UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS...
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i UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS TEMA EVALUACIÓN DE HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA Y ENZIMOINMUNOENSAYO PARA DIAGNÓSTICO DE TOXOPLASMOSIS EN GUAYAQUIL. TESIS PRESENTADA COMO REQUISITO PARA OPTAR POR EL GRADO DE MAGISTER EN BIOQUÍMICA CLÍNICA MAESTRANTE Q.F. JESSENIA ELIZABETH PONCE ARÁMBULO TUTOR: DR. TELMO EDUARDO FERNÁNDEZ RONQUILLO, M.Sc. GUAYAQUIL - ECUADOR 2014
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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
TEMA
EVALUACIÓN DE HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA Y
ENZIMOINMUNOENSAYO PARA DIAGNÓSTICO DE
TOXOPLASMOSIS EN GUAYAQUIL.
TESIS PRESENTADA COMO REQUISITO PARA OPTAR POR EL GRADO DE
MAGISTER EN BIOQUÍMICA CLÍNICA
MAESTRANTE
Q.F. JESSENIA ELIZABETH PONCE ARÁMBULO
TUTOR:
DR. TELMO EDUARDO FERNÁNDEZ RONQUILLO, M.Sc.
GUAYAQUIL - ECUADOR
2014
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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
Esta tesis cuya autoría corresponde a la Q.F. YESSENIA ELIZABETH PONCE
ARÁMBULO, ha sido aprobada luego de su defensa pública, en la forma presente por
el Tribunal Examinador de Grado nominado por la Universidad de Guayaquil, como
requisito parcial para optar el grado de MAGISTER EN BIOQUIMICA CLINICA.
Q.F. Héctor Núñez Aranda, M.Sc. Dr. Wilson Pozo Guerrero, Phd.
DECANO – PRESIDENTE DEL TRIBUNAL. MIEMBRO DEL TRIBUNAL
D r. Tomas Rodríguez León, M.Sc. Dr. Julio Rodríguez Zurita, M.Sc.
MIEMBRO DEL TRIBUNAL MIEMBRO DEL TRIBUNAL
Ing. Nancy Vivar Cáceres
SECRETARIA ENCARGADA
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
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CERTIFICACION
CERTIFICO que he dirigido, revisado y APROBADO la tesis:
Evaluación de hemaglutinación indirecta y enzimoinmunoensayo para
diagnóstico de toxoplasmosis en Guayaquil, de la Q.F. JESSENIA
ELIZABETH PONCE ARÁMBULO, como requisito previo para optar por
el grado de MAGISTER EN BIOQUÍMICA CLÍNICA, en la Facultad de
Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil
Dr. Telmo Eduardo Fernández Ronquillo, M.Sc.
Tutor
iv
Guayaquil, 5 de Mayo de 2014
CERTIFICACIÓN DE GRAMATOLOGIA
M.Sc. Lcda. Elena Fernández Ronquillo CERTIFICA que ha revisado la tesis previa a
la obtención del título de MAGÍSTER EN BIOQUÍMICA CLÍNICA de la Q.F.
JESSENIA ELIZABETH PONCE ARÁMBULO, C.I: 0922565791.
El tema desarrollado es: “EVALUACIÓN DE HEMAGLUTINACIÓN
INDIRECTA Y ENZIMOINMUNOENSAYO PARA DIAGNÓSTICO DE
TOXOPLASMOSIS EN GUAYAQUIL”
Declaro que la tesis está escrita de acuerdo a las normas gramaticales de la Real
Academia de la Lengua Española.
Por lo expuesto y en uso de mis derechos como especialista en Lengua y Literatura,
recomiendo la VALIDEZ GRAMATICAL Y ORTOGRÁFICA de su proyecto, previo a
la obtención del título académico de MAGÍSTER EN BIOQUÍMICA CLÍNICA.
M.Sc. Lcda. Elena Isabel Fernández Ronquillo
C.I 0903967602
Teléfono celular 0999070804
v
DEDICATORIA
La culminación de este proyecto está dedicada a la todos los miembros de la familia
Fernández Cadena ya que confiaron en mí, desde muy niña y me brindaron su apoyo
incondicional, gracias a esto, he logrado ser una profesional y alcanzar esta maestría.
Dedicó también este trabajo a mi hermana Shirley y a Gustavo quienes me apoyaron en
los momentos de decline y cansancio, ya que con sus palabras dulces me daban aliento y
me alegraban el día a día.
Siempre me repito este dicho: “las cosas pasan por algo” en mi caso pasaron cosas
muy buenas en mi vida.
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AGRADECIMIENTO
La presente tesis de maestría es un esfuerzo que contó con la ayuda de varias
personas, que con su conocimiento y estímulo que me brindaron, hicieron posible
su culminación.
En especial agradezco con profundo respeto a mi Director de tesis Dr. Telmo
Eduardo Fernández Ronquillo, MSc que con su conocimiento, paciencia y
sabiduría puso en camino este proyecto, que con su vasta experiencia logró que
este trabajo sea un éxito.
Al Dr. Telmo Fernández Cadena que me brindo su apoyo desinteresadamente.
A la Unidad de Diagnóstico Fernández que permitió realizar parte de mi trabajo
en sus instalaciones.
A la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil y en
particular al Instituto de Investigaciones Médicas de la Facultad de Ciencias
Médicas, que me dieron el apoyo al proyecto de Toxoplasmosis, logrando así que
mi tesis se pudiera llevar a cabo.
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RESUMEN
Los exámenes serológicos son la única herramienta segura para llegar al diagnóstico
definitivo de toxoplasmosis, pues tiene curso clínico benigno, excepto cuando es
adquirida en el momento del embarazo por la posibilidad de transmisión congénita y
causar serios daños al niño. El objetivo de esta investigación es estandarizar las
pruebas serológicas de Hemaglutinación Indirecta (HAI) y Enzimoinmuno ensayo
(microelisa). Además, establecer los rangos referenciales, las tasa de prevalencia, de
incidencia anual (quinquenal) y la frecuencia de contacto con una fuente de infección.
Se examinaron 578 sueros de niños y adolescentes, distribuidos en diversos centros de
salud, la edad promedio es de 9,74 años; el promedio de habitantes por casa 4,7;
varones 2.77, y mujeres 2.83, y el promedio de morar en la misma casa 7 años. Las
pruebas serológicas, se realizaron siguiendo estrictamente las indicaciones del
fabricante. La correlación entre las dos pruebas demostró sensibilidad 95,6%,
especificidad 98,7%, valor predictivo positivo 97,5% y valor predictivo negativo de
97,6%. La prevalencia aumento según la edad, hasta alcanzar 60% en el grupo 15 a
menos de 20 y la incidencia quinquenal es 4,9% y 9,6% en los primeros 10 años. No se
identificó una fuente de riesgo de transmisión pero se considera que es por ooquistes. Se
discuten aspectos relacionado con la disminución de la prevalencia, la alta incidencia
entre los menores de 10 años, el alto riesgo de transmisión en esta edad y los posibles
factores; además la contribución de estos datos en el cálculo del riesgo de transmisión
congénita y la propuesta de medidas de prevención factibles de ser implementadas en la
sociedad, para disminuir el impacto social y económico de esta patología en el Ecuador.
Palabras clave: TOXOPLASMOSIS, EPIDEMIOLOGIA, TOXOPLASMOSIS
CONGÉNITA, ECUADOR, TRANSMISION, TESIS, SEROLOGIA
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SUMMARY
Serological testing have been a safe tool for the definitive diagnosis of toxoplasmosis,
even though its benign course, there is one circumstance in which an accurate diagnosis
is mandatory and is when infection is acquired during pregnancy when the possibility of
congenital transmission and congenital malformation are serious. The objectives of this
research can be summarized in: standardization of the diagnostic approach for
serological testing methods as Indirect Hemaglutination (IHA) or enzyme linked
inmunoassay (ELISA), propose reference ranges, calculate the seroprevalence, annual
(quinquenial incidence and correlation with the frequency of contact with a potential
source of infection. 578 samples were examined, the average age was 9,74 years old,
mean number of members per habitable unit was 4,7, 2,77 male and 2,83 female with a
mean length of using the same habitational unit of 7 years. Testing was performed per
manufacturer instructions. Correlation between both methods proved a sensibility of
95,6%, specificity 98,7%, a positive predictive value of 97,5% and a negative predictive
value of 97,6%. Prevalence was affected by time with an increment related to age
reaching 60% upon 15-20 years old group and a quinquenial incidence from 4,9 to 9,6%
in the first 10 years. A definite source of infection could not be definitely identified
nevertheless oocysts are thought to be the culprit. Aspects related with reduction of
prevalence, the high incidence among 10 years old and below group, the high risk for
transmition in the same group and potential risk factors are discussed, furthermore this
dataset may be used for calculating the risk for congenital transmission and a proposal
for prevention strategies on this context.
Words key: TOXOPLASMOSIS, EPIDEMIOLOGY, CONGENITAL
TOXOPLASMOSIS, ECUADOR, TRANSMITION, THESIS, SEROLOGY
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REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA FICHA DE REGISTRO DE TESIS
TÍTULO Y SUBTÍTULO: EVALUACIÓN DE HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA Y ENZIMOINMUNOENSAYO PARA DIAGNÓSTICO DE TOXOPLASMOSIS EN GUAYAQUIL.
AUTOR/ES: Q.F. JESSENIA ELIZABETH PONCE ARÁMBULO
TUTOR: DR. TELMO EDUARDO FERNÁNDEZ RONQUILLO, M.Sc.
REVISORES:
INSTITUCIÓN: Universidad de Guayaquil FACULTAD: Ciencias Químicas
CARRERA: Maestría en Bioquímica Clínica
FECHA DE PUBLICACIÓN: No. DE PÁGS: 62
TÍTULO OBTENIDO: Magíster en Bioquímica Clínica
ÁREAS TEMÁTICAS: Bioquímica Clínica
PALABRAS CLAVE: TOXOPLASMOSIS, EPIDEMIOLOGIA, TOXOPLASMOSIS CONGÉNITA, ECUADOR, TRANSMISIÓN, TESIS, SEROLOGIA.
RESUMEN: Los exámenes serológicos son la única herramienta segura para llegar al diagnóstico definitivo de toxoplasmosis, pues tiene curso clínico benigno, excepto cuando es adquirida en el momento del embarazo por la posibilidad de transmisión congénita y causar serios daños al niño. El objetivo de esta investigación es estandarizar las pruebas serológicas de Hemaglutinación Indirecta (HAI) y Enzimoinmuno ensayo (microelisa). Además, establecer los rangos referenciales, las tasa de prevalencia, de incidencia anual (quinquenal) y la frecuencia de contacto con una fuente de infección. Se examinaron 578 sueros de niños y adolescentes, distribuidos en diversos centros de salud, la edad promedio es de 9,74 años; el promedio de habitantes por casa 4,7; varones 2.77, y mujeres 2.83, y el promedio de morar en la misma casa 7 años. Las pruebas serológicas, se realizaron siguiendo estrictamente las indicaciones del fabricante. La correlación entre las dos pruebas demostró sensibilidad 95,6%, especificidad 98,7%, valor predictivo positivo 97,5% y valor predictivo negativo de 97,6%. La prevalencia aumento según la edad, hasta alcanzar 60% en el grupo 15 a menos de 20 y la incidencia quinquenal es 4,9% y 9,6% en los primeros 10 años. No se identificó una fuente de riesgo de transmisión pero se considera que es por ooquistes. Se discuten aspectos relacionado con la disminución de la prevalencia, la alta incidencia entre los menores de 10 años, el alto riesgo de transmisión en esta edad y los posibles factores; además la contribución de estos datos en el cálculo del riesgo de transmisión congénita y la propuesta de medidas de prevención factibles de ser implementadas en la sociedad, para disminuir el impacto social y económico de esta patología en el Ecuador.
No. DE REGISTRO (en base de datos): No. DE CLASIFICACIÓN:
DIRECCIÓN URL (tesis en la web):
ADJUNTO PDF: X SI NO
CONTACTO CON AUTOR/ES Teléfono: 0991980370 E-mail: [email protected]
CONTACTO EN LA INSTITUCIÓN:
Nombre: Sra. Rosemery Velasteguí de Carrillo
Teléfono: 2293680 - 0997821581
E-mail: [email protected]
x
INDICE
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Planteamiento del problema 1
1.1.1Metodología 1
1.1.2 Justificación 2
1.2 Objetivos
1.2.1 Objetivo general 2
1.2.2 Objetivos específicos 2
1.3 Hipótesis 3
1.4 Variables 3
Variable independiente
Variable dependiente
Variables de control
Variables intervinientes
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Definiciones conceptuales 4
2.1. 1 Concepto 4
2.1.2 Datos históricos 4
2.1. 3 Clasificación biológica (taxonómica) 7
2.1. 4 Morfología de Toxoplasma gondii 8
2.1. 5 Trofozoitos 8
2.1. 6 Quistes (tisulares) 9
2.1. 7 Ooquistes 10
2.1. 8 Microscopia electrónica 11
2.1. 9 Reproducción 13
2.1. 10 Ciclo evolutivo en el huésped definitivo: gatos y
felinos afines
14
2.1. 11 Ciclo evolutivo en el huésped intermediario (Ser
humano)
14
xi
2.2 Epidemiología 15
2.2.1 Infección por ooquistes 15
2.2.2 Infección por quistes 16
2.2.3 Otros mecanismos de transmisión 16
2.2.4 Ciclo evolutivo de Toxoplasma gondii 17
2.3 Patogenia 18
2.4 Transmisón transplacentaria (vertical) 18
2.4.1 Impacto de la toxoplasmosis congénita 19
2.4.2 Cuantificación del riesgo 20
2.4.3Factores de riesgo 21
2.5 Evaluación y estandarización de HAI y microelisa
23
DEFINICION DE PALABRAS CLAVE
3. MATERIALES Y MÉTODOS
24
3.1 Materiales
25
3.1.1 Lugar de la investigación
3.1.2: El período de la investigación
3.1.3: Recursos empleados
3.1.3.1: Recursos humanos
3.1.3.2: Recursos físicos
3.1.4: Universo
3.1.5: Muestra
3.2 Métodos
26
3.2.1 Tipo de investigación 26
3.2.2 Diseño de investigación 27
3.2.3 Técnicas de investigación 27
xii
3.2.3.1Principio del Enzimoinmunoensayo 27
Procedimiento
Medición
Cálculo de los resultados
3.2.3.2 Principio del ensayo: Hemaglutinación Indirecta 31
Procedimiento
Interpretación de los resultados
3.3 Determinar la incidencia de la infección 33
Toma de la muestra
3.4 Recolección de la información
34
3.4.1Análisis estadístico
3.5 Proponer estrategias de diagnóstico serológico 35
Aspectos éticos
4. RESULTADOS
4.1 Primer objetivo específico
36
4.1.1 Entrevista y toma de muestra 36
4.1.2 Universo de la muestra 36
4.1.3 Condiciones de la vivienda 38
4.1.4 Validación de las pruebas serológicas 39
4.2 Segundo objetivo específico 42
4.2.1 Resultados estadísticos 42
4.3 Tercer objetivo específico 44
Factores de riesgo 46
4.4 Cuarto objetivo específico 48
xiii
5. DISCUSIÓN
5.1.Observaciones de la muestra 49
5.2 Validación de las pruebas de HAI y Elisa 49
5.3 Análisis de los resultados serológicos 50
5.4 Prevalencia
5.5 Incidencia anual. Riesgo quinquenal
50
51
5.6 Mecanismos de infección 52
6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
6.1 Conclusiones
6.2 Recomendaciones
53
54
7. BIBLIOGRAFÍA
55
ANEXOS
Conducta general en el diagnóstico de toxoplasmosis
adquirida en embarazadas inmunocompetentes
58
Matriz de productos 59
Formulario de encuesta 60
1
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Planteamiento del problema
La toxoplasmosis es una enfermedad infecciosa de curso clínicobenigno, causada por el
protozoario coccidio Toxoplasma gondii.El huésped principal es el gato (multiplicación
sexual), el huésped secundario es el ser humano (multiplicación asexual), así como más
de 300 géneros de mamíferos y más de 30 aves. El principal problema de salud de la
toxoplasmosis es la posibilidad de la transmisión transplacentaria y la consecuencia de
un niño con infección congénita, esto es posible cuando la infección es adquirida por
primera vez en el momento del embarazo. Al llegar al niño puede causarle serios
daños, generalmente neurológicos, como hidrocefalia, microcefalia, calcificaciones
cerebrales, coriorretinitis. También es causa de aborto, cuando la infección ocurre en las
primeras semanas del embarazo (1, 10, 23). Otro aspecto importante son los graves
trastornos neurológicos que causa en pacientes inmunodeprimidos, en especial en los
infectados por VIH en la fase de SIDA.
Por lo tanto es imperativo establecer el diagnóstico seguro de toxoplasmosis por medio
de pruebas serológicas; así como el riesgo que tienen los niños de nacer con
toxoplasmosis congénita.Todos los aportes en este sentido contribuyen a disminuir el
impacto familiar y social que representa un infante con esta infección (4, 9).
1.1.1 Metodología:
Los exámenes serológicos de laboratorio son la única herramienta para el diagnóstico
definitivo; actualmente tienen altas sensibilidad y especificidad, pero es imprescindible
la ejecución técnica adecuaday los valores de referencia pues la concentración de
anticuerpos, varía en distintas poblaciones. La interpretación correcta de los resultados
incluye, los conocimientos epidemiológicos que hay en cada comunidad (3, 13, 14).
2
1.1.2 Justificación
La situación antes mencionada requiere como prioridad establecer el riesgo de que un
niño en gestación la adquiera, es decir,diagnosticar las infecciones recientes o agudas en
embarazadas. Otro parámetro importante es determinar la edad y los mecanismos de
transmisión por los se adquiere la infección en la comunidad. Para conseguir conocer lo
antes mencionado, el cuadro clínico no es de gran ayuda, pues enel 85% no se presenta
ninguna sintomatologíay en menos del 15% de las infecciones puede haber un cuadro
ganglionar inespecífico u oligosintomático.
1.2 OBJETIVOS
1.2.1 OBJETIVO GENERAL
Analizar los beneficios de cada una de las pruebas: Hemaglutinación Indirecta (HAI) y
enzimoinmuno ensayo (microelisa), para el diagnóstico seguro de toxoplasmosis y
colaborar en la estimación del riesgo anual (quinquenal) de transmisión de T. gondii y
en la elaboración de política públicas para el control de la transmisión.
1.2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Estandarizar las técnicas de HAI y Microelisa para el diagnóstico de
toxoplasmosis y establecer los rangos de referencia en Guayaquil.
2. Determinar la incidencia de la infección por Toxoplasma gondii, por
seroconversión anual (quinquenal), hasta los 20 años de edad.
3. Estimar, en base a los resultados los más sobresalientes mecanismos de
transmisión de toxoplasmosis en Guayaquil.
4. Proponer estrategias de diagnóstico serológico seguro, factibles de ser aplicadas
3
1.3 HIPÓTESIS
La estandarización y ejecución técnica correctas de las pruebas serológicas HAI y micro
elisa, para detectar anticuerpos antitoxoplasma, permitirá obtener resultados altamente
confiables para el diagnóstico de toxoplasmosis.Los resultados de estas pruebas, con la
interpretación correcta, permitirán calcular el riesgo de transmisión congénita, tanto en
el caso individual, como en la comunidad de Guayaquil.
1.4 VARIABLES
Ø Variable independiente: Los pacientes con toxoplasmosis (Edad de los
examinados, menores a 20 años de edad, agrupados en quinquenios).Factores de
riesgo.
Ø Variable dependiente:La propuesta de diagnóstico serológico seguro (Nivel de
anticuerpos detectados por serología por las técnicas de HAI y microelisa).
Ø Variables intervinientes:Incidencia, Técnicas de HAI y microelisa, Mecanismos
de transmisión.
Ø Variables de control:Realizar las reacciones serológicas en similares
condiciones técnicas y ambientales.
4
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Definiciones conceptuales
2.1.1 Concepto:
Toxoplasmosis es la infección por el coccidio parásito Toxoplasma gondii, que parasita
a más de 300 especies de mamíferos, entre ellos el ser humano y no menos de 30
especies de aves (2, 6). En el ser humano, la infección natural adquirida sigue un curso
benigno y curación espontánea, pero reviste gravedad cuando se transmite al niño por
vía congénita (8,13). Se la adquiere por la ingesta de agua y alimentos contaminados
con ooquistes que se excretan en las heces del gato y, también, por ingerir quistes
tisulares en carnes mal cocidas.
2.1.2 Datos históricos.
Splendore, (26) en Sao Paulo, Brasil encontró por primera vez T. gondii fue en 1908, en
conejos, en que describió lo “corpúsculos parasitarios”, en algunos tejido del animal,
libres o agrupados, así como algunas lesiones patológicas, llegando a concluir que se
trataba de un protozoario parásito, pero no lo identificó ni ensayó una ubicación
taxonómica, por considerar que no tenía los datos completos, como por ejemplo el ciclo
evolutivo. En este mismo año Nicolle y Manceaux (19), en Túnez, África, describen un
microorganismo similar en un pequeño roedor el Ctenodactyllus gondii, y por su forma
de arco lo denominan Toxoplasma, pero lo consideraron como una especie de
Leishmania, a pesar de no observarse cinetonúcleo, para finalmente concluir que es un
nuevo género y la especie: T. gondii.
En los próximos casi 30 años, hasta 1937, se aislaron varios toxoplasmas de las más
diversas especies de mamíferos y de aves, por ejemplo Carini en conejos, Mello en
perros, Castellani en el ser humano (1913), Carini y Maciel en perros, cobayos y
palomas, ubicando cada aislamiento como especie diferente: T. aviar, T. hominis,
T.alencari, T. bahiensis, T. brumpti,T.colubri, T.gondii, T.hammondi, T.pardalis,
5
T.ranae y T.serpai.etc (2). Sin embargo ya estaba planteada la posibilidad que se trate
de una sola especie conescasa afinidad parasitaria (eurixeno). En 1937, Sabin y Olitsky
(24) demostraron la transmisión interespecies, de manera experimental y concluyeron
que todas las “especies” eran una sola, y el nombre que prevaleció es el primero, T.
gondii.
Durante esta época, en este mismo año, Wolff y Cowen (29), al estudiar un caso de
encefalitis en un recién nacido, observaron en el cerebro, en la autopsia, “corpúsculos”
que ellos los catalogaron como Encephalitozoon hominis, lo que fue corregido por
Sabin al reconocer que eran similares a los que estaba estudiando en animales. Así pues
este ese el primer caso relacionado con patología en humanos.Estos mismos autores, en
1939, hicieron el segundo diagnóstico, ahora en vida, de otro caso de encefalitis que
incluyó el aislamiento del parásito, por inoculación peritoneal en ratones blancos. Estos
dos casos de encefalitis, hoy sabemos son producto de infección congénita.A partir de
estas descripciones se practicaron varios trabajos retrospectivos, de historias clínicas y
muestras anatomo patológicas, en especial de recién nacidos, descubriéndose que la
toxoplasmosis era frecuente y además había la fuerte sospecha de su transmisión
congénita, lo que motiva investigaciones en este campo.
En 1941, Pinkerton y Henderson (21) reportan un cuadro con síntomas de infección
generalizada grave, en el que sería el primer caso de toxoplasmosis adquirida del adulto.
Las investigaciones tienen entonces un gran adelanto gracias a la puesta en práctica de
las reacciones serológica, la primera, la reacción de fijación del complemento (RFC), en
1942, por Warren y Sabin y en 1948 el “Dye Test” de Sabin y Feldman, que se
constituyó en el referente de otras pruebas serológicas durante muchos años, aún en la
actualidad se la practica en centros determinados pues se manipula toxoplasmas vivos.
Entonces se empezaron a detectar casos clínicos de variada intensidad, desde leves,
moderados y graves, se describieron los síntomas y signos de cada uno y, el aspecto más
importante, la gran cantidad de infectados sin ninguna sintomatología. Se llegó
inclusive a sobrestimar la importancia de estas infecciones, al considerar que era
suficiente la presencia de anticuerpos anti T. gondii, como signo de enfermedad.Los
6
estudios serológicos en animales mamíferos demostraron la amplia distribución entre las
más diversas especies y se afirmó el carácter cosmopolita de este protozoario (2).
Podemos situar a 1950, para mencionar que con el desarrollo de las pruebas serológicas
se instituyó que T. gondii es capaz de producir infección inaparente. Este hecho fue
trascendental para explicar como niños con enfermedad congénita y cuadros graves,
provenía de madres asintomáticas. Se destaca la descripción hecha por Siim (25) sobre
adenopatías, de evolución benigna, oligo sintomáticas, similares a mononucleosis
infecciosa, que en la actualidad se reconoce como la forma más frecuente de
presentación de toxoplasmosis adquirida.
En esta década se identificaron las afecciones oculares como coriorretinitis, iridociclitis,
y vale citar el trabajo de Wilder (28) en 1953 y Jacob (16) en 1963, que permitieron
ubicar como un problema de gran importancia estas localizaciones oculares y que son
manifestaciones tardías de toxoplasmosis congénita.
Los avances clínicos vertiginosos contrastaban con los avances mas lentos en
epidemiología y fue hasta 1970, Hutchison et al (15) definieron, con los
descubrimientos de los ooquistes, producto de reproducción sexual, en las heces del
gato que aclararon varios aspectos de la transmisión, en especial entre los herbívoros y
las aves, pues hasta entonces se conocía sólo la transmisión por carnivorismo entre los
huéspedes intemediarios, el parásito fue clasificado como coccidio.Al dilucidarse el
ciclo sexuado en los gatos se demostró que se expelen millones de ooquistes que al
diseminarse pueden infectar miles de otros huéspedes, en especial herbívoros, entre
ellos el ser humano.
Los avances inmunológicos, taxonómicos, biológicos, clínicos, epidemiológicos, etc.,
han llevado a una producción bibliográfica increíble. Como punto de partida para la
presente investigación situamos el Simposio Interamericano de Toxoplasmosis,
realizado en Instituto Colombiano para el Fomento de la Educación Superior, de la
Universidad de los Andes en Bogotá, Colombia en 1984.
7
A partir de esta fecha, con la presencia epidemia del Virus de la Inmunodeficiencia
Humana (VIH) y su consecuencia el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA),
la toxoplasmosis se tornó en una de las más importantes infecciones oportunistas,
marcadoras del SIDA, con alta mortalidad de cuadros neurológicos y generalizados,
importancia que se mantiene hasta ahora.
2.1.3 Clasificación biológica (taxonómica)
El T.gondii permaneció durante décadas como parásito de ubicación incierta, hasta
cuando se estableció de manera definitiva su ciclo sexuado y la producción de ooquistes
(2). Es muy importante esta ubicación taxonómica pues al agrupar y categorizar los
seres vivos se facilita su análisis en función de otros seres similares, vivos o extintos.
Los actuales estudios con técnicas moleculares llevan a revisiones permanentes y los
cambios taxonómicos llevan a ubicaciones que son permanentes. Eso sí se mantiene la
denominación binominal para las especies de Carlos Linneo en1753. A partir del año
2000 la Society of Protozoologists, en la segunda edición de la Guía Ilustrada, propone:
Clasificación taxonómica de Toxoplasma gondii
Phylum: Apicomplexa(Levine, 1970)
Clase: Conoidasida(Levine, 1988)
Subclase: Coccidiasina(Leuckart, 1879)
Orden: Eucoccidiorida(Légerand Duboscq, 1910)
Suborden: Eimeriorina(Léger, 1911)
Familia: Sarcocystidae(Poche, 1913)
Subfamilia: Toxoplasmatinae(Bicoca, 1957)
Género: Toxoplasma (Nicolle and Manceaux, 1909)
Especie: Toxoplasma gondii(Nicolle y Manceaux 1909)
8
2.1.4 Morfologíade Toxoplasma gondii(2, 6, 23)
T. gondii tiene dos estadios asexuales: trofozoitos y quistes (tisulares) y uno sexuado:
ooquistes. Los trofozoitos se pueden observar libres, por ejemplo, en el exudado
peritoneal de ratones inoculados, pero su hábitat natural es el interior de células, en
particular el macrófago, se observan agrupados en el citoplasma producto de
reproducción binaria.Los quistes en diversos tejidos de los huéspedes intermediarios,
entre ellos el ser humano y contienen gran cantidad de trofozoitos. Los ooquistes están
en el intestino del gato y se eliminan en sus heces y son producto de reproducción
sexuada.
2.1.5 Trofozoitos
En un examen en fresco, sin tinción, en el microscopio de luz, con aumento de 40x, el T.
gondii libre se ve como un pequeño organismo que tiene la forma de semiluna o arco
(toxon), sin ningún movimiento, y tampoco se observan ninguna estructura como
flagelos o cilios.
Una vez fijado y teñido con los colorantes habituales, Giemsa o wright, se observa el
polo anterior, que corresponde al extremo agudo, mientras que el posterior es
redondeado más ancho, donde se visualiza un núcleo excéntrico de color rojo, que
resalta en el citoplasma teñido de azul. El parásito mide de 5 a 7 μ de largo por 2 a 4 μ
en su parte más ancha.
En el citoplasma de macrófagos se agrupan en gran número, son producto de
reproducción rápida (taquizoitos), y cada uno de los elementos presenta similares
características morfológicas al trofozoito libre, aunque son más pequeños y con leves
variaciones de forma. Al ser inoculados en ratón, adquieren la forma clásica descrita,
cuando libres en el exudado peritoneal.
9
Toxoplasma gondi, tachizoitos, teñidos con Giemsa,.
Frotis de exudado peritoneal de ratón inoculado en el laboratorio.
T. gondii teñidos por immunofluorescencia (IFA).
2.1.6 Quistes (tisulares)
Tienen forma esférica u ovalada y su tamaño es variable desde 10 a 100 μ de diámetro y
el número de trofozoitos que contienen también oscila desde varios centenares a miles
de ellos. El tamaño y el número de trofozoitos aumenta paulatinamente, a causa de la
multiplicación lenta en su interior (bradizoitos). Se forman en el citoplasma de las
células, en especial a nivel del músculo esquelético, cardiaco y cerebro, aunque pueden
10
existir en cualquier órgano. Estos elementos fueron llamados como “seudoquistes” pues
se consideraba que la membrana de la célula afectada era la única que los mantenía y
protegía, pero luego se estableció que tienen membrana propia segregada por los
parásitos y, por lo tanto, son quistes verdaderos.
Quiste tisular, en el músculo de mamífero
2.1.7 Ooquistes
Los ooquistes son el producto de reproducción sexual en el intestino de gatos y felinos
afines y se excretan en las heces, en grandes cantidades, hasta por 3 semanas, en el
ambiente, luego de 2 o 3 días de maduración o esporulación, se vuelven infectantes. Son
ovales, miden 10 a 15 μ. de diámetro mayor, en el interior se distinguen dos
esporoquistes con cuatro esporozoitos cada uno. Son resistentes a las condiciones
externas y en humedad y temperatura adecuadas, sobreviven y permanecen infectantes
durante varios meses hasta 1 año.
Ooquiste de T. gondii como se observa en el examen en fresco de heces de gato.
11
Ooquiste de T. gondii, examen en fresco con solución de lugol, de heces de gato
2.1.8 Microscopia electrónica
La microscopia electrónica, a partir de 1960, tanto la de barrido como de transmisión,
permitió grandes avances en el conocimiento de la biología de T. gondii, En primer
lugar confirmó las características morfológicas mencionadas anteriormente y luego el
análisis de su estructura interna que revela que reúne en su citoplasma todas las
estructuras de los coccidios.
Estos elementos son varias estructuras como el conoide, que parte del extremo más
agudo hacia el interior y de donde se originan fibrillas llamadas toxonemas y las roptrias
u organelas secretoras, que es el sitio de penetración a la célula. También se observa
varias nervaduras radiales que atraviesan toda la longitud del cuerpo por la superficie.
En el citoplasma se visualizan mitocondrias, granulaciones y aparato de Golgi y en el
núcleo, un nucléolo.
El conoide, es la estructura más destacada, en forma de cono truncado de 0,1 a 0,25 μ de
diámetro y de 0,2 a 0,3 μ de profundidad. El T. gondii, al entrar en contacto con una
célula, el conoide efectúa movimientos diversos de extensión o retracción, rotación, etc.
buscando un punto de “anclaje” e inmediatamente por secreciones líticas de las roptrias
penetra en la célula.
12
Toxoplasma gondii en proceso de invasión de macrófagos, obtenidos de líquido ascítico de ratón (x 15.000 A).
Microscopía electrónica de barrido (Cortesía T. Fernández
Conoide, (R1, R2): Anillospreconoidales,
(OM): Pared celular, (IM): Membrana citoplasmática,
(P): Anillo Polar, (N): Núcleo, (NU): Nucleolo,
(RH): Roptrias, (MN): Micronemas, (ER): Retículo endoplasmático,
(GO): Aparato de Golgi, (NE): Membrana nuclear, (NP): Poros nucleares,
(MI): Mitocondria, (A): Gránulos de amilopectina, (L): Inclusiones
lipídicas.
Original: E.Scholtyseck y P.Overdulve.1988
13
2.1.9Reproducción(23)
Las formas vegetativas o trofozoitos se reproducen exclusivamente en el interior de
células huéspedes, formando una vacuola parasitófora y por un proceso asexual
denominado de endodiogenia, en que dos células hijas se forman en el interior de la
célula madre, hasta formar rosetas que rompen la célula parasitada.La reproducción es
rápida y por eso se los denominan taquizoitos. Estos elementos deben ingresar en
nuevas células, son muy frágiles, los anticuerpos y defensas celulares los destruyen con
rapidez y en el exterior no resisten la desecación, la temperatura superior a 65° C,
desinfectantes comunes como el hipoclorito de sodio o etanol, así como el jugogástrico,
siendo incapaces de transmitirse de un huésped a otro, pero son los causantes de la
transmisión transplacentaria.
Los quistes, tisulares, se forman bajo factores aún no del todo esclarecidos, pero todo
señala una respuesta inmune del huésped que lleva a un proceso de multiplicación lenta
(bradizoitos). Permanecen en los músculos y tejidos del huésped por mucho tiempo y
soportan sin problemas los 45ºC y la acidez gástrica, y, en consecuencia, son capaces de
transmitirse por vía digestiva por medio de carnes y tejidos mal cocidos.
Los ooquistes son producto de la reproducción sexual, por gametocitos femenino y
masculino, que se forman en las células epiteliales del intestino del gato, se unen y
forman estos elementos que salen al ambiente por medio de sus heces. Cabe señalar,
además, que en los felinos se han descrito que ocurren los dos ciclos completos de
esquizogonia y esporogonia (monoxeno), aspecto importante para entender la respuesta
inmune en estos animales ya su rol epidemiológico. Los ooquistes son resistentes a la
mayor parte de desinfectantes y al jugo gástrico, y, en condiciones adecuadas de
temperatura y humedad, pueden resistir en el medio ambiente hasta por un año.
2.1.10 Ciclo evolutivo en el huésped definitivo: gatos y felinos afines
Los gatos y los felinos en general son las únicas especies capaces de albergar el ciclo
esporogónico (sexual) y por eso se los denomina huéspedes definitivos de
14
Toxoplasmagondii, y, aunque también en ellos se realiza la fase esquizogónica
(asexual), esta carece de interés en la transmisión. Este ciclo puede durar
indefinidamente en el huésped definitivo (2)
El gato se infecta por ingestión de quistes en los tejidos de animales como ratas, ratones,
aves, etc., aunque también podría ser por ooquistes provenientes de material fecal de
otros gatos y el agua de bebida, se liberan trofozoitos, que invaden las células epiteliales
del intestino, se multiplican en el citoplasma, rompen la célula e invaden el organismo.
También se producen gametocitos femenino y masculino con la producción de
ooquistes y su eliminación al ambiente con la materia fecal. Estos elementos
sondiseminados por el agua de la lluvia, manipulación de la tierra, transporte de
alimentos, vectores, etc., y son ingeridos por animales, principalmente los herbívoros.
2.1.11 Ciclo evolutivo en el huésped intermediario (Ser humano)
Los huéspedes intermediarios son múltiples animales domésticos, salvajes y varias
especies de aves y el hombre. La infección se adquiere tanto por ooquistes y quistes,
que liberan trofozoitos que invaden las células epiteliales del intestino. Se distinguen
dos fases: aguda y crónica. La primera, se caracteriza por rápida multiplicación de los
trofozoitos en casi todos los tejidos, en especial linfático, muscular y nervioso, con o
sin sintomatología pero con diseminación hemática, peligrosa para el feto en la
embarazada. (2, 6)
Este proceso es autolimitante gracias a la respuesta inmune y continúa la fase crónica
con la formación de quistes conteniendo miles de trofozoitos, que permanecerán latentes
por largos períodos y continuarán el ciclo al ser ingeridos por otro huésped por
carnivorismo.
En el ser humano con inmunodepresión, como en los casos de SIDA, u otros factores, el
control de la infección se afecta con diseminación grave de la fase inicial o la recidiva
de la fase latente.
15
El ser humano por su característica de omnívoro, se infecta como los herbívoros con
ooquistes a partir del ambiente y como carnívoro al ingerir carnes infectadas con quistes
tisulares.En las dos formas del ciclo es igual, con multiplicación inicial en el epitelio
intestinal y diseminación linfo-hematógena a cualquier órgano.
2.2 Epidemiología.
T. gondii es un parásito eurixeno, y se lo ha aislado en alrededor de 300 especies de
mamíferos, incluyendo algunas especies marinas y más de 30 especies de aves de corral
y silvestres, lo que la define como la zoonosis y el protozoario, en el ser humano, más
difundido en el mundo. Sin embargo, en su ciclo sexual demuestra una gran
especificidad pues sólo lo cumple en el gato y en especies muy afines (7, 11)
Esta amplia diseminación se debe, a la resistencia de los ooquistes a las condiciones
ambientales, y a la persistencia de los quistes tisulares por largos períodos de tiempo, en
animales que sirven como alimento.
El ser humano adquiere la infección natural por ooquistes, quistes y por vía
transplacentaria y también por accidentes de laboratorio.
2.2.1 Infección por ooquistes
El gato doméstico, es el único felino que juega un papel importante en la transmisión al
ser humano. La excreción de ooquistes es por lo general una sola vez en la vida del
animal, aunque es posible que haya otros períodos mucho más cortos de eliminación.
Es necesario que el gato no esté inmunizado y por eso el ciclo esporogónico es posible
en animales de corta edad, menores de 4 meses, en la práctica cuando el animal no se
aleja del domicilio humano y es una mascota protegida.
Los ooquistes deben ser arrastrados de la materia fecal del gato pues la putrefacción,
proliferación de bacterias, desecación, acción directa de la luz solar y variaciones de
temperatura, los destruyen.La lluvia es fundamental para la diseminación de los
16
ooquistes, los liberan de las heces y los distribuyen en amplias áreas húmedas. También
juega un rol importante como vector, el propio ser humano, capaz de trasladar los
ooquistes por sus manos hacia su propio organismo o hacia los demás en la preparación
de comidas y bebidas.Otros vectores como moscas y cucarachas también son
importantes.
2.2.2. Infección por quistes
Las carnes de consumo habitual humano portan los quistes que resisten el paso por el
estómago y pueden ser destruidas a 60°C. Los quistes pueden ser viables hasta 1 mes en
carnes guardadas a 4°C. Se considera un promedio de 72 % de ovejas y un 28 % de los
cerdos, están afectados, mientras apenas un 4% del ganado vacuno, pero dada la
frecuencia de ingestión de esta carne y la modalidad de comerla semicruda, esta es la
mayor fuente de infección
El papel de las aves domésticas debe definirse, al ser obvio el cambio de modalidad de
consumo de aves criadas en granjas protegidas y de consumo a las 6 semanas de
nacidas, por lo que es dudosa la infección de las mismas.
2.2.3 Otros mecanismos de transmisión
T. gondii puede transmitirse por transfusiones sanguíneas o sus derivados, pues los
trofozoitos pueden sobrevivir algunos días en la sangre citratada, de pacientes en fase de
diseminación hematógena. Esto tiene particular importancia para también para los casos
de trasplantes de órganos
El personal que trabaja en laboratorio con T. gondii viable, puede contaminarse por vía
parenteral. Es una de las razones para la restricción y casi no utilización de la clásica
reacción de Sabin y Feldman (dye test).
No hay evidencias de transmisión por la leche materna.
17
2.2.4 Ciclo evolutivo de Toxoplasma gondii
El gato es el único huésped definitivo de Toxoplasma gondii importante para el ser humano (1), elimina
ooquistes en sus heces, que llegan a ser infectantes en 1 a 5 días. Los huéspedes intermediaries, que son
más de 300 mamíferos y 30aves, los ingieren con el agua y vegetales contaminados (2) Los tachizoitos
invaden el organismo y se localizan en el tejido nervioso y el muscular donde forman los quistes tisulares
(3), que sirven para reinfectar a los gatos (4). Los quistes tisulares infectan infectan varios animals que
ingieren carne cruda (5) y el ser humano por las siguientes rutas:
Ø Ingestión de carne mal cocida o semicruda de animales infectados (6).
Ø Ingestion de agua o alimentos contaminados con heces de gato que contiene ooquistes (7)
Ø Transfusión sanguinea o transplantes (8)
Ø Transmisión transplacentaria (9)
En el ser humano los quistes permanecen asintomáticos en los músculos esqueléticos, cerebro, etc. y el
diagnóstico es por serología (10), aunque en el diagnóstico de la transmisión placentaria puede hacerse
detección de ADN de T. gondii por método moleculares. (11)
18
2.3 Patogenia
La infección por T. gondii, adquirida por de quistes tisulareso por ooquistes, es mayor
o menor en diversas regiones del mundo y en particular del Ecuador, según la
exposición a los factores de riesgo, que predominan y varían de acuerdo a las
poblaciones, aunque tambien se implican a variaciones del parásito (5). En la costa
ecuatoriana, las observaciones prácticas diarias, permiten concluir que los dos
elementos deben actuar por igual, observación no corroborada aún por un trabajo de
investigación (10).
Este contacto con T. gondii se inicia en etapas tempranas de la vida, a partir de los 4 a 5
años de edad y hasta los 18 a 20 años, el nivel de infección alcanza su punto máximo de
la comunidad, es decir la curva demostrativa alcanza la meseta máxima. En la costa
ecuatoriana está establecido que hasta los 20 años de edad la prevalencia de anticuerpos
es de 74% (3, 11, 14).
De cualquier manera como se la adquiera (por quiste u ooquistes), el curso clínico es
generalmente asintomático, y, aún, cuando hay enfermedad manifiesta, la evolución es
benigna y con curación espontánea, dejando inmunidad permanente y efectiva por el
resto de la vida (6, 17).
2.4 Transmisón transplacentaria (vertical)
Este es el mecanismo de transmisión más importante, pues la infección
transplacentaria,que ocurre cuando la infección de la mujer con T. gondii, por primera
y única vez, coincide con el embarazo, cursa con parasitemia inicial y persistente, por
dos o tres semanas y lleva los trofozoitos a la placenta y, así, al feto. (1, 18).Las
mayores consecuencias para el feto son durante los tres primeros meses de gestación,
que pueden derivar en aborto, mortinatos o partos prematuros, pero también recién
nacidos en los que se puede observar desde la típica tríada descrita por Sabin:
coriorrenitis, hidrocefalia y retardo psicomotor, y con encefalomielitis, macrocefalia,
hidrocefalia, convulsiones, microoftalmia, estrabismo, corioretinitis pigmentaria, en
general de gravísima evolución en pocas semanas o meses y retraso psicomotriz.
19
La infección del segundo trimestre, de embarazo puede presentarse una diseminación
multivisceral: neurológica, hepática y/o esplénica, con ictericia, hepatoesplenomegalia y
colitis ulcero-hemorrágicas; o un cuadro similar a sepsis, totalmente inespecífico de
evolución grave.
Si la infección ocurre en el tercer trimestre de embarazo el aspecto delrecién nacido
puede ser normal, y sólo presentar convulsiones, retraso psicomotor ycorioretinitis
pigmentaria al cabo de varios años. La consecuencia inmediata es la prevalencia
acumulada de niños con diverso grado de dificultades en su desarrollo sicomotor.
La infección de la placenta ocurre en primer lugar y es el único momento en que podría
realizarse un tratamiento que evite que el feto se infecte. Esta observación es importante
pues la respuesta de anticuerpos en la madre está en sus inicios y las reacciones
serológicas pueden dar resultados negativos o a títulos bajos que llevan a confusión.
Este riesgo de la gravedad de las lesiones en relación directa con el período de gestación
en que ocurrió la infección, se presenta en el cuadro siguiente (10), en el que cabe
destacar que durante las primeras seis semanas de gestación el riesgo de contaminación
es solo de 1% y hasta la semana 10 alcanza el 2%, dato de importancia para el consejo
de interrupción médica del embarazo.
2.4.1 Impacto de la toxoplasmosis congénita
La toxoplasmosis, en particular la congénita tiene un impacto emocional muy fuerte en
la familia que la recibe, así como un impacto económico y social, que en el país aun no
se ha establecido. En la actualidad con la posibilidad de hacer un diagnóstico seguro
prenatal (17, 22), y un administrar un tratamiento de dudosa eficacia y aún en discusión
(20), los padres enfrentan decisiones éticas sobre posibilidades de interrupción del
embarazo por aborto. Posteriormente la presencia de un niño con diversos grados de
afección neurológica, retardo mental, ceguera, problemas de educación, etc., siempre
afecta el entorno familiar y es una carga económica y social muy significativa.
20
2.4.2 Cuantificación del riesgo
Entonces, la necesidad de cuantificar el riesgo de transmisión se torna absoluta. La tasa
de prevalencia de anticuerpos en adultos es el primer elemento para el cálculo, también
debe conocerse la tasa de incidencia anual de toxoplasmosis en la población, en otros
términos, cuantas nuevas personas se seroconvierten cada año en la comunidad, en
realidad la seroconversión utilizada no es la anual sino la quinquenal y, finalmente la
frecuencia de contacto con una fuente de infección o factor de riesgo de los
recientemente infectados. (4, 7, 12, 27).
La prevalencia de anticuerpos varía de acuerdo con la región y particularidades propias
de la población, como costumbres y hábitos alimenticios o estado de infraestructura. La
transmisión de T. gondii se ve favorecida en las zonas húmedas y calientes,
características que se presentan en la zona tropical de la costa ecuatoriana.
Estudios previos (9), demostraron prevalencias en Babahoyo de 71%, Milagro 58%,
Portoviejo 70%, Quevedo 58% y Guayaquil 80%, lo que hace un promedio de 74% para
la región litoral. Otro estudio serológico en alumnos de la Facultad de Ciencias
Médicas, de Guayaquil, con edad promedio de 21 años, señaló 79% de positividad. En
Esmeraldas llega al 90%, (datos no publicados).Estas altas cifras de inmunización
natural, sustentan que el riesgo de transmisión es menor en las zonas donde
Cuadro 1: Riesgo de infección fetal según la edad
gestacional
Trimestre Semana % de Riesgo
Primero
0 -10
2
11 - 15
15 - 20
Segundo
16 -28
30 - 55
Tercero
29 - 42
60 - 65
21
laprevalencia es mayor, pero en la realidad no es así, pues para las madres seronegativas
intervienen otros factores, en especial la frecuencia de contacto por costumbres: ingerir
carne semicruda; disponibilidad de agua potable; contacto con gatitos y el aseo de sus
cajas de excretas; preparación de alimentos, etc.
Finalmente, es imperativo en particular, estimar el número de recién nacidos con
toxoplasmosis congénita que pueden presentarse anualmente en todo en el país, para
implementar políticas públicas tendentes a disminuir su fuerte impacto tanto familiar,
cuanto comunitario y social.
En 1985 se estimó, en Guayaquil, que serían 147 casos esperados por año (9), cálculo
que se actualiza y acepta hasta 2001 (10). Esta estimación se realiza en base a la
prevalencia de anticuerpos en las embarazadas, sin embargo, es necesario ajustarlo con
los otros componentes, aún no concretados, para tener la imagen más precisa.
La incidencia, es decir los casos nuevos en el lapso de un año, obtenida por el rango de
seroconversión en los grupos de edades menores de 18 – 20 años, permite concretar la
frecuencia de exposición a factores de riesgo en la comunidad. En el Ecuador este factor
no ha sido establecido, y contribuir a este conocimiento forma parte del objetivo de este
estudio, por medio de técnicas serológicas confiables.
2.4.3Factores de riesgo
Mientras tanto los factores de riesgo si han sido claramente establecidos, pero su
importancia depende del nivel de exposición en cada una de las sociedades. Así
tenemos:
1. Ingerir carne de vacuno semicruda: por la alta frecuencia como alimento
preferencial y la costumbre o aceptación de comerla semicruda, por ejemplo
hamburguesas y otros tipo de preparaciones, se constituye en un factor de
primera línea.
22
2. Contacto con gatos y en particular con las pequeñas mascotas de menos de 6
meses de edad, incluye el hábito de limpiar la caja destinada a sus excretas, es
un factor preponderante.
3. Alimentación con otro tipo de carnes (oveja, cerdo) sin cocción adecuada, pero
la menor frecuencia de su ingesta y casi siempre muy bien cocida, la ubica como
una fuente de infección menos factible. El consumo muy elevado de pollos
criados en avícolas controladas, que se los sacrifica a las 6 semanas de edad, es
probable que no sean una fuente importante de quistes de T. gondii, pero aún no
se establecido su real dimensión.
4. El beber agua potable contaminada, mal conservada en el domicilio o
definitivamente tomar agua no tratada, juega un papel aún no bien establecido.
En Brasil se encontró fuerte asociación con toxoplasmosis e ingesta de agua
contaminada. Admitimos como factor de riesgo de alta probabilidad en los
lugares económicamente menos favorecidos. (12)
5. Preparación de comida con vegetales crudos, mal lavados, que previamente se
pudieron contaminar con ooquistes a nivel de mercados o sitios de expendio
insalubres.
Cada uno de estos factores se disgrega en actividades menores, como por ejemplo
probar la sazón de la carne cruda, tipos de cuidado al hacer la limpieza de la caja del
gato, cantidad de felinos en el vecindario, costumbre de comer fuera de casa, beber agua
no segura, etc.
23
2.5 Evaluación y estandarización de HAI y microelisa
Esta investigación propone:
1. Evaluar dos técnicas de diagnóstico: Hemaglutinación Indirecta (HAI) y Enzimo
Inmunoensayo (Microelisa) para dejar establecido los rangos de valores
diagnósticos.
2. Determinar la incidencia anual (quinquenal) en la población comprendida entre 0 a
20años, de diversos sectores de la ciudad de Guayaquil.
3. Contribuir a estimar los mecanismos de transmisión de toxoplasmosis en Guayaquil,
pues estos resultados son necesarios para el cálculo global de riesgo, en especial de
toxoplasmosis congénita.
4. Obtener conclusiones que puedan ser aplicadas para elaborar estrategias de
diagnóstico serológico seguro, factibles de ser aplicadas, en comunidad.
24
DEFINICIÓN DE PALABRAS CLAVE
TOXOPLASMOSIS.- es la infección por el coccidio parásito Toxoplasma gondii,
EPIDEMIOLOGIA.- La epidemiología es el estudio de la distribución y los
determinantes de estados o eventos (en particular de enfermedades) relacionados con la
salud y la aplicación de esos estudios al control de enfermedades y otros problemas de
salud.
TOXOPLASMOSIS CONGÉNITA.-es la infección fetal por trasmisión
trasplacentaria del parásito Toxoplasma gondii en el transcurso del embarazo.
ECUADOR.- es un país constitucional, republicano y centralizado en el noroeste de Sudamérica, limita al norte con Colombia, al este y sur con Perú, y al oeste con el océano Pacífico. TRANSMISION.- Acción y efecto de transmitir.
TESIS, es el inicio de un texto argumentativo, una afirmación cuya veracidad ha sido
argumentada, demostrada o justificada de alguna manera. Generalmente enuncia una
proposición científica, un axioma o un hecho demostrable.
SEROLOGIAEstudio de la naturaleza y producción de los antígenos y los anticuerpos
presentes en el suero.
25
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Materiales
3.1.1: Lugar de la investigación.
Norte: centro de salud N° 1, Julián Coronel y Baquerizo Moreno
Centro: centro de salud N° 7, Cuenca y Noguchi
Noroeste: Subcentro N° 1,sector Balerio Stacio, 5° etapa Mz 1881, solar 12
Subcentro San Alonso Rodríguez, sector Sergio Toral Mz 3301, solar 1
Subcentro Nueva Prosperina, coop. N. Prosperina 8° etapa, Mz 2179,
solar 3
Subcentro Lomas de la Florida, bloque 3, Mz 904, solar 17
Suroeste: Subcentro San Eduardo
3.1.2: El período de la investigación se extiende desde el mes de marzo de 2012 a
octubre de 2012, y la tabulación de resultados, escritura de la tesis e informes hasta
diciembre de 2012.
3.1.3: Recursos empleados
3.1.3.1: Recursos humanos: Tesista JESSENIA ELIZABETH PONCE ARAMBULO,
esta tesis forma parte del proyecto de investigación del Fondo competitivo de la
Universidad de Guayaquil: “Valoración del riesgo de nacer con Toxoplasmosis
congénita y estrategias de prevención, en Guayaquil”, son colaboradores el Dr. Telmo
Fernández Ronquillo (director del proyecto), Dra. Mariuxi Montaño y Dra. Sara
Basantes, investigadoras asociadas y Carmen Yolanda Salazar, secretaria del Instituto
de Investigaciones Médicas.
3.1.3.2: Recursos físicos: el trabajo de laboratorio se desarrollará en el IIM
Kits comerciales para detectar anticuerpos antitoxoplasma por HAI y microelisa
Fotómetro con filtros de 450/620 nm
Incubadora/cámara húmeda con termostato
Dispositivo de lavado manual o automático
26
Micropipetas (10, 100, 200, 1000 μl), tubos de ensayo, tubos al vacío
(vacutainer), jeringuillas de 5 cc y de 10cc, papel filtro, tubos capilares, láminas,
laminillas, cajas de petri, cajas térmicas (plumafón), algodón, alcohol, torundas,
torniquetes, formularios, solución salina, papelógrafos, marcadores de vidrio,
etc
3.1.4: Universo: menores de 20 años que viven en la ciudad de Guayaquil.
3.1.5: Muestra. Se calcula en base a la fórmula:
Donde Z=1,962, p= 0,5, considerando que en Guayaquil en adultos la prevalencia es
74%, en menores de 20 años podría estimarse en 50%; q=(1-05) y d=0,052, margen de
error de 5%.
El número de personas obtenido es 384, y considerando un efecto de diseño de 1,5 se
obtiene 579. Es conveniente aumentar un 5% de improvisto, lo que da el gran total de
608. La muestra se subdivide en 150 por cada grupo:
Ø 0 a menos de 5 años;
Ø 5 a menos de 10 años;
Ø 10 a menos de 15 años
Ø 15 a menos de 20 años.
3.2 Métodos
3.2.1 Tipo de investigación
a) Es una investigación aplicada pues se utiliza conocimientos preestablecidos
para encontrar uno nuevo, en bien de un diagnóstico y de la sociedad.
27
b) Es investigación analítica pues establece comparación entre variables entre
grupos intentando probar una hipótesis.
c) Es una investigación de campo al obtenerse los datos en grupos de
adolescente y niños de diversos sectores de la ciudad.
d) Es investigación transversal, pues realiza una sola medición en relación a un
tiempo determinado. El análisis con resultados anteriores, incluye también el
aspecto de investigación retrospectiva.
3.2.2 Diseño de investigación
El diseño es no experimental, es un estudio observacional, no se modifica el entorno al
momento de recabar los datos; es correlacional pues mide variables y luego las analiza
si están relacionadas con las personas estudiadas
3.2.3 Técnicas de investigación
Objetivo específico 1:Estandarizar las técnicas de HAI y Microelisa para el
diagnóstico de toxoplasmosis y establecer los rangos de referencia
Se utilizaron kits comerciales para detectar anticuerpos antitoxoplasma, tipo IgG, con
las técnicas de enzimo inmuno ensayo (ELISA) y de Hemaglutinación indirecta (HAI).
Por tratarse de un estudio epidemiológico no es necesario detectar la presencia de
anticuerpos tipo IgM, para diagnóstico de infección reciente.
3.2.3.1 Principio del Enzimoinmunoensayo:
Prueba Enzimoinmunoensayo (IgG ELISA) para la determinación cuantitativa de
anticuerpos IgG específicos contra Toxoplasma gondii en suero o plasma humano
La determinación inmunoenzimatica cuantitativa de anticuerpos específicos contra
Toxoplasma gondii se basa en la técnica del ELISA (Enzym linked Immunosorbent
Assay). Antígenos específicos de Toxoplasma gondii se fijan a la fase sólida en los
micropocillos. Los anticuerpos existentes en la muestra se unen a estos
28
antígenosformado un complejo AgAc. Al agregar el conjugado de anticuerpos IgG anti
humano con peroxidasa de rábano, este se une a los complejos AgAc, desarrollando
una coloración azul después de incubarlos con sustrato de tetrametilbenzidina
(TMB).Finalmente, al añadir ácido sulfúrico para detener la reacción, cambia la
coloración de azul a amarillo. La densidad óptica se mide con un lector de ELISA a
450nm.
Los kits comerciales proveen:
Ø Microtiras (IgG) recubiertas de antígeno de Toxoplasma gondii
Ø Diluyente para IgG de la muestra: solución de tampón; pH 7.2 ± 0.2;
Ø Solución de parada: ácido sulfúrico, 0.2mol/l, listo para ser utilizado; tapa roja.
Ø Solución de lavado (20x conc.): solucíon de tampón 20x concentrado para lavar
los pocillos; pH 7.2 ± 0.2.
Ø Conjugado IgG anti-humano (Toxoplasma gondii): conjugado de anticuerpos
IgG anti-humano con peroxidasa.
Ø Solución de sustrato de TMB: 3,3’,5,5’-tetrametilbenzindina (TMB); listo para
ser utilizado.
Ø Soluciones IgG de estándar (Toxoplasma gondii):
Estándar A: 0 IU/ml.: control negativo
Estándar B: 50 IU/ml.: control positivo bajo
Estándar C: 100 IU/ml; control positivo medio
Estándar D: 200 IU/ml.: control alto
Procedimiento
Es imprescindible seguir de manera estricta las instrucciones y precauciones del
productor que se describen en la literatura inserta.
Graduar la incubadora a 37 ± 1°C
29
El siguiente procedimiento es válido para el método manual.Para excluir efectos de
lavado en caso de utilizar los automáticos ELISA elevar el número de lavado de 3 a
5veces y el volumen de solución de lavado de 300 μl a 350 μl.
Antes de comenzar, especificar exactamente la repartición y posición de las muestras y
de los controles en la hoja de resultados suministrada. Usar la cantidad necesaria de
tiras o pocillos en el soporte. En cada ensayo por lo menos 1 pocillo (A1) para el
blanco, 4 pocillos ( B1, C1, etc.) para los estándares A, B, C y D.
Para cada paso de pipeteado en los estándares y en las muestras, usar siempre puntas de
pipeta de un solo uso.
1. Pipetear 100 μl de estándares y muestras en los pocillos respectivos.
2. Recubrir las tiras con los autoadhesivos suministrados.
3. Incubar 1 h ± 5 min a 37°C.
4. Después de la incubación, retirar el autoadhesivo, aspirar el líquido de la
tira y lavarla tres veces con 300μl de la solución de lavado. Evitar el
rebosamiento de los pocillos. El tiempo entre cada lavado y cada
aspiración tiene que ser por lo menos de 5 segundos. Para sacar el resto
del líquido de las tiras, es conveniente sacudirlas sobre papel absorbente.
Ojo: El lavado es muy importante! Un mal lavado provoca una mala
precisión y resultados erróneos!
5. Pipetear 100μl de conjugado anti-IgG (Toxoplasma gondii) en cada
pocillo con excepción del blanco. Cubrir con una lámina adhesiva.
6. Incubar 30 min a 37°C.
7. Repetir el lavado como en el paso numero 4.
8. Pipetear 100μl de sustrato de TMB en todos los pocillos.
9. Incubar exactamente 30 min en oscuridad a temperatura ambiente
(20...25 C).
10. Pipetear en todos los pocillos 100μl de la solución de parada en el mismo
orden y mismo intervalo de tiempo como con el sustrato de TMB.
Toda coloración azul formada durante la incubación se convierte en
amarilla.
30
11. Medir la extinción de la solución en cada pocillo con 450/620nm, 30 min
después de añadir la solución de parada.
Medición
Calibrar a cero con el pocillo “blanco” (A1) el fotómetro (lector de ELISA). Medir la
extinción de todos los pocillos con 450nm y anotar los resultados de los controles y de
las muestras en la hoja de resultados.
Cálculo de los resultados:
Criterios de validez del ensayo.El ensayo es válido si se cumplen los siguientes
criterios:
1. Blanco en A1 extinción < 0.100
2. Estándar A en B1 extinción < 0.200
3. Estándar B en C1 extinción > 0.300
4. Estándar C en D1 extinción > 0.500
5. Estándar D en E1 extinción > 1.000
Estándar A <Estándar B <Estándar C <Estándar D
Cálculo del valor de la medición
Para obtener resultados cuantitativos en IU/ml se tiene que establecer una curva
estándar con los valores de extinción (eje y) de los 4 estándares A, B, C y D contra sus
respectivas concentraciones (0, 50, 100, 200 IU/ml) (eje x).
Con esta curva estándar se obtienen los resultados por el promedio de las extinciones de
las pruebas de los pacientes.
31
3.2.3.2. Principio del ensayo: Prueba de Hemaglutinación Indirecta (HAI)
para la detección de anticuerpos contra Toxoplasma gondii.
La pruebaHAI se fundamenta en la capacidad que tienen los anticuerpos anti-T. gondii
de producir aglutinación de glóbulos rojos sensibilizados con antígenos citoplasmáticos
y de membrana del parásito.
El empleo de ambos tipos de antígenos incrementa la sensibilidad del método
permitiendo la detección precoz de la infección.
Los kits comerciales proveen:
Ø El antígeno HAI: liofilizado de glóbulos rojos de carnero sensibilizados con
antígenos citoplasmáticos y de superficie de T. gondii.
Ø Solución fisiológica tamponada a pH 7 para su reconstitución al momento de
utilizarla.
Ø Suspensión al 1% de eritrocitos de carnero no sensibilizados, para control y
absorción de heterofilia.
Ø Controles Positivo y negativo
Es imperativo seguir las instrucciones y precauciones, de manera precisa, que se
indican en la literatura del fabricante.
Procedimiento
Los exámenes serológicos se procesarán en el Instituto de Investigaciones Médicas
32
Seleccionar una policubeta con pocillos sin usar de fondo en U. Pasar un trapo húmedo
por la base de la policubeta antes de usar, colocarla en forma horizontal sobre el trapo y
realizar el ensayo manteniéndola en esta posición.
1) Con micropipeta, colocar 25 ul de diluyente de sueros en todos los pocillos a
utilizar
2) Añadir en la primera columna, 25 ul de cada suero, incluidos los controles
positivo y negativo.
3) Realizar diluciones a partir de la columna 1 (dilución 1/2), pasando los
microdilutores a la columna 2 (dilución 1/4) y así sucesivamente hasta la
columna 6 (dilución 1/64).
4) Colocar en las columnas 1 y 2 (diluciones 1/2 y 1/4) una gota (25 ul) de GR no
sensibilizados, para control de heterofilia.
5) En el resto de los pocillos, agregar una gota (25 ul) de antígeno HAI.
6) Agitar la policubeta golpeando con los dedos en las paredes laterales, durante 30
segundos por lo menos.
7) Dejar en reposo, al resguardo de vibraciones, durante 90 minutos.
8) A partir de los 90 minutos, leer.
Se puede aumentar la nitidez de la imagen, leyendo sobre un espejo, iluminando la placa
desde arriba e interponiendo un papel blanco y traslúcido entre la policubeta y la fuente
de luz.
Interpretación de los resultados
33
Dentro de las técnicas inmunológicas, la HAI es considerada un método confiable para
la determinación de anticuerpos específicos. No obstante, sus resultados, al igual que los
de cualquier método serológico, sólo constituyen un dato auxiliar para el diagnóstico. Es
por esta razón que los informes deben ser considerados en términos de probabilidad. En
este caso, mayor o menor probabilidad de parasitosis por T. gondii.
Ø No Reactivo: presencia de un sedimento en forma de botón o pequeño anillo de
bordes regulares.
Ø Reactivo: formación de una película o manto que cubre el 50% o más del fondo
de los pocillos.
Se consideran presumiblemente parasitados aquellos individuos cuyos sueros son
reactivos en diluciones mayores o iguales a 1/16.
Recordar que la concentración de anticuerpos varía en distintas poblaciones y en esta
investigación se propone determinar los valores de referencia de la población en
estudio
3.3. Objetivo específico 2: Determinar la incidencia de la infección por Toxoplasma
gondii, por seroconversión anual (quinquenal), hasta los 20 años de edad
Se practicaron los exámenes serológicos, de acuerdo con la técnica descrita,a menores
de 20 años, distribuidos de acuerdo a los qrupos etáreos en quinqueneos.
Distribución espacial: las muestras de sangre se tomaron en los diversos centros de
salud antes mencionados, seleccionados al azar.
Toma de la muestra:
Previo a la toma se obtuvo el consentimiento informado de los padres o representantes
de los niños y adolescentes (ver formulario en anexo 3).
34
Ø Las muestras de sangre se tomaron por venopuntura, por la ventaja que ofrece
para guardar contramuestra y repetir el examen de laboratorio.La toma fue de
preferencia en ayunas, o en ocasiones luego de no ingerir alimento por tres o
cuatro horas. El suero de lo separó de acuerdo a la técnica usual. En ningún caso
hubo necesidad de tomas en capilares microhematocrito o de papel filtro.
Ø Los sueros se conservaron en refrigerador (2-8oC) cuando se aseguraba su
proceso en el transcurso de no más de 72-96 horas. Para períodos más
prolongados se los congeló (-20oC). Además se los mantuvo congelados hasta el
final del estudio para repetir la serología, en casos necesarios, evitando
reiterados descongelamientos y congelamientos
3.4 Objetivo específico 3: Estimar, en base a los resultados, el riesgo de adquirir
toxoplasmosis en Guayaquil.
Recolección dela información: Por medio de un formulario guía se aplicó la encuesta
dirigida hacia la madre o adulto que vive en la casa y conoce de cerca las actitudes de
los menores a quienes se les tomó la muestra.
Esta encuesta enfoca hacia la exposición a los diversos factores de riesgo para adquirir
toxoplasmosis, tales como consumo de carnes semicrudas, crianza de gatos en el
domicilio, preparación de alimentos con vegetales crudos y características del agua de
bebida. Para obtener la información, cada uno de los factores de riesgo fue desglosado
en varias preguntas acerca de actividades precisas que permitirían la infección.
El cuestionario fue aplicado en pruebas pilotos para ajustarlo a respuestas claras y
precisas y su aplicación fue en entrevista directa.
3.4.1Análisis estadístico:
Las variables obtenidas se colocaron en una base de datos de Excel, y se analizaron de
manera individual y por correlaciones bivariadas. Esto permitió calcular la razón de
35
disparidad (OR), los intervalos de confianza de 95%, así como las probabilidades.Con
los datos obtenidos se analizaron y estimaron, de manera objetiva, la realidad sobre
como se transmite la toxoplasmosis en Guayaquil.
3.5 Objetivo específico 4: Proponer estrategias de diagnóstico serológico
seguro, factibles de ser aplicadas.
La elaboración de propuestas se basan en los resultados de las pruebas serológicas a ser
aplicadas tanto en el diagnóstico individual, así como en un programa de control, con
las características de objetividad y factibilidad. Es muy importante esta última para que
sea de fácil ejecución.
Aspectos éticos:
Consentimiento informado escrito: Se explicó claramente a la madre, o el
representante y acompañante del niño, para obtener el consentimiento
correspondiente, firmado en la propia hoja de registro.
No se entregaron regalos, ni vituallas o alimentos, para conseguir la
colaboración, ni se ejerció la más mínima presión para conseguir la
participación.
No se detectaron casos de toxoplasmosis que necesitaban atención inmediata.
36
4. RESULTADOS
4.1. Primer objetivo específico: Estandarizar las técnicas de HAI y Microelisa
para el diagnóstico de toxoplasmosis y establecer los rangos de referencia en
Guayaquil.
4.1.1 Entrevista y toma de muestra
El tamaño de la muestra fue calculada con la fórmula:
Donde Z = 1,962, p = 0,5, considerando que en Guayaquil en adultos la prevalencia es
74%, en menores de 20 años podría estimarse en 50%; q = (1- 05) y d = 0,052, margen
de error de 5%.
Así se estableció un primer total de 384, luego se consideró el efecto de diseño de 1,5,
con 579 individuos y, finalmente se estipuló conveniente aumentar un 5% de
imprevistos, lo que dio el gran total de 608.
Estos datos permitieronestablecer 150 personas en cada uno de los 4 grupos etáreos,
(600 personas, hasta completar el mínimo de 579), distribuidos en base a los años
cumplidos: así un niño con cuatro años 11 meses se ubica en el grupo de 0 – 5 y un niño
con 5 años cumplidos en el grupo 5 – 10.
Ø 0 a menos de 5 años (hasta 4 años 11 meses);
Ø 5 a menos de 10 años (desde 5 años hasta 9 años 11 meses);
Ø 10 a menos de 15 años (desde 10 años hasta 14 años 11 meses)
Ø 15 a menos de 20 años (desde 15 años)
37
4.1.2 Universo de la muestra: se tomaron aproximadamente 600 muestras de sangre,
pero se descartaron alrededor de 22, por diversos motivos, en especial transportación
irregular, manipulación no adecuada, hemólisis, encuesta no fiable, etc. y así el total
trabajado fue de 578, distribuidos en 285 VARONES y 292 MUJERES, y 1 no
especificado. La distribución por grupos de edades se detalla en la TABLA 1.
Tabla 1: Distribución por grupos etáreos
0 a menos de 5 años 148
5 a menos de10 años 175
10 a menos de 15 años 162
15 a menos de-20 años 92
No registrado 1
Total 578
La TABLA 2 muestra los rangos de la muestraobtenida, con la finalidad de evidenciar si
es tomada de acuerdo a la distribución planificada. Así, la edad promedio de las
personas, es de 9,74 (casi 10 años), el 50% de la muestra está entre los 5 y 14 años, la
edad mínima es de 1 año y la máxima de 18.El número de habitantes por casa de los
examinados es en promedio 4,7, agrupados en varones 2.77, y mujeres 2.83, que no es
significativamente diferente en lo referente al sexo. También se muestra que el número
promedio de años habitando en la misma casa es de 7 años.
Tabla 2: Descripción de la Muestra
Promedio Desviación estándar
Edad (años) 9.74 5.02
Número de habitantes varones 2.77 1.37
Número de habitantes mujeres 2.83 1.48
Años habitando en la misma casa 7.09 4.07
38
4.1.3 Condiciones de la vivienda: el 54% de las viviendas son construidas con
cemento; el 64% tiene pozo séptico como mecanismo de eliminación de excretas y tan
solo el 22% por medio de alcantarillas. Por otro lado, el 59% de hogares recibe agua por
medio de red pública y el resto a través de tanqueros; el 85% almacena el agua en
recipientes y apenas el 13% en cisternas; el 54% hierve el agua para su consumo,
mientras que el 28% la toma directa de la llave. En la tabla 3 se resumen las condiciones
de la viviendas.
Tabla 3: Resultados de los Exámenes y Condiciones del Hogar
Resultados Positivo 34,8
Negativo 65,2
Condiciones de la vivienda
Cemento 54.01
Madera/caña 28.40
Mixta 16.90
Otra 0.70
Eliminación de excretas
Alcantarilla 21.55
Letrina 13.28
Pozo séptico 63.79
Otros 1.38
Provisión de agua Red pública 59.12
Tanquero 40.88
Almacenamiento de agua
Cisterna 12.61
Varios recipientes 84.78
Envasada 2.61
Consumo de agua
Llave 28.33
Hervida 54.06
Clorinada 2.60
Envasada 15.01
39
Cabe destacar, además, que en la pregunta directa “Considera que en ocasiones toma
agua no segura? ¿Con qué frecuencia? Explique”, los que dieron positivo al examen
serológico, apenas 11,7% afirmó que siempre toma agua segura, mientras que el 88,3%
manifestó que de manera frecuente o esporádica toma agua no segura, con explicaciones
variadas. La respuesta en los negativos el 25% afirmó tomar siempre agua segura
mientras el 75% no.
4.1.4 Validación de las pruebas serológicas
La ejecución de las pruebas, de HAI y de Elisa, se realizó siguiendo estrictamente las
indicaciones del fabricante. En el caso de HAI se aceptaron los límites de títulos ≥ 1/32
como positivos y los de ≤1/16 como negativos. En el caso de la prueba de Elisa, el
fabricante indica que títulos ≥ 30 son positivos, sin embargo, luego de realizadas las
pruebas el punto de encuentro se dio en 20 UI, es así, para efectos de aumentar la
sensibilidad se adoptó el criterio de ≥ 21 como positivo.
Resultados serológicos. Definiciones: Con el criterio ante mencionado se adoptaron las
siguientes definiciones:
Caso positivo:HAI ≥1/32 (positivo) y Elisa ≥21 UI (positivo), Verdaderos
positivos (VP)
Caso negativo:HAI ≤1/16 (negativo) y Elisa ≤ 20 UI (negativo) Verdaderos
negativos (VN)
Casos no determinados:discrepancia en HAI y Elisa: falsos positivos (FP) y falsos negativos (FN), fueron 14 casos (2,4%) y se describen en la TABLA 4
40
Tabla 4: casos no determinados (discrepancias entre HAI y Elisa)
Títulos ELISA (UI)
Títulos HAI (dilución)
≤ 20 21 - 30 31 - 40 Total
≤1/16
5 2 7
1/32 4 2
6
1/64 1
1
Total 5 7 2 14
En la TABLA 5 se resumen los resultados para cada prueba, para efectos del cálculo de
la sensibilidad y especificidad. Para el efecto son importantes los casos no
determinados.
Tabla 5: Sensibilidad y especificidad
ELISA
HAI Positivos Negativos
Positivos 196 (VP)
5 (FP)
201
Negativos 9
(FN) 368
(VN) 377
Total
205 373 578
41
Sensibilidad: la sensibilidad de la prueba es el número de pruebas positivas por Elisa que fueron identificadas por HAI (x100), es decir la posibilidad de la presencia de falsos negativos es baja.
Especificidad: La especificidad es el número de muestras negativas por Elisa que también fueron identificadas como negativas para HAI (x100), es decir la posibilidad de falsos positivos es baja.
Valor predictivo positivo:
Valor predictivo negativo:
%
42
4.2 Segundo objetivo específico: Determinar la incidencia de la infección por
Toxoplasma gondii, por seroconversión anual (quinquenal), hasta los 20 años de edad.
4.2.1 Resultados estadísticos En la TABLA 6 se describen los resultados, con el porcentaje respectivo entre negativos
y positivos, de acuerdo a los grupos etáreos.Se excluyen los no determinados. También
se incluye los porcentajes de incidencia quinquenal.
Estos resultados de manera explícita indican que el porcentaje de resultados negativos
decrece mientras mayor es la edad del paciente.El resultado inverso, es decir, el
aumento de positivos a medida que aumenta la edad, se presenta en la ¡Error! No se
encuentra el origen de la referencia..
Tabla 6: Resultados serológicos
Edades Negativo Porcentaje Positivo Porcentaje Total Incidencia quinquenal
0 a menos de 5 120 81,1% 28 18,9% 148 4,9%
5 a menos de 10 116 68,2 54 31,8 170 9,6%
10 a menos de 15 96 61,1 61 38,9 157 10,8%
15 a menos de 20 35 39,8 53 60,2 88 9,4%
Desconocida 1
1
Total 368 65,2 196 34,8 564
No determinados 14
578
43
0 a menos de
5
5 a menos de
10
10 a menos
de 15
15 a menos
de 20
Porcentaje 18,9 31,8 38,9 60,2
18,9
31,8
38,9
60,2
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
Ed
ad
es
Figura 1: Prevalencia de resultados positivos por grupo etario
0 a menos
de 5
5 a menos
de 10
10 a
menos de
15
15 a
menos de
20
Incidencia quinquenal 4,9 9,6 10,8 9,4
4.9%
9.6%
10.8%
9.4%
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
Po
rce
nta
je d
e i
nci
de
nci
a q
uin
qu
en
al
Figura 2: Incidencia quinquenal por grupo etario
44
4.2. Tercer objetivo específico: Estimar, en base a los resultados los más
sobresalientes mecanismos de transmisión de toxoplasmosis en Guayaquil.
Para efectos del análisis es necesario presentar los dos grupos de resultados:
losserológicamente positivos y los negativos.
La TABLA 7 presenta los resultados de la regresión logística para los resultados del
examen de toxoplasmosis. La razón de momios se interpreta como el aumento
porcentual en la probabilidad de un resultado positivo ante cambios unitarios en las
variables explicativas. De allí que por cada año de edad del encuestado, la probabilidad
de encontrar un resultado positivo aumenta en 5.7%.En la TABLA 8 se recogen los
factores de riesgo principales para una probable infección, sin embargo los resultados
confirman los hallados en la TABLA 7.
No se encuentran diferencias significativas entre los casos (resultados positivos) y los
controles (resultados negativos). El único caso donde habría un leve riesgo es si los
pacientes consumen alimentos fuera de casa con frecuencia, sin embargo, esto es
significativo al 90% de confianza.
En la TABLA 9 se presenta la ingestión de carne y su frecuencia semanal, separados en
los casos por serología negativos y positivos. Se obtuvieron un total de 559 respuestas.
No se observa diferencia significativa entre los grupos respectivos. El gráfico 3
representa estas diferencias.
45
Tabla 7:
Regresión Logística para la Probabilidad de Resultados Positivos a Toxoplasmosis
Razón de
momios
Error
estándar
Valor
P
Edad 1.057 0.025 0.020
Años habitando en la misma casa 1.025 0.030 0.392
Número de habitantes en la casa 1.037 0.042 0.367
Construcción de la vivienda (1: cemento, 0:
otro) 0.816 0.165 0.315
Almacenamiento del agua (1: cisterna, 0:
otro) 1.456 0.507 0.281
Consumo de agua (1: Directo de la llave, 0:
otro) 1.415 0.350 0.161
Tiene gatos como mascota (1: Sí, 0: No) 1.038 0.230 0.865
Eliminación de excretas (1: Alcantarilla, 0:
Otro) 0.777 0.221 0.375
Provisión de agua (1: Red pública, 0: otro) 0.890 0.219 0.635
Intercepto 0.190 0.080 0.000
46
Tabla 8: Factores de riesgo para la infección por toxoplasmosis
Factores de riesgo
Casos Controles Intervalos
de confianza Valor p
# % # % OR
Vivienda construida de cemento
105 52.2 205 54.2 0.92 0.64 - 1.32 0.647
Eliminación de excretas por alcantarilla
39 19.4 86 22.7 0.81 0.51 - 1.27 0.351
Provisión de agua por red pública
111 55.2 223 58.9 0.85 0.59 - 1.22 0.382
Almacenamiento de agua en cisterna
21 10.4 37 9.7 1.07 0.57 - 1.95 0.801
Consumir agua de la llave o del tanque
72 35.8 113 29.8 1.31 0.89 - 1.91 0.145
Consumir agua hervida 118 58.7 235 62.1 0.86 0.61- 1.24 0.41
Come fuera de casa frecuentemente
29 14.43 36 9.5 1.6 0.91 - 2.78 0.075
Tiene gatos como mascota 112 57.1 198 54.4 1.11 0.77 - 1.61 0.532
Tabla 9: Frecuencia en la ingestión de carne por semana
Ingestión de carne
Negativos % Positivos Total % Total %
Todos los días 4 1,1 5 2,6 9 1,6
1 vez/semana 124 34,2 65 33,2 189 33,8
3 veces/semana 235 64,7 126 64,2 361 64,6
Total 363
196
559
47
La TABLA 10 evidencia el contacto con gatos como mascotas en 577 respuestas y es
así que el 56,5% (326) aceptaron tener gatos en el intradomicilio, mientras que el 43,5
(251) lo negaron. El desglose por respuesta serológica no muestra diferencia
significativa, pues los de los que tenían gatos el 55,9% eran negativos y el 58,2% eran
positivos.
Tabla 10: Contacto con gatos como mascota
Serología
Negativos % Positivos % Total %
SI contacto 209 55,9 117 58,2 326 56,5
NO contacto 167 44,4 84 41,8 251 43,5
Total 376
201
577
0,0%
20,0%
40,0%
60,0%
80,0%
1,1%
34,2%
64,7%
2,6%
33,2%
64,2%P
orc
en
taje
Gráfico 3: Frecuencia en la ingestión de carne por semana
Porcentaje con
serología negativa
Porcentaje con
serología positiva
48
La TABLA 11 demuestra el contacto con gatos menores a 6 meses (gatitos) en 571
respuestas, en que se evidencia un ligero predominio de los casos positivos con 68,2%
que admiten contacto frente a 62,9% de los negativos. (Gráfico 5)
Tabla 11: contacto con gatos menores a 6 meses de edad (gatitos)
Contacto con gatos menores a 6 meses
Negativos % Positivos %
SI contacto 233 62,9 137 68,2
NO contacto 137 37,1 64 31,8
Total 370
201
4.4 . Cuarto objetivo específico: Proponer estrategias de diagnóstico
serológico seguro, factibles de ser aplicadas.
Las recomendaciones están dirigidas principalmente hacia evitar la transmisión
congénita. La situación óptima sería que todas las mujeres en edad gestacional ya estén
inmunizadas de manera natural, pues no existe ninguna vacuna. No es factible
recomendar medidas como comer carne cruda, aunque en Francia si se lo recomendó
tiempo atrás, ni otras medidas que parecerían absurdas. Además, otra característica
fundamental es de recomendar medidas factibles de ser aplicadas en la comunidad, de
bajo costo, evaluables en corto plazo e incluidas dentro de programas nacionales y no
como uno particular para toxoplasmosis.
Las medidas específicas se detallan en el capítulo de recomendaciones como prevención
primaria, secundaria y terciaria.
49
5. DISCUSIÓN
5.1 Observaciones de la muestra:
Para cumplir con los objetivos propuestos se calculó la muestra en 579 niños y
adolescentes hasta 20 años; se alcanzó y procesó 578 muestras válidas (99,8%), con
dispersión similar entre varones (2.77 promedio) y mujeres (2.83), diferencia no
significativa; promedio de edad de 9.74 años; el 50% de la muestra está en el rango
intermedio, entre los 5 y 14; todos estos datos afirman que la población muestreada es
adecuada.
Además, el obtener datos sobre otros indicadores como las condiciones de la vivienda,
tiempo de habitabilidad en ella, tenencia de gatos y consumos de carne, ratifica la
satisfactoria logística ejecutada para cumplir con esta investigación.
5.2 Validación de las pruebas de HAI y Elisa
Las pruebas serológicas demostraron excelente correlación entre ella, no sólo por el
bajo número de resultados indeterminados, 14 (2,42%), sino por los altos rangos de
sensibilidad y especificidad: 95,6% y 98,7%, respectivamente, así como valor
predictivo positivo de 97,5% y valor predictivo negativo de 97,6%.
No hubo cambios en la ejecución de las pruebas, se siguieron las indicaciones de los
fabricantes en todos los detalles, y se aceptaron los valores de referencia por ellos
indicados. Sin embargo en el análisis global de correlación de las dos pruebas, se
observó que en Elisa el límite propuesto de que títulos mayores a 30 UI sean
considerados positivos podía ser reducido a 21UI, sin afectar la especificidad pero si
aumentando la sensibilidad. Así fue decidido y los resultados se muestran de esa
manera.
En este punto cabe concluir que para el diagnóstico de toxoplasmosis cualquiera de las
dos pruebas puede ser utilizada, siempre y cuando su ejecución se haga bajo las normas
de buenas prácticas de laboratorio. La decisión de optar por cualquiera de ellas
dependen de otros factores como el económico, disponibilidad de técnicos, y en especial
el propósito como por ejemplo si es a nivel de las embarazadas o a nivel del
50
reciénnacido; en el primer caso es indistinta la utilización, en el segundo es más fácil la
técnica de Elisa.
En este comentario no se incluye otros sobre la determinación de IgM, IgA, avidez de
IgG o PCR en líquido amniótico, por no ser motivo de este trabajo.
5.3 Análisis de los resultados serológicos
Estos resultados permiten establecer como primer factor la tasa de prevalencia de
anticuerpos (sero-positivos)y el otro dato es la tasa de incidencia anual en la población
en estudio, que más bien es la seroconversión quinquenal. Finalmente, establecer el
mecanismo de transmisión y la frecuencia de contacto con una fuente de infección o
factor de riesgo. (3, 8, 15, 28).
5.4 Prevalencia
Al comparar el grupo actual de 15 a 20 años que tiene 60,2%, hay una diferencia
porcentual de 18% con la prevalencia de 74% de anticuerpos en adultos para toda la
región litoral o costa ecuatoriana, en el estudio previo de 1989 (10,); más aún, al
observar en este mismo estudio, se reportó la tasa en Guayaquil en 80,1%, y, en
particular, más aún, en el grupo de embarazadas menores a 20 años en 78,3% (202
positivas/258 examinadas). También en 1984, los exámenes realizados en estudiantes
del tercer curso de medicina, con promedio 21 años de edad, dieron como resultado
79% (14). Esta diferencia es importante; en parte se explicaría, por los evidentes
cambios de las condiciones de servicios básicos en la ciudad, provisión de agua potable
y alcantarillado y recolección de basura, desde antes de 1989, época de las
investigaciones, hasta la actual, así como en los aspectos de educación para la salud que
en la actualidad se imparte. Esta situación impone nuevos estudios, no sólo en
Guayaquil, sino en las otras regiones del litoral, así como incluir otros estratos sociales.
Sin embargo, es indudable, que la inmunización natural sigue siendo significativa.
Las curva de prevalencia asciende desde el grupo de edad menor (figura 1), lo que
demuestra que la infección se adquiere desde edades muy tempranas (Tabla 6). El
incremento es sostenido hasta alcanzar el 60,2 % en el grupo etáreo final. Este dato es
51
muy importante, pues indica que los niños, desde las edades en que aun son
dependientes de sus padres ya están expuestos a los factores de riesgo.
5.5. Incidencia anual
La incidencia, es decir, el número de casos nuevos en el período de 5 años, o la
seroconversión quinquenal en los grupos etáreos, presentada en la Tabla 6, en promedio
es de 8,7 por cada cinco años y sería de 1,7 anual.
Sin embargo, lo más importante es el hecho que demuestra el rápido incremento de la
infección en los dos primeros quinquenios, hasta los 10 años de edad, que ratifica que a
estas edades la exposición a los factores de riesgo es más intensa. Más aún, el análisis
pormenorizado de los casos positivos del grupo 0 a menos de 5 años, indica que en esos
28 infantes, 8 tienen menos de 2 años; entonces, es posible concluir que es a partir de
los dos años de edad cuando hay un rápido incremento de la infección.
Riesgo quinquenal: Estos datos permiten hacer el cálculo del riesgo de adquirir la
infección, de acuerdo a la fórmula:
En cada uno de los grupos se obtiene:
0 a menos de 5 años: 23,3%
5 a menos de 10: 22,4%
10 a menos de 15: 7,3%
15 a menos de 20: ≤ 1%
Estos datos ratifican que la toxoplasmosis se adquiere en la infancia con gran rapidez
hasta los 10 años, para luego disminuir hasta los 15 años, en la pubertad, dato muy
significativo a considerar para evaluar el riesgo de toxoplasmosis congénita.
52
5.6 Mecanismos de infección
Aunque no se pudo establecer con certeza cual es el más importante y frecuente
mecanismo de infección de los infantes a edad tan corta (entre 2 a 10 años de edad), si
es posible afirmar que debe ser por ooquistes de Toxoplasma gondii, a través del agua
de bebida y alimentos contaminados. La presencia de gatos en toda la comunidad es
muy notoriay los niñoscuando se alejan del hogar a la escuela y otros sectores vecinos,
tienen poco o ningún cuidado acerca de los cuidados de beber agua segura. También
destaca el hecho de la escasa ingestión de carne de ganado vacuno y de otros
mamíferos, señalada como importante mecanismo de transmisión, y la ingestión
frecuente de carne de pollos criados en avícolas y sacrificados apenas a 5 o 6 semanas
de vida, lo que los hace muy poco probables como mecanismo directo de transmisión.
53
6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
6.1 CONCLUSIONES
1. Los exámenes serológicos para toxoplasmosis por HAI y Elisa tienen
sensibilidad y especificidad elevadas y coincidentes, así como el VPP y el VPN,
por lo tanto, para el diagnóstico de toxoplasmosis puede ser utilizado una de las
dos pruebas, siempre y cuando su ejecución se haga bajo las estrictas normas de
buenas prácticas de laboratorio.
2. Hay un descenso evidente de la prevalencia en la población de 20 años de la
ciudad de Guayaquil, con incidencia muy clara en la los primeros 10 años de
edad. Son necesarios trabajos de investigación más amplios en este sentido.
3. No se pudo identificar la fuente de infección, sólo discutir la posibilidad más
destacada que sea por ooquistes y la necesidad de estudios más amplios.
4. Estos datos contribuirán para establecer el cálculo de riesgo fetal de
toxoplasmosis congénita en Guayaquil y llegar a implementar medidas de
prevención para disminuir el impacto de la misma en la familia y la sociedad en
general.
54
6.2 RECOMENDACIONES
Las estrategias están dirigidas a la prevención de la infección por T. gondii en el
embarazo por el peligro de transmisión congénita.
Prevención primaria: Las medidas higiénicas que se recomiendan a las embarazadas,
de manera usual y general, para su cuidado, son capaces de disminuir drásticamente el
riesgo de infección por T. gondii, durante este período; estas son el lavado frecuente de
las manos, en especial al manipular alimentos; limpieza cuidadosa de vegetales que se
ingieren crudos; tomar agua segura. La provisión de agua potable, alcantarillado
sanitario y recolección de basura son factores determinantes de gran importancia.
En particular debe insistirse en la no manipulación de gatos menores de 6 meses
(gatitos) y la limpieza de su caja de arena o similares. La no ingestión de carne
semicruda de res, debe enfatizarse pues es mecanismo concreto de transmisión efectivo.
Para tomar estas precauciones no es necesario conocer el estado serológico de la
embarazada.
Prevención secundaria: se inicia con la práctica obligatoria de las pruebas serológicas
a la embarazada para el diagnóstico de infección reciente y la posibilidad de transmisión
congénita. Para la interpretación de los resultados es recomendable seguir el algoritmo
propuesto por Fernández et. al (11), destacando que en este algoritmo no se incluyen
otro tipo de pruebas que pueden realizarse como la avidez de IgG, determinación de IgA
y PCR en líquido amniótico (18, 19, 21), pues encarecen el proceso, crean angustia y
desesperación en la embarazada y deben ser reservados para casos estrictamente
necesarios.
Prevención terciaria: se refiere al diagnóstico del recién nacido, bien sea “in utero” o
inmediatamente al nacer. Es muy importante esta evaluación por cuanto el tratamiento
disminuye el impacto de las lesiones causadas por T. gondii, en especial en el desarrollo
neurológico y visual. Al respecto existen varios esquemas, a los cuales hacemos
referencia, y no son motivo de esta investigación (19)
55
7 BIBLIOGRAFÍA
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58
ANEXOS
Conducta general en el diagnóstico de toxoplasmosis adquirida
en embarazadas inmunocompetentes
Título anticuerpos Negativo No infección
(HAI o ELISA )
Bajo o medio Infección pasada
(Historia clínica/epidemiología)
Alto
Determinar IgM nuevo examen
en 10 – 14 días Igual resultado
IgM positiva título más alto
al cuádruplo de IgG
Toxoplasmosis reciente Asintomática
Oligoasintomática
EMBARAZADA
Analizar fecha de infeccióny parasitemia
Primer trimestre Segundo Tercero
¿Aborto terapéutico? Tratamiento Esperar nacimiento
Profiláctico
Fernández T. et al (9)
Toxoplasmosis
aguda
59
Matriz de productos
Productos Usuarios
Técnica de HAI y microelisa para diagnóstico de
toxoplasmosis estandarizadas y valores referenciales
para Guayaquil.
Parámetro importante para el cálculo del riesgo de
toxoplasmosis congénita en Guayaquil y también en la
zona tropical ecuatoriana
Laboratorios públicos y privados
Médicos en general
Médicos gineco-obstetras
Obstetrices
Investigadores universitarios
Resultados Beneficiarios Inmediatos
Técnicas validadas para el diagnóstico de
toxoplasmosis
Determinación del riesgo de transmisión de
Toxoplasma gondii.
Sugerencias de medidas y normas destinadas a ser
aplicadas en un programa de control, con las
características de objetividad y factibilidad de
Implementarlas
Laboratorios de diagnóstico
Epidemiólogos
Familias, generalmente jóvenes, que tendrán la certeza
de no tener un hijo con toxoplasmosis congénita
Instituciones de salud y bienestar de control prenatal.
Efectos Beneficiarios Mediatos
Mejor diagnóstico de la toxoplasmosis en Guayaquil.
Interpretación correcta de los resultados, en especial
para el diagnóstico de toxoplasmosis congénita.
Fortalecimiento de investigaciones sobre
toxoplasmosis en general
Laboratorios de investigación
Familias y población en general
Organismos gubernamentales y seccionales que
atienden a niños con problemas de aprendizaje u otros
efectos neurológicos.
60
FORMULARIO DE ENCUESTA
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
UNIDAD DE POSGRADO INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO (UPID)
DIRECCIÓN DE INVESTIGACIONES Y PROYECTOS ACADÉMICOS (DIPA)
Factores de riesgo para la infección por T. gondii
ENTREVISTADOR: CODIGO:
Nombre y relación del responsable del
menor: (a quien se realiza la entrevista)
Firmó consentimiento
informado?
SI NO
Dirección y ubicación de la vivienda:
El niño o joven en entrevista cuanto tiempo ha
vivido en esta casa?
Años: Meses:
Edad del entrevistado
años
cumplidos
Constitución de la familia:
varón mujer Total
¿Cuántas personas habitan en la vivienda?
Adultos ( más 20 años)
Jóvenes (15 – 20)
Adolescentes (10 -15)
Niños mayores (5 -10)
Niños menores (0 -5)
Condiciones de la vivienda
Cemento Madera y
caña
Mixta otra
61
Eliminación de excretas
Alcantarill
a
letrina Pozo
séptico
otro
Provisión de agua potable
Red
pública
Tanquero Envasada otro
Almacenamiento intradomiciliario del
agua
Cisterna Varios
recipientes
Envasada otro
Consumo del agua en el domicilio
Directa de
la llave o
del tanque
hervida clorinada Envasada
Consumo de agua en otros lugares: escuela
Directa hervida clorinada Envasada
¿Considera que en ocasiones toma agua no segura? ¿Con
qué frecuencia? Explique
Ingestión de carne de vacuno: frecuencia
Todos los
días
3 veces/
semana
1 vez /
semana
¿La ingiere aún cuando la observa que esté algo cruda?
NO
Rara vez frecuente Muy
frecuente
Ingestión de otras carnes de mamífero (cerdo, chivo,
borrego)
Rara vez frecuente Muy
frecuente
¿La ingiere aún cuando la observa que esté algo cruda?
NO
Rara vez frecuente Muy
frecuente
Ingestión de otras carnes de aves: pollos de avícola
¿La ingiere aún cuando la observa que esté algo cruda?
NO
Rara vez frecuente Muy
frecuente
62
Otro tipo de aves, incluye “gallina criolla”
¿La ingiere aún cuando la observa que esté algo cruda?
NO
Rara vez frecuente Muy
frecuente
¿Tiene gatos como mascota? NO SI
(dentro de casa)
Siempre Con
frecuencia
Rara vez
¿Tiene contacto con gatos menores de 6 meses? NO
SI
Siempre Con
frecuencia
Rara vez
Comidas fuera de casa
Rara vez frecuente Muy
frecuente
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