis Álvarez Álvarez
Narcisa Desiree Villón Álvarez
Tutor: Ph.D. Adonis Bello Alarcón
RESUMEN
La presente investigación presenta como objetivo principal aplicar una metodología para obtener una fracción enriquecida de ácidos grasos insaturados a partir del aceite fijo extraído de semillas de naranja (Citrus sinensis) recolectada como desechos de la producción del jugo en diferente establecimiento de la ciudad de Guayaquil. La extracción del aceite se realizó por método de Soxhlet con n-hexano como disolvente, obteniendo un rendimiento de aceite de 46,90%. El análisis fisicoquímico del aceite crudo mostró una densidad relativa de 0,85; pérdida por calentamiento 1,43%; índices de: yodo 24,23mg/100g; acidez 3,52mgKOH/g, saponificación 226,62mgKOH/g; peróxido 7,69; refracción 1,47 y materia insaponificable 0,50%. El análisis por Cromatografía Líquida de Ultra-Alta resolución del aceite crudo mostró una concentración de 33.65% de ácidos grasos saturados, 66,22% de ácidos grasos insaturados, conteniendo 4,78% de Omega 3 y 37,59% de Omega 6. El fraccionamiento del aceite en ácidos grasos saturados e insaturados se realizó mediante la metodología de diferencias en el punto de fusión con temperatura controlada. La determinación del índice de yodo dio como resultado 16,88mg/100g para la fracción rica en omegas y 5,36mg/100g para el residuo graso, demostando que fue posible la obtención de una fracción con un alto porcentaje de ácidos grasos insaturados.
Palabras Claves: Citrus sinensis¸ aceite de semilla, ácidos grasos insaturados, propiedades fisicoquímicas.
XXIII
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA QUÍMICA Y FARMACIA
UNIDAD DE TITULACIÓN
"OBTAINMENT OF AN ENRICHED FRACTION OF OMEGAS
FROM ORANGE (Citrus sinensis) SEED OIL"
Authors: Carlos Luis Álvarez Álvarez
Narcisa Desiree Villón Álvarez
Advisor: Ph.D. Adonis Bello Alarcón
ABSTRACT
The aim of this research is to apply a methodology to obtain an enriched fraction of unsaturated fatty acids from oil extracted from orange seeds (Citrus sinensis), collected from juice production in different establishments in Guayaquil city. The extraction of the oil was carried out by Soxhlet method with n-hexane as solvent and an oil yield of 46.90% was obtained. The physicochemical analysis of the crude oil showed a relative density of 0.85; heating loss 1.43%; Indices of: iodine 24.23mg/100g; acidity 3.52mgKOH/g, saponification 226.62mgKOH/g; peroxide 7.69; refraction 1.47 and unsaponifiable matter 0.50%. Ultra-high resolution liquid chromatography analysis of crude oil showed a concentration of 33.65% of saturated fatty acids, 66.22% of unsaturated fatty acids, containing 4.78% of Omega 3 and 37.59% of Omega 6. Fractionation of oil into acids Saturated and unsaturated fats was performed using the difference in melting point methodology with controlled temperature. The determination of the iodine index resulted in 16.88mg /100g for the fraction rich in omegas and 5.36mg/100g for the fatty residue and it demonstrated that it was possible to obtain a fraction with a high percentage of unsaturated fatty acids.
Keywords: Citrus sinensis, seed oil, unsaturated fatty acids, physico-chemical parameters.
1
INTRODUCCIÓN
En la familia botánica de Rutaceaes, los cítricos (Citrus) son los más abundantes
y de fácil cultivo. Entre ellos, se destacan sus usos industriales, tanto medicinal
como alimenticio. Precisamente, esta última característica hace que se distribuya
ampliamente en la mayoría de los países del mundo. Los frutos de los cítricos son
de sabor amargo y útiles en la dieta por su gran contenido en vitamina C y otras
sustancias que proporcionan beneficios terapéuticos, profilácticos y depurativos
contra afecciones en el cuerpo, en particular resulta muy reconocido su utilización
en los problemas del sistema respiratorio (Ancillo y Medina, 2019).
Dentro de los Citrus, uno de los árboles más cultivados alrededor del planeta se
encuentra la Naranja (Citrus sinensis). Según Ancillo y Medina (2015), esta especie
tiene su origen en la hibridación de dos especies más antiguas: zamboa (Citrus
máxima) y mandarina (Citrus reticulata). El nombre en español naranja tiene su
origen en la antigua Persia donde era conocida como narang.
En la actualidad, la producción mundial de Citrus sinensis es alrededor de 52
millones de toneladas. Entre los países con mayor producción de este fruto se
encuentran Brasil, China, Estados Unidos y México (Departamento de Estados
Unidos para la Agricultura y la Alimentación [USDA], 2019).
En la industria farmacéutica, el aceite esencial extraído a partir de las glándulas
en su cáscara es muy deseado ya que cuenta con beneficios antiinflamatorios,
relajantes, promueve la producción de colágeno, entre otros. En la industria
alimentaria, la pulpa de este fruto es la más cotizada en su familia para la producción
de jugos y zumos (Yances, 2018).
En Ecuador, hasta el 2018 la naranja se encontró entre los 25 cultivos con más
relevancia, con un promedio 300 naranjas por árbol al año en alrededor de 56 mil
hectáreas de cosecha. En el sector norte de la ciudad de Guayaquil, la venta de
estos jugos es un comercio creciente. Los subproductos derivados de esta industria
están conformados entre otras cosas por cáscara y semillas, los cuales pueden
utilizarse para el desarrollo de varios productos de valor agregado teniendo como
ejemplo, los aceites (Yances, 2018).
2
Los aceites de origen vegetal obtenidos de semillas presentan numerosas
aplicaciones industriales y para consumo humano. Este producto es muy estudiado
debido a su gran cantidad de ácidos grasos insaturados, lo que los puede convertir
en una fuente principal de omegas (Ancillo y Medina, 2015).
Los omegas son compuestos que en la actualidad se consideran indispensables,
ya que el organismo no puede sintetizarlos y se deben obtener mediante la dieta,
son muy aceptados por consumidores ecuatorianos a pesar de que los precios son
altos y a veces inaccesibles para cierto tipo de mercado (Ancillo y Medina, 2015).
Dado lo expuesto, la finalidad de esta investigación es utilizar las semillas
consideradas desechos de la industria de jugos ambulantes en Guayaquil y
presentar resultados de extracción y caracterización fisicoquímica del aceite crudo
de estas. Finalmente, con la aplicación de una técnica de separación basada en las
diferencias de punto de fusión se obtiene una fracción rica en ácidos grasos
insaturados (omegas) que son ampliamente demandados por la industria de
alimentos, la farmacia y la ciencia cosmética.
3
CAPÍTULO I: PROBLEMA
I.1 Planteamiento y Formulación del Problema
I.1.1. Planteamiento del Problema.
Los ácidos grasos insaturados presentan un sin número de beneficios para la
salud. Los comúnmente llamados “omegas” poseen una mayor aceptación por los
consumidores ecuatorianos a pesar de que los precios son altos y a veces
inaccesibles para cierto tipo de mercado. Entre otros elementos, las distribuidoras
farmacéuticas justifican estos valores, alrededor de los treinta dólares, porque estos
productos son importados y en consecuencia hay que cubrir impuestos y otros
gastos.
En el mercado artesanal del Ecuador, gran parte de la población comercializa
extractos de frutas para consumir, y como resultado de esta práctica se generan
residuos como las semillas, cortezas, cáscaras, entre otros. Estos desechos de la
industria de alimentos con el tiempo pudieran generar un impacto negativo en el
medio ambiente, ya que los artesanos no tienen conocimiento de dónde
depositarlos, o simplemente los dejan acumular en la vía pública, causando malos
olores y acumulación de bacterias. Si se toma como ejemplo la naranja (Citrus
sinensis) en la ciudad de Guayaquil, diariamente se procesan por local pequeño
alrededor de 700 frutas que generan importante cantidad de cáscara y semillas,
cuyo único destino es ser desechadas.
Estos desechos se podrían convertir en materia prima para extraer aceites
vegetales ricos en ácidos grasos insaturados u otros compuestos necesarios para
la salud y el bienestar general. Por otro lado, si se considera la posibilidad de
producir nacionalmente, con los desechos, productos de alta demanda los costos
serían más bajo y en consecuencia aumentaría el número de personas que
adquieren estas sustancias. Además de generar proyectos de emprendimientos que
permitan dar vinculación laboral a profesionales y personas de apoyo.
La demanda nacional de ácidos grasos insaturados (omegas) ha incrementado
con el pasar de los años, sin embargo, existe dependencia de la importación como
materia prima para la elaboración de suplementos medicinales. Por otro lado, en el
4
país se generan desechos de la industria de los alimentos que pueden ser utilizados
para la obtención de estos productos beneficiosos para la salud.
I.1.2. Formulación del Problema
En base a lo anterior, se plantea la siguiente interrogante: ¿Cómo puede
obtenerse una fracción rica en omegas a partir del aceite obtenido de las semillas
de naranja?
5
I.2. Justificación e Importancia
Los ácidos grasos insaturados contienen uno o varios dobles enlaces aislados
(no conjugados) en una configuración trans (Gómez y de la Fuente, 2019). La
reserva energética más importante del organismo la constituyen las grasas,
proporcionan 9 kilocalorías por gramo (Kcal/g), se encuentran en variedad de
alimentos, desarrollando funciones inmunológicas, estructurales y fisiológicas,
interviniendo en el transporte de vitaminas liposolubles (Cabezas, Hernandez y
Vargas, 2016).
Diferentes reportes científicos demuestran que consumir ácidos grasos
insaturados pueden producir efectos beneficiosos en enfermedades como lupus
eritomatoso, diabetes mellitus tipo 2, cáncer, arterioesclerosis, hiperlipidemia,
síndrome metabólico, entre otras. Debido a la importancia de este efecto benéfico
en enfermedades cardiovasculares, diferentes asociaciones internacionales
emitieron sus recomendaciones para su consumo (Castellanos y Rodríguez, 2015).
Para obtener los beneficios anteriormente mencionados, es necesario separar la
mezcla de ácidos grasos que origina la saponificación de aceites y grasas, fuentes
usualmente empleadas para la obtención de estos compuestos, en dos fracciones
donde una de ellas, por lo general llamada "oleína", que contiene la cantidad más
alta de ácidos insaturados, mientras que la otra parte es llamada "estearina", en la
cual se reduce la cantidad posible de estos ácidos (Haraldsson, 1984). Este
proyecto se centrará en las "oleínas" por su alta cantidad de ácidos grasos
insaturados y extensas funciones benéficas en la fisiología del ser humano. Los
ácidos grasos insaturados, “oleínas”, son aquellos que no tienen todos los enlaces
saturados por hidrógenos, sino que cuentan con dobles enlaces entre carbonos,
preferente en disposición espacial “cis”. El término omega define la posición del
primer doble enlace a partir del metilo terminal de la molécula (Mckee y Mckee,
2014).
El creciente interés en el uso de compuestos de origen natural que pueden
contribuir a mejorar la salud del consumidor ha llevado a que se exploren recursos
naturales como aditivos alimenticios (Rahal, Barba, Barth y Chevalor, 2015).
6
En Ecuador, el consumo de omegas, si bien es aceptado por la población, se ve
afectado por los altos precios establecidos en el mercado de importación. Al usar el
desecho de productos orgánicos nacionales, como las semillas no comestibles de
los frutos utilizados en la industria de alimentos, se dará la oportunidad de poder
obtener a un precio más bajo los ácidos grasos insaturados. La calidad de los
aceites extraídos depende necesariamente del proceso de extracción, los solventes
usados, origen del material, el almacenamiento previo y el pretratamiento del mismo
(Pereira, Hamerski, Andrade, Scheer y Corazza, 2017).
Como principales beneficiarios de este proyecto se encuentran los estudiantes y
docentes participantes de la Facultad de Ciencias Químicas, que al finalizar
dominarán técnicas para separación de ácidos grasos saturados e insaturados. La
Facultad de Ciencias Químicas se beneficiará al desarrollar la metodología de
recuperación de materiales desechos que podría ser utilizada como nuevo material
para impartir clases, evitando la problemática que es la obtención de muestras. La
industria de alimentos y farmacéutica podrán adoptar la metodología y transformar
semillas consideradas desechos, en productos de valor agregado y obtener
mayores ingresos.
En el campo, los productores de las frutas podrían tener más demanda de sus
artículos, ya que las grandes productoras estarían interesadas en obtener las
semillas y comercializar el producto con valor agregado, con esto, ellos tendrían la
oportunidad de aumentar su costo y tener mayores ingresos. Finalmente, la
población se beneficiará ya que, al obtener estos ácidos grasos insaturados
nacionalmente, no habrá necesidad de exportarlos, por lo tanto, los precios bajarán
significativamente facilitando su adquisición y consumo.
Este trabajo se fundamenta en la necesidad de investigar nuevas fuentes de
ácidos grasos insaturados en el país, aprovechando residuales de la industria de
alimentos para de esa forma, minimizar los posibles efectos nocivos que, como
basura acumulada, estos remanentes puedan producir en el medio ambiente.
7
I.3. Hipótesis
La aplicación del método de separación por diferencia en el punto de fusión de
los ácidos grasos insaturados permite obtener una fracción rica en omegas en el
aceite de semillas de (Citrus sinensis).
I.4. Objetivos
I.4.1 Objetivo general
• Aplicar una metodología para la obtención de una fracción de omegas a partir
del aceite de las semillas de naranja (Citrus sinensis)
I.4.2 Objetivos específicos
• Determinar el rendimiento del aceite obtenido a partir de las semillas de
naranja.
• Analizar los parámetros fisicoquímicos y de calidad del aceite obtenido a
partir de las semillas de naranja.
• Determinar mediante Cromatografía Líquida de Ultra-alta Resolución (UPLC)
el perfil lipídico del aceite obtenido
• Aplicar la técnica de separación por diferencia de punto de fusión para
obtener una fracción con un alto contenido de omegas.
8
I.5. Variables
En base a la hipótesis planteada en esta investigación se identificaron tres
variables que se presentan en el acápite I.5.1
I.5.1. Operacionalización de las variables.
En la Tabla I se resumen los indicadores e índices de medición de las
variables definidas en esta investigación
Tabla I. Operacionalización de las variables.
Tipo Variables Conceptualización Indicador
Dependiente Fracción rica en
omegas
Parte separada del aceite que posee gran cantidad
de ácidos grasos insaturados esenciales.
Índice de yodo (mg/100g)
Independiente
Calidad del aceite vegetal
Conjunto de propiedades o atributos que
posee un aceite y que determina el grado de
aceptación del consumidor
Humedad (%) Materia Insaponificable (%) Densidad (mg/ml) Índice de refracción Índice de acidez (mgKOH/g) Índice de saponificación (mgKOH/g)
Contenido de ácidos grasos en
el aceite
Concentración de biomoléculas orgánicas
formadas por una larga cadena
hidrocarbonada lineal.
Àcidos grasos saturados (%) Ácidos grasos insaturados (%)
Fuente: Autores
9
CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO
II.1. Aspectos generales de la naranja (Citrus sinensis).
II.1.1. Taxonomía.
Clase: Equisetopsida C. Agardh
Subclase: Magnoliidae Novák ex Takht.
Superorder: Rosanae Takht.
Order: Sapindales Juss. Ex Bercht. & J. Presl
Family: Rutaceae Juss.
Genus: Citrus L.
Nombre científico: Citrus sinensis (L.) Osbeck. (Osbeck, 1765).
II.1.2. Origen.
Las cuatro especies principales del género Citrus son C. medica L. (cidro), C.
reticulata (mandarina), C. máxima (Burm.) Merr. (zamboa) y C. micrantha Wester
(papeda). La hipótesis más aceptada indica los cítricos restantes son
probablemente híbridos directos o sucesivos de estas. La naranja tiene su origen
en la hibridación directa entre zamboa y mandarina (Ancillo y Medina, 2015).
Entre los cítricos, el naranjo es el más cultivado por esta razón, la especie más
importante de todo el género Citrus (Zambrano, 2014). Es originario de las regiones
tropicales y subtropicales de China e Indonesia, siendo éste el punto de partido para
luego dispersarse por todo el mundo. Esta dispersión se debió principalmente a las
conquistas, expansiones y descubrimientos de nuevos continentes (Universidad
Escuela de Agricultura de la Región Tropical Húmeda [EARTH], 2004).
Actualmente existen numerosas variedades de naranjas debido a las
modificaciones por selección natural, hibridaciones producidas por el hombre y
mutaciones espontáneas (Zambrano, 2014).
10
II.1.3. Características.
El naranjo es un árbol de tamaño medio a grande, entre 8 a 10m
aproximadamente, que requiere entre 3 y 5 años para producir el fruto (naranja).
Las condiciones para su cultivo se ubican en altitudes entre 200 y 1200 metros sobre
el nivel del mar a temperaturas mínimas de 10°C y máximas de 40°C siendo típica
de regiones tropicales y subtropicales (Sarh y Bancomext, 1993).
La naranja es un fruto esférico, globosos, aunque también se encuentran más o
menos achatados por los polos, de un diámetro entre 6 y 10 cm y de un peso medio
de 150 gr a 200 gr. La cáscara es gruesa y rugosa al tacto de color naranja intenso,
bajo ésta se encuentra la segunda capa, una piel blanca que rodea el fruto cuyo
objetivo es proteger a la pulpa. Ésta última es jugosa con un sabor poco ácido,
anaranjada y de textura esponjosa (Zambrano, 2014).
II.1.4. Composición.
La composición nutricional de la naranja en la Tabla II se demuestra que este
fruto es gran fuente de ácido ascórbico o vitamina C, calcio, potasio, fósforo y agua.
Tabla II. Valor nutricional de la naranja (Citrus sinensis)
Valor nutricional /100 g de porción
comestible
Energía (kcal) 42
Hidratos de carbono (g) 8,60
Fibra (g) 2,00
Agua (g) 88,60
Calcio (mg) 36,00
Yodo (µg) 2
Magnesio (mg) 12
Sodio (mg) 3
Potasio (mg) 200
Fósforo (mg) 28
Selenio (µg) 1
Folatos (µg) 37
Vitamina C (mg) 50
Vitamina A (µg) 40
Fuente: Moreiras, Carbajal, Cabrera, Cuadrado, (2013).
11
II.1.5. Propiedades, usos y beneficios.
Debido al alto contenido de vitaminas C, la naranja es altamente consumida (en
fruta o jugo) para tratamiento de cáncer, infecciones respiratorias causadas por
virus, degeneración muscular relacionada con la edad, se benefician del fruto
(Zambrano, 2014).
El contenido de ácido ascórbico o vitamina C en la naranja se correlaciona con
la actividad antioxidante total del fruto representado entre el 65% y el 100%, debido
a la capacidad eficiente de este compuesto para captar las especies reactivas del
oxígeno, se convierte en uno de los antioxidantes solubles en agua más importantes
(Almendaris, 2018).
En los residuos generales de la naranja, como la cáscara, se reportan polifenoles,
que puede tener relación con el pigmento de esta, la degradación de estos induce
a la biosíntesis de los carotenoides como moléculas de polifenoles. Los alimentos
ricos en estos compuestos ayudan a disminuir numerosos riesgos como cáncer,
degradación muscular, daños en la piel causados por quemaduras solares y
enfermedades cardiovasculares (Lagou, Konan y Assa, 2018). Por otro lado,
Egbuonu y Amadi (2016) indican que la alta mezcla de nutrientes como vitaminas
A, C, B3, B2, B1, Calcio, Magnesio, Sodio y Potasio en la cáscara de naranja
muestran actividad antifúngica contra C. albicans y A. flavus y abre las posibilidades
de estudios para el uso de la naranja en dietas y remedios antifúngicos.
II.1.6. Aceites Esenciales de Naranja.
Según Guo, Gao, Li, Fu, Liang, Zhu y Shan (2019), los aceites esenciales pueden
ser obtenidos de los residuos de los cítricos, como la cáscara, a partir de métodos
como la compresión, destilación por arrastre de vapor y destilación con agua
asistida por radiación de microondas. Generalmente, se reporta un rendimiento de
0,40% de esta mezcla, teniendo como principales compuestos limoneno y linalol.
Los aceites esenciales tienen actividad antimicrobiana y poseen gran potencial para
ser utilizados como preservantes de alimentos y en consecuencia extender la vida
útil del producto.
12
II.1.7. Semillas de Naranja (Citrus sinensis).
Las semillas de la naranja son residuos que en la mayoría de los casos son
desechados, con excepción de las cantidades que se utilizan para la siembra de
nuevos ejemplares. Según Lagou et al. (2018), entre todo lo considerado residuo,
podemos encontrar diversos compuestos útiles para el ser humano, como se
describe en la Tabla III.
Tabla III. Contenido de semillas de naranja
CONTENIDO EN LAS SEMILLAS CONCENTRACIÓN
Proteínas 7, 12 a 27, 44 mg/100g
Lípidos 20,22 a 37,74 g/100 g
Carbohidratos 0,91 a 0,96 g/100 g
pH 5,20 a 5,90
VITAMINAS
Retinol o vitamina A 22,51 mg/100 g
Ácido ascórbico o vitamina C 7,04 mg/100 g
Niacina o vitamina B3 0,23 mg/100 g
Riboflavina o vitamina B2 0,06 mg/100 g
Tiamina o vitamina B1 0,09 mg/100 g
Fuente: (Egbuonu y Amadi, 2016).
II.2. Extracción de Aceites en Semillas.
La elaboración de aceite vegetal en la actualidad es por extracción química,
utilizando extractos de disolvente, con mayor producción y rendimientos, que
resultan menos costoso y más rápidos. Como solvente más común se utiliza un
derivado del petróleo (hexano). Se utiliza esta técnica para la mayoría de los aceites
industriales, tales como aceites de maíz y soja entre otros (Meléndez,2018).
13
II.2.1. Aceites vegetales.
Los aceites vegetales son extractos orgánicos obtenidos de diferentes órganos
de una planta, siendo las semillas las más comúnmente evaluada (Tabio, Díaz,
Rondón, Fernández y Piloto, 2017). Es un componente importante tanto como para
la industria de los alimentos como para otras industrias con fines diferentes
(producción de detergentes, pinturas, cosméticos, etc.) (Ionescu, Ungureanu, Biris,
Voicu y Dilea, 2015).
Los aceites vegetales contienen una mezcla con 95% de triglicéridos y 5% de
ácidos grasos libres. Como características físicas se encuentran su insolubilidad en
el agua, su densidad es menor a esta y no son fácilmente degradables. La principal
causa para su pérdida de calidad es el deterioro químico conocido como rancidez
(Tabio et al., 2017).
II.2.2. Extracción de prensa manual.
La primera extracción de aceite documentada data de 1650 a.C. cuando las olivas
maduras eran prensadas a mano utilizando morteros de piedra y madera. El aceite
obtenido era con pelo de cabra y usado como lubricante. Los aceites de sésamo,
castor y linaza fueron obtenidos en Egipto también por prensado manual para el año
259 a.C. como se muestra en la Figura 1. (Kemper, 2005).
Figura 1. Obtención de aceite por prensa manual.
Fuente: Paley (2014).
14
II.2.3. Extracción mecanizada temprana.
En el año 184 a.C. los Romanos desarrollaron una tecnología más sofisticada
que la encontrada en Egipto, como prensas de tornillo y cuña y molinos de borde.
Combinaban las ventajas del uso animal para ayudar con la extracción del aceite.
Al llegar al siglo XVIII, el viento y el agua reemplazaron la ayuda de los animales
para la extracción de aceites Figura 2 (Kemper, 2005).
Figura 2. Molino de borde asistido por caballo.
Fuente: (Kemper, 2005).
II.2.4. Extracción con prensa hidráulica.
En 1795, la prensa hidráulica (Figura 3) fue inventada en Inglaterra por J. Bramah
para la extracción de aceites. Las semillas para la obtención eran molidas,
cocinadas y envueltas en filtros de tela hechos de pelo de caballo (Kemper, 2005).
Con un solo paso de compresión expulsa el aceite y lo separa de la llamada “torta
proteínica”. Este método asegura un producto sin contaminación, la desventaja es
que su rendimiento no es eficiente dejando alrededor del 8-14% de aceite en la torta
(Ionescu et al., 2015).
15
Figura 3. Prensa hidráulica
Fuente: Kemper (2005).
II.2.5. Extracción con prensa de tornillo.
En 1990, Valerius D. Anderson inventó la prensa de tornillo en Estados Unidos.
La cual fue un avance radical con respecto a la prensa hidráulica. Utilizaba un
alimentador vertical y un tornillo horizontal con diámetro creciente para impartir
presión sobre las semillas mientras avanzaba a lo largo del eje. El aceite expulsado
era recolectado en un recipiente ubicado en la parte baja del equipo. La principal
ventaja de este método es permitir una extracción continua con mínimo esfuerzo
Figura 4 (Kemper, 2005).
Figura 4. Prensa de tornillo.
Fuente: Kemper (2005).
16
II.2.6. Extracción con solvente.
Deiss Marseilles fue la primera persona en realizar extracción de aceites con
solvente en el año de 1855, en Francia. Utilizó disulfuro de carbono para extraer el
aceite de oliva retenido en semillas de aceitunas (Kemper, 2005).
Este es el proceso de separar el líquido de un sistema sólido-líquido con la ayuda
de un disolvente (Ionescu et al., 2015). Este método tiene como ventaja un
rendimiento mayor al de la extracción mecánica con menor costo de operación
esperando que el aceite residente en la muestra sea menor al 1%. El solvente
mayormente usado en la extracción de aceite de semillas de plantas es el hexano,
una mezcla de hidrocarburos hirviendo a un rango de temperatura de 65-69°C
(Kemper, 2005). Como desventajas de este método se encuentra el peligro de los
disolventes para la salud humana y el riego de incendio o explosiones (Ionescu et
al., 2015).
La técnica más utilizada es la extracción en Soxhlet, (Figura 5) una operación de
transferencia de masa, donde el disolvente extrae los solutos encontrados en la
muestra sólida. Entre las ventajas de estas técnicas se encuentra evitar la filtración
después de la extracción, la muestra entra en contacto en repetidas ocasiones con
disolvente fresco y la más importante, al finalizar la mezcla de disolvente es
separada y el disolvente es recuperado para ser utilizado nuevamente (Tabio et al.,
2017).
Figura 5. Equipo Soxhlet.
Fuente: Anisa y Morad (2014).
17
II.2.7. Extracción con fluidos supercríticos.
Se trata de una técnica similar a la extracción química con solvente, la diferencia
radica en que el solvente es un gas en condiciones de presión y temperaturas
superiores a su punto crítico y no líquido (Figura 6). El fluido supercrítico usado en
extracción de aceite es CO2, siendo el más utilizado en aplicaciones analíticas
porque no extrae oxígeno molecular y no es un fluido tóxico (Ionescu et al., 2015).
El aceite se disuelve en el dióxido de carbono, que por alta presión se encuentra
en forma líquida para luego liberar la presión. Esto produce que el dióxido de
carbono regrese a su forma gaseosa y el aceite precipite (Ionescu et al., 2015).
Figura 6. Diagrama de extracción por fluido supercrítico.
Fuente: Ionescu et al. (2015).
II.3. Parámetros fisicoquímicos estudiados en el aceite.
Para conocer la calidad de los aceites Es necesario realizar un análisis sobre las
propiedades fisicoquímicas y organolépticas, de esta forma determinar si sus
características sápido- aromáticas y cualitativas se mantienen intactas desde el
cultivo hasta su elaboración y conservación (Meléndez, 2018).
II.3.1. Densidad relativa.
Indica la relación de la masa del volumen dado del aceite y la masa de un
volumen igual de agua en las mismas condiciones de presión y temperatura (Norma
Mexicana [NMX], 1987).
18
II.3.2. Índice de refracción.
El índice de refracción es una medida que establece la reducción de la velocidad
de la luz al propagarse por un medio homogéneo. Se puede establecer a través de
un intervalo. Este parámetro está vinculado con la estimación de la pureza de
sustancias (García, 2017)
II.3.3. Pérdida por calentamiento.
Determina el contenido de humedad y las materias volátiles que se perderán en
el aceite sometido a calentamiento.
II.3.4. Índice de yodo.
El índice de yodo indica el grado de insaturación del aceite. Es directamente
proporcional a la cantidad de compuestos con doble enlace e inversamente
proporcional con el punto de fusión y la resistencia a reacciones de oxidación (Plúas
y Portés, 2017).
II.3.5. Índice de acidez.
Indica los miligramos de hidróxido de potasio necesarios para neutralizar los
ácidos grasos libres o no combinados contenidos en 1 gramo de aceite. Un alto
resultado del índice de acidez muestra que el aceite posee una cantidad alta de
ácidos grasos libres, ya que ha experimentado un alto grado de hidrólisis (Tabio et
al., 2017).
19
II.3.6. Índice de saponificación.
Indica los miligramos de hidróxido de potasio requeridos para saponificar 1 gramo
del aceite. Los aceites están formados mayoritariamente por triglicéridos, y por tanto
se requieren el equivalente de tres moléculas de hidróxido de potasio para
saponificarse, por lo tanto, es posible usar el índice de saponificación para evaluar
el peso molecular aproximado del aceite (Tabio et al., 2017).
II.3.7. Índice de peróxido.
Se expresa en miliequivalentes de oxígeno por kilogramo de muestra, indica el
grado de oxidación inicial del aceite ya que los ácidos grasos insaturados
reaccionan con el oxígeno y forman peróxidos e hidroperóxidos. Es inversamente
proporcional a la capacidad antioxidante del aceite (Plúas y Portés, 2017).
II.3.8. Materia insaponificable.
Este análisis indica el contenido de sustancias disueltas en el aceite no
saponificables por los álcalis, pero solubles en los disolventes empleados en las
extracciones de lípidos.
II.4. Ácidos grasos.
Los ácidos grasos se encuentran mayoritariamente en la naturaleza, tienen un
gran aporte en el carácter de los glicéridos. Se compone de un solo grupo carboxilo
ubicado en el extremo de una cadena carbonada estos compuestos se los denomina
alifáticos monobásico (Moncerrate & Zuñiga, 2018).
En la literatura científica existen diferentes maneras de clasificar a estos
compuestos de acuerdo a su estructura (saturados e insaturados), el número de
dobles enlaces (mono, di y poliinsaturados) y la longitud de la cadena (corta, media
y larga) (García, 2017).
20
II.4.1. Ácidos grasos saturados.
Los ácidos grasos saturados son más comunes en el reino animal y menos en el
reino vegetal, aunque existen excepciones, tales como en la leche, grasa de
rumiantes y en lípidos de vegetales utilizados para la obtención de aceites. Entre
los ácidos grasos saturados naturales que más comúnmente son informados se
encuentran el ácido palmítico (16:0), ácido láurico (12:0), ácido mirístico (14:0) y
ácido esteárico (18:0) que son cadenas rígidas (Meléndez, 2018).
II.4.2. Ácidos grasos insaturados.
Los ácidos grasos insaturado son compuestos con al menos un doble enlace en
la cadena carbonada. Se pueden clasificar según la estructura de su molécula en
“cis” o “trans” (Cabezas, Hernandez y Vargas, 2016). Mientras mayor sea la
cantidad de dobles enlaces más reactivos son los ácidos grasos. Los ácidos grasos
insaturados también denominados omegas, son reconocidos por la posición del
doble enlace. Por ejemplo, el ácido oleico (omega-9), ácido linoleico (omega-6) y el
ácido linolénico (omega-3) todos identificados por la posición del primer doble
enlace desde el carbono terminal (Barberán y Zúñiga, 2018). Estos compuestos en
la actualidad se consideran indispensables, ya que el organismo no puede
sintetizarlos y se deben obtener mediante la dieta. La indispensabilidad de estos
compuestos se debe a que los mamíferos carecen de las enzimas necesarias para
insertar los enlaces dobles en los átomos de carbono (Rodríguez, Tovar, Prado y
Torres, 2005).
II.5. Cromatografía Líquida de Ultra-Alta Resolución.
El equipo de cromatografía liquida de Ultra performance (UPLC) es un sistema
cromatográfico desarrollado en los últimos años que ha permitido un salto
importante en los análisis de analitos de mezclas complejas. El UPLC es un equipo
similar a la cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) desde el punto de vista
tecnológico pero que se diferencia por las presiones que se utilizan lo que
21
representa, en la mayoría de los casos, mejoras en la resolución, sensibilidad,
eficacia de las columnas empleadas en las separaciones de los componentes de
una mezcla. Estas condiciones permiten optimizar los tiempos de corridas de las
muestras (Naushad y Rizwan, 2014).
Los equipos disponen de un sistema de bombas binarias que alcanzan una
presión de hasta15000 psi (1000 bar) en comparación con el sistema tradicional
HPLC que alcanza una presión máxima de 4000 psi, con flujos muy bajos entre el
orden 0,2 a 0,5 ml.min-1, por lo cual el tiempo y consumo de las cantidades de
solvente son menores. Para este sistema es necesario el uso de columnas
especiales, empaquetadas con relleno que contiene partículas de diámetro de
1.7um y una columna de longitud no mayor a 100mm, las mismas que no permiten
su uso en sistemas tradicionales HPLC (Rendón, 2013).
22
CAPÍTULO III: MATERIALES Y MÉTODOS
III.1. Tipo de Investigación:
Este estudio se basa en una investigación experimental, descriptiva y explicativa
sobre la metodología realizada para obtener una fracción rica en omegas a partir
del aceite de semillas de Citrus sinensis, además de ser una investigación
cuantitativa y cualitativa para los parámetros fisicoquímicos del aceite de las
semillas.
III.2. Equipos, Materiales y Reactivos:
III.2.1. Equipos
Los equipos utilizados en esta investigación (Tabla IV) fueron facilitados por la
Facultad de Ciencias Químicas.
Tabla IV. Equipos utilizados en los ensayos realizados junto a su marca, modelo y serie.
EQUIPO MARCA MODELO SERIE
Balanza Analítica Mettler Toledo ME204 BA-273
Balanza Analítica Mettler Toledo AG 204 BA-06
Balanza Analítica Sartorius Cubis MSA 2245 BA-011
Balanza Analítica Ohaus AX5202 B543617537
Estufa VWR Scientific 1350 GM 4800698
Refractómetro ABBE ZWAJ 1703900
Rotavaporador Heidolph Laborota 4001 402003
Bomba vacío IKA
MVP10 Basic
5001
Agitador
Magnético con Calor Daihan Scientific MSH-20D
0411996142D001
0411996142D002
Baño María Fanem LTDA Modelo 100 E. 1299
Fuente: Autores.
23
III.2.2. Reactivos
Los reactivos utilizados en esta investigación (Tabla V) fueron facilitados por la
facultad de Ciencias Químicas y adquiridos por los autores.
Tabla V. Reactivos, marca y cantidad de consumo utilizados en los ensayos realizados.
REACTIVO MARCA CANTIDAD
n-Hexano PHARMCO-
AAPER
4000ml
Ácido acético glacial EMSURE 500ml
Ácido Clorhídrico Concentrado APPLICHEM 130ml
Agua destilada CEVALLOS 8000ml
Alcohol etílico 95% CEVALLOS 4000ml
Almidón soluble J.T. BAKER 1g
Cloroformo CEVALLOS 500ml
Éter de Petróleo FISHER
CHEMICALS
1000ml
Éter dietílico LABKEM 600ml
Fenolftaleína *Provisto por la
facultad de CCQQ
ya preparado.
1g
Granallas zinc o aluminio *Provisto por la
facultad de CCQQ.
6g
Hidróxido de Sodio SIGMA-ALDRICH 25g
Hidróxido de Potasio SIGMA-ALDRICH 70g
Tiosulfato de Sodio
Pentahidratado
BIOPACK 30g
Solución Saturada de Yoduro de
Potasio
SIGMA-ALDRICH 10ml
Acetona EMSURE 100ml
Fuente: Autores.
24
III.3. Muestra:
Para esta investigación se utilizaron 546,70g de polvo de semilla seca de
naranja.
III.4. Metodología Experimental:
III.4.1. Material vegetal.
La muestra utilizada fue recolectada a partir de desechos de la industria artesanal
de ventas de jugo de frutas, específicamente, de jugo de naranja en el sector norte
de la ciudad de Guayaquil.
III.4.1.1. Identificación botánica de la especie en un Jardín Botánico Nacional.
Se recolectó una muestra de la planta y se obtuvo su certificación taxonómica en
el Herbario Guay de la Universidad de Guayaquil (Anexo A).
III.4.1.2. Recolección de muestras de semillas de naranja de la industria de los
alimentos.
Las semillas fueron recolectadas en lugares donde la pulpa del fruto es utilizada
como fuente de alimento, pero ellas han sido desechadas dado que no poseen
utilidad alguna en esta industria. Las impurezas fueron eliminadas por medio de
tamizado y lavado.
III.4.1.3. Identificación macro morfológica.
La descripción macro morfológica de las semillas de la especia se realiza a simple
vista con una lupa, observando su forma, consistencia y color. De igual manera, con
asistencia de un vernier se realizaron las mediciones de largo y ancho de 50
semillas obteniendo valores promedio y desviación estándar (Anexo B).
25
III.4.2. Preparación de la muestra de semillas de naranja.
III.4.2.1. Secado de las semillas.
Las semillas se secan de forma natural, para ello se colocan sobre un papel bond
sin que estén expuestas directamente al sol, por un periodo de tiempo menor a 7
días.
Manualmente, la episperma (cascarilla) es separada del endospermo (nuez) y se
coloca en una estufa a no más de 50°C por aproximadamente 48 horas para
completar la eliminación de la humedad.
III.4.2.2 Trituración.
Las semillas secas, fueron trituradas en un mortero hasta obtener un polvo fino
para facilitar la extracción del aceite. Se envasan y conservan en un lugar fresco y
libre de contaminación para su posterior estudio.
III.4.3. Extracción del aceite.
III.4.3.1. Obtención del aceite por medio del método de SOXHLET.
Los cartuchos de extracción (recipiente de la muestra en el equipo) fueron
elaborados con papel filtro con diámetro de 5cm alto 10cm. En cada cartucho (dedal
de Soxhlet) se pesaron en balanza analítica, entre 45 a 55g de muestra. La muestra
fue introducida dentro del cartucho y se introdujeron en el sifón con
aproximadamente 250ml de n-hexano como disolvente en un balón pírex de 500ml.
El equipo de Soxhlet se montó sobre una hornilla eléctrica por cinco horas a la
temperatura de ebullición del disolvente.
El extracto orgánico obtenido se concentró en un equipo rotaevaporador,
utilizando bomba de vacío para evitar el sobrecalentamiento del aceite. El hexano
26
obtenido se utiliza en extracciones sucesivas.
El porcentaje de rendimiento se determina de acuerdo con la siguiente ecuación:
% 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 𝑐𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜
𝑐𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑣𝑒𝑔𝑒𝑡𝑎𝑙 × 100
El aceite obtenido se guarda en un frasco ámbar para posteriores análisis.
III.4.4. Control de calidad del aceite de los residuales de semillas de
naranja.
Los parámetros fisicoquímicos del aceite obtenido, según los procedimientos de
las normas del Servicio Ecuatoriano de Normalización (INEN) que definan la
calidad de los aceites comestibles. Los procedimientos generales fueron
considerados para la investigación y posterior análisis porque no existe una
norma específica para aceite de semillas de naranja. Todos los ensayos fueron
realizados por triplicado.
III.4.4.1. INEN 35 - Densidad Relativa.
El picnómetro limpio y seco debe ser pesado en una balanza analítica,
posteriormente se pesa el mismo picnómetro lleno de agua destilada, evitando la
formación de burbujas al momento de colocar la tapa. Finalmente, el picnómetro se
limpia y seca nuevamente para colocar la muestra de aceite y obtener ese peso.
Los cálculos correspondientes son realizados siguiendo la fórmula:
𝑑 =𝑚2 − 𝑚
𝑚1 − 𝑚
Siendo:
• m: Peso del picnómetro vacío
• m1: Peso del picnómetro con agua
• m2: Peso del picnómetro con muestra
27
III.4.4.2. INEN 42 – Índice de refracción.
La temperatura del refractómetro se ajustó a 25°C y se verifica que los
prismas estén completamente limpios y secos. Entre 2 y 3 gotas de la muestra
son colocadas sobre el prisma inferior, cerrado con el superior y se ajustan
firmemente mediante el tornillo correspondiente.
El sistema se mantiene en reposo durante unos pocos minutos para que la
muestra adquiera la temperatura del instrumento y se ajusta la luz para obtener
la lectura más clara posible y determinar el índice de refracción.
III.4.4.3. INEN 39 – Pérdida por calentamiento.
Sobre la cápsula de porcelana previamente tarada, se pesaron
aproximadamente 5g de la muestra. La cápsula y su contenido se colocaron
durante 1 hora en la estufa calentada a 103°C ± 2°C. A continuación, se enfrió
hasta temperatura ambiente en el desecador y se pesó nuevamente.
Las operaciones indicadas se repiten entre una y dos veces más, hasta que la
diferencia entre los resultados de dos operaciones de pesajes sucesivas no exceda
de 0,002g.
Fórmula:
𝑃 =𝑚1 − 𝑚2
𝑚1 − 𝑚× 100
Siendo:
• P= Pérdida por calentamiento, en porcentaje de masa.
• m= Masa de la cápsula.
• m1= Masa de la cápsula y la muestra antes del calentamiento.
• m2= Masa de la cápsula con la muestra, después del calentamiento.
28
III.4.4.4. INEN 37 – Determinación del índice de yodo.
Aproximadamente 0,2mg en masa de muestra se pesan y se añaden 20ml
de tetracloruro de carbono. Luego, se agregan 25ml de solución e Wijs y se
agita hasta conseguir una mezcla íntima de su contenido. El matraz se guarda
en un lugar oscuro durante una hora a una temperatura de 25°C.
Posteriormente, 20ml de solución de yoduro de potasio y 100ml de agua
destilada recién hervida y enfriada se añaden. El yodo libre es titulado con la
solución 0,1N de tiosulfato de sodio (con agitación constante y energética),
hasta que el color amarillo desapareció casi por completo. Entre 1 y 2ml de
solución indicadora de almidón es agregada y se continúa con la titulación hasta
que el color azul desparezca completamente.
Fórmula:
𝑖 =12,69(𝑉 − 𝑉1)𝑁
𝑚
Siendo:
• i= Índice de yodo de la muestra, en cg/g.
• V= Media aritmética de los volúmenes de solución de tiosulfato de
sodio empleados en la titulación de los ensayos.
• V1= Volumen de solución de tiosulfato de sodio empleado en la titulación
de la muestra.
• N= Normalidad de la solución de tiosulfato de sodio.
• m= Masa de la muestra analizada.
III.4.4.5. INEN-ISO 660 – Determinación de acidez.
En un matraz de Erlenmeyer se pesa aproximadamente entre 1,5 a 2g de
muestra. Se adicionan 50ml de etanol 98% y 50ml de éter de petróleo y se agita.
1ml de solución de fenolftaleína 1% se añadió para proceder a titular con solución
de hidróxido de sodio 0,1N hasta aparición de coloración rosada persistente por 30
29
segundos. El volumen gastado es anotado y se realizan todas las mismas
operaciones en un blanco para aplicar la siguiente fórmula:
%á𝑐𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑔𝑟𝑎𝑠𝑜𝑠 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒𝑠(𝑜𝑙𝑒𝑖𝑐𝑜𝑠) = 𝑉 × 𝑁 × 28.2
𝑃
Siendo:
• V = Volumen en ml de solución de álcali utilizado.
• N = Normalidad de la solución de KOH.
• P = Peso en gramos del aceite.
• M = Masa molecular del ácido graso.
III.4.4.6. INEN 40 – Índice de saponificación.
La muestra (3g) se pesa y se trata en 25ml de hidróxido de potasio disuelto
en etanol al 98%. La disolución se conecta a un refrigerante en posición vertical
(reflujo) y se calienta por 60 minutos a temperatura de ebullición utilizando Baño
de María.
Posteriormente, 1ml de solución indicadora de fenolftaleína es añadida y se
procede a titular, en caliente, el exceso de hidróxido de potasio con 0,5N de
ácido clorhídrico, hasta que desaparezca la coloración rosada. En este caso, la
siguiente ecuación es aplicada:
𝑖 = 56,1(𝑉1 − 𝑉2)𝑁
𝑚
Siendo:
• i = índice de saponificación del producto.
• V2 = volumen de solución de ácido clorhídrico o sulfúrico empleado en la
titulación de la muestra.
• V1 = volumen de solución de ácido clorhídrico empleado en la titulación
del ensayo en blanco.
30
• N = normalización de la solución de ácido clorhídrico.
• m = masa de la muestra analizada.
III.4.4.7. INEN 277 – Índice de peróxido.
La muestra de aceite de naranja se disuelve en 30ml de solución 3:2 de ácido
acético (18ml) y cloroformo (12ml). El matraz es agitado hasta completa
disolución del contenido y luego se añade 0,5ml de la solución saturada de
yoduro de potasio, se agita nuevamente durante aproximadamente un minuto y
se añaden 30ml de agua destilada. Usando la solución 0,1N de tiosulfato de
sodio, se titula gradualmente y con agitación constante hasta que el color
amarillo haya casi desaparecido.
Posteriormente 0,5ml de la solución indicadora de almidón es añadida y se
continúa la titulación cerca del punto final, agitando constantemente para liberar
todo el yodo de las capas de cloroformo. La solución de tiosulfato de sodio se
añade gota a gota, hasta que el color azul desaparezca completamente.
Para calcular el resultado se utilizó la siguiente fórmula:
𝑙 = 𝑣𝑁
𝑚× 100
Siendo:
• / = Índice del peróxido en meq. de O2 por kilogramo del producto.
• v = Volumen de la solución de tiosulfato de sodio empleado en la titulación
de la muestra.
• N = Normalidad de la solución de tiosulfato de sodio.
• m = Masa de la muestra analizada.
31
III.4.4.8. INEN 41 - Determinación de materia insaponificable.
En un matraz Erlenmeyer se pesan 5g de muestra, adicionándole 30ml de etanol
y 5ml de hidróxido de potasio al 50%, conectar el refrigerante durante 1 hora en una
fuente de calor, pasado este tiempo se retira y se agrega por la parte superior del
refrigerante 50ml de agua destilada, se agita vigorosamente, enfría y se transfiere
el contenido a un embudo de separación para realizar tres lavados con 50ml de éter
de petróleo cada vez. En cada caso se agita suavemente y se deja reposar un
minuto para logar separar adecuadamente cada fase. La fase orgánica (etérea) se
transfiere a otro embudo de decantación para lavarla con 50ml de etanol al 10%. La
parte etérea se trasvasa a un cristalizador para por medio de baño de vapor eliminar
la mayor cantidad de disolvente, posteriormente se seca en la estufa por 15 minutos
y se pesa el residuo para calcular el porcentaje insaponificable de la muestra
Fórmula:
% insaponificable = peso residual (g)
Peso aceite (g) x100
III.4.5. Determinación del perfil lipídico de ácidos grasos y omegas
presentes en el aceite de las semillas de naranja.
Las determinaciones se realizaron en el laboratorio World Survey Services
Ecuador S.A. (WSS) donde se sigue la metodología descrita en procedimiento
operacional estándar código LI-018 Prada F, Delgado W. (1999). La muestra (0,5g)
se somete a saponificación utilizando una disolución 2M de KOH en etanol.
Posteriormente, 100ml de agua destilada y 50ml de éter son agregados, y se elimina
el gas que expulsa la solución al momento de ser homogenizada.
La fase acuosa es descartada y se lava la fase orgánica, dos veces más, con
30ml de agua destilada que son descartadas nuevamente. La disolución obtenida
se filtra y se deposita en un balón agregándole aproximadamente 1g de sulfato de
32
sodio anhidro para eliminar el agua residual. Finalmente, la fracción se restituye en
acetona (5ml), se añaden 500μl de dibromofenacilo y 200μl de carbonato de potasio
que son homogenizados en baño de María por 1 hora a 60°C, la disolución tratada
es llevada a un filtro de HPLC, bajo las siguientes condiciones cromatograficas
(Tabla VI). Las concentraciones del gradiente utilizado pueden observarse en el
Anexo F.
Tabla VI. Condiciones cromatográficas
CONDICIONES INSTRUMENTALES
Columna Acquity UPLC BEH C18 1.7 μm 2.1 x 100 mm
Volumen de inyección 1 μl
Longitud de onda 255 nm
Flujo 0.20 ml/min
Tiempo de análisis 25.0 min
Temperatura del horno
de la columna
55 ± 5 °C
Temperatura de la
muestra
35 ± 2 °C
Detector red de fotodiodos (PDA) ACQUITY UPLC
CONDICIONES DE GRADIENTE
Fase móvil A Acetonitrilo
Fase móvil B Agua
Fase móvil C Metanol
Elaboración: Autores.
33
III.4.6. Separación de ácidos grasos saturados e insaturados que forman
parte del aceite de la semilla por diferencia en el punto de fusión.
El aceite (5g) fue sometido a un proceso de saponificación como se presentó en
el acápite III.4.4.6 donde se agregó 25ml de solución etanólica de hidróxido de
potasio, luego se conectó al refrigerante de reflujo y la mezcla se calentó
mediante baño de María a una temperatura de 80ºC por 1 hora. Transcurrido este
tiempo la mezcla obtenida se trata con ácido clorhídrico 0,5N logrando neutralizar
el exceso de hidróxido de sodio. Verificando el pH.
La mezcla acuosa se filtró para separar los sólidos formados, fracción de ácidos
grasos, y las aguas resultantes fueron desechadas.
La separación de los ácidos grasos saturados e insaturados se hizo en base a lo
indicado por Haraldsson (1984). La técnica se basa en las diferencias significativas
de los puntos de fusión de estos ácidos independiente del número de carbonos de
la mezcla. En la Tabla VII se resumen estos valores informados en la literatura.
Tabla VII. Puntos de fusión de ácidos grasos saturados e insaturados.
Nombre Trivial Fórmula Estructura Pf (°C)
Ácidos grasos saturados
Ácido palmítico 16:0 CH3-(CH2)14-COOH 63,0
Ácido esteárico 18:0 CH3-(CH2)16-COOH 69,6
Ácido aranquídico 20:0 CH3-(CH2)18-COOH 76,5
Ácido lignocérico 24:0 CH3-(CH2)22-COOH 86,0
Ácidos grasos insaturados
Ácido palmitoleico 16:1 ω 7 CH3-(CH2)5-CH=CH-(CH2)7-COOH - 0,5
Ácido oleico 18:1 ω 9 CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COOH 13,4
Ácido linoleico 18:2 ω 6 CH3-(CH2)4-(CH=CH-CH2)2-(CH2)6-COOH - 3,0
Ácido linolénico 18:3 ω 3 CH3-CH2-(CH=CH-CH2)3- CH2)6-COOH - 11,0
Ácido aranquidónico
20:4 ω 6 CH3-(CH2)4-(CH=CH-CH2)4-(CH2)2-COOH - 49,5
Fuente: Knothe y Dunn, (2009)
34
La separación de los ácidos grasos se realizó utilizando un baño de María a
temperatura controlada de 50ºC. En estas condiciones se produce un líquido
sobrenadante que fue extraído con micropipeta Pasteur para su posterior
evaluación. La muestra se conservó en refrigeración a -23ºC.
La comparación del contenido de ácidos grasos insaturados, omegas, se realiza
mediante determinación del Índice de Yodo siguiendo la metodología descripta en
el acápite III.4.4.4.
35
CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIONES:
IV.1. Material Vegetal
Las semillas de naranja tienen una presentación elíptica, puntiaguda y de
color blanquecino.
Los valores promedio de las mediciones de 100 semillas de naranja, su peso
expresado en mg es de 0,1982 ±0,0283, su largo es de 1,45cm y un ancho de
58,1mm.
IV.2. Obtención del aceite
El aceite obtenido por extracción Soxhlet a partir de semillas de naranja se
observa viscoso, amarillento, olor característico de la naranja y sabor amargo.
La extracción por Soxhlet, usando n-hexano como disolvente tuvo una
duración de 6 horas con un promedio de 16 minutos entre cada sifonada en una
temperatura promedio de 280°C.
Tabla VIII. Rendimiento de las semillas de naranja (Citrus sinensis) y aceite obtenido.
PESO MUESTRA
(g)
CANTIDAD ACEITE
OBTENIDO (ml)
RENDIMIENTO (%)
% CV
25,5108 14,50 56,84
23,2598 11,50 49,44
66,3795 31,20 47,00
58,4194 29 49,64
43,4746 25,10 57,73
32,6105 18,80 57,65
67,2578 36,59 54,40
48,9652 27,53 56,22
62,0879 34,68 55,86
49,7012 22,43 53,87 0.08
Fuente: Autores.
36
El promedio de rendimiento del aceite fijo obtenido a partir de las semillas fue
de 46,79% (Tabla VIII), este valor es superior al reportado por Escalante et al.
(2012), los autores utilizaron el método de extracción por Soxhlet y como
disolvente el hexano, los resultados mostraron un rendimiento de 42,00%. En
un estudio realizado por Pereira y Neuza (2013), en el cual se utilizó el prensado
a temperatura ambiente como método de extracción, los resultados presentan un
rendimiento de 39,60%. Waheed et al. (2009) evaluaron la composición de
ácidos grasos en semillas de citrus, para la extracción de los aceites, se agitaron
en una mezcla 2:1 de cloroformo:metanol y filtraron. Se observa un resultado
de 36,52% de rendimiento del aceite obtenido. Con los datos presentados, se
sugiere que el hexano es un solvente apropiado capaz de extraer una elevada
concentración de aceite fijo.
IV.3. Parámetros Fisicoquímicos del Aceite.
Los resultados por triplicado de los parámetros fisicoquímicos realizados al aceite
de semillas de naranja obtenido se pueden observar en la Tabla IX.
Tabla IX. Parámetros fisicoquímicos del aceite de semillas de naranja.
Parámetros Repeticiones
Promedio %CV 1 2 3
Densidad relativa 0,86 0,86 0,86 0,86 0,00
Índice de refracción 1,472 1,472 1,469 1,471 0,00
Pérdida por calentamiento (%) 1,40 1,40 1,48 1,43 0,03
Índice de yodo (mg/100 g) 24,72 22,59 25,38 24,23 0,06
Índice de acidez (mg KOH/g) 3,70 3,42 3,43 3,52 0,04
Índice de saponificación mg KOH/g 227,12 226,39 226,36 226,62 0,00
Índice de peróxido (meq/kg) 7,90 7,57 7,59 7,69 0,02
Materia insaponificable (%) 0,40 0,70 0,50 0,50 0,29
Fuente: Autores.
La densidad relativa del aceite extraído fue de 0,86±0,000, el cual se
encuentra en el rango general de aceites minerales y vegetales de 0,840 y 0,960
(Ibrahim y Yusuf, 2015). El resultado de este trabajo es aproximado al mostrado
por Ibrahim y Yusuf (2015), los autores obtuvieron una densidad relativa de
0,88.
37
El índice de refracción fue de 1,471±0,002, el cual se encuentra en el rango
para sustancias grasas, que es de 1,4600 y 1,5000 (Medina, 2013). El resultado
presentado en esta investigación es ligeramente mayor al observado por Pereira
y Neuza (2013) de 1,4668 y por Dunn et al. (1948) de 1,4686.
El resultado de pérdida por calentamiento muestra 1,43% lo cual indica que
la cantidad de agua y materias volátiles encontradas en el aceite extraído es
baja.
El índice de yodo obtenido fue de 24,23±1,46mg/100g lo cual indica presencia
de insaturaciones en este aceite. Este estudio indica que el aceite de semillas
de naranja es una gran fuente de ácidos grasos insaturados.
El valor promedio de índice de acidez es de 3,52 ± 0,16mg de KOH/g, esto
señala que el aceite extraído en esta investigación tiene una gran cantidad de
ácidos grasos libres. Este resultado es considerablemente mayor al obtenido
por Rezaei (2014), de 0,58mg de KOH/g y el mostrado por Pereira y Neuza
(2013) de 0,54mg de KOH/g.
El promedio de índice de saponificación obtenido del aceite de semillas de
naranja es de 226,62 ± 0,4309mgKOH/g, este alto índice muestra que el aceite
de semillas de naranja contiene ácidos grasos de cadena corta. Otros estudios
también muestran resultados altos, el realizado por Mingo et al. (1943) mostró
191,15mgKOH/g, Pereira y Neuza (2013) muestran 190,83mgKOH/g y en Dunn
et al. (1948) presentan 195,50mgKOH/g.
Los resultados de índice de peróxido dieron un promedio de 7,69±0.1,840
meq/kg, esto insinúa una baja capacidad antioxidante de este aceite. El
resultado de este trabajo es mayor al promedio del estudio realizado por Ibrahim
y Yusuf (2015), 5,8 meq/kg.
El porcentaje de materia insaponificable obtenido fue de 0,5%, esto denota un
bajo nivel de impurezas. El resultado de este trabajo concuerda con el realizado por
Mingo et al. (1943) que obtuvo 0,45%, Pereira y Neuza (2013) el cual muestra un
resultado de 0.57% y con Dunn et al. (1948) en el cual se observa un resultado de
0.6%.
38
IV.4. Perfil lipídico
En las Tablas X y XI se observan los resultados obtenidos en el ensayo de perfil
lipídico del aceite de semillas de naranja junto con su cromatograma (Figura 7).
Tabla X. Perfil lipídico del aceite obtenido a partir de semillas de naranja.
Pico Compuestos Tiempo de retención
(min) Concentración %
1 Ácido linoleico C18:2 9.171 37,60
2 Ácido palmítico C16:0 11.608 28,36
3 Ácido oleico C18:1 12.024 23,58
4 Ácido linolénico C18:3 7.459 4,79
5 Ácido esteárico C18:0 14.610 4,50
6 Ácido palmitoleico C16:1 8.589 0,29
- Otros ácidos grasos - 0,93
Fuente: Autores.
Tabla XI. Perfil lipídico totalitario del aceite obtenido a partir de semillas de naranja.
Ensayo Compuestos Resultado g/100 g
grasa
Determinación de ácidos grasos
mediante UPLC
Ac. Grasos Saturados 33,65
Ac. Grasos Monoinsaturados 23,85
Ac. Grasos Polinsaturados 42,37
Ac. Grasos Omega 3 4,78
Ac. Grasos Omega 6 37,59
Ac. Grasos Trans 0,00
Fuente: Autores.
El contenido de ácidos grasos insaturados de esta investigación fue de 66,22%,
esto muestra un gran contenido de omegas viables a ser separados y obtenidos en
este aceite. Este resultado es mayor al indicado por Pereira y Neuza (2013) de
52,34% y por Waheed et al. (2009) de 58,80%.
39
Entre estos, se posee un 4,78% de omega 3 (ácido linolénico), mayor en
comparación al 2,30 de Pereira y Neuza (2013); y 37,59% de omega 6 (ácido
linoleico), mayor al 23,84% de Pereira y Neuza (2013). El contenido de ácidos
grasos saturados del aceite extraído en este trabajo fue de 33,65%, resultado menor
al presentado por Pereira y Neuza (2013) de 47,66% y al descrito por Waheed et al.
(2009) de 41,20%. Esto demuestra el aceite de semillas de naranja tiene una
cantidad mayor de ácidos grasos insaturados en comparación con la concentración
de los ácidos grasos saturados.
Figura 7. Cromatograma UPLC – PDA de análisis de la muestra de aceite de semilla de naranja.
IV.5. Obtención de la fracción rica en omegas.
Con el consumo de 48,2ml de ácido clorhídrico 0,5N se logró llegar a un pH de
3 en el aceite saponificado. Con el cual, mediante diferencia en el punto de fusión,
se obtuvo 7ml de una fracción rica en omegas.
En la Tabla XII se muestran los resultados del ensayo de índice de yodo y se
observa que en la fracción rica en omegas se obtuvo un promedio de 16,8755
± 0,63mg/100g en comparación con los resultados del residuo grasoso de 5.9100 ±
0.48mg/100g. Esto demuestra que la parte líquida de la separación contiene los
ácidos grasos insaturados aislados, ya que, como se ha indicado anteriormente,
éstos poseen menor punto de fusión.
40
Tabla XII. Resultados, promedio y desviación estándar del ensayo para determinación de índice de yodo en fracción rica en omegas.
Parámetro Parte
estudiada 1 2 3 Promedio
Desviación Estándar
Índice de yodo
Fracción rica en omegas
16,9200 16,2203 17,4862 16,8755 0,634122141
Residuo grasoso
5,9100 5,07 5,09 5,3567 0,479305052
Fuente: Autores
En la literatura se describen muchos procedimientos para la obtención de
fracciones enriquecidas de omegas (Bonilla-Mendez y Hoyos-Concha, 2018),
pero en su mayoría están basadas en técnicas a partir de aceites de pescado.
Según esta información la técnica de fraccionamiento por diferencias en el punto
de fusión no es la más eficiente porque logra entre un 50-70% de purificación,
mientras que otras, como la formación de complejos de inclusión con la urea y
posterior destilación controlada, se logra entre un 85-90% de separación. Estos
reportes pudieran ser negativos para el procedimiento seguido, sin embargo, no
se considera así porque la fuente de partida es diferente y se conoce la
complejidad de los aceites de pescado con respecto a los aceites vegetales. En
este caso, se debe profundizar en el procedimiento y se debe demostrar por
técnicas instrumentales más precisas los rendimientos de la fracción de omegas
obtenidos.
El resultado de la prueba de índice de iodo sugiere que la fracción obtenida
es al menos tres veces más abundante en omegas que la fracción residual, lo
cual sugiere que el procedimiento funciona en estas condiciones. En la revisión
bibliográfica no se encontró reporte de la aplicación de esta técnica en aceites
vegetales de cítricos.
El resultado obtenido es un ejemplo de aprovechamiento de un residuo
sólido, es decir, sugiere que es posible incorporar al ciclo económico y
productivo un material como las semillas de naranja proveniente de la
41
producción de jugos para desarrollar en este caso un producto farmacéutico de
alta demanda, como los omegas. Por otro lado, el aporte social de esta
investigación radica no solo en los beneficios sanitarios, ambientales y/o
económicos sino además en la posibilidad de proveer nacionalmente a las
personas con un producto más económico.
42
CONCLUSIONES
• El aceite obtenido a partir de semillas de naranja (Citrus sinensis),
presenta un rendimiento promedio de 46,80%.
• La caracterización fisicoquímica del aceite obtenido a partir de la semilla
de naranja mostró que éste presentó bajos niveles de impurezas.
• Se identificó un elevado contenido de ácidos grasos insaturados, de
estos, el más abundante fue ácido linoleico (Omega 6).
• Por medio de la técnica de diferencia en los puntos de fusión se pudo obtener
una fracción con un alto contenido de omegas a partir del aceite obtenido.
43
RECOMENDACIONES
• Establecer estudios microbiológicos en el aceite obtenido de la semilla de
naranja (Citrus sinensis).
• Asegurar la eficacia como posible uso cosmético y alimenticio del aceite
obtenido de semillas de naranja (Citrus sinensis).
• Confirmar por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de
masas el perfil lipídico del aceite obtenido de semillas de naranja (Citrus
sinensis).
• Evaluar por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas
la fracción rica en omegas obtenida.
• Realizar estudios comparativos con semillas del mismo género.
44
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San Francisco de Quito. Quito, Ecuador.
48
ANEXOS
Anexo A. Certificación taxonómica de la plata utilizada para la
extracción de aceite de semillas.
Figura 8. Certificación taxonómica de la planta utilizada para la extracción de aceite de semillas.
49
Anexo B. Parámetros realizados en las semillas.
Determinaciones macroscópicas
Secado y molienda de las semillas
Figura 9. Medición de ancho y largo de semillas individuales.
Figura 10. Peso de semillas individuales.
Figura 11. Secado de semillas en la estufa.
Figura 12. Triruración de la nuez de las semillas.
50
Anexo C. Caracterización fisicoquímica del aceite de semillas de naranja
Citrus sinensis.
Figura 14. Extracción del aceite. Figura 13. Peso de cartucho con muestra.
Figura 16. Rotaevaporación. Figura 15. Aceite de Semillas.
51
Figura 18. Densidad relativa. Figura 17. Índice de refracción.
Figura 19. Índice de yodo. Figura 20. Perdida por calentamiento.
Figura 21. Índice de acidez. Figura 22. Índice de saponificación.
52
Figura 23. Índice de peróxido.
Figura 25. Materia insaponificable.
Figura 24. Baño de vapor materia insaponificable.
53
Anexo D. Resultados de análisis del perfil lipídico al aceite de semillas
de naranja Citrus sinensis.
Figura 26. Informe de ensasyo del perfil lípidco por UPLC - PDA.
54
Figura 27. Informe de ensayo del perfil lípidico por UPLC - PDA.
55
Figura 28. Información de metodología empleada en la determinación delperfil lípidico de Ácidos Grasos.
56
Figura 29. Información de metodología empleada en la determinación delperfil lípidico de Ácidos Grasos.
57
Figura 30. Cromatograma de análisis de la muestra de aceite de semillas de naranja.
58
Anexo E. Separación de los ácidos grasos insaturados en el aceite de
semillas de naranja Citrus sinensis.
Figura 31. Acidulación de la muestra.
Figura 33. Toma de pH.
Figura 35. Formación de prescipitado.
Figura 34. refrigeración del precipitado.
Figura 32. Baño maría en la separación de Ácidos Grasos.
59
Anexo F. Concentraciones del gradiente utilizado para la determinación
del perfil lipídico.
Tiempo Flujo A% B% C% Curva 0,2 40 60 0
4 0,4 80 20 0 5
10 0,4 80 20 0 6
13 0,4 90 10 0 6
14 0,4 7 8 85 6
14,4 0,4 80 8 12 6
16 0,4 80 0 20 6
18 0,4 70 0 30 6
20 0,4 70 0 30 6
21 0,4 40 60 0 6
24 0,4 40 60 0 6
24,5 0,2 40 60 0 6
25 0,2 40 60 0 6
