UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS DE LA … · Tabla 1. Clasificación de NoV en 7...

I

UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

MAESTRÍA EN INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS

Detección de agentes virales diarreagénicos en niños menores de cinco años en

Bucaramanga y su área metropolitana

Nayibe Tatiana Sanchez Alvarez

Proyecto de Maestría presentado al

Programa de Maestría en Investigación

en Enfermedades Infecciosas de la

Facultad de Ciencias de la Salud de la

Universidad, como parte de los requisitos

para la obtención del título de Magíster en

Investigación en Enfermedades

Infecciosas.

BUCARAMANGA

II

Nayibe Tatiana Sanchez Alvarez

Detección de agentes virales diarreagénicos en niños menores de cinco años en

Bucaramanga y su área metropolitana

Tutora: Dra. M.Sc. Ana Elvira Farfán García

Co-Tutor: Dr. MD, PhD. Oscar G. Gómez-Duarte.

BUCARAMANGA

2016

IV

______________________________________

Tutora

Dra. M.Sc. Ana Elvira Farfán García

V

______________________________________

Co-Tutor

Dr. MD, PhD. Oscar G. Gómez-Duarte

VI

Solo podemos ver poco del futuro, pero lo

suficiente para darnos cuente que hay mucho por

hacer.

Alan Turing.

VII

Dedicatoria….

Esta tesis la dedico con todo mi amor y cariño a mi familia Esperanza

Alvarez, Cristian Sánchez y mi novio Haiver Navarro, por sus sacrificios y

esfuerzos, me brindaron el apoyo incondicional, creyeron en mis

capacidades para hacer este sueño realidad.

Gracias a todos.

VIII

AGRADECIMENTOS

De ante mano quisiera dar mis sinceros agradecimientos a Dios por permitirme iniciar y

finalizar esta etapa de mi vida, a mis padres que desde que inicie mi carrera investigativa

han dado lo mejor de ellos para servirme de apoyo.

A mis tutores la Dra. Ana Elvira Farfán García y al Dr. Oscar Gómez Duarte, que creyeron

en mis capacidades y habilidades, brindándome todo el soporte e inspiración durante el

proceso. A ellos que crearon en mí una semilla de seriedad, responsabilidad, y amor por

la ciencia.

Mis más gratos agradecimientos al programa de Maestría en Investigación en

Enfermedades infecciosas de la Universidad de Santander UDES y a la directora, la Dra.

Liliana Torcoroma García, por su acompañamiento incondicional durante este proceso.

A la Universidad de Santander y la Universidad de Vanderbilt por permitirme hacer parte

de ella en la culminación con éxito de mis pasantías las que me hicieron crecer personal y

profesionalmente.

A Colciencias y a la UDES, por financiar mí propuesta de joven investigador, dirigida por

la Dra. Ana Elvira Farfán García.

IX

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Países con la mayor morbimortalidad de diarrea a nivel mundial. Reporte de

diarrea 2012, OMS. ............................................................................................................ 1

Figura 2. Evolución de las tasas de mortalidad por EDA en Colombia durante 1998 a 2014,

en niños < 5 años. ............................................................................................................... 2

Figura 3. Tasas de mortalidad por EDA en menores de cinco años por 100.000 menores

de cinco años, según departamentos. Colombia, 2010....................................................... 3

Figura 4. Estructura del virus Norwalk, Norovirus. ........................................................... 6

Figura 5. Replicación viral de norovirus.. .......................................................................... 8

Figura 6. Organización genómica de rotavirus. ............................................................... 11

Figura 7. Ciclo de replicación de rotavirus.. .................................................................... 12

Figura 8. Organización genómica de sapovirus.. ............................................................. 14

Figura 9. Organización genómica de Astrovirus.............................................................. 16

Figura 10. Ciclo de replicación viral de astrovirus.. ........................................................ 17

Figura 11. Organización genómica de adenovirus.. ......................................................... 18

Figura 12. Unión del virión de adenovirus con su receptor en la célula, para la entrada

celular.. ............................................................................................................................. 19

Figura 13 Metodología de clonación................................................................................ 33

Figura 14. Análisis filogenético de la secuencia de nucleótidos de norovirus GI.. ......... 60

Figura 15. Análisis filogenético de la secuencia de nucleótidos de norovirus GII. ......... 61

Figura 16. Análisis filogenético de la secuencia de nucleótidos de rotavirus.VP4.......... 63

Figura 17. Análisis filogenético de la secuencia de nucleótidos de rotavirus VP7.......... 64

X

Lista de Gráficos

Gráfica 1. Identificación de norovirus GI/GII, rotavirus, sapovirus, astrovirus y

adenovirus, durante los meses .......................................................................................... 45

Gráfico 2. Identificación de norovirus GI / GII, rotavirus, sapovirus, astrovirus y

adenovirus, durante los meses en los tres rangos de edad................................................ 52

Gráfico 3. Identificación de norovirus GI/GII, rotavirus, sapovirus, astrovirus y

adenovirus, durante los meses en el sexo femenino y masculino. ................................... 55

Gráfico 4. Infección única e identificación de norovirus GI/GII, rotavirus, sapovirus,

astrovirus y adenovirus en el sexo femenino y masculino. .............................................. 57

Gráfico 5. Coinfección e identificación de norovirus GI/GII, rotavirus, sapovirus,

astrovirus y adenovirus en el sexo femenino y masculino. .............................................. 58

Grafico 6. Identificación de norovirus GI/GII, rotavirus, sapovirus, astrovirus y

adenovirus en presencia de diarrea, disentería, vómito, fiebre, dolor abdominal en el sexo

femenino y masculino. ..................................................................................................... 68

Grafico 7. Identificación de norovirus GI/GII, rotavirus, sapovirus, astrovirus y

adenovirus en presencia de diarrea, disentería, vomito, fiebre, dolor abdominal en los tres

rangos de edad. ................................................................................................................. 69

XI

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Clasificación de NoV en 7 genotipos, basados en la secuencia de aminoácidos de

la proteína de la cápside VP1. ............................................................................................ 6

Tabla 2. Reactivos para la PCR múltiple por RT-qPCR para detección de

sapovirus/astrovirus, norovirus GI/GII y qPCR para adenovirus. ................................... 27

Tabla 3. Primers y condiciones amplificación de la PCR múltiple por RT-qPCR para la

detección del ARN y ADN viral (Protocolo del CDC Atlanta, Chhabra Preeti (2013). .. 28

Tabla 4. Componentes de reacción de transcriptasa reversa Norovirus (NovGI, NovGII).

.......................................................................................................................................... 30

Tabla 5. Condiciones del ciclado para la PCR transcriptasa reversa ............................... 30

Tabla 6. Primers usados para la identificación de la región C del gen de la cápside viral,

según protocolo establecido por Kojima et al., 2002. ...................................................... 31

Tabla 7. PCR Master mix ................................................................................................. 31

Tabla 8. Condiciones del ciclado PCR convencional ...................................................... 32

Tabla 9. Condiciones para la ligación de ADN en vectores PGEM ................................ 33

Tabla 10 Genes de la región C de la cápside de referencia de norovirus GI y GII. ......... 35

Tabla 11. Oligonucleótidos primers para la identificación de los genes VP4 y VP7, según

protocolo establecido por Aly et al., 2015. ...................................................................... 37

Tabla 12. Condiciones del ciclado VP4 ........................................................................... 38

Tabla 13. Condiciones del ciclado VP7 ........................................................................... 38

Tabla 14. Genes VP4 / VP7 referencia de rotavirus. ....................................................... 38

Tabla 15. Datos sociodemográficos y factores de riesgo para EDA en la población de

estudio .............................................................................................................................. 40

Tabla 16. Proporción de infecciones por virus entéricos mediante ensayos moleculares y

ELISA en casos y controles. ............................................................................................ 43

Tabla 17. Proporción de coinfecciones por virus entéricos. ........................................... 55

Tabla 18. Proporción de coinfecciones por virus entéricos según rangos de edad .......... 56

Tabla 19 Clasificación de rotavirus detectados según programa RotaC 2.0, de acuerdo a

cada una de las secuencias de las proteínas VP4 y VP7 .................................................. 65

Tabla 20 Tabla resúmen de los genotipos identificados mediante la base de datos del

RotaC 2.0 ........................................................................................................................... 65

Tabla 21 Resumen de los genotipos de la proteína VP4 mediante la base de datos GenBank

.......................................................................................................................................... 66


.......................................................................................................................................... 66

Tabla 23. Distribución de virus identificados por sexo en casos y controles .................. 67

Tabla 24 Distribución de virus identificados por grupos de edad en casos y controles ... 67

Tabla 25 Proporción de diarrea, diarrea sanguinolenta (disentería), vómito y dolor

abdominal en casos de EDA con infección por virus diarreagénicos ............................. 70

XII

LISTA DE ABREVIATURAS

aa: aminoácidos

Ad40: adenovirus tipo 40

Ad41: adenovirus tipo 41

ADN: Ácido desoxirribonucleico

AL: aglutinación en látex

ARN: Ácido ribonucleico

BHQ: quencher Blackhole

Cp: punto de corte

Ct: Cycle Threshold

DEPC: Dietilpirocarbonato

dsRNA: RNA de doble cadena

EDA: Enfermedad Diarreica Aguda

EIA: inmunoanálisis enzimático

ELISA: Inmunoensayo Enzimático (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

ER: retículo endoplásmico

FAM: 6-carboxyfluoreceina

G: genogrupos

G: Gamma

HAstV: Astrovirus humanos

HBGA: antígenos de grupo histosanguíneo

Hsc70: Proteinas de choque termico

XIII

IC: inmunocromatografía

K2: parámetros de kimura

LB: medio Luria Bertani

LAMP: Amplificación isotérmica mediada por bucles

LIBB: Laboratorio de Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas

ME: microscopía electrónica

NASBA: amplificación basada en secuencias de ácido nucleico

NIH: National Institute of Health

NoVGI: Norovirus GI

NoVGII: Norovirus GII

ORF: marcos de lectura abiertos

Pb: Pares de bases

PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa

RT: Transcriptasa Reversa

RoV: Rotavirus

RoVA: Rotavirus grupo A

RT-PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa transcriptasa reversa

RT-qPCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa transcriptasa reversa en tiempo real

SaV: Sapovirus

T92: Tamura de los 3 parametros

UDES: Universidad de Santander

XIV

TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 1

1. MARCO TEÓRICO ............................................................................................. 1

1.1 Enfermedad Diarreica Aguda ...................................................................... 1

1.2 Carga de la Enfermedad Diarreica Aguda (EDA) a nivel global ................ 1

1.3 Epidemiología de EDA en Colombia .......................................................... 2

1.4 Agentes causantes de EDA .......................................................................... 5

1.4.1 Norovirus - NoV ........................................................................................ 5

1.4.1.1 Historia ................................................................................................... 5

1.4.1.2 Biología y taxonomía ............................................................................. 5

1.4.1.3 Replicación viral o ciclo biológico ................................................... 7

1.4.1.4 Epidemiología .................................................................................. 8

1.4.1.5 Formas de transmisión ...................................................................... 9

1.4.1.6 Aspectos clínicos y complicaciones ....................................................... 9

1.4.2 Rotavirus .................................................................................................. 10

1.4.2.1 Historia ................................................................................................. 10

1.4.2.2 Biología y taxonomía .......................................................................... 10

1.4.2.3 Replicación viral o ciclo biológico ...................................................... 11

1.4.2.4 Epidemiología ...................................................................................... 12

1.4.2.5 Formas de transmisión ......................................................................... 13

1.4.2.6 Aspectos clínicos y complicaciones ..................................................... 13

1.4.3 Sapovirus ................................................................................................. 13

1.4.3.1 Historia ................................................................................................. 13

1.4.3.2 Biología y taxonomía ........................................................................... 13


1.4.3.4 Epidemiología ...................................................................................... 14

1.4.3.5 Formas de transmisión .................................................................... 15

1.4.3.6 Aspectos clínicos y complicaciones ............................................... 15

1.4.4. Astrovirus ............................................................................................... 15

1.4.4.1 Historia ................................................................................................. 15



1.4.4.4 Epidemiología ...................................................................................... 17


1.4.4.6. Aspectos clínicos y complicaciones .................................................... 18

1.4.5 Adenovirus entéricos ............................................................................... 18

1.4.5.1 Historia ................................................................................................. 18



1.4.5.4 Epidemiología ...................................................................................... 19


1.4.5.6 Aspectos clínicos y complicaciones ..................................................... 20

XV

1.5 Diagnóstico de agentes virales diarreagénicos. .............................................. 20

1.5.1 Técnicas directas: microscopía electrónica, Detección de antígenos por

inmunoensayos y aglutinación. ........................................................................ 20

1.5.2 Detección del genoma viral ..................................................................... 20

1.5.2.1. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) ..................................... 21

1.5.2.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR)21

1.5.2.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa transcriptasa reversa en tiempo real (RT-

qPCR) ............................................................................................................... 22

1.5.2.5 Otras técnicas ....................................................................................... 22

2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 24

2.1 OBJETIVO GENERAL ............................................................................ 24

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................... 24

3. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................. 25

3.1 Tipo de estudio .......................................................................................... 25

3.2 Área geográfica ......................................................................................... 25

3.3 Universo .................................................................................................... 25

3.4 Población ................................................................................................... 25

3.5 Muestra ...................................................................................................... 25

3.6 Material biológico ..................................................................................... 25

3.7 Procedimientos .......................................................................................... 26

3.7.1 Extracción de ARN viral ......................................................................... 26

3.7.2 Extracción de ADN viral ......................................................................... 26

3.7.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa Transcripción Reversa en Tiempo Real

(RT-qPCR) múltiple ......................................................................................... 27

3.7.4 Interpretación de resultados de RT-qPCR ............................................... 29

3.7.5 Secuenciación de cADN de Norovirus .................................................... 29

3.7.5.1 Protocolo de Transcripción Reversa (RT) del ARN de Norovirus GI/GII

30

3.7.5.2 Purificación del producto de PCR .................................................. 31

3.7.5.3 Polymerase Chain Reaction (PCR) convencional de la región C .. 31

3.7.5.4 Análisis de secuenciación y construcción del árbol filogenético ... 32

3.7.5.5 Protocolo de clonación ................................................................... 32

3.7.5.5.1 Purificación del producto de PCR. ............................................. 33

3.7.5.5.2 Ligación en el vector p-GEM ..................................................... 33

3.7.5.5.3 Transformación. .......................................................................... 34

3.7.6 Extracción del plásmido .......................................................................... 34

3.7.7. Árbol filogenético norovirus .............................................................. 35

3.7.8 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) para la identificación de

Rotavirus .......................................................................................................... 36

3.7.8.1 PCR para la identificación y posterior secuenciación de rotavirus ...... 37

3.8 ASPECTOS ÉTICOS ................................................................................ 39

3.9 ANÁLISIS DE DATOS ............................................................................ 39

4. RESULTADOS .................................................................................................. 40

4.1. Datos sociodemográficos y factores de riesgo .............................................. 40

4.2. Estudio viral .................................................................................................. 42

XVI

4.2.1. Proporción de agentes virales ................................................................ 42

4.2.2. Detección viral en meses del año entre casos y controles ...................... 43

4.2.3 Detección viral entre casos y controles por rangos de edad y durante los meses

de estudio ......................................................................................................... 46

4.2.4 Detección viral en meses del año por sexo entre casos y controles ........ 52

4.2.5 Coinfecciones virales en casos y controles .............................................. 55

4.3 Filogenia de aislados de norovirus GI y norovirus GII ............................. 58

4.4. Filogenia de aislados de rotavirus ................................................................. 62

4.4.1 Comparación del análisis filogenético de las proteína VP4/VP7 de rotavirus

65

4.5 Factores demográficos implicados en EDA de etiología viral ....................... 66

5. DISCUSIÓN ....................................................................................................... 71

6. CONCLUSIONES ................................................................................................. 77

7. REFERENCIAS ..................................................................................................... 79

8. ANEXOS .............................................................................................................. 100

XVII

RESUMEN

Introducción: La enfermedad diarreica aguda (EDA), presenta mayor prevalencia en

niños menores de cinco años. Puede estar causada por bacterias, parásitos y/o

principalmente virus. El diagnóstico de infecciones virales gastrointestinales es limitado

por los altos costos en técnicas moleculares y el desconocimiento del personal de salud

sobre su importancia clínica. Los estudios reportados de estas infecciones en Colombia

son escasos. Objetivo: Identificar la frecuencia de agentes virales asociados a EDA y

caracterizar a nivel filogenético los dos agentes virales más frecuentes. Materiales y

métodos: A partir del material biológico colectado de un estudio previo de casos y

controles de 405 niños con EDA y 405 controles, se realizó un estudio analítico. Las

muestras de heces se procesaron por métodos moleculares para la detección de adenovirus,

norovirus, sapovirus, astrovirus y rotavirus. Adicionalmente, ELISA directo fue usada

para la detección de antígenos de rotavirus. El análisis filogenético fue realizado para

norovirus y rotavirus mediante la amplificación de genes blanco de los fragmentos de la

región C de la cápside y las proteínas VP4 y VP7, respectivamente. Resultados: Entre las

810 muestras se detectó positividad para virus en 30,1 %, 45,4 % en casos y 14,8 % en

controles. El virus más prevalente fue norovirus GII 10,9 %, seguido de rotavirus y

sapovirus con 5,1 % cada uno. Adenovirus, astrovirus y norovirus GI se detectaron en

porcentajes que variaron entre 1,7 y 3,8 %. La mayor frecuencia de virus se observó en

los rangos de edad de 12 a 23 meses y de 24 a 59 meses. Norovirus GII fue el más

prevalente en los casos con síntomas de diarrea y vómito en 93 y 88,8 % respectivamente.

Los genotipos de norovirus más frecuentes fueron GI.2 y GII.4 y los genotipos más

frecuentes de rotavirus fueron G12P8 y G9P8. Conclusiones: Se logró la identificación

de 6 virus en muestras de materia fecal de niños menores de cinco años. El agente viral

más frecuentemente aislado fue norovirus y el subtipo más importante fue norovirus GII.

Se demostró la importancia de los virus en la epidemiología de EDA y la alta diversidad

genética de los genotipos de norovirus y rotavirus en una población pediátrica de

Bucaramanga y su área metropolitana, Colombia.

XVIII

ABSTRACT

Introduction: acute diarrheal disease (ADD), the highest prevalence in children under

five. It can be caused by bacteria, parasites and / or viruses mainly. The diagnosis of

gastrointestinal viral infections is limited by the high costs of molecular techniques and

the lack of health personnel about its clinical importance. Reported studies of these

infections in Colombia are scarce. Objective: To identify the frequency of viral agents

associated EDA phylogenetic level and characterize the two most common viral agents.

Materials and Methods: From biological material collected from a previous case-control

study of 405 children with EDA and 405 controls, an analytical study. Stool samples were

processed by molecular methods for the detection of adenovirus, norovirus, sapovirus,

astrovirus and rotavirus. Additionally, direct ELISA was used for the detection of

rotavirus antigen. Phylogenetic analysis was performed to norovirus and rotavirus by

amplifying target gene fragment C region capsid proteins VP4 and VP7 and respectively.

Results: Among the 810 samples positive for the virus was detected in 30,1%, 45,4% in

cases and 14,8% in controls. The most prevalent virus norovirus GII was 10,9%, followed

by rotavirus and sapovirus with 5,1% each. Adenovirus, astrovirus and norovirus GI were

detected in percentages ranging from 1,7 to 3,8%. The highest frequency of virus was

observed in the age ranges of 12 to 23 months and 24-59 months. GII Norovirus was the

most prevalent in cases with symptoms of diarrhea and vomiting in 93 and 88,8%

respectively. The most common norovirus genotypes were GI.2 and GII.4 and the most

common rotavirus genotypes were G12P8 and G9P8. Conclusions: 6 virus identification

was achieved in stool samples of children under five years. The most frequently isolated

viral agent was norovirus and most important subtype was norovirus GII. The importance

of virus in the epidemiology of EDA and high genetic diversity of genotypes of norovirus

and rotavirus in a pediatric population of Bucaramanga and its metropolitan area,

Colombia was demonstrated.

Introducción

1

INTRODUCCIÓN

La enfermedad diarreica aguda (EDA) es considerada un problema en salud pública

que afecta a todos los grupos de edad. Se ha convertido en la principal causa de

consulta en países en vías de desarrollo, observándose una alta prevalencia en niños

menores de 5 años (Kosek et al., 2003; Kotloff et al., 2013; Ahmed et al., 2014; Walker

et al., 2012; Lim et al., 2016).

Las enfermedades gastrointestinales infecciosas son causadas por bacterias entre el 20

al 30% y más del 75 % son de etiología viral (Sidoti et al., 2015; Webb & Starr 2005;

Clark et al., 2004). Los patógenos virales más asociados a EDA en niños menores de

2 años son rotavirus con una prevalencia entre 30 y 50 %, adenovirus del 5 al 20 %.

En menores de 5 años se identifica con una frecuencia entre 10 y 38% y 1 a 4%,

norovirus y astrovirus, respectivamente (Liu et al., 2011; Clark et al., 2004).

Sin embargo, otros virus menos identificados como aichivirus, parechovirus,

enterovirus y bocavirus humano han sido considerados agentes productores de diarrea

en humanos (Chhabra et al., 2013; Khamrin et al., 2011; Sidoti et al., 2015; Stanway

et al., 2000; Pang et al., 2005; Reuter et al., 2009; Chow et al., 2010).

Desde 1972, cuando fue identificado el primer agente causal de gastroenteritis

(Kapikian et al., 1972), diferentes técnicas de identificación como microscopía

electrónica (ME), cultivo celular, aglutinación en látex (AL), inmunoanálisis

enzimático (EIA) y técnicas moleculares, se han implementado para la identificación

de los agentes virales causantes de EDA. El cultivo celular, aunque es la técnica

estándar de oro para la identificación viral, presenta una gran desventaja por ser

dispendiosa, costosa y no todos los laboratorios cuentan con infraestructura y recursos

necesarios para su realización (Logan et al., 2006; Kapikian et al., 1972).

Las técnicas moleculares son muy sensibles y requieren de 101 a 103 partículas

virales/gramo de materia fecal (Bellido et al., 2007; Logan et al., 2006; Svraka et al.,

2010; Bon et al., 1999; Chikhi et al., 2002; Yan et al., 2004), por lo que son empleadas

con fines diagnósticos por los laboratorios altamente especializados o de investigación.

Sin embargo, no han sido empleadas con frecuencia en todos los laboratorios por las

mismas limitaciones que presenta la técnica estándar de oro.

La EDA en Colombia, contínua siendo una enfermedad común que ocupa los primeros

lugares de morbimortalidad en niños menores de cinco años (Manrique et al., 2006).

La tasa de mortalidad por EDA es de 22,6 casos por 1.000.000 habitantes menores de

cinco años (Boletín epidemiológico, semana 37, SIVIGILA, 2015).

En Colombia son muy escasos los estudios que se han llevado a cabo para la

identificación de virus diarreagénicos, los principales están enfocados en la detección

de rotavirus como agente viral causante de EDA, destacándose que este agente es

inmunoprevenible, a diferencia de los otros patógenos implicados en esta enfermedad

(Urbina et al., 2003, 2004; Urbina et al., 2008; Fernández el at., 2015; Cáceres et al.,

2006; Solano et al., 2012).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Clark%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15353966

Introducción

2

El diagnóstico viral de EDA en la región de Santander, ha sido limitado, debido a los

altos costos de las técnicas usadas, al desconocimiento por parte del equipo de salud

de los diversos virus que causan diarrea, a la inadecuada recolección y manejo de las

muestras para el diagnóstico. Entre otras, estas son causas que no permiten determinar

con exactitud la prevalencia de estos virus en la región (Gutiérrez et al., 2005). De otro

lado, el diagnóstico se enfoca en agentes etiológicos de tipo parasitario y bacteriano,

sin tener en cuenta el análisis viral (Beersma, 2012; Sidoti et al., 2015).

En Santander, existen pocos informes epidemiológicos sobre EDA y escasos estudios

completos reportados que muestren la prevalencia de los agentes etiológicos

(bacterianos, parasitarios o virales), al igual que los factores de riesgo en la población

más vulnerable (niños menores de 5 años) (Yepes et al., 2009). La información

disponible corresponde a lo notificado por el SIVIGILA.

Teniendo en cuenta los antecedentes de esta enfermedad en la población menor de

cinco años, se planteó este estudio con el objetivo de identificar mediante técnicas de

biología molecular e inmunológicas agentes virales diarreagénicos (norovirus GI/GII,

sapovirus, astrovirus, adenovirus y rotavirus) en dos grupos (niños con EDA (casos) y

sin EDA (controles)) de niños menores de cinco años de Bucaramanga y su área

metropolitana.

Marco Teórico

1

1. MARCO TEÓRICO

1.1 Enfermedad Diarreica Aguda

La Organización Mundial de la Salud (OMS) define la diarrea como la presencia de 3 o

más episodios de heces blandas o líquidas en 24 horas (OMS, 2015; CDC, 2015). Se

considera una alteración de la motilidad intestinal caracterizada por un aumento en el

contenido de agua, volumen o frecuencia de las heces (Chow et al., 2010). Las principales

manifestaciones clínicas de esta enfermedad son diarrea aguda, moderada o severa con o

sin vómitos, acompañada de dolor abdominal, dolor de cabeza, fiebre y escalofríos

(Hernández et al., 2011), pudiendo llegar a deshidratación y finalmente en casos extremos

a la muerte (OMS).

1.2 Carga de la Enfermedad Diarreica Aguda (EDA) a

nivel global

A nivel mundial, la EDA es considerada la segunda causa de muerte en niños menores de

cinco años. Se atribuye que una de cada diez muertes en este grupo de edad es por esta

enfermedad, dando como resultado aproximadamente 800.000 muertes al año en países en

desarrollo, la mayoría ocurridos en África subsahariana y el sur de Asia (Kotloff et al.,

2013; Ahmed et al., 2014), contrario a los países industrializados, en donde el número de

muertes por esta enfermedad es de aproximadamente 300 por año (Chow et al., 2010).

Adicionalmente, cada año se presentan 1700 millones de casos (OMS, 2016) (Figura 1).

Figura 1. Países con la mayor morbimortalidad de diarrea a nivel mundial. Reporte de diarrea 2012, OMS.

Color azul, Afganistán, Angola, China, República Democrática del Congo, Etiopía, India, Mali, Pakistán,

Nigeria, y Sudán.

Fuente: Who.int. (2016). WHO | Ending preventable deaths from pneumonia and diarrhoea by 2025. [online]

Available at: http://www.who.int/maternal_child_adolescent/news_events/news/2013/gappd_launch/en/

[Accessed 3 Oct. 2016].

Marco Teórico

2

1.3 Epidemiología de EDA en Colombia

En Colombia, la EDA ocupa los primeros lugares de morbimortalidad en niños menores de

cinco años (Manrique et al., 2006). Aunque es una enfermedad prevenible y a pesar que

desde los últimos 20 años las muertes por esta causa han disminuido, aún sigue cobrando

vidas dentro de la población infantil. Las tasas de mortalidad entre los años 1998 y 2014

han disminuido pasando de 33,8 a 3,11 muertes por 100.000 niños menores de cinco años

(Castillo et al., 2014; Así vamos en Salud, 2016) (Figura 2).

Figura 2. Evolución de las tasas de mortalidad por EDA en Colombia durante 1998 a 2014, en niños < 5

años.

Fuente: https://www.asivamosensalud.org/inidicadores/estado-de-salud/grafica.ver/12

Un reporte generado en el año 2010 de las tasas de mortalidad en niños menores de 5 años

por EDA en Colombia, muestra que los departamentos con las tasas más altas en el país

son Vaupés con 43,7% seguido de Guainía con 10,4%. Casanare y San Andrés Islas en este

año no habían reportado casos de mortalidad por EDA en menores de cinco años. Sin

embargo, es importante anotar que durante el presente año la principal entidad territorial

que ha notificado el mayor número de casos de EDA en niños menores de cinco años ha

sido la Guajira con un 14,4% (Sivigila, 2016). En Santander, se observa una tasa de

mortalidad por EDA de menos de 13.00 por 100.000 menores (Figura 3).

33,8

21,8 22,9

16,7

20,1 20,4

16,3

13,311,5 11,7

8,27,3

5,23,7 3,5 3,4 3,1

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014

Tasa

de

Mort

ali

da

d d

e E

DA

< 5

añ

os

Año

https://www.asivamosensalud.org/inidicadores/estado-de-salud/grafica.ver/12

Marco Teórico

3

Figura 3. Tasas de mortalidad por EDA en menores de cinco años por 100.000 menores de cinco años,

según departamentos. Colombia, 2010. Fuente: Ministerio de salud y protección social dirección de

epidemiología y demografía grupo ASIS, 2013.

Los pocos estudios realizados en nuestro país se han centrado en la identificación de

algunos agentes virales en especial rotavirus tipo A como agente causal de EDA en niños

menores de 5 años. La cronología de algunos estudios enfocados en la identificación de

agentes virales en Colombia han sido reportados desde 1982 con la identificación de

rotavirus en 48% de los niños con EDA grave y 36% con EDA moderada en muestras

seleccionadas de 75 niños de la ciudad de Medellín (Trujillo el at., 1985).

En las ciudades de Cartagena y Sincelejo, durante marzo de 1998 a julio del 2000, rotavirus

tipo A fue identificado en 36,6% como el principal agente causante de EDA, 44,2% en

Cartagena y 28,3% en Sincelejo, seguido de Salmonella 9,0%, Shigella 8,0%, E. coli 6,0%

entre otros agentes bacterianos y parasitarios (Urbina et al., 2003).

En un trabajo realizado en el 2004 se genotipificó rotavirus en 67,9% de las muestras

positivas. Los resultados de la secuenciación de la proteína VP7, mostró el genotipo G1

como el más prevalente con 57,9%, seguido de G3 (21,1%), G9 (15,8%) y G2 (5,3%). Los

genotipos P basados en la proteína VP4 fueron, P[4], P[6], P[8] en 49,1%, 36,4% y 14,5%,

respectivamente. Las combinaciones más comunes entre G y P fueron G3P[4] (8,8%) y

G9P[6] (7,0%), seguido de G1P[4] y G1P[8] (con 5,3% cada uno). Este estudio evidenció

una marcada diversidad en las cepas recolectadas (Urbina et al., 2004).

En Bogotá, con el fin de establecer la relación entre las infecciones causadas por rotavirus

y la deshidratación por diarrea en niños menores de cinco años, se llevó a cabo un estudio

durante el período de abril del año 2000 a febrero del 2001. Se observó asociación

Marco Teórico

4

estadísticamente significativa entre la diarrea, la deshidratación y la presencia de rotavirus.

43% de las 290 muestras de materia fecal fueron positivas para este agente (Cáceres et al.,

2005).

En la misma época, entre los años 1996 y 2002 con el objetivo de determinar el

comportamiento de astrovirus como agente causal de diarrea en las ciudades de Bogotá,

Facatativá, Cartagena y Quibdó en niños menores de cinco años, se determinó baja

prevalencia de este virus (2,8%). Las muestras positivas genotipificadas no evidenciaron

ningún cambio evolutivo en su genoma, comparado con cepas de otros países, lo que

sugiere que han sido cepas conservadas en los últimos tiempos (Gutiérrez et al., 2005).

En el año 2004, se determinó la prevalencia y los tipos de agentes infecciosos causantes de

EDA en niños menores de cinco años que consultaron a la IPS de Tunja, Boyacá,

considerándose como agente causal rotavirus con 48,1% comparado con agentes

bacterianos y parasitarios (Manrique et al., 2006).

En tres regiones Colombianas (región Andina, Costa Atlántica y el Oeste del Pacífico) entre

los años 1984 a 2006, se realizó una revisión sistemática de 23 estudios con el fin de

determinar la frecuencia de virus como causa de EDA. Rotavirus fue identificado con

mayor frecuencia (35,2%), Calicivirus en 10,4% solo fue identificado en la ciudad de

Facatativá durante 1999 al 2000 y en Quibdó entre del año 2000 al 2003. Adenovirus y

astrovirus se identificaron en 2,7% y 1,35%, respectivamente, en Bogotá, Facatativá,

Cartagena y Quibdó (Urbina et al., 2008).

En la ciudad de Bucaramanga, en los meses de septiembre a octubre del 2006 se determinó

la prevalencia de los agentes patógenos comunes asociados con EDA en niños menores de

cinco años, que eran atendidos en los servicios de urgencias de instituciones de salud,

evidenciándose rotavirus en 44 % con respecto a los otros agentes, lo cual indica que es

fundamental su identificación en esta región (Yepes et al., 2009).

En el año 2015 se determinó la prevalencia de rotavirus y norovirus en dos regiones de

Colombia. En el Chocó se identificó 8% de norovirus y 6 % de rotavirus, menor que en

Cundinamarca con 9,7 % para el último y 9 % para el primero. Estos datos sugieren

diferencias en la distribución de norovirus, lo cual podría ser explicado por patrones de

estacionalidad, población vulnerable y a las diferentes técnicas de identificación empleadas

(Fernández et al., 2015).

Actualmente y según reporte del SIVIGILA, en el boletín epidemiológico de la semana 37

del año 2016, han ingresado 98 casos probables de muerte por EDA en menores de cinco

años, 55 han sido confirmados y 43 se encuentran en estudio para su clasificación final y

definición de la causa de muerte (Sivigila, Instituto Nacional de Salud Colombia).

El número de casos de muertes en Colombia varía desde 1 en el departamento de Sucre

hasta 14 en la Guajira, siendo esta la región con el máximo de casos reportados. La

incidencia más alta de EDA se registró en el sexo femenino con 56,1% y en menores de un

año con 56,1% (Sivigila, 2016).

Marco Teórico

5

1.4 Agentes causantes de EDA

La frecuencia de los agentes etiológicos de la EDA varían de acuerdo al país, región o

comunidad, cambios climáticos, rangos de edad, tipo y sensibilidad de las técnicas

empleadas para su diagnóstico (Manrique et al., 2006). Los parásitos Giardia lamblia,

Cryptosporidium y Entamoeba histolytica son los que presentan aproximadamente el 10%

de relevancia en los casos de gastroenteritis (Chow et al., 2010; Elliott, 2007; Kotloff et al.,

2013; Panchalingam et al., 2012). La diarrea causada por bacterias varía entre 10 al 20%,

los agentes bacterianos más comunes son Salmonella spp, Shigella spp, patotipos de E.

coli, Campylobacter, Yersinia spp (Caracciolo et al., 2007).

Los virus son responsables de aproximadamente el 75% de los cuadros diarreicos en niños

menores de cinco años (Khamrin et al., 2011; Andreasi et al., 2008; Jakab et al., 2005;

Sidoti et al., 2015; Webb & Starr 2005; Elliot, 2007). Existen más de 20 tipos de virus que

causan diarrea acuosa en humanos (Andreasi et al., 2008; Wilhelmi et al., 2003). Los

grupos virales más importantes incluyen virus ARN: rotavirus del grupo A, norovirus,

astrovirus y sapovirus y un virus ADN: adenovirus entérico tipo 40/41 (Chhabra et al.,

2013; Gallimore et al., 2004; Bon et al., 1999; Chikhi-Brachet et al., 2002; Clark and

McKendrick, 2004; Heatley et al., 1988).

1.4.1Norovirus - NoV

1.4.1.1 Historia

En 1929, Zahorsky describió por primera vez la "hemis hiperémesis" o "enfermedad de

vómitos de invierno", como una enfermedad caracterizada por la aparición de vómitos y

diarrea, que por lo general alcanzaba su punto máximo durante los meses más fríos (Patel

et al., 2009).

En 1972, se descubrieron partículas virales de aproximadamente 27 nm de diámetro

llamadas norovirus, mediante el uso de la microscopía inmunoelectrónica (IEM) en un

filtrado de heces de un brote de gastroenteritis infecciosa aguda no bacteriana en Norwalk,

Ohio, Estados Unidos. De forma natural y experimental, se demostró que el agente tenía la

capacidad para inducir enfermedad en voluntarios humanos (Kapikian et al., 1972).

Posteriormente, en 1990 el genoma de NoV fue clonado y caracterizado. Se identificó su

ácido ribonucleico (ARN) monocatenario de sentido positivo de aproximadamente 7,6 kb

(Kapikian et al., 1972).

1.4.1.2 Biología y taxonomía

El genoma de NoV está organizado en tres marcos de lectura abiertos (ORF). El ORF1 en

el extremo 5´ codifica para una poliproteína no estructural grande de 1738 aminoácidos

(aa) con un peso molecular de 193,5 (193.5K). Esta poliproteína se escinde en motivos

cortos identificados como 2C (helicasa), 3A, 3B o VPg, 3C (Cisteína proteasa), 3D (ARN-

polimerasa dependiente de ARN) y p48. Estas proteínas están implicadas en la replicación

viral.

Marco Teórico

6

El segundo marco de lectura, ORF2, codifica una proteína de 530 aa (56,6k) denominada

proteína mayor de la cápside (VP1). Esta proteína forma dos dominios el P (Protruding,

por hacer parte de la porción más externa, a su vez, presentan dos subdominios el P1 y el

P2), blancos para la genotipificación y S (Shell, ubicado en la porción interna de la cápside)

(Figura 4).

Figura 4. Estructura del virus Norwalk, Norovirus. A. estructura de la cápside icosahédrica. El color amarillo

muestra el dominio P2, el rojo el dominio P1 y el azul el domino de la corteza. B. Genoma con los 3 ORF y

cada una de las proteínas que codifican. Modificada de Glass et al., 2009.

La mayoría de las interacciones celulares y las características de reconocimiento

inmunológico se dan en el subdominio P2, el cual es principalmente reconocido por los

antígenos del grupo histosanguíneo (HBGA, del inglés histo-blood group antigens),

considerado como un receptor y factor de susceptibilidad del huésped para la infección. A

su vez, cada virus tiene su receptor celular para el proceso de infección.

De acuerdo a la información de las secuencias del gen POL en el ORF1 o el gen VP1 del

ORF2 (Vinjé at al., 2003), NoV se divide en siete genogrupos (G), de los cuales GI, GII y

GIV afectan a humanos. Dentro de estos genogrupos, existen diversos genotipos (Tabla 1)

(Vinjé et al., 2015).

Tabla 1. Clasificación de NoV en 7 genotipos, basados en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la

cápside VP1.

Genogrupo Genotipo

Región C Área geográfica Fuente Referencias

GI GI.1–GI.9

Taiwan, Grecee,

China, Australia,

Japan:Miyagi, Italia,

áfrica del sur,

España, Finlandia,

Brasil, Singapur

Materia fecal de

humano, Aguas

residuales, ríos.

Comidas.

Wu et al., 2016;

Siafakas 2016; Lim et

al., 2016; Kazamaet al.,

2016, Pavoni et al.,

2014, Mans et al.,

2016, Fernandez-

Marco Teórico

7

Jiménez et al., 2016,

Huu et al., 2016,

Teixeira et al., 2015,

Neo et al., 2016,

GII GII.1–GII.22

Korea del sur,

Ethiopia, Cameroon,

China, Brazil,

Mexico, Russia,

Paraguay,USA,

Vietnam

Materia fecal de

Humano – Porcino,

aguas residuales.

Koo et al., 2016, Sisay

et al., 2016; Li et al.,

2016; de Andrade

Et al., 2014; Ajami

Et al., 2016;

Zhirakovskaia

Et al., 2015, Galeano et

al., 2013, Park et al.,

2016; Tra My

Et al., 2014.

GIII GIII.1–GIII.3 Irán, Egipto Materia fecal de

bovino

Pourasgari et al., 2015;

Mohamed et al., 2016;

GIV GIV.1–GIV.2 Brasil, Corea del sur,

USA, Costa Rica

Materia fecal de

humano,

Felino/Canino,

aguas residuales.

Teixeira et al., 2016;

Han et al., 2013;

Kitajima et al., 2016.

Pichardo et al., 2014.

GV GV.1–GV.2 USA Murinos Zhang et al., 2015;

GVI GVI.1–GVI.2 Japón, Italia Canino Takano et al., 2015;

Martella et al., 2012.

GVII GVII.1 Uruguay Aguas residuales Lizasoain et al., 2015.

La clasificación en genogrupos se realiza por secuenciación del producto obtenido

mediante RT-PCR de la secuencia genómica presente en el ORF1 y ORF2 (Vinje et al.,

2003).

1.4.1.3 Replicación viral o ciclo biológico

La infección depende de la presencia de HBGA. Los receptores HBGA son una familia

compleja de glucanos presentes en la superficie de células sanguíneas, en los epitelios

intestinales, respiratorios, secreciones biológicas, como la saliva y la leche, que actúan

como receptores para el virus en los hospedadores susceptibles (Ribes et al., 2010).

Adicionalmente, existen diferentes enzimas como la fucosiltransferasa 2 (FUT2, enzima

secretora), FUT3 (enzima Lewis) y las enzimas A y B implicadas en la síntesis de HBGAs.

Así, mutaciones en los genes que codifican estas enzimas pueden alterar la expresión de

HBGAs en la superficie de la mucosa que conllevan a la resistencia natural a la infección.

Principalmente la deficiencia de la enzima FUT2, hace que las personas que estén en

contacto con NoVGI.1, NoVGII.3 y la mayoría de NoVs GII.4 no se infecten (Lindesmith

et al., 2003; Donaldson et al., 2010)

NoV se une a los receptores celulares a través de un dominio específico de la proteína de

la cápside (región P2). Esa unión conlleva a la penetración del genoma al interior celular,

ya sea por la liberación directa desde la superficie o por la endocitosis de la partícula viral

y su posterior salida al citoplasma. Puesto que el genoma de NoV es un ARN de cadena

sencilla y de polaridad positiva, una vez que se localiza en el citoplasma celular puede

actuar como ARN mensajero y sintetizar las proteínas virales utilizando la maquinaria

traduccional celular (Ribes et al., 2010; Vinje et al., 2015) (Figura 5).

Marco Teórico

8

Figura 5. Replicación viral de norovirus. 1. Unión al factor de fijación. 2. Unión de la partícula viral al

receptor celular. 3. Entrada de la partícula viral. 4. Eliminación o pérdida de la cápside. 5. Traducción. 6.

Procesamiento de la poliproteína. 7. Formación de complejos de replicación. 8. Replicación del ARN. 9.

Ensamblaje del virión. 10. Salida de la partícula viral. Modificado de Thorne et al., 2014.

La incapacidad para cultivarse in vitro ha bloqueado la caracterización del ciclo de vida de

este agente viral (Thorne et al., 2014). Sin embargo, en el presente año se reportó un cultivo

de enterocitos infectados con NoV, en el que se necesita la bilis como factor para la

replicación del virus. La inadecuada expresión del antígeno del grupo histosanguíneo en

las células intestinales restringe la replicación del virus, pero aún así se requieren más

estudios que aborden esta temática (Ettayebi et al., 2016).

1.4.1.4 Epidemiología

NoVs han sido reconocidos como una de las más importantes causas de gastroenteritis

aguda no bacteriana en todos los grupos de edad a nivel mundial (Gómez et al., 2012; Patel

et al., 2009). Es el responsable del 90 % de las gastroenteritis virales y por lo menos del

50% de todos los brotes de gastroenteritis a nivel mundial en recintos cerrados como

ancianatos, cruceros, guarderías, entre otros. Sin embargo, la prevalencia de este agente es

raramente registrada en los países en vías de desarrollo (Hall et al., 2011; Widdowson,

2005). Se conoce que NoVs son la causa de 900.000 episodios de gastroenteritis, 64.000

hospitalizaciones y 128.000 muertes cada año en niños menores de cinco años en los países

en vías desarrollo (Patel et al., 2008; Monteiro et al., 2013).

Marco Teórico

9

En estos países se ha implementado la búsqueda de tasas de reinfección, prevalencia y

susceptibilidad genética a NoV mediante la implementación de técnicas de identificación

más sensibles, con el objetivo de aportar información del impacto de estos agentes en la

clínica. NoV ha sido el responsable de 11,2% de los episodios de EDA en niños de la India,

de los cuales 2,6% fueron NoVGI y 8,1% NoVGII (Menon et al., 2016). En Lima, Perú, se

identificó NoV en 17,4% de 224 muestras diarreicas en niños menores de 24 meses de edad

y entre estas muestras positivas, el 92 % fueron norovirus GII (Rivera et al., 2011). Por su

parte, en Brasil en el año 2009 se identificaron NoVs de niños sintomáticos y asintomáticos

en 17% y 13%, respectivamente (Barreira et al., 2010).

Adicionalmente NoV se ha reportado en el 58 % de los brotes alimentarios, en los países

desarrollados en donde se ha introducido la vacuna de rotavirus, reemplanzado la causa de

gastroenteritis viral (Payne et al., 2013).

1.4.1.5 Formas de transmisión

El virus puede estar presente en las heces y el vómito de las personas infectadas, siendo así

de fácil y rápida propagación, a través gotitas, fómites, el contacto de persona a persona,

contaminación de alimentos y aguas residuales con partículas virales provenientes de

materia fecal.

Los principales factores de NoVs que impactan en la salud pública incluyen: (I) Las bajas

dosis infecciosas (18 a 1000 partículas víricas), (II) aparición de la enfermedad en hasta del

30% de las personas expuestas, aumentando el riesgo potencial de diseminación

secundaria, (III) soportan una amplia gama de temperaturas (congelación a -60°C) y

persistencia en superficies del medio ambiente, aguas recreativas, de bebida y en una

variedad de alimentos, incluyendo ostras, frutas y verduras que son regadas con aguas

residuales y que se consumen crudas, (IV) La diversidad de cepas de NoVs y (V) la falta

de inmunidad a largo plazo (6-14 semanas). Una persona sintomática infectarse de nuevo

con la misma cepa después de 2 o 3 años (Glass et al., 2009; Constantini, 2010).

1.4.1.6 Aspectos clínicos y complicaciones

Las infecciones causadas por NoV tienen un período de incubación de 10 a 51 horas. Los

síntomas incluyen vómitos en proyectil, seguido de calambres abdominales, fiebre, diarrea

acuosa y otros síntomas tales como dolor de cabeza, escalofríos y mialgias. La enfermedad

normalmente dura entre 2 a 3 días, pero puede prolongarse de 4 a 6 días. Las personas

infectadas que no tienen compromiso de su sistema inmune expulsan partículas virales

durante un máximo de 8 semanas y los pacientes inmunocomprometidos durante más de

un año (Bellido et al., 2007; Patel et al., 2009; Glass et al., 2009).

Marco Teórico

10

1.4.2 Rotavirus

1.4.2.1 Historia

La primera partícula viral de rotavirus (RoV) fue descubierta por primera vez en animales

en el año 1960 y 1973, mediante el uso de ME, Ruth Bishop, Geoffrey Davidson, Ian

Holmes y Brian Ruck identificaron el virus en células epiteliales maduras que recubren las

vellosidades del duodeno y en las heces de los niños con gastroenteritis aguda.

El virus fue identificado como reovirus similar a orbivirus, que presentaban gran parecido

a los virus ya implicados en la etiología de diarrea en ratones recién nacidos (Bishop et al.,

2009). Fue hasta el año 1974, cuando Thomas Henry lo denominó rotavirus basado en la

estructura de rueda (rota en latín) observada en el microscopio electrónico. En 1980, se

iniciaron los primeros estudios del desarrollo de las vacunas para rotavirus (Ciarlet et al.,

2009; Vesikari et al., 2010).


RoV pertenecen a la familia Reovidae. Son virus de aproximadamente 70 nm de diámetro,

icosahédricos, no envueltos. Su genoma es ARN de doble cadena (dsRNA) que está

rodeado de una cápside de tres capas. Este ARN presenta 11 segmentos, que codifican 6

proteínas estructurales, VP1 a VP4, VP6, VP7 y 6 proteínas no estructurales NSP1 a NSP6

(Aly et al., 2015).

La proteína VP6 es la más abundante y presenta los determinantes antigénicos específicos

de los grupos y es parte de la capa media de la cápside. La capa externa presenta dos

proteínas, VP4 y VP7. Estas actúan como antígenos neutralizantes, los cuales sirven como

blancos vacunales. Es importante anotar que estas dos proteínas definen el genotipo del

virus. La proteína VP7 es glicosilada, lo que permite la clasificación de los genotipos G y

la VP4 es una proteasa que determina el genotipo P. Por otra parte, la proteína NSP4,

permite la categorización en diferentes genotipos y actúa como una enterotoxina capaz de

desencadenar diarrea (Aly et al., 2015).

En este género hay siete serogrupos distintos del A al G, que se distinguen por poseer

diferentes proteínas VP6. Los grupos A, B y C son responsables de EDA en los seres

humanos, siendo el grupo A, el más identificado en niños menores de cinco años (Aly et

al., 2015; Bishop et al., 1973; Yan et al., 2004) (Figura 6).

Marco Teórico

11

Figura 6. Organización genómica de rotavirus. Modificado de Nan et al., 2014

En la actualidad se conocen aproximadamente 27 tipos G y 37 tipo P, los genotipos más

comunes son G1P[8], G2P[4], G3P[8] y G4P[8], siendo estos los responsables del 90 % de

casos de gastroenteritis humana del grupo A en el norte de América y Europa (Aly et al.,

2015).


Las partículas virales que tienen tres capas en la cápside, primero se adhieren a los HBGAs

sobre la superficie de la célula del huésped, seguido por la interacción con otros receptores

celulares, como integrinas y las proteínas de choque térmico (Hsc70) (Gualtero et al.,

2007). El virus se internaliza mediante endocitosis mediada por receptores. Después de

esto, ocurre la eliminación de la capa exterior, provocada por el bajo nivel de calcio del

endosoma, lo que provoca la liberación de partículas de doble capa en el citoplasma. Estas

comienzan el proceso de transcripción de ARNm, dichos ARN son utilizados para traducir

las proteínas virales. Una vez que se han producido suficientes proteínas víricas, el genoma

de ARN se replica y se empaqueta en estructuras llamadas viroplasmas (Hu et al., 2012).

Los partículas de doble capa se unen a la proteína NSP4, que sirve como receptor en el

retículo endoplásmico (ER del inglés endoplasmic reticulum). Durante este proceso, las

partículas víricas se empiezan a ensamblar en el ER, ocurre la eliminación de la membrana

transitoria y empieza el montaje de las proteínas de la cápside externa VP4 y VP7,

resultando en la maduración de la partícula con las tres capas.

Finalmente, se libera la progenie de viriones mediante lisis celular. En las células epiteliales

polarizadas, las partículas son liberadas por un mecanismo de transporte vesicular (Hu et

al., 2012) (Figura 7).

Marco Teórico

12

Figura 7. Ciclo de replicación de rotavirus. Modificado de Hu et al., 2012.


Las principales infecciones son causadas por rotavirus del grupo A, (RoVA), responsables

de más de 600.000 muertes anuales en todos los niños a nivel mundial. Sumado a esto,

causan entre el 25 al 35% de los casos de las hospitalizaciones por enfermedad

gastrointestinal (Azaran et al., 2016). Este agente viral es la principal causa de brotes, tanto

en los países desarrollados como en desarrollo (Wilhelmi et al., 2003; Rahman et al., 2007).

Comercialmente se conocen dos vacunas: una llamada Rotarix, monovalente derivada de

la cepa humana G1P[8] y la otra Rotateq, pentavalente recombinante de la cepa bovino

(WC3)-humano (Ali et al., 2016; McAtee et al., 2016). Rotarix, (RIX4414), es administrada

en dos dosis orales principalmente en el 2do y 4 do mes de edad (Yeung et al., 2016),

disponible en muchos países de Europa, América del Norte, América Latina, Asia y África

(Phua et al., 2009). En América Latina se ha encontrado una eficacia entre 80 al 83 %.

RotaTeq es combinada con cinco cepas atenuadas, que expresan la proteína de superficie

VP7 de los RoV de los tipos G1, G2, G3 y G4. El genotipo P[8] corresponde a la presencia

de la proteína VP4 del RoV (Ciarlet et al., 2009; Vesikari et al., 2010). El esquema de

administración son tres dosis por lo general al 2 do, 4 to y 6 to mes de edad (Yeung et al.,

2016).

Estas dos vacunas fueron aprobadas y recomendadas para la inmunización de rutina en la

Unión Europea en el año 2006. La eficacia de las vacunas ha oscilado entre el 80% al 98%

en los países industrializados y en América Latina, pero en países como Kenia, Malawi,

África, Bangladesh, Vietnam y Asia la eficacia, es de 51% al 64%, esto puede ser debido

a la alta incidencia de la enfermedad grave por rotavirus, una amplia diversidad de cepas

de rotavirus circulantes y una alta exposición a la infección natural por rotavirus en la

infancia temprana (Mrozek et al., 2016; Phua et al., 2009; Cunliffe et al., 2012). Estas

Marco Teórico

13

vacunas fueron diseñadas como estrategias de prevención y para disminuir severidad en las

infecciones por RoV.


La principal forma de transmisión es fecal/oral de persona a persona. Este virus exhibe

bajas dosis infecciosas (menos de 10 partículas virales). El virus es expulsado en 1011

partículas por gramo de heces, antes del inicio de los síntomas y después de dos semanas

(Chen et al., 2012; Richardson et al., 1998). Las partículas virales pueden durar en

superficies secas durante 10 días y más de 4 horas en las manos de las personas, por lo que

la transmisión puede ser por fómites, agua y superficies ambientales (chen et al., 2012).


Los síntomas más evidentes son vómitos, fiebre y diarrea no sanguinolenta, generalmente

entre 10 a 20 deposiciones durante 3 a 8 días (OMS). La diarrea es producida por una

reducción de la superficie de absorción debido al daño celular por efectos enterotoxigénicos

de la proteína NPS4 (Bellido et al., 2007; Chen et al., 2012).

Dentro de la primera semana de la enfermedad se detecta IgM específica de RoV en las

heces y en el suero. Pasada la enfermedad se detecta IgG, indicativo de una infección

resuelta. Estos anticuerpos confieren protección para una próxima infección (Bellido et al.,

2007).

1.4.3 Sapovirus

1.4.3.1 Historia

Las partículas de sapovirus (SaV) fueron descubiertas por primera vez mediante

microscopía electrónica (ME) en muestras de heces diarreicas de humanos en el Reino

Unido en 1976 (Oka et al., 2015; Madeley et al., 1976). Un año después se identificó en un

brote de diarrea en un orfanato en Sapporo, Japón, en Octubre 1977, lugar que le atribuye

su nombre (Torner et al., 2016).


SaV pertenece a la familia Caliciviridae. Son virus de 30 a 38 nm de diámetro con

estructura icosahédrica (Oka et al., 2015) y ARN de cadena sencilla con polaridad positiva

(Yan et al., 2003) con un tamaño de 7.3 a 7,5 kb. Este virus tiene depresiones en forma de

copa en la superficie, lo cual es una morfología típica de los Calicivirus (Oka et al., 2015).

Su genoma consta de 2 ORF. El ORF1 codifica para proteínas no estructurales (NS1 a NS7)

y proteínas VP1 de la cápside, el ORF2 codifica una proteína menor de la cápside llamada

VP2 (Svraka et al., 2010; Oka et al., 2015) (Figura 8).

Marco Teórico

14

Figura 8. Organización genómica de sapovirus. Modificado Oka et al., 2015.

Mediante los análisis de la secuencia completa de la cápside, se han clasificado en cinco

genogrupos (GI a GV). SaV GIII infecta la especie porcina y SaV GI, GII, GIV y GV

infectan a los humanos (Svraka et al., 2010).

Se han descrito 15 genotipos en los cuatro genogrupos relacionados en las infecciones en

humanos (GI.1 a GI.8, GII.1 a GII.5, GIV y GV) (Torner el at., 2016).


El conocimiento detallado del ciclo de replicación de los calicivirus en humanos no se

conoce por falta de un modelo animal y de un sistema de cultivo de células infectadas (Bull

et al., 2011).


SaV son responsable de gastroenteritis en todos los grupos de edad. Afecta tanto humanos

como animales. Están presentes en baja prevalencia de los casos de EDA en niños y se

relacionan principalmente a pacientes con complicaciones clínicas como

inmunosuprimidos o niños prematuros (Oka et al., 2015). La mortalidad por este agente es

rara.

Reportes realizados en diferentes estudios en Japón durante los años 1999 al 2013 muestran

tasas de detección entre 1,7 a 19,2%, cabe resaltar que las altas tasas de estos estudios

fueron por los largos periodos de estudio. Sin embargo, la prevalencia de casos esporádicos

en otros informes demuestran tasas que oscilan entre 1,7 a 5,1% (Thongprachum et al.,

2016).

En el norte de África, la República Tinecica, se investigó la incidencia y el papel clínico

de varios virus entéricos responsables de gastroenteritis infantil, durante el año 2003 al

Marco Teórico

15

2005, encontrándose a sapovirus relacionado en 1,0% de los casos (Sdiri et al., 2008).

Ouagadougou, Burkina Faso, desde el año 2011 al 2012, atribuyó la diarrea a sapovirus en

10,3% siendo este porcentaje bajo comparado con la identificación de otros agentes virales

como rotavirus, adenovirus y norovirus en 63,5%, 31,2%, y 18,2%, respectivamente

(Ouédraogo et al., 2016).

En Estados Unidos estudios recientes en los estados de Portland, Maryland y Virginia, han

demostrado la identificación de sapovirus en solo 2% como agente viral diarreagénico, bajo

porcentaje en comparación con los otros agentes (Grytdal et al., 2016).

Las infecciones relacionadas con este agente son menos reportadas, alcanzando tasas de

detección del 10 %. En general los síntomas son más leves comparados con los otros

agentes virales diarreagénicos (Bucardo et al., 2014).


La transmisión es de persona a persona o puede propagarse a través de la vía fecal/oral y

alimentos o aguas contaminadas. La exposición a superficies contaminadas ha sido

implicada en algunos brotes (Torner et al., 2016; Repp et al., 2012).


El principal síntoma es la diarrea, acompañada o no de fiebres, vómitos y dolores

abdominales, a diferencia de norovirus cuyos síntomas principales son vómito y fiebre

(Svraka et al., 2010).

El período de incubación es de 12 a 48 horas. 4 días después de la exposición ocurre

excreción viral y puede persistir durante 3 semanas (Torner et al., 2016).

1.4.4. Astrovirus

1.4.4.1 Historia

Identificado por primera vez en 1975, por Appleton y Higgins, las partículas virales,

mediante ME en muestras de materia fecal de niños con diarrea aguda (Bosch, et al., 2014)

Su nombre fue asignado por sus características morfológicas parecidas a una estrella, de 5

a 6 puntas en su extremo (Koci et al., 2003; Wilhelmi et al., 2003; Krishna et al., 2006). En

1993 fue agrupado taxonómicamente en la familia Astroviridae (Bellido et al., 2007).


AsV son virus ARN monocatenario de sentido positivo, no envueltos, con un diámetro

entre 28 a 30 nm. Se encuentran en una amplia variedad de especies animales, incluida la

humana. Pertenecen a la familia Astroviridae, que se divide en dos géneros, el primero los

mamastrovirus, que incluyen los astrovirus humanos y animales, el segundo los

avastrovirus en el que pertenecen astrovirus aviares (Bellido, 2007; Ulloa et al., 2010).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Krishna%20NK%5Bauth%5D

Marco Teórico

16

El genoma está compuesto por 6771 nucleótidos agrupado en 3 ORF, ORF1a, ORF1b y

ORF2. El ORF1a y ORF1b codifican proteínas no estructurales, una serin proteasa 3C en

el ORF1a y una ARN polimerasa dependiente ARN putativo en ORF1b.

El ORF2, codifica una proteína precursora de la cápside (Jeong et al., 2012; Wilhelmi et

al., 2003), que se escinde en dos clases de dominios. El primer dominio contenido en los

residuos de los nucleótidos 1 al 415, siendo altamente conservados entre la familia

Astroviridae. Por el contrario, el segundo dominio, presente en los residuos del nucleótido

416 al extremo, son muy divergentes entre todos los genotipos conocidos y se ha informado

de que anticuerpos monoclonales neutralizantes se asignan a este segundo dominio

(Krishna et al., 2006) (Figura 9).

Figura 9. Organización genómica de Astrovirus. A. con los 2 ORF y las proteínas que codifica. B.

Proteínas estructurales del ORF2. Modificado de Krishna et al., 2006.

Una poliproteína de 87 kDa, da lugar a las proteínas estructurales de la cápside VP34,

VP29, VP26, siendo esta última la responsable de la clasificación de astrovirus en los

diferentes genotipos (Wilhelmi et al., 2003).

Los Astrovirus humanos (HAstV) han sido clasificados en 8 tipos antigénicos denominados

HAstV 1 a HAstV 8, de los cuales el tipo predominante reportado es el HAstV 1 (Gutierrez

et al., 2005). Adicionalmente, se han reportado 7 AsV diferentes identificados en muestras

de materia fecal de personas, estos han sido reconocidos como MLB Like divididos en

MLB1, MLB2, MLB3 y VA like clasificados en VA1/HMO-C, VA2/HMO-B, VA3/HMO-

A, HMO (del inglés human, mink and ovine-like), estas cepas son distintas genéticamente

a las cepas clásicas de astrovirus, de hecho están estrechamente relacionadas con las

encontradas en los visones que son mamíferos carnívoros que se asemejan a la manta y a

las otras cepas de astrovirus de las ovejas (Kapoor et al., 2009; Meyer et al., 2015;

Finkbeiner et al., 2009; Jiang et al., 2013).


Los receptores celulares y las células diana para el reconocimiento viral son desconocidos,

aunque el sitio principal de la replicación parece ser el tracto gastrointestinal, se ha

encontrado virus presente en enfermedades diseminadas y encefalitis (Cordey et al., 2016).

Después de la entrada de AsV a las células del huésped, el ARN genómico no está

recubierto, por lo tanto se puede traducir en un precursor de poliproteína que es escindido

en las proteínas necesarias para la replicación del genoma del virus y ensamblaje de la

Marco Teórico

17

progenie viral. Este proceso se lleva a cabo en las membranas celulares. La finalización del

ciclo de vida del virus requiere la acción de las caspasas de las partículas de virus para salir

de la célula (Figura 10).

Figura 10. Ciclo de replicación viral de astrovirus. Modificado Méndez et al., 2001.


En países en vías de desarrollo y climas sin estaciones definidas como el nuestro, existen

pocos reportes epidemiológicos (Ramírez et al., 2014). Este virus afecta principalmente a

niños menores de cinco años de edad, pero se ha encontrado relación con EDA en adultos,

ancianos y pacientes inmunocomprometidos (Ramirez et al., 2014; Jeong et al., 2012).

Se considera que el 10 % de los casos esporádicos de gastroenteritis no bacteriana, son

causadas por astrovirus (Holtz et al., 2011). Se encuentra entre 13 al 65 % de las

coinfecciones con otros agentes virales como rotavirus y calicivirus (Jeong et al., 2012;

Pang et al., 1999).

En regiones de Colombia, AsV ha sido determinado, mediante ELISA, con una prevalencia

global de 2,8% (Gutierrez et al., 2005). Adicionalmente, se han identificado en 4,1% de

171 muestras de materia fecal de niños menores de cinco años, mediante técnicas tanto

moleculares como inmunológicas (Ulloa et al., 2010), lo cual evidencia la circulación de

AsV en nuestro país.


Los virus se transmiten principalmente por la vía fecal/oral, entre personas o agua y

alimentos contaminados (Ha et al., 2016; Monroe et al., 1993).

Marco Teórico

18

1.4.4.6. Aspectos clínicos y complicaciones

La infección produce diarrea, sin cambios en la morfología intestinal (Behling et al., 2002;

Koci et al., 2003). La diarrea se caracteriza por ser de corta duración, de aproximadamente

3 días con un rango de 1 a 21 días. Durante las primeras 24 horas se presentan entre 1 a 10

deposiciones con una media de 4. Esta enfermedad es considerada de menor gravedad

comparada con la causada por otros agentes virales, solo entre 0 al 3% tienen progreso a

deshidratación (Jeong et al., 2012; Ramírez et al., 2014; Wilhelmi et al., 2003).

Los síntomas como el vómito, dolor de cabeza, dolor abdominal y la fiebre son menos

frecuentes que en otras infecciones (Hu et al., 2016). El virus es eliminado en heces durante

más de dos semanas, pero se puede prolongar dependiendo del compromiso inmunológico

de los pacientes (Ramírez et al., 2014).

1.4.5Adenovirus entéricos

1.4.5.1 Historia

Los adenovirus fueron aislaron por primera vez en 1953 en un cultivo de células adenoides

humanas (Hoeben et al., 2013). En 1960 y 1970, se logró realizar el cultivo celular, con el

fin de conocer la forma de replicación (Hoeben et al., 2013).


Los AdV pertenecen a la familia Adenoviridae, son virus ADN de doble cadena,

icosahédricos que presenta una cápside compuesta por 7 proteínas, hexón (II), base de

pentón (III), fibra (IV), IIIa, VI, VIII y IX, clasificados en 52 genotipos y agrupados en 7

especies desde A a la G (Crosby et al., 2014; Feeney et al., 2011; Logan et al., 2006). Las

principales proteínas de la cápside que constituyen la mayoría de la superficie del virión

son el hexon, la base de pentón y fibra, presentes en 720, 60 y 36 copias por virión (Crosby

et al., 2014).

Entre los genotipos más frecuentemente asociados con la producción de gastroenteritis son

el 40 y 41, que pertenecen al subgénero F. Adicionalmente, otros genotipos de los

subgéneros A (31, 12, 18) y C (1, 2, 5, 6) también han sido implicados en la etiología de la

diarrea aguda (Figura 11).

Figura 11. Organización genómica de adenovirus. Modificado de Crosby et al., 2014.

Marco Teórico

19

El hexón juega un papel estructural como una proteína de revestimiento, mientras que la

base del pentón y la fibra son responsables de las interacciones célula, virión que

constituyen el tropismo del virus (Glasgow at la. 2006).


La replicación de AdV es un proceso muy eficiente. En 40 horas, una célula infectada tiene

la capacidad de producir aproximadamente un millón de copias de ADN viral (Hoeben et

al., 2013).

La entrada del virus en células implica dos pasos distintos, uno la unión a una molécula de

receptor primario en la superficie celular, seguido por la interacción con moléculas

responsables de la internalización del virión y dos la unión directa del dominio de la fibra

a su receptor celular primario, llamado (CAR) para la mayoría de los genotipos, incluyendo

Ad2 y Ad5.

Después de la unión al receptor, se efectúa la endocitosis mediada por el receptor del virión

de la base pentónica, aminoácidos Arginina-Glicina-Asparagina (RGD), motivos con las

integrinas celulares, incluyendo αvβ3, αvβ5, αvβ1, α3b1 y alfa5β1. Los virus entran a la

célula en vesículas revestidas de clatrina, la cual es transportada a los endosomas. En este

paso ocurre la acidificación que conlleva a la liberación del virus y permite la permanencia

en el citosol, para finalmente pasar, al núcleo donde la replicación viral se lleva a cabo

(Glasgow et al., 2006) (Figura 12).

Figura 12. Unión del virión de adenovirus con su receptor en la célula, para la entrada celular. Modificado

de Glasgow et al., 2006.


La especie A, genotipos 12, 18, 31 y F genotipos 40 y 41, se han relacionado con las

infecciones gastrointestinales en niños menores de 2 años (Feeney et al., 2011; Logan et

al., 2006; Yan et al., 2003).

Se consideran entre 1,4 a 10% de las gastroenteritis a nivel mundial (Al thani et al., 2013),

Casi el 50% de los niños menores de cinco años han sido seropositivos para anticuerpos de

adenovirus tipo 40 (Ad40) y adenovirus tipo 41 (Ad41) en Asia, Europa y América del Sur

(Khoshdel et al., 2015).

Marco Teórico

20


La principal vía de infección es vía fecal/oral. Esta infección se produce durante todo el

año y afecta principalmente a los niños menores de cuatro años (Khoshdel et al., 2015)


Los AdV son una de las causas principales de síndromes clínicos, incluyendo

gastroenteritis, enfermedad respiratoria, conjuntivitis, cistitis hemorrágica y exantema

(Sanaei et al., 2016).

Los adenovirus entéricos asociados con diarrea prolongada pueden contribuir a la

deshidratación y a la desnutrición infantil en los países en desarrollo (Chow et al., 2010).

Por lo general, después de un período de incubación de 8 a 10 días, se produce la diarrea

acompañada con fiebre, vómitos, dolores abdominales y deshidratación (Sanaei et al.,

2016; Chow et al., 2010).

1.5 Diagnóstico de agentes virales diarreagénicos.

1.5.1 Técnicas directas: microscopía electrónica,

Detección de antígenos por inmunoensayos y

aglutinación.

Una variedad de técnicas directas basadas en inmunoensayo enzimático (EIA) (Caul, 1996

a,b), aglutinación con partículas de látex (LA) (Lee et al., 2011), inmunocromatografía (IC)

y recientemente, inmunoensayo quimioluminiscente (CLIA) (Sidoti et al., 2015), han sido

utilizadas comúnmente por los laboratorios de entidades prestadoras de salud para el

diagnóstico común de virus entéricos causantes de EDA, dado que son fáciles de usar, son

altamente específicas y no se requiere una infraestructura especial de los laboratorios. No

obstante el límite de detección de estas técnicas es de 104 a 105 partículas virales por gramo

de materia fecal (Bellido et al., 2007) y comparadas con las técnicas moleculares carecen

de sensibilidad, debido a la gran diversidad de las cepas que presentan los virus (Pang et

al., 2005; Logan et al., 2006; Kim et al., 2012).

1.5.2 Detección del genoma viral

Desde 1972, cuando norovirus fue identificado mediante ME como el primer agente causal

de gastroenteritis (Kapikian et al., 1972), una variedad de técnicas para detectar agentes

virales en muestras de heces se han implementado. Las pruebas moleculares, han sido

usadas por su alta sensibilidad debido a que necesitan menor cantidad de partículas para su

detección entre 101 a 10 3 (Bellido et al., 2007; Sidoti et al., 2015).

Marco Teórico

21

1.5.2.1. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), es una técnica para la amplificación directa

de un gen o fragmento de ADN e indirecta del ARN, partiendo del ADN complementario

(cADN), presentes en mezclas de muy diversas fuentes sin necesidad de una purificación

previa de la muestra (Luque et al., 2006).

Esta técnica genera múltiples copias de una secuencia específica de ADN, mediante una

desnaturalización, hibridación específica y finalmente una replicación usando la enzima

ADN polimerasa, con el propósito de ser analizados con fines diagnósticos, investigativos,

y epidemiológicos (Tamay de Dios et al., 2013).

La PCR presenta variantes usadas dependiendo de las características de cada virus, las

muestras, la calidad del genoma y la cantidad viral que la técnica requiera para su detección.

1.5.2.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa transcriptasa

inversa (RT-PCR)

Variante de la PCR cuyo fin es la amplificación de ARN (especialmente ARN mensajero

(RNAm)) a través de la síntesis previa de su cADN in vitro, que después es amplificado

por PCR convencional. Es decir, no se obtienen copias de ARN de partida sino de ADNc,

este paso le confiere mayor estabilidad al ARN (Cotazar et al., 2004).

En la actualidad, la RT-PCR múltiple, ha sido empleada en la detección de varios agentes

virales diarreagénicos. Una de las ventajas que presenta este método es que permite la

detección rápida, sensible y específica de más de un patógeno (Kojima et al., 2002,

Khamrin et al., 2011; Panchalingam et al., 2012; Dung et al., 2013; Rooney et al., 2014).

La principal desventaja que esta técnica presenta es la disminución de su sensibilidad por

la presencia de algunos inhibidores en la materia fecal como las bilirrubinas, polisacáridos

complejos, sales biliares (Trujillo et al., 2006; Fuentes et al., 2009).

Diversos estudios han implementado esta técnica con diferentes fines informativos para la

investigación clínica, en particular en el contexto de infecciones mixtas. En un estudio

realizado en Tanzania, para la detección y cuantificación de agentes virales esta técnica

mostró entre el 88% al 100% de sensibilidad y especificidad respectivamente (Liu et al.,

2011).

Otros desarrollados en los países con altas tasas de mortalidad, Sudáfrica y Asia, han

implementado RT-PCR múltiple para la detección de NoV (GI yGII), AsV, y SaV

(Panchalingam et al., 2012). Al igual que en Estados Unidos durante los años 1999 al 2004,

en muestras de materia fecal de casos esporádicos de gastroenteritis en niños, la PCR en

tiempo real transcriptasa inversa (TaqMan) permitió la rápida detección y tipificación de

cepas pertenecientes a NoV (GI, GII), mediante el uso de sondas TaqMan específicas para

cada secuencia a identificar (Trujillo et al., 2006).

Marco Teórico

22

Khamrin y cols en Japón implementaron una técnica PCR multiplex transcriptasa inversa

para la identificación de 10 agentes virales diarreagénicos. En este la positividad para

agentes virales fue de 47,2 % a partir de 235 muestras de heces (Khamrin et al., 2011).

1.5.2.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa transcriptasa

reversa en tiempo real (RT-qPCR)

Es el método más sensible para detectar y cuantificar los ácidos nucleicos mediante el uso

de fluorescencia. La emisión de fluorescencia es proporcional a la cantidad de templete en

la muestra. Aún teniendo una cantidad muy pequeña de templete, el sistema garantiza una

alta sensibilidad, especificidad y eficiencia (De Dios et al., 2013). Para el diagnóstico de

agentes virales diarreagénicos en investigación se han usado tanto reacciones simples como

múltiples.

Múltiples investigaciones han implementado estas técnicas para la identificación de

agentes virales diarreagénicos. Feeney y cols en el 2011, describieron dos PCR múltiples,

para el procesamiento de 137 muestras durante un período de 3 años, desde marzo de 2007

a febrero de 2010. Mediante el empleo de una combinación de sondas TaqManTM,

encontraron sensibilidad de 97,3%, 100%, 95,1% y especificidad de 99%, 100%, 97,9%,

en la identificación de AdV, RoV y NoV, respectivamente.

Otro estudio realizado en Estados Unidos en muestras de heces de niños con o sin EDA,

emparejados por edad, recogidos entre octubre de 2008 y septiembre de 2009 fueron

evaluados para la identificación de AdV, AsV, SaV, parechovirus, bocavirus y aichivirus,

mediante técnicas inmunológicas y moleculares (qPCR). Identificándose los virus en

11,8%, 4,9%, 5,4%, 4,8%, 1,4% y 0,2% de los pacientes con EDA y 1,8%, 3,0%, 4,2%,

4,4%, 2,4%, y 0% de los controles sanos, respectivamente (Chhabra et al., 2013).

La detección y tipificación de virus mediante RT-qPCR con sondas TaqMan, ha permitido

la identificación de genogrupos GI, GII de NoV a partir de muestras clínicas y de agua. En

este trabajo estas muestras fueron previamente positivas por RT-PCR convencional. Esto

ayuda en la orientación hacia el uso de RT-qPCR con el uso de sondas TaqMan, puesto

que disminuye el tiempo de post procesamiento de PCR, dado que no se requiere el uso de

geles para la visualización del producto amplificado (Trujillo et al., 2006).

Estos ensayos han demostrado ser útiles en la investigación, salud pública y el diagnóstico

de los laboratorios que necesitan reportar resultados rápidamente a los equipos de gestión

de brotes (Trujillo et al., 2006).

1.5.2.5 Otras técnicas

Nuevas técnicas menos estudiadas pero implementadas como el microarray (Kim et al.,

2012), amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP) y amplificación basada en

secuencias de ácido nucleico (NASBA), han permitido la detección de AsV, NoV, RoV y

AdV disminuyendo el tiempo en el diagnóstico dado que son técnicas que no requieren

infraestructuras estrictas para su implementación. Estas han demostrado mayor sensibilidad

comparada con la RT-PCR (Tai et al., 2002).

Marco Teórico

23

Dentro de las técnicas moleculares en la actualidad se cuenta con un sistema integrado de

un panel Filmarray gastrointestinal, el cual su principal ventaja es la detección de 23

patógenos diarreagenicos, entre ellos, 14 bacterias (Campylobacter (jejuni, coli,

upsaliensis), Clostridium difficile (Toxin A/B), Plesiomonas shigelloides, Salmonella,

Yersinia enterocolitica, Vibrio (parahaemolyticus, vulnificus, cholerae), Vibrio cholerae,

E. coli diarreagénica, Shigella, E. coli O157, E. coli enteroagregativa (EAEC), E. coli

Enteropatógena (EPEC), E. coli enterotoxigénica (ETEC) lt/st, E. coli shigatoxigénica

(STEC) stx1/stx, E. coli O157, E. coli Shigella/Enteroinvasiva (EIEC)); cinco virus

(norovirus GI/GII, rotavirus A, adenovirus F 40/41, astrovirus, sapovirus I, II, IV,V) y

cuatro parásitos (Cryptosporidium, Cyclospora cayetanensis, Entamoeba histolytica,

Giardia lamblia), todos identificados en una sola reacción, de una forma rápida, ya que

solo tarda una hora, sencilla por solo necesitar 2 minutos de manipulación, y fácil por no

requerir de pipeteo o alguna medición precisa de la muestra. Esta técnica integra pasos que

son realizados de forma manual como la extracción y purificación de ácidos nucleicos

directamente de la muestra, la PCR y la detección de las regiones génicas amplificadas. De

esta forma se ofrece un panorama de diagnóstico más rápido y eficaz en las infecciones

gastrointestinales (Farfán et al., 2016; http://www.biomerieux-diagnostics.com/filmarrayr-

gi-panel).

Objetivos

24

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GENERAL

Identificar norovirus (NoV GI, NoV GII), rotavirus, astrovirus, adenovirus y

sapovirus en niños menores de cinco años con enfermedad diarreica aguda

(EDA) y sin EDA de Bucaramanga y su área metropolitana mediante técnicas

moleculares.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar la frecuencia de norovirus (GI, GII), rotavirus, astrovirus,

adenovirus y sapovirus entre los niños menores 5 años de edad con o sin EDA

en Bucaramanga y su área metropolitana (Colombia).

Determinar la frecuencia de genogrupos y genotipos de Norovirus en niños

con o sin EDA en Bucaramanga y su área metropolitana (Colombia).

Identificar los genotipos de rotavirus predominantes en niños con o sin EDA

en Bucaramanga y su área metropolitana (Colombia).

Describir los factores de riesgo y las características clínicas en niños con EDA

de etiología viral en Bucaramanga y su área metropolitana (Colombia).

Materiales y métodos

25

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Tipo de estudio

Estudio analítico, anidado en un estudio de casos y controles que hace parte del proyecto

multicéntrico “Studies on emergent diarrheagenic E. coli pathogens con grant No.

1R01AI095346 aprobado por National Institute of Allergy and Infectious Diseases”.

National Institutes of Health (NIH) de los Estados Unidos cuyo investigador principal de

la Universidad de Vanderbilt es el Dr. Oscar Gómez Duarte y por el programa de

Bacteriología y Laboratorio Clínico de la Universidad de Santander (UDES) la Dra. Ana

Elvira Farfán García. Alícuotas de las muestras de materia fecal incluidas en el estudio

multicéntrico fueron analizadas para la detección de virus en este trabajo.

3.2 Área geográfica

Bucaramanga y su área metropolitana. Instituciones de salud (Centro de salud el Rosario,

Hospital Local del Norte, Unidad Materno Infantil Santa Teresita, UIMIST, del ISABU,

la Clínica Materno Infantil San Luis, el Hospital San Juan de Dios de Floridablanca y la

Fundación Oftalmológica de Santander, FOSCAL).

3.3 Universo

Niños menores de cinco años de Bucaramanga y su área metropolitana.

3.4 Población

Niños menores de cinco años que asistieron a las 6 instituciones durante el período de

julio 2013 a diciembre 2014.

3.5 Muestra

El tamaño muestral calculado para el estudio multicéntrico fue de 300 casos y 300

controles con una potencia para detectar un odd ratio de 5.2 o mayor, si la prevalencia era

de 0,05 y 0,01 entre los grupos de casos y controles, respectivamente (con un error de tipo

I > 0.5). Sin embargo, se logró la inclusión de 405 casos y 405 controles pareados por

edad 1:1.

3.6 Material biológico

Las muestras de materia fecal procedentes del estudio multicéntrico fueron recogidas en

frascos plásticos desechables, marcados y transportados al Laboratorio de Investigaciones

Biomédicas y Biotecnológicas (LIBB) de la Universidad de Santander (UDES), dentro de

las dos horas siguientes a su recolección e inmediatamente procesadas para estudios


26

bacteriológicos y parasitológicos. Una alícuota de cada muestra fue guardada a -80°C

hasta su posterior procesamiento en la detección de virus diarreagénicos para este trabajo.

La detección viral NoV GI, NoV GII, SaV, AsV y AdV se realizó mediante RT-qPCR.

Rotavirus fue identificado mediante ELISA y PCR convencional. A continuación se

describen cada uno de los procedimientos.

3.7 Procedimientos

3.7.1 Extracción de ARN viral Para la extracción del material genético se usó el kit QIAamp Viral RNA (QIAgen,

Valencia, USA) de acuerdo al protocolo del fabricante. Para ésto, se realizó una

suspensión de materia fecal al 10% en agua ultra pura DEPC (Dietilpirocarbonato) (Life

Technologies, Carlsbad, USA), se mezcló en vortex, luego fue centrifugada dos veces a

máxima velocidad durante 5 min a 4 °C y finalmente, el ARN viral fue extraído a partir

del sobrenadante (Anexo 1).

3.7.2 Extracción de ADN viral

Para la extracción del ADN se usó el Kit QIAamp ADN Stool Mini Kit (QIAgen,

Valencia, USA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Brevemente, se realizó una

suspensión al 10 % de materia fecal en agua grado molecular (Científica Senna, México),

se mezcló en vortex, seguido se centrifugó dos veces a máxima velocidad durante 5 min

a 25 °C y finalmente, el ADN viral se extrajo a partir del sobrenadante. El ADN fue

mantenido a -20°C en alícuotas hasta su procesamiento (Anexo 2).


27

3.7.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa Transcripción

Reversa en Tiempo Real (RT-qPCR) múltiple

El ARN extraído de las muestras clínicas fueron amplificados y cuantificados mediante el

ensayo RT-qPCR con el kit One-Step RT- PCR (TaqMan® Life Technologies, Carlsbad,

USA). Este kit permite la transformación del ARN a cADN para su posterior uso en la

amplificación por medio de qPCR. Este mismo protocolo fue empleado en la

identificación del ADN de adenovirus usando qPCR. De acuerdo a las instrucciones del

fabricante, brevemente, en un tubo eppendorff de 1,5 ml se mezclaron los reactivos y los

primers como se observa en la tabla 2.

Tabla 2. Reactivos para la PCR múltiple por RT-qPCR para detección de sapovirus/astrovirus, norovirus

GI/GII y qPCR para adenovirus.

22 µl del mix fueron adicionados en cada pocillo de la placa, más 3 µl de cada una de las

muestras, una vez preparada la mezcla, la placa se centrifugó y se llevó al termociclador

CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, California,

USA). Utilizando las condiciones de amplificación que se describen en la Tabla 3.

Sapovirus/Astrovirus Norovirus GI/GII Adenovirus

Componente Volumen (µl) Componente Volumen (µl) Componente Volumen (µl)

2X RT-PCR buffer 12.5 2X RT-PCR buffer 12.5

2X RT-PCR buffer 12,5 Agua libre de

nucleasas grado

biología molecular.

2.5 Agua libre de nucleasas grado

biología molecular. 1.08

AsFF (10 μM) 0.6 Potenciador de Detección 1.67 Agua libre de nucleasas

grado biología molecular. 4,33

AsFR (10 μM) 0.6 Cog 1F (10 μM) 1

AstZFB (10 μM) 0.25 Cog 1R (10 μM) 1 Potenciador de Detección 1,67

SaV 124F (10 μM) 1.0 Ring 1E (10 μM) 0.5

SaV 1F (10 μM) 1.0 Cog 2F (10 μM) 1

JTVFF(10 μM) 1

SaV 5F (10 μM) 1.0 Cog 2R(10 μM) 1

SaV 1245R (10 μM) 1.0 Ring 2 (10 μM) 0.5

JTVFR (10 μM) 1

SaV124TP (10 μM) 0.25 MS2.F (10 μM) 0.25

SaV 5TP (10 μM) 0.25 MS2.R (10 μM) 0.25 JTVFAP (10 μM) 0,5

25 X Enzima RT-PCR 1 MS2.P 0.25

25 X Enzima RT-PCR 1 25 X Enzima RT-PCR 1

RNA 3 μl


28

Tabla 3. Primers y condiciones amplificación de la PCR múltiple por RT-qPCR para la detección del ARN

y ADN viral (Protocolo del CDC Atlanta, Chhabra Preeti (2013).

N/A: No aplica. MS2 bacteriófago. Control de extracción de RNA.

En cada prueba se procesaron controles negativos y agua grado biología molecular libre

de ADNsas, proteasas y ARNsas (sin emisión de fluorescencia). Cada ensayo se validó

por la fluorescencia emitida de los ADN de plásmidos usados como controles positivos

(controles de CDC, clonados en el vector pGEM)) de cada uno de los virus a identificar.

MS2 fue usado como control interno de extracción de ARN para NoV. MS2 es un

bacteriófago usado para controlar cada paso de amplificación de ácido nucleico con el fin

de evitar resultados falsos negativos debido a la inhibición de la reacción (Dreier et al.,

2005).

Los datos de la amplificación fueron analizados en el software Bio-Rad CFX manager

versión 3.1. Si se detecta la presencia de ADN, la información es reflejada gráficamente

en curvas cinéticas de la reacción para cada una de las muestras y los controles (Anexo 3).

Virus Región

objetivo Primer Secuencia

Concentrac

ión primers

nM

Condiciones

Referencia Ciclos Desnaturalización

Alineamiento /

Extensión

Norovirus

GI

ARN

Unión ORF1-

ORF2 (GI)

Cog 1F CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA 400

45 95 °C, 15 segundos

60 °C, 1 minuto

Trujillo et al., 2006 Cog 1R CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C 400

Ring 1E probe [6-FAM]-AGATYGCGRTCYCCTGTCCA-[Tamra]

[6-FAM]-AGATYGCGRTCYCCTGTCCA-[BHQ1] 200 Hill et al., 2010

Norovirus

GII

ARN

Unión ORF1

ORF2 (GII)

Cog 2F CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG 400

Trujillo et al., 2006 Cog 2R TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA 400

Ring 2 probe QUA – TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT – BHQ2 200

N/A Región.

289 –387

MS2.F TGG CAC TAC CCC TCT CCG TAT TCA CG 100

Feeney et al., 2011

MS2.R GTA CGG GCG ACC CCA CGA TGA C 100

MS2.P probe HEX - CAC ATC GAT AGA TCA AGG TGC CTA

CAA GC – BHQ1

100

Astrovirus ARN

ORF1b

AsFF GGC CAG ACT CAC AGA AGA GCA 400

40 95 °C, 15 segundos 60 °C, 1 minuto

Grant et al., 2012 AsFR GTC CTG TGA CAC CTT GTT TCC TGA 400

AstZFB HEX - CCA TCG CAT TTG GAG GGG AGG ACC

AGC GA 200

Sapovirus ARN

ORF1

SaV 124F GAY CAS GCT CTC GCY ACC TAC 400

Oka et al., 2006

SaV 1F TTG GCC CTC GCC ACC TAC 400

SaV 5F TTT GAA CAA GCT GTG GCA TGC TAC 400

SaV 1245R CCC TCC ATY TCA AAC ACT A 400

SaV124TP FAM-CCR CCT ATR AAC CA 200

SaV 5TP FAM-TGC CAC CAA TGT ACC A 200

Adenovirus ADN

Hexon

JTVFF AAC TTT CTC TCT TAA TAG ACG CC 400

40 95 °C, 15 segundos 60 °C, 1 minuto Jothikumar et al.,

2005 JTVFR AGG GGG CTA GAA AAC AAA A 400

JTVFAP FAM-CGA AGA GTG CCC GTG TCA GC-BHQ1 200


29

Para cada muestra el programa informático calcula el número de ciclos en el que el lector

empieza a detectar un incremento de fluorescencia significativo, con respecto a la señal

de base. El ciclo en el que se empieza a detectar el aumento de fluorescencia se denomina

punto de corte (Cp, del inglés crossing point) o ciclo umbral (Ct, del inglés threshold

cycle) y es inversamente proporcional a la concentración inicial de ADN blanco presente

en la muestra. Con las concentraciones previamente conocidas de los controles externos y

sus Cp correspondientes se dibuja una curva patrón, interpolando en ella los valores de los

Cp de cada muestra problema (Costa., 2004).

3.7.4 Interpretación de resultados de RT-qPCR

Los resultados son interpretados de acuerdo a los valores de Ct del ciclo en el cual la

producción de fluorescencia pasa el umbral establecido. Es decir los resultados de Ct

menores a 40 ciclos se consideraron positivos. Resultados de Ct iguales o mayores a 40

ciclos se consideraron negativos.

3.7.5 Secuenciación de cADN de Norovirus

Para realizar este procedimiento, se seleccionaron las muestras de material fecal que

fueron positivas por RT-qPCR para norovirus. La secuenciación se realizó con el fin de

determinar cuáles eran los genotipos de NoV, circulantes en niños de Bucaramanga y su

área metropolitana. Los protocolos se realizaron según Kojima et al., 2002 y Vinje et al.,

2004. En el siguiente orden se prepararon los cADN para secuenciación.

El ARN de NoV GI y GII extraído a partir de una suspensión de material fecal al 10% se

utilizó para la realización de la Transcripción Reversa (RT) usando el kit AB High

Capacity cADN Reverse Transcription (Life Technologies, Carlsbad, USA).

Posteriormente, el producto de la PCR fue purificado con el kit QIAquick PCR

purification Kit (QIAgen, Valencia, USA). Estos protocolos fueron realizados de acuerdo

a las instrucciones del fabricante.

Enseguida, se realizó una PCR convencional de la región C para la genotipificación de

NoV Este producto fue visualizado mediante electroforesis en geles de agarosa al 2 %. Se

consideró positivo la presencia de una banda de 329 pb para NoV GI y de 343 pb para

NoV GII.

Posteriormente, se realizó la purificación del material genómico con el kit QIAquick PCR

purification Kit (QIAgen, Valencia, USA). Para esto, se extrajeron del gel las bandas de

cada uno de los genotipos NoV GI y NoV GII.

Finalmente, los productos de la PCR se enviaron a la compañía GENEWIZ para la

secuenciación del ADN mediante el método de secuenciación enzimática sanger.


30

Una vez obtenidas las secuencias estas fueron analizadas, determinando la calidad del

producto secuenciado. Se analizó la calidad de la información de cada una de las bases

de las secuencias obtenidas en el cromatograma que emite el equipo de secuenciación,

considerándose un cromatograma de buena calidad cuando se observaban picos únicos,

bien separados entre sí y con poco ruido de fondo (presencia de líneas inespecíficas debajo

de las líneas que señalan las bases, indicativo de contaminación con otro ADN o

contaminación con otro cebador (normalmente el cebador reverso utilizado en la PCR).

Las secuencias obtenidas con ruido en el cromatograma fueron posteriormente clonadas y

enviadas nuevamente a secuenciación. A continuación se describen cada uno de los

protocolos previos a la secuenciación de forma detallada:

3.7.5.1 Protocolo de Transcripción Reversa (RT) del ARN de

Norovirus GI/GII

Este protocolo fue realizado para obtener cADN a partir de ARN. El master mix fue

realizado con el kit AB High Capacity cADN Reverse Transcription (Applied

Biosystems™, Foster, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Todos los reactivos

se mantuvieron en hielo. Brevemente, se pipetearon 10 µl de master mix en cada uno de

los 96 tubos de PCR de 0,2 mL (Tabla 4).

Tabla 4. Componentes de reacción de transcriptasa reversa Norovirus (NovGI, NovGII).

Componentes Volumen (µl) con

Inhibidor

10x RT buffer 2

25x dNTP MIX (100mM) 0,8

10x RT random primers 2

Reverse transcriptase - MultiScribe 1

Inhibidor Rnase 1

Agua libre de nucleasa 3,2

Total 10

Luego se adicionaron 10 µl de ARN a cada pozo y se procesaron en el termociclador

C1000 Touch Thermal Cycler con las condiciones descritas en la tabla 5 (Anexo 5).

Tabla 5. Condiciones del ciclado para la PCR transcriptasa reversa

Paso 1 Paso 2 Paso 3 Paso 4

Temperatura 25 °C 37 °C 85 °C 4 °C

Tiempo 10 min 120 min 5min ∞


31

3.7.5.2 Purificación del producto de PCR

Para este procedimiento se utilizó el cADN obtenido en el protocolo anterior (3.7.5.1).

Siguiendo las instrucciones del fabricante del Kit QIAquick PCR purification (QIAgen,

Valencia, USA), brevemente se adicionaron 5 volúmenes de buffer PB a 1 un volumen de

reacción de PCR. El mix anterior se transfirió a una columna (suministrada en el kit), la

cual se centrifugó durante 1 minuto y el volumen del tubo recolector se descartó. 750 µl

de buffer PE fueron adicionados. Posteriormente, se centrifugó durante 1 minuto,

nuevamente, el volumen del tubo recolector fue descartado y se realizó otra

centrifugación. La columna fue transferida a un tubo eppendorf de 1.5 ml nuevo.

Finalmente, se adicionaron 50 µl de buffer EB, eluyente de ADN y el producto fue

almacenado a - 20°C hasta su uso (Anexo 5).

3.7.5.3 Polymerase Chain Reaction (PCR) convencional de

la región C

Esta se realizó para la genotipificación de NoV. A partir del material genómico para NoV

GI/GII se realizó RT-PCR convencional, usando los primers que se muestran en la tabla

6, en una reacción final de 50 µl.

Tabla 6. Primers usados para la identificación de la región C del gen de la cápside viral, según protocolo

establecido por Kojima et al., 2002.

Genogrupo Primer Secuencia (5 ´- 3´) Tamaño del

producto en pb

GI G1SKF CTGCCCGAATTYGTAAATGA

329 G1SKR CCAACCCARCCATTRTACA

GII G2SKF CNTGGGAGGGCGATCGCAA

343 G2SKR CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT

El master Mix se realizó con Go Taq G2 Hot start Green master mix, PCR supermix

(Promega, Madison, WI, USA), como se describe en la tabla 7.

Tabla 7. PCR Master mix

Componente Volumen (μl)

Green mix 25

Primer forward 2

Primer reverse 2

Agua 18

cADN 3

Total 50

La PCR se realizó en un termociclador C1000 Touch Thermal Cycler con las condiciones

de ciclado de la tabla 8.


32

Tabla 8. Condiciones del ciclado PCR convencional

Ciclos Tiempo Temperatura

1 3 min 94 °C

40

30 seg 94 °C

30 seg 50°C

1 Seg 72 °C

1 7 min 72 °C

La migración del material genómico amplificado fue realizado en una electroforesis en

geles de agarosa al 2 % durante 25 minutos a 200 voltios y 300 amp y luego visualizados

con Sybr Safe (Invitrogen, Foster, CA) bajo luz UV (Anexo 6).

3.7.5.4 Análisis de secuenciación y construcción del árbol

filogenético Se analizaron los resultados de la cromatografía de las regiones estables de cada cepa,

enviados por la empresa de secuenciación (GENEWIZ). Para ésto, se determinaron los

picos de cada nucleótido. Se buscó la secuencia complementaria del primer reverse usando

la página web http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Se realizó

alineamiento de las secuencias obtenidas de los primer forward y reverse en el software

Bioedit V 7.2.5. Posteriormente, se crearon las secuencias unificadas y las secuencias que

contenían los primers fueron eliminadas. Las secuencias unificadas sin primer, se pegaron

en el software Bioedit V 7.2.5 para realizar su respectivo alineamiento con las secuencias

referencias listadas en la tabla 10. Posteriormente se utilizó el software Mega 6.06 para la

creación de los árboles filogenéticos.

3.7.5.5 Protocolo de clonación

La clonación fue realizada con el fin de mejorar la calidad de las secuencias obtenidas en

el cromatograma. En la figura 13 se observan los detalles del protocolo de clonación

(Figura 13).

http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html


33

Figura 13 Metodología de clonación. Modificado del protocolo pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vector

Systems.

Fuente: https://worldwide.promega.com/-/media/files/resources/protcards/pgem-t-and-pgem-t-easy-vector-

systems-quick-protocol.pdf

3.7.5.5.1 Purificación del producto de PCR.

Este protocolo se llevó a cabo con el Kit QIAquick PCR purification (QIAgen, Valencia,

USA), según las instrucciones del fabricante (Anexo 5).

3.7.5.5.2 Ligación en el vector p-GEM

Partiendo del producto de PCR purificado con el kit QIAquick PCR purification (QIAgen,

Valencia, USA), se realizó una ligación de cada una de las muestras en el vector p-GEM,

según condiciones del fabricante. Brevemente, los tubos eppendorf que contenían el vector

P-GEM-T, control del ADN y buffer de ligación fueron centrifugados y adicionados a un

tubo de PCR de 0,2 ml, según la tabla 9.

Tabla 9. Condiciones para la ligación de ADN en vectores PGEM

Reactivos Reacción

muestras µl

Control

positivo

µl

Control

negativo

µl

2X Buffer ligación rápida, T4 ADN

ligasa 5 5 5

Vector pGEM-T (50ng) 1 1 1

Producto de PCR 3 - -

ADN control inserto - 2 -

T4 ADN ligasa (3 Unidades/µl) 1 1 1

Volumen final de agua deshionizada 10 10 10

Las reacciones se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente.

Ligación.

Se incubó a temperatura

ambiente durante

1 hora o a 4 ° C durante la

noche.

Descongelación de células

competentes en hielo. Se

añadieron 50 µl de células a 2μl

de reacción de ligación. Se incubó

en hielo durante

20 minutos.

Choque de calor

45-50 segundos

exactamente a 42 ° C

Incubación en hielo 2 minutos

Se añadió medio SOC.

Se incubó a 37 ° C

con agitación.

Placa de Petri:

Se seleccionaron

colonias blancas

https://worldwide.promega.com/-/media/files/resources/protcards/pgem-t-and-pgem-t-easy-vector-systems-quick-protocol.pdf

https://worldwide.promega.com/-/media/files/resources/protcards/pgem-t-and-pgem-t-easy-vector-systems-quick-protocol.pdf


34

3.7.5.5.3 Transformación.

Una vez incubadas las reacciones se realizó la transformación. Brevemente, teniendo todo

los tubos eppendorf en hielo. A 5 µl de la reacción de ligación anterior, se le adicionaron

100 µl de células competentes. La reacción fue incubada durante 20 minutos, pasado este

tiempo se transfirieron a agua con una temperatura de 42°C durante 2 minutos, se pasaron

al hielo durante 5 minutos y se procedió a adicionar 950 µl de medio SOC (Invitrogen,

Carlsbad, USA). Este se usó en el paso final de la transformación de células bacterianas

para obtener máxima eficacia de la transformación de E.coli.

La reacción fue incubada durante 1 hora a 37 °C en agitación de 150 r.p.m. 100 µl de este

contenido se transfirieron a cajas de Petri que contenían medio Luria Bertani (LB) más

100 mg/ml de ampicilina. Estas placas fueron incubadas durante toda la noche a 30 °C.

Al día siguiente, se observaron las colonias de color blanco crecidas en las cajas de Petri.

Estas se pasaron a un nuevo medio LB y fueron incubadas toda la noche. Al siguiente día

se realizó extracción de material genético, adicionando una colonia a 20 µl de agua grado

molecular. Estos tubos se transfirieron al termociclador en una temperatura de 100 °C

durante 5 minutos, pasado este tiempo se centrifugaron durante 2 minutos y finalmente se

trasladaron a hielo durante 5 minutos para proceder con la PCR.

3.7.5.5.4 PCR para la visualización del inserto

Brevemente, en un tubo de PCR se adicionaron 12,5 µl de Green mix, 1 µl primer forward,

1 µl primer reverse, 9,5 µl de agua grado molecular y 1 µl de ADN con las condiciones

de la PCR convencional de la tabla 7.

La migración del material genómico amplificado fue realizado en una electroforesis en


con Sybr Safe (Invitrogen, Foster, CA) bajo luz UV (Anexo 6).

Una vez se observaron los productos, se procedió a cultivar las colonias originales que

contenían las muestras en caldo LB más ampicilina, toda la noche en agitación a 150 r.p.m

(Anexo 7).

3.7.6 Extracción del plásmido

Brevemente, con el kit QIAprep Spin Miniprep (QIAgen, Canadá, USA) de acuerdo a las

instrucciones del fabricante. El pellet de la bacteria E. coli crecida fue resuspendido en

250 µl de buffer P1.

Posteriormente, fue centrifugado durante 1 minuto a máxima revolución. Se adicionaron

250 µl de buffer P2 y se mezclaron por inversión de 4 a 6 veces. Luego, se le adicionaron

350 µl de buffer N3, nuevamente se mezclaron por inversión de 4 a 6 veces y finalmente


35

se centrifugaron por 10 minutos a 13.000 r.p.m. Este contenido fue transferido a una

columna suministrada por el kit.

Esta columna se centrifugó durante 30 a 60 segundos, el residuo se descartó, la columna

fue lavada con 500 µl buffer PB, se centrifugó durante 1 minuto, se lavó nuevamente con

750 µl buffer PE y nuevamente se centrifugó.

La columna se transfirió a un tubo eppendorf de 1,5 ml nuevo para eluir la muestra. Se

adicionaron 50 µl de buffer EB, se centrifugó durante 1 minuto a máxima revolución

(Anexo 8).

El ADN obtenido a una concentración 100 ng/µl fue enviado para secuenciación a

GENEWIZ con los primers del plásmido. Forward: 5´-

(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)-3´ y reverse: 5´-

(TCACACAGGAAACAGCTATGAC)-3´.

3.7.7. Árbol filogenético norovirus

Una vez tenidas las secuencias, se realizó el árbol filogenético usando el test Maximun,

Likelihood tree con el modelo de los dos parámetros de kimura (K2) y Gamma (G)

(MEGA 6.06). Este fue diseñado incluyendo las secuencias disponibles de grupos

genéticos conocidos según Vinje et al., 2015 en el Genbank (Tabla 10).

Tabla 10 Genes de la región C de la cápside de referencia de norovirus GI y GII.

Genotipo

Vp1

Genotipo

Región C Cepa de referencia

N° de acceso

GenBank

Localización

Aislamiento Referencia

GI

GI GI.1 GI/Hu/US/1968/GI.1/Norwalk M87661 Houston Jiang et al., 1993

GI.1 NGI/Hu/GI/US/290507-3/2007/SGP GQ925106 Singapore Aw et al., 2010

GI.1 NGI/Hu/NoV/22_2/2006/SE EU007717 Sweden - Europa Lysen et al., 2009

GI GI.2 GI/Hu/GB/1991/GI.2/Southampton L07418 Southampton -

Inglaterra

Lambden et al., 1993

GI.2 NGI/Hu/GI.2/NJ22/CHN/2014 KP753278 China Wang et al., 2015

GI.2 GI/Hu/HuzhouNS13170/2013/CHN KM462611 China Wu et al.,2015

GI.2 NGI/Hu/GI.2/131015/BE-3540 KM349493 Belgica Wollants et al., 2015

GI.2 NGI/Hu/GI.1/2005/6067/Bishkek/RUS FJ383887 Rusia -Bishkek Podkolzin et al., 2009

GI GI.3a GI/Hu/SA/1990/GI.3/DesertShield395 U04469 Bethesda,

Maryland

Lew et al., 1994

GI.3c Norovirus Hu/GI/Otofuke/1979/JP AB187514 Japón Wakuda et al.,.2005

GI GI.4 GI/Hu/JP/1987/GI.4/Chiba407 AB042808 Tokyo - Japón Someya et al., 2000

GI GI.5 NGI/Hu/GI/2003/3168/Moscow/RUS FJ383818 Moscow, Rusia Podkolzin et al.,2009

GI.5b GI/Hu/JP/1999/GI.5/SzUG1 AB039774

Musashi-

murayama,

Tokyo, Japan

Katayama et al.,2002

GI GI.6b GI/Hu/GB/1995/GI.6/Sindlesham AF093797 Berlin -Germany Schreier et al.,2000

GI GI.7b NGI/Hu/GI.7/Providence191/2010/USA JN899243 Atlanta - USA Barclay et al., 2012

GI GI.8 GI/MO14/aug.2010/BRA KR053451.1 Brasil, Belem Teixeira et al., 2010


36

GI GI.9 CAIQ12110628 nonstructural

polyprotein KF586507.1 China

Han et al., 2012

GII

GII GII.1 GII/Hu/US/1971/GII.1/Hawaii U07611 Bethesda Lew et al., 1994

GII GII.2 GII/Hu/GB/1994/GII.2/Melksham X81879 Southampton Green et al., 2005

GII GII.3a GII/Hu/CA/1991/GII.3/Toronto U02030 Bethesda Lew et al., 1994

GII.3b GII/Hu/AR/1999/GII.3/Arg320 AF190817 Virginia - USA Jiang et al., 1999

GII.3-GII.16 GII/Hu/PV_Voelk0018/2013/DEU KM289172 Germany Hoehne and Zeitlmann,

2014

GII GII.4. Bristol GII/Hu/GB/1993/GII.4/Bristol X76716 Southampton Green et al., 1994

GII GII.4 New

Orleans GII/Hu/US/2009/GII.4/NewOrleans GU445325 USA Vega et al., 2011

GII.4

NSW001P GII/Hu/AU/2008/GII.4/NSW001P GQ845367 Australia Eden et al., 2010

GII GII.4 Sydney GII/Hu/AU/2012/GII.4/Sydney JX459908 Australia Eden et al., 2013

GII.4 GII/Hu/GII.4 KP868597 USA Montazeri et al., 2015

GII GII.5 GII/Hu/GII.P22/GII.5/Kaohsiung/12-

AV-1/2012/TW KM036378 Taiwan Wu et al., 2015

GII GII.6b GII/Hu/US/1994/GII.6/Miami292 AF414410 Miami Ando et al., 2001

GII.6 GII/Hu/GII.4 KM267742 Taiwan Wu et al., 2015

GII GII.7 Hu/GII.7/NSW6038/2014/AU KT239630.1 Australia Lim et al., 2016

GII GII.8 Hu/GII.8/160/2008/USA KJ415787.1 USA Hu,Y., et al., 2015

GII GII.9 GII/Hu/US/1997/GII.9/VA97207 AY038599 Cincinnati - USA Jiang et al., 2002

GII GII.10 Hu/GII.10/NZ14608/2014/NZ KT151035.1 New Zealand Lim et al., 2015

GII GII.11 GII/Po/JP/1997/GII.11/Sw918 AB074893 Japon Sugieda, et al., 2002

GII GII.12 HU/BRA/2009/GII.12/Rio Grande KJ179760.1 Brasil Andrade et al., 2014

GII GII.13 GII/Hu/GII.13/10N4441/2010/NP AB810006 Nepal Hoa Tran et al., 2015

GII GII.14 GII/Hu/GII/Moscow/7844/2005/RUS FJ264893 Moscow, Rusia Podkolzin et al., 2008

GII.14 GII/Hu/GII.14 KR904230 South Afríca Mans et al., 2015


GII GII.16 GII/Hu/US/1999/GII.16/Tiffin AY502010 USA Zheng et al., 2006

GII GII.17 GII/Hu/US/2002/GII.17/CS-E1 AY502009 USA Zheng et al., 2006

GII GII.18 GII/Po/US/2003/GII.18/OH-QW101 AY823304 USA Wang et al., 2005

GII GII.19 GII/Po/US/2003/GII.19/OH-QW170 AY823306 USA Wang et al,., 2005

GII GII.20 Hu/GII.20/WA344G/2014/AU KT239644.1 Australia Lim et al., 2016


GII GII.22 GII/Hu/JP/2003/GII.22/Yuri AB083780 Japón: Akita Kuzuguchi ,et al., 2009

3.7.8 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) para la

identificación de Rotavirus

Se utilizó un ELISA directo para la detección de antígenos de rotavirus, de acuerdo a las

instrucciones del fabricante AccuDiag™ Rotavirus (Fecal) ELISA Kit (Diagnostic

Automation®, Calabasas, USA). En este ELISA en la primera incubación, los antígenos

de rotavirus presentes en las muestras de materia fecal son capturados por los anticuerpos

policlonales unidos en cada uno de los pozos de la placa. La segunda incubación añade un


37

anticuerpo tipo IgG anti-rotavirus. La tercera incubación contiene peroxidasa de rábano

para la reacción tipo sándwich. Después de realizar lavados para eliminar la enzima no

unida, se añade un cromógeno que desarrolla un color azul en presencia del complejo

enzima y peróxido de hidrógeno. La solución de parada termina la reacción generando un

color amarillo.

Brevemente, las muestras de materia fecal se descongelaron y se realizó una dilución 1:5

mediante la adición de 1 gramo de materia fecal a 4 ml de buffer de lavado diluido. Se

mezclaron bien y se separó el número de pozos necesarios (número de muestras más dos

pozos para los controles) para la reacción. Se añadieron 100 μl de control negativo para el

número 1 y 100 μl de control positivo para el número 2. Posteriormente, se adicionaron

100 μl de sobrenadante de las heces, se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos

y luego se realizaron 3 lavados de la placa con buffer de lavado. Luego, se añadieron 2

gotas de reactivo 1 que contiene anticuerpos policlonales anti-rotavirus con color azul y

timerosal, a cada pocillo, la placa fue incubada a temperatura ambiente durante 5 minutos

y luego se lavó nuevamente 3 veces. Después de esto, se añadieron 2 gotas de reactivo 2

que contenía suero anti-cabra conjugada con peroxidasa de color rojo y timerosal a cada

pocillo y la placa fue incubada a temperatura ambiente durante 5 minutos. Posterior a esto,

se lavó 3 veces y se adicionaron 2 gotas de cromógeno que contenía tetrametilbenzidina

(TMB) y peroxidasa a cada pocillo. Esto se incubó a temperatura ambiente durante 5

minutos. La reacción se detuvo con 2 gotas de solución ácido fosfórico a cada pocillo.

Finalmente, se realizó la lectura de los resultados en un espectrofotómetro mediante una

lectura bicromática a 450nm y 620-650 nm.

La interpretación de los resultados se realizó considerando una muestra reactiva, a aquella

que evidenciara color amarillo y en el espectrofotómetro la lectura mostrara niveles

superiores a 0.15. Controles positivos y negativos fueron utilizados (Anexo 9).

3.7.8.1 PCR para la identificación y posterior secuenciación de

rotavirus

A las muestras de materia fecal positivas en la prueba de ELISA para rotavirus, se les

realizó extracción de ARN viral (3.7.1), transformación de ARN en cADN (3.7.5.1) y

purificación del producto (3.7.5.2) de acuerdo a los protocolos previamente descritos.

Posterior a esto, se realizó una PCR convencional para los genes VP4 y VP7 (Aly et al.,

2015), usando los primers que se muestran en la tabla 11 en una reacción final de 50 µl.

Tabla 11. Oligonucleótidos primers para la identificación de los genes VP4 y VP7, según protocolo

establecido por Aly et al., 2015.

Gen Primer Secuencia (5 ´- 3´) Tamaño del

producto en pb

VP4 Forward TAT GCT CCA GTN AAT TGG

628 Reverse ATT GCA TTT CTT TCC ATA ATG

VP7 Forward ATG TAT GGT ATT GAA TAT ACC AC

844 Reverse AAC TTG CCA CCA TTT TTT CC


38

El master mix se realizó con Go Taq G2 Hot start Green master mix, PCR supermix

(Promega, Madison, WI, USA), como se describió en la tabla 7.

La PCR fue realizada en un termociclador C1000 Touch Thermal Cycler con las siguientes

condiciones de ciclado para los genes VP4 y VP7 (tablas 12 y 13).

Tabla 12. Condiciones del ciclado VP4

Ciclos Tiempo Temperatura °C

1 10 min 95

35

1 min 94

1 min 50

1 min 72

1 10 min 72

Tabla 13. Condiciones del ciclado VP7


1 10 min 95

40

1 min 94

3 min Gradiente 45 a 65

1 min 72

1 10 min 72

La migración del material genómico amplificado fue realizado en una electroforesis de


con Sybr Safe (Invitrogen, Foster, CA) bajo luz UV (Anexo 6). Las muestras positivas en

la PCR se purificaron y fueron enviadas para secuenciación siguiendo el mismo protocolo

descrito para norovirus (Anexo 10).

Posteriormente, se realizó el árbol filogenético usando el test Maximun, Likelihood tree

con el modelo de Tamura de los 3 parámetros (T92) y Gamma (G) (MEGA 6.06). Este

fue diseñado incluyendo las secuencias disponibles en el Genbank (Tabla 14).

Tabla 14. Genes VP4 / VP7 referencia de rotavirus.

Genotipo

Proteína VP4 Cepa de Referencia

N° de acceso

GenBank

Localización

Aislamiento Referencia

P8 RVA/Human/SA/Taif-3/2013/G1P[8] KP281281.1 Saudi Arabia:

Al-Taif Abdel-Moneim et al., 2015

P8 Human-wt/BRA/AC314/2012/G12P[8] KT025876.1 Brasil Neves et al., 2016

P8 RVA/Human-wt/USA/VU12-13-

149/2013/G12P[8] KT919043.1

USA: Davidson

County, TN Das et al., 2015

P8 Hu-wt/ITA/PA144/12/2012/G12P8 KU048596.1 Italia De Grazia et al., 2016

P8 RVA/Human

wt/BEL/BE1001a/2008/G9P[8] JN849127.1 Belgica Zeller et al., 2012

P8 RVA/Human wt/BG/2013/G9P[8] KC484721.1 Bangladesh:

Matlab Afrad et al., 2013

P8 RVA/Human-

wt/USA2008747369/2008/G3P[8] HM773659.1 USA Spiro et al., 2014


39

P8 RVA/Human-

wt/ITA/PR1015/2013/G3P[8] KT988296.1 Italia Medici et al., 2015

P8 RVA/Human-

wt/ITA/TO01/2012/G4P[8] KF202511.1 Italia Ianiro. et al., 2014

P8 Hu/CU-B1775/KK/2013/G2P[4] KT007888.1 Thailandia Chieochansin et al., 2015

P4 Hu/CU-B1912/KK/2014/G1P[8] KT007949.1 Thailandia Chieochansin et al., 2015

Genotipo

Proteína VP4 Cepa de referecnia

N° de acceso

GenBank

Localización

Aislamiento Autores / año

G9 Human/KOR/Seoul1354/2010/G9P[4] KF812606.1 Korea del sur Han et al., 2014

G9 RVA/Human-wt/SVN/SI-

1975/12/2012/G9P[8] KJ432723.1 Slovenia Steyer et al., 2015

G9 RVA/Human-

wt/Italy/PG08/2012/G9P[8] KM205791.1 Italia Delogu et al., 2015

G12 RVA/Human-

wt/PRY/1471SR/2006/G12P[9] KJ412580.1

Paraguay:

Asuncion Kirkness et al., 2015

G12 Hu-wt/ITA/PA144/12/2012/G12P8 KU048640.1 Italia De Grazia et al., 2016

G12 Hu-wt/ITA/RG179/13/2013/G12P8 KU048654.1 Italia De Grazia et al., 2016

G2 RVA/Human-

wt/BRA/RS18922/2010/G2P[4] KJ638639.1 Brasil Gomez et al., 2014

3.8 ASPECTOS ÉTICOS

Esta investigación se considera sin riesgo, de acuerdo con el artículo 11 de la resolución

No.008430 de 1993 del Ministerio de Salud. El proyecto multicéntrico en el cual se anida

este trabajo de grado fue aprobado por los comités de ética de la Universidad de Santander

(UDES), Vanderbilt University de Estados Unidos y de las instituciones incluidas en el

estudio. Las muestras y la información de los pacientes fueron obtenidas directamente de

los padres o acudientes mediante un cuestionario previa firma del consentimiento

informado.

3.9 ANÁLISIS DE DATOS

Los datos de este estudio fueron archivados en bases de datos elaboradas en la REDcap

https://redcap.vanderbilt.edu (Página web para la construcción, gestión de encuestas y

bases de datos en línea, que apoya la captura de datos para estudios de investigación).

Toda la información requerida fue manejada con códigos. Una vez la base de datos estaba

en la REDcap esta fue descargada en una hoja de Microsft Excel (Santa Rosa, California,

2013). En este estudio se determinó la prevalencia de cada virus en las muestras fecales

mediante porcentajes. Se determinaron diferencias significantes entre los 6 virus

estudiados, tanto en casos como en controles, usando el test X2. Valores p < 0.05 se

consideraron estadísticamente significativos. Se determinaron los odd ratio (OR) con los

intervalos de confianza del 95 % usando el software Epidat 3.1 (Área de análisis de salud

y sistemas de información sanitaria, Organización panamericana de la salud, enero 2006).

https://redcap.vanderbilt.edu/

Resultados

40

4. RESULTADOS

4.1. Datos sociodemográficos y factores de riesgo

En este estudio se seleccionaron 810 muestras de niños menores de 5 años de

Bucaramanga y su área metropolitana, que asistieron a seis instituciones de salud. Del

total de las muestras analizadas 374 (46,2 %) y 436 (53,7 %) fueron del sexo femenino

y masculino, respectivamente. El promedio de edad en la población de estudio fue de

20 meses (DS: 14,7) con un rango entre 0 meses (días de nacido) y 59 meses. Estos se

agruparon en tres grupos pareados 1:1entre casos y controles, grupo 1 (0 a 11 meses),

2 (12 a 23 meses) y 3 (24 a 59 meses). El promedio de edad en meses de cada grupo

fue de 5,4 (DS: 4,5), 15,6 (DS: 3,4), 38,2 (DS: 9,6) para controles y 6,8 (DS: 2,9), 16,9

(DS: 3,3), 37,8 (DS: 10,2) para casos (Tabla 15).

Durante el período de estudio se realizó una encuesta sobre aspectos epidemiológicos

y clínicos. Se recolectaron datos de los cuidadores principales responsables del infante,

acceso a servicios de salud y antecedentes vacunales. Adicionalmente, se evaluaron

las principales condiciones ambientales y socioeconómicas. Entre éstos, la frecuencia

de la recolección de basuras, procedencia del agua de la casa, la forma de tratamiento

del agua y la eliminación de la misma, el contacto con animales durante los últimos 7

días antes de la encuesta.

Los niños incluidos procedían de los estratos desde 1 al 6, siendo el estrato 3 el de

mayor frecuencia en los casos (31,3 %) y en el de los controles el 2 (34,3%). La

mayoría de los niños tanto en casos como en controles habían tenido durante el periodo

anterior al muestreo contacto con animales (57,5% y 60,2% respectivamente). Sin

embargo, la mayor frecuencia fue para perros en ambos grupos, seguido de gatos.

Los resultados de este cuestionario también mostraron que existe una recolección

periódica de las basuras de 2 a 3 veces por semana, lavado de manos con jabón y

disposición de las aguas residuales tanto en casos como en los controles. Entre los

antecedentes vacunales para rotavirus el mayor porcentaje de los niños tenían entre

uno a dos dosis (Tabla 15).

Tabla 15. Datos sociodemográficos y factores de riesgo para EDA en la población de estudio

Variables Casos (405) Controles (405)

Sexo n (%) n (%)

Femenino 181 (44,6) 193 (47,6)

Masculino 224 (55,3) 212 (52,3)

Edad

0 – 11 meses 126 (31,1) 126 (31,1)

12 – 23 meses 145 (36,8) 145 (36,8)

24 – 59 meses 134 (33,0) 134 (33,0)

Estrato

1 104 (2,6) 103 (25,4)

2 118 (29,1) 139 (34,3)

3 127 (31,3) 115 (28,3)

4 44 (10,8) 37 (9,1)

5 3 (0,7) 3 (0,7)

Resultados

41

6 3 (0,7) 1 (0,2)

Desconoce 6 (1,4) 7 (1,7)

Educación Cuidadores Principales

Escuela primaria 69 (17) 55 (13,5)

Secundaria 218 (53,8) 191 (47,1)

Tecnología 59 (14,5) 78 (19,2)

Universitario 51 (12,5) 74 (18,2)

Posgrado 0 (0) 4 (0,9)

Otro 0 (0) 0 (0)

Ninguno 4 (0,9) 3 (0,7)

Desconoce 4 (0,9) 0 (0)

Acceso a servicios de salud

EPS subsidiada 148 (36,5) 164 (40,4)

EPS contributiva 224 (55,3) 134 (33)

Privado – Paga directamente 15 (3,7) 99 (24,4)

Privado – medicina prepagada 12 (2,9) 2 (0,4)

Desconoce 1 (0,2) 0 (0)

No respondió 4 (0,9) 6 (1,4)

Antecedentes Vacúnales (Vacuna de

Rotavirus)

Si 384 (94,8) 382 (94,3)

No 16 (3,9) 22 (5,4)

Desconoce 5 (1,2) 1 (0,2)

N° de dosis de vacuna Rotavirus

1 10 (2,6) 34 (8,9)

2 358 (93,2) 335 (87,6)

3 11 (2,8) 11 (2,8)

Desconoce 5 (1,3) 2 (0,5)

Contacto con animales

Ninguno 172 (42,4) 244 (60,2)

Si tuvo contacto 233 (57,5) 161 (39,7)

Aves 16 (6,8) 16 (9,9)

Gatos 62 (26,6) 63 (39,1)

Perro 133 (57,0) 129 (80,1)

Pollo 10 (4,2) 12 (7,4)

Cerdo 2 (0,8) 0 (0)

Vacas 1 (0.4) 0 (0)

Caballos 0 (0) 0 (0)

Cabra 0 (0) 0 (0)

Reptiles (Serpiente, lagartija, Tortuga) 1 (0,4) 2 (1,24)

Anfibios (Ranas, Salamandras) 0 (0) 0 (0)

Insectos 0 (0) 0 (0)

Roedores 3 (1,2) 3 (1,86)

Otros 5 (2,1) 3 (1,86)

Desconoce 0 (0) 1 (0,62)

Frecuencia de la recolección de basuras

Ninguno 5 (1,2) 2 (0,4)

Si hubo frecuencia 400 (98,7) 403 (99,5)

Diario 22 (5,5) 26 (6,4)

2 – 3 días en la semana 374 (93,5) 372 (92,3)

Una vez a la semana 4 (1) 5 (1,2)

Procedencia del agua de la casa

Agua de la llave 402 (99,2) 399 (98,5)

Agua de la llave fuera de casa 1 (0,2) 3 (0,7)

Agua de pozo comunal 1 (0,2) 2 (0,4)

Camión Cisterna 0 (0) 0 (0)

Resultados

42

Otro 1 (0,2) 1 (0,2)

Lavado de manos con jabón

Si 383 (94,5) 398 (98,2)

No 22 (5,4) 3 (0,7)

Desconoce 0 (0) 4 (0,9)

Tratamiento del agua

No 148 (36,5) 145 (35,8)

Si se trata el agua 257 (63,4) 260 (64,1)

Hervida 220 (85,6) 237 (91,1)

Filtrada 37 (14,3) 23 (8,8)

Con límpido 0 (0) 0 (0)

Desconoce 0 (0) 0 (0)

Eliminación de aguas residuales

Ninguno 1 (0,2) 0 (0)

Si hay eliminación de aguas residuales 404 (99,7) 405 (100)

Alcantarillado 398 (98,5) 403 (99,5)

Tanque séptico 5 (1,2) 2 (0,4)

Calle 0 (0) 0 (0)

Desconoce 1 (0,2) 0 (0)

*Las categorías no son exhaustivamente, ni mutuamente excluyentes debido a las respuestas múltiples

para algunas preguntas del cuestionario, por lo tanto el porcentaje de positividad es mayor de 100.

4.2. Estudio viral

4.2.1. Proporción de agentes virales

En 222 (27,4%) de las 810 muestras analizadas se logró la identificación de 244

(30,1%) de uno o más de los virus analizados, 184 (45,4%) en casos y 60 en controles

(14,8 %). 120 (14,8%) NoV GI/GII fueron identificados, existiendo una diferencia

estadísticamente significativa entre casos y controles para norovirus GII (p = 0.00). El

segundo virus con mayor prevalencia fue RoV en 42 (5,1%), seguido de 42 (5,1%)

SaV con p = 0,42, 26 (3,2%) AsV p = 0,02 y AdV 14 (1,7 %, p = 0,00) (Tabla 16).

Resultados

43

Tabla 16. Proporción de infecciones por virus entéricos mediante ensayos moleculares y ELISA en

casos y controles.

*En algunos pacientes las identificaciones fueron múltiples (varios tipos de virus), por lo tanto, no se

puede asociar la presencia de un solo tipo de virus a cada caso o control.

Entre los casos se identificó con mayor frecuencia NoVGII (OR 4,93 IC 95% 2,85-

8,53), seguido de RoV (OR 22,08 IC 95% 5,29-92,01) y SaV (OR 1,35 IC 95 % 0,72-

2,53). NoVGI, AdV y AsV mostraron porcentajes que variaron entre 3,2 y 4,6. Por el

contrario, en los controles se identificó con mayor frecuencia SaV (4,4%), seguido en

menor proporción de NoVGII y NoVGI (4,1 % y 3,7 %). Las prevalencias de AdV,

RoV y AsV variaron entre 0,2 % y 1,7 % (Tabla 16).

Cabe resaltar que todos casos a los que se les identificó RoV, tenían la vacuna. Los

dos controles no habían sido vacunados.

4.2.2. Detección viral en meses del año entre casos y

controles

Durante los meses de agosto del 2013 a diciembre del 2014 se presentaron infecciones

por alguno de los 6 agentes virales. Mayo fue el mes en donde se identificó el mayor

número de casos de NoVGI Gráfica 1 (A). Por el contrario NoVGII, se identificó en

los casos durante los meses de marzo, julio, agosto, septiembre, octubre y noviembre

y en los controles durante el mes de diciembre del año 2013 (B). La mayor

identificación de RoV se realizó en los casos en comparación con los controles, siendo

agosto del año 2014 el mes en donde se observó mayor detección viral para los

controles. Al mismo tiempo, en este mes la identificación disminuyó en los casos (C).

Para SaV, AsV y AdV la mayor identificación en los casos se observó en el mes de

mayo del 2014 (D, F, G).

Grupo Total

Norovirus

GI OR - IC

Norovirus

GII OR - IC

Sapovirus

OR - IC

Astrovirus

OR - IC

Adenovirus OR -

IC

Rotavirus

(ELISA) OR - IC

Total

positivos

n (%)

Total

negativos

n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)

Casos 405 16 (3,9) 1,06

(0,52 – 2,19)

72 (17,7) 4,93

(2,85 -8,53)

24 (5,9) 1,35

(0,72 - 2,53)

19 (4,6) 2,79

(1,16 - 6,73)

13 (3,2) 13,23

(1,72 -

101,63

)

40 (9,8) 22,08

(5,29 - 92,01)

184 (45,4) 221 (54,5)

Controles 405 15 (3,7) 17 (4,1) 18 (4,4) 7 (1,7) 1 (0,2) 2 (0,4) 60 (14,8) 345 (85,1)

Total 810 31 (3,8) 89 (10,9) 42 (5,1) 26 (3,2) 14 (1,7) 42 (5,1) 244 (30,1) 566 (69,8)

Valor p 1.00 <0.01 0,42 0,02 <0.01 <0.01 <0.01

Resultados

44

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

N°

de P

osi

tiv

os

Meses

Norovirus GI

Casos

Controles

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

N°

de P

osi

tiv

os

Meses

Norovirus GII

Casos

Controles

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

N°

de P

osi

tiv

os

Meses

Rotavirus

Casos

Controles

A

B

C

Resultados

45

Gráfica 1. Identificación de norovirus GI/GII (A, B), rotavirus (C), sapovirus (D), astrovirus (E) y

adenovirus (F), durante los meses agosto 2013 a diciembre 2014.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

N°

de P

osi

tiv

os

Meses

Sapovirus

Casos

Controles

02468

1012141618

N°

de

Posi

tivos

Meses

Astrovirus

Casos

Controles

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

N°

de P

osi

tiv

os

Meses

Adenovirus

Casos

Controles

D

E

F

Resultados

46

4.2.3 Detección viral entre casos y controles por

rangos de edad y durante los meses de estudio

En la gráfica 2 se muestra la detección viral en casos y controles para cada tipo de

virus en cada mesa del periodo de estudio. NoVGI fue identificado en los tres grupos

de edad tanto en casos como en controles (A). NoVGII se identificó más en los casos

que en los controles, siendo los niños de 1 a 2 años los de mayor identificación (B). El

mes de mayo fue donde se presentaron las mayores identificaciones en casos de niños

de 1 a 2 años con NoVGI y para NoVGII fue el mes de septiembre, con 10 casos.

SaV y RoV presentaron la mayor identificación en los casos de niños de 2 a 5 años,

principalmente en los meses de mayo a octubre (C y D).

AsV se presentó en mayor prevalencia en el mes de mayo en niños de 1 a 5 años (E) y

AdV presentó positividad en los casos en los tres grupos de edad (F).

N°

Po

sitiv

os

Meses

Norovirus GI < 1 año

Casos

Controles

0

1

2

3

N°

Po

sitiv

os

Meses

Norovirus GI 1 a 2 años

Casos

Controles

A

Resultados

47

0

1

2

N°

Po

sitivo

s

Meses

Norovirus GI 2 a 5 años

Casos

Controles

0

1

2

3

4

5

N°

Po

sitiv

os

Meses

Norovirus GII < 1 año

Casos

Controles

0

2

4

6

8

10

12

N°

Po

sitiv

os

Meses

Norovirus GII 1 - 2 años

Casos

Controles

B

Resultados

48

0

1

2

3

4

5

N°

Po

sitivo

s

Meses

Norovirus GII 2 a 5 años

Casos

Controles

0

1

2

3

N°

Po

sitiv

os

Meses

Sapovirus < 1 año

Casos

Controles

0

1

2

3

4

5

6

N°

Po

sitiv

os

Meses

Sapovirus 1 - 2 años

Casos

Controles

C

Resultados

49

0

1

2

3

N°

Po

sitivo

s

Meses

Sapovirus 2 - 5 años

Casos

Controles

0

1

2

3

4

N°

Po

sitiv

os

Meses

Rotavirus < 1 año

Casos

Controles

0

1

2

3

4

N°

Po

sitiv

os

Meses

Rotavirus 1 - 2 años

Casos

Controles

D

Resultados

50

0

1

2

3

4

5

N°

Po

sitivo

s

Meses

Rotavirus 2 - 5 años

Casos

Controles

0

1

2

3

N°

Po

sitiv

os

Meses

Astrovirus < 1 año

Casos

Controles

0

1

2

3

N°

Po

sitiv

os

Meses

Astrovirus 1 - 2 años

Casos

Controles

E

Resultados

51

0

1

2

3

4N

°p

osi

tivo

s

Meses

Astrovirus 2 a 5 años

Casos

Controles

0

1

2

N°

Po

sitiv

os

Meses

Adenovirus < 1 año

Casos

Controles

0

1

2

3

N°

Po

sitiv

os

Meses

Adenovirus 1 - 2 años

Casos

Controles

F

Resultados

52

Gráfico 2. Identificación de norovirus GI / GII (A, B), rotavirus (C), sapovirus (D), astrovirus (E) y

adenovirus (F), durante los meses agosto 2013 a diciembre 2014 en los tres rangos de edad.

4.2.4 Detección viral en meses del año por sexo entre

casos y controles

La gráfica 3 evidencia los tipos de virus analizados con respecto al sexo tanto en casos

como en controles y durante el período de estudio. NoVGI, se identificó en los casos

del sexo femenino con 2 en el mes de febrero y 2 en mayo. Se detectaron 6 positivos

en los controles de este mismo sexo, repartidos en los meses de septiembre y octubre

del 2013, febrero, junio, septiembre del 2014. En el sexo masculino, se presentaron en

6 casos y 9 en controles (A).

NoVGII tuvo mayor identificación en 44 casos del sexo masculino a diferencia de 28

casos en el sexo femenino. El mes septiembre del 2014, fue el mes que presentó 8

casos tanto del sexo femenino como en masculino, seguido de 5 en noviembre en el

masculino y 4 en el femenino. Este mismo agente se presentó en solo 7 y 10 de los

controles del sexo femenino y masculino, respectivamente (B).

En general RoV se detectó en igual número de los casos para los dos sexos, 20 en el

femenino, 20 en el masculino. Al igual que 1 control del sexo femenino y 1 control del

masculino. 4 de los casos del sexo femenino fueron en el mes de octubre. Los casos

del sexo masculino, estaban repartidos, 2 en el mes de septiembre del 2013, 2 en

noviembre del 2013, 2 en enero, 2 en mayo, 2 en junio, 4 en julio, 2 septiembre y 4

octubre (C).

Del total de los 17 casos en el que se aisló SaV en el sexo masculino, 6 se presentaron

en el mes de mayo, siendo el mes con mayor identificación, a diferencia de 3 de los 10

controles fueron en el mes de noviembre del 2013, seguido de 2 en el mes de octubre

del 2013. En el sexo femenino se presentaron 7 casos y 8 controles, 1 caso, 1 control

en octubre del 2013, 1 caso en diciembre del 2013, 1 control en abril, en mayo 1 caso

con 2 controles, 1 control en junio, 1 caso en julio, agosto, en octubre del 2014 un caso,

2 controles, un caso en noviembre y diciembre (D).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

N°

Po

sitivo

s

Meses

Adenovirus 2 - 5 años

Casos

Controles

Resultados

53

AsV fue identificado en 9 casos y 4 controles del sexo femenino y en 10 casos y 3

controles del masculino. Mayo fue el mes con mayor número de casos, 3 del sexo

femenino y 3 del masculino. Los controles en el sexo femenino fueron positivos

durante los meses de mayo, julio, agosto, octubre, a diferencia del sexo masculino que

fueron en septiembre del 2013, junio y agosto del 2014 (E).

AdV se detectó en 3 y 10 de los casos de los sexos femenino y masculino,

respectivamente. Durante el año de estudio no se identificaron controles del sexo

femenino para este agente viral, en el sexo masculino solo se presentó en un control

durante mayo (F).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

N°

de

Posi

tivos

Meses

Norovirus GI

Masculino Controles

Masculino Casos

Femenino Controles

Femenino Casos

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

N°

de

Posi

tivos

Meses

Norovirus GII

Masculino Controles

Masculino Casos

Femenino Controles

Femenino Casos

A

B

Resultados

54

0

2

4

6

8

10

N°

de

Posi

tivos

Meses

Rotavirus

Masculino Controles

Masculino Casos

Femenino Controles

Femenino Casos

-1

1

3

5

7

9

11

13

15

N°

de

Posi

tivos

Meses

Sapovirus

Masculino Controles

Masculino Casos

Femenino Controles

Femenino Casos

0

1

2

3

4

5

6

78

9

10

N°

de

Posi

tivos

Meses

Astrovirus

Masculino Controles

Masculino Casos

Femenino Controles

Femenino Casos

D

E

C

Resultados

55

Gráfico 3. Identificación de norovirus GI/GII (A, B), rotavirus (C), sapovirus (D), astrovirus (E) y

adenovirus (F), durante los meses agosto 2013 a diciembre 2014 en el sexo femenino y masculino.

4.2.5 Coinfecciones virales en casos y controles

De los 222 niños, se presentó coinfección en 201 de los 244 agentes virales

identificados. Las infecciones fueron únicas y en 43 se observaron coinfecciones. Se

observaron 40 infecciones dobles entre las que se encuentran principalmente

AsV/AdV (2,5%), AsV/RoV (7,5%), SaV/AsV (2,5%), SaV/NoVGI (10%),

SaV/NoVGII (2,5%), SaV/RoV (5%), NovGI/GII (2,5%), AdV/NoVGII (2,5%),

NoVGI/RoV (10%), NoVGII/RoV (10%) y en 3 se observaron infecciones triples con

la presencia de AsV, SaV y NoVGII (Tabla 17).

Tabla 17. Proporción de coinfecciones por virus entéricos.

En el rango de edad de 12 a 23 meses de los casos se identificó el mayor porcentaje de

infecciones únicas y coinfecciones (Tabla 18).

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

5N

°d

e P

osi

tivos

Meses

Adenovirus

Masculino Controles

Masculino Casos

Femenino Controles

Femenino Casos

Virus

Infección

Única

Coinfección

(2 virus)

Coinfección

(3)

n % n % n %

Norovirus GI 24 11,9 7 17,5 - -

Norovirus GII 81 40,3 7 17,5 1 33,3

Rotavirus 31 15,4 11 27,5 - -

Sapovirus 33 16,4 8 20 1 33,3

Astrovirus 20 10,0 5 12,5 1 33,3

Adenovirus 12 6,0 2 5 - -

Total 201 82,3 40 16,3 3 1,2

F

Resultados

56

Tabla 18. Proporción de coinfecciones por virus entéricos según rangos de edad

Virus

Infección Única Confección (2 ó 3)

0 - 11 meses 12 - 23 meses 24 - 59 meses 0 - 11 meses 12 - 23 meses 24 - 59 meses

Casos

n=33

Controles

n=21

Casos

n=58

Controles

n=22

Casos

n=52

Controles

n=15

Casos

n=5

Controles

n=0

Casos

n=9

Controles

n=0

Casos

n=6

Controles

n=1

n % n % n % n % n % n % n % n % n % n % n % n %

Norovirus GI 2 6,1 4 19 3 5,17 5 22,7 5 9,6 5 33,3 2 20 0 0 3 15,8 0 0 1 8,3 1 50

Norovirus GII 16 48,5 6 28,6 33 56,9 8 36,4 15 28,8 3 20 1 10 0 0 6 31,6 0 0 1 8,3 0 0

Rotavirus 5 15,2 0 0 8 13,8 1 4,55 16 30,8 1 6,67 3 30 0 0 4 21,1 0 0 4 33,3 0 0

Sapovirus 3 9,1 9 42,9 6 10,3 5 22,7 7 13,5 3 20 2 20 0 0 3 15,8 0 0 3 25 1 50

Astrovirus 5 15,2 1 4,8 3 5,17 3 13,6 5 9,6 3 20 2 20 0 0 2 10,5 0 0 2 16,7 0 0

Adenovirus 2 6,1 1 4,8 5 8,62 0 0 4 7,7 0 0 0 0 0 0 1 5,3 0 0 1 8,3 0 0

Total 33 21 58 22 52 15 10 0 0 19 0 0 12 2

Se observó infección única en los dos sexos para NoVGI, RoV, SaV, AsV en casos y

controles (Gráfico 4 (A, B)).

En los casos del sexo femenino el mayor agente que se identificó fue NoVGII con

42,1%, seguido de RoV, NoVGI, AsV, SaV y AdV con 22,8%, 12,3%, 10,5%, 7,0%

y 5,3 %, respectivamente. En los controles de este mismo sexo el mayor porcentaje fue

para SaV con 29,6%, después de NoVGII, NoVGI y AsV con 25,9%, 22,2% y 14,8%,

cada uno. RoV y SaV correspondieron a 3,7% cada uno.

NoVGII, RoV, SaV, AdV, AsV y NoVGI, fueron identificados en 46,5%, 18,6%,

14,0%, 9,0%, 8,1% y 3,5% de los casos del sexo masculino, a diferencia de los

controles en los que se detectaron en el 29,0%, 25,8%, 9,7% y 3,2% SaV, NoVGI,

AsV y RoV. AdV no se identificó en los controles del sexo masculino (B).

05

101520253035404550

Po

rce

nta

je %

Virus

Casos

Femenino

Masculino

A

Resultados

57

Gráfico 4. Infección única e identificación de norovirus GI/GII, rotavirus, sapovirus, astrovirus y

adenovirus en el sexo femenino y masculino.

Todos los casos del sexo masculino presentaron coinfecciones entre los 6 agentes

virales. SaV con 23,8%, fue el virus con mayor coinfección en este grupo, seguido de

19,0% tanto para NoVGI como RoV. AsV y NoVGI se detectaron en 14,3% cada uno.

AdV fue positivo en 9,3% (Gráfica 5A).

No se presentaron coinfecciones en los controles del sexo femenino, contrario a los

casos en los que se presentó el 35% de RoV, seguido de 20% de NoVGII. NoVGI, SaV

y AsV presentaron 15% cada uno. AdV no se encontró en coinfecciones en los casos

del sexo femenino. El sexo masculino fue el único que presentó coinfección en los

controles, en los agentes NoVGI y SaV (Gráfica 5B).

05

101520253035404550

Po

rce

nta

je %

Virus

Controles

Femenino

Masculino

B

Resultados

58

Gráfico 5. Coinfección e identificación de norovirus GI/GII, rotavirus, sapovirus, astrovirus y

adenovirus en el sexo femenino y masculino.

4.3 Filogenia de aislados de norovirus GI y

norovirus GII

A los 120 aislados identificados mediante RT–qPCR como NoVGI o NoVGII (31 y

89 respectivamente), se les realizó purificación del producto de PCR a partir de una

reacción de transcriptasa reversa para la obtención del cADN. El producto de la

purificación de la PCR se almacenó a –80°C. 31 (100%) de los aislados de NoVGI y

85 (95,5%) de NoVGII fueron enviados a secuenciación. El alineamiento de

secuencias se realizó utilizando el software Bioedit V 7.2.5 (actualizado 12/ 11 / 2013).

El análisis filogenético de los aislados de RNA de NoVGI y NoVGII se basó en la

región C del extremo 5’ del ORF2. Se compararon con 17 y 30 secuencias de referencia

para cada genotipo a partir de la base de datos de GenBank.

Según el análisis se determinó que el genotipo de NoVGI, GI.2 (n=22) con 70,9 % fue

el más frecuente a diferencia de GI.1, GI.3 y GI.5 (29%, 3,2% y 12,9%

respectivamente). Dos muestras identificadas como NoVGI presentaron 2 genotipos

diferentes una GI.1/GI.2 y la otra GI.2/GI.5.

0

10

20

30

40

50

60

Po

rce

nta

je %

Virus

Casos

Femenino

Masculino

0102030405060

Po

rce

nta

je %

Virus

Controles

Femenino

Masculino

A

B

Resultados

59

El genotipo de NoVGII con mayor identificación fue GII.4 (n=50) con 58.8%. Los

otros genotipos en menor proporción identificados fueron GII.3, GII.5, GII.6, GII.9,

GII.13, GII.14 y GII.17 (1,17%, 5,8%, 8,2%, 2,3%, 4,7%, 22,3%, 1,17%,

respectivamente). De las cuatro muestras que fueron clonadas para NoVGII, 1 presentó

un mismo genotipo NGII.4 Sydney (Figura 1, 2). Los árboles filogenéticos se

realizaron con el programa MEGA 6.06 (Test Maximun - Likelihook tree, bootstrap,

1000, método Kimura2 - Gamma).

Resultados

60

Figura 14. Análisis filogenético de la secuencia de nucleótidos de norovirus. Árbol filogenético de la

región C del extremo 5’ del ORF-2, de norovirus GI (muestras seleccionadas con rombo de color rojo),

comparadas con las secuencias de referencia de la base de datos GeneBank.

785GI

821GI

759GI

693GI

649GI

360GI

358GI

309GI

264GI

228GI

214GI

173GI

833.3 NGI

164GI

96GI

58GI

33GI

43GI

39.3 NGI

170.2 NGI

833.2 NGI

300GI

GI.2.KP753278

GI.2 KM462611

GI.2.KM349493

GI.2-L07418

GI.2.FJ383887

98GI

150GI

39.2NGI

378GI

GI.5 FJ383818

GI.5b-AB039774

GI.6b-AF093797

GI.4-AB042808

GI.1-M87661

GI.1. EU007717

GI.1. GQ925106

532GI

170.3NGI

833.1GI

570GI

338GI

244GI

308GI

594GI

170.1GI

GI.7b-JN899243

GI.9.KF586507.1

GI.3c-AB187514

752GI

GI.3a-U04469

GI.8.KR053451.1

Resultados

61

Figura 15. Análisis filogenético de la secuencia de nucleótidos de norovirus. Árbol filogenético de la

región C del extremo 5’ del ORF-2, de norovirus GII (muestras seleccionadas con rombo de color rojo), comparadas con las secuencias de referencia de la base de datos GeneBank.

584GII

609GII

583GII

556GII

544GII

522GII

496GII

495GII

486GII

430GII

428GII

322GII

480GII

481GII

476GII

628GII

724GII

711GII

700GII

710GII

571GII

810GII

650GII

132GII

751.9GII

166GII

171GII

221GII

595GII

673GII

767GII

801GII

751.4.2GII

456GII

580GII

167GII

173GII

507GII

GII.4.KP868597

502GII

621GII

198GII

199GII

197.4GII

153GII

197GII

200GII

266GII

197.2GII

GII.4-Bristol-X76716

GII.4-New Orleans GU445325

GII.4-NSW001P-GQ845367

GII.4-Sydney-JX459908

180GII

181GII

9GII

GII.3-GII.16.KM289172

GII.3a-U02030

GII.3b-AF190817

531GII

GII.13.AB810006

555GII

438GII

543GII

798GII

GII.17-AY502009

GII.1-U07611

GII.16-AY502010

GII.11-AB074893

GII.19-AY823306

187GII

304GII

542GII

GII.5.KM036378

520GII

453GII

GII.2-X81879

GII.22-AB083780

117GII

191GII

206GII

443GII

613GII

631GII

744GII

GII.6.KM267742

GII.6b-AF414410

GII.18-AY823304

54GII

113GII

GII.9-AY038599

508GII

709GII

527GII

528GII

612GII

663GII

680GII

717GII

GII.14 FJ264893

GII.14.KR904230

514GII

539GII

516GII

559GII

578GII

599GII

606GII

813GII

599.3NGII

632.1GII

632.4GII

Resultados

62

4.4. Filogenia de aislados de rotavirus

42 aislados positivos en el ELISA para RoV (40 casos y 2 controles) fueron analizados

para clasificar los diferentes genotipos. A los productos obtenidos a partir de la

reacción de transcriptasa reversa para la obtención del cADN, se les realizó PCR

simple convencional para la identificación de las proteínas estructurales VP4 y VP7

(proteasa o proteína P; glicoproteína o proteína G, respectivamente). Se purificó el

producto de la PCR. 24 de los aislados de RoV positivos para los dos genes VP4 y

VP7 fueron enviados a secuenciación. 8 de los 42 solo presentaron uno de los dos

genes. El alineamiento de secuencias se realizó utilizando el software Bioedit V 7.2.5

(actualizado 12/ 11 / 2013).

El análisis filogenético de los aislados de RoV se basó en la comparación de secuencias

de las proteínas VP4 y VP7 alineadas en la base de datos de GenBank. La

secuenciación mostró que los genotipos detectados se agrupaban en los clúster (G1P8,

G2P4, G4P8, G12P8, G12P4, G12P9, G9P8, G9P4) (Figura 16 y 17).

Resultados

63

Figura 16. Análisis filogenético de la secuencia de nucleótidos de rotavirus. Árbol filogenético de la

proteína VP4 de rotavirus (muestras seleccionadas con rombo de color rojo), comparadas con las

secuencias de referencia seleccionadas de la base de datos GeneBank.

36VP4

KT919043.1-G12P8-USA

136VP4

158VP4

290VP4

44VP4

106VP4

127VP4

247VP4

341VP4

356VP4

497VP4

KF202511.1-G4P8-Italia

KU048596.1-G12P8-Italia

465VP4

KC484721.1-G9P8-Bangladhes

665VP4

338VP4

478VP4

161VP4

176VP4

KT025876.1-G12P8-Brazil

KP281281.1-G12P8-Saudi Arabia

374VP4

655VP4

KT007949.1-G1P8-Thailandia

155VP4

154VP4

151VP4

JN849127.1-G9P8-Belgium

HM773659.1-G3P8-USA

KT988296.1-G3P8-Italia

KT007888.1-G12P4-Thailandia

427VP4

440VP4

Resultados

64

Figura 17. Análisis filogenético de la secuencia de nucleótidos de rotavirus. Árbol filogenético de la

proteína VP7 de rotavirus (muestras seleccionadas con rombo de color rojo), comparadas con las

secuencias de referencia seleccionadas de la base de datos GeneBank.

Una vez obtenidas las secuencias de RoV, también fueron analizadas en el programa

RotaC 2.0, permitiendo la clasificación como se observa en la tabla 19, 20.

106VP7

127VP7

136VP7

338VP7

478VP7

176VP7

44VP7

290VP7

36VP7

161VP7


665VP7

KJ412580.1-G12P9-Paraguay

655VP7

374VP7


247VP7

158VP7

440VP7

KJ638639.1-G2P4-Brazil

427VP7

KJ432723.1-G9P4-Slovenia

154VP7

155VP7

151VP7

341VP7

356VP7

465VP7

497VP7

KF812606.1-G9P4-South Korea

KM205791.1-G9P8-Italia

Resultados

65

Tabla 19 Clasificación de rotavirus detectados según programa RotaC 2.0, de acuerdo a cada una de

las secuencias de las proteínas VP4 y VP7

Identificación de la

muestra

Genotipo

36 G12; P8

44 G12; P8

106 G12; P8

127 G12; P8

136 G12; P8

151 G9; P8

154 G9; P8

155 G9; P8

158 G12; P8

161 G12; P8

176 G12; P8

247 G12; P8

290 G12; P8

338 G12; P8

341 G9; P8

356 G9; P8

374 G12; P8

427 G2; P4

440 G2; P4

465 G9; P8

478 G12; P8

497 G9; P8

655 G12; P8

665 G12; P8

Tabla 20 Tabla resúmen de los genotipos identificados mediante la base de datos del RotaC 2.0

Genotipo Número %

G12P8 15 62,5

G9P8 7 29,1

G2P4 2 8,3

4.4.1 Comparación del análisis filogenético de las

proteína VP4/VP7 de rotavirus

Se evidenció concordancia cuando se compararon los dos análisis filogenéticos. La

agrupación de los genotipos identificados en la base de datos RotaC 2.0 de las tabla 21

y 22 resume la clasificación de los genotipos P y G según las proteínas VP4 y VP7,

respectivamente, basado en la base de datos GenBank.

Resultados

66


Rota C

P8 P4

VP4

GenBank

P8 22 -

P4 - 2


Rota C

G12 G9 G2

VP7

GenBank

G12 15 - -

G9 - 7 -

G2 - - 2

4.5 Factores demográficos implicados en EDA de

etiología viral

De los 405 casos, 224 correspondieron al sexo masculino y 181 al femenino. Se logró

identificar algún tipo de virus en 47,8% y 42,5% respectivamente. 221 de los controles

correspondieron al sexo masculino y 194 al femenino, en éstos se identificó positividad

a algún virus en 15,6% y en 13,9% respectivamente.

140 muestras positivas eran del sexo masculino tanto para casos como para controles,

seguido de 104 muestras en el femenino (Tabla 23).

Tanto en el grupo de los casos como en los controles, NoVGII fue el virus más

frecuente en ambos sexos, 38,6% en el masculino, p<0.01 (OR 4.91 IC95% 2,40-

10,04) y 33,7% en el femenino, p<0.01 (OR 4,88 IC95% 2,07-11,49), seguido de SaV

con 19,3% y 14,3%.

Adicionalmente, para RoV se observaron diferencias estadísticamente significativas

entre casos y controles en los dos sexos. En el sexo femenino 20,2% p<0,01 (OR 23,97

IC95% 3,18-180,59) y para el sexo masculino 15,0% (OR 20,58 IC 95% 2,73-154,82)

(Tabla 23).

AdV se identificó en 4,5% en los casos del sexo masculino, presentándose diferencias

estadísticamente significativas p<0.01 (Tabla 23).

Resultados

67

Tabla 23. Distribución de virus identificados por sexo en casos y controles

Virus

Casos (n=405) Controles (n=405)

P OR – IC

Masculino

P OR – IC

Femenino

Total positivos

Masculin

o (n=224)

Femenino

(n=181)

Masculin

o (n=211)

Femenino

(n=194)

Masculino

(n=140)

Femenino

(n=104)

n % n % n % n % Masculino Femenino n % n %

Norovirus GI 6 2,7 10 5,5 9 4,3 6 3,1 0.43 0,61

(0,21 - 1,76) 0.30

1,83

(0,65 - 5,14) 15 10,7 16 15,4

Norovirus GII 44 19,6 28 15,5 10 4,7 7 3,6 <0.01 4,91

(2,40 - 10,04) <0.01

4,88

(2,07 -11,49) 54 38,6 35 33,7

Sapovirus 17 7,6 7 3,9 10 4,7 8 4,1 0.23 1,65

(0,73 - 3,69) 1.00

0,93

(0,33 - 2,63) 27 19,3 15 14,4

Astrovirus 10 4,5 9 5,0 3 1,4 4 2,1 0.08 3,23

(0,87 - 11,93) 0.16

2,48

(0,75 - 8,21) 13 9,3 13 12,5

Adenovirus 10 4,5 3 1,7 0 0,0 1 0,5 <0.01 / 0.35 3,25

(0,33 - 31,55) 10 7,1 4 3,85

Rotavirus 20 8,9 20 11,0 1 0,47 1 0,5 <0.01 20,58

(2,73 - 154,82) <0.01

23,97

(3,18 -180,59) 21 15,0 21 20,2

Total virus 10

7 47,8 77 42,5 33 15,4 27 13,9 <0.01

4,93

(3,13 - 7,77) <0.01

4,57

(2,77 - 7,56) 140 100 104 100

* La positividad a virus en cada columna no fue única por paciente. En un mismo individuo se

presentaron coinfecciones (2 o más virus).

Con respecto a la edad, se observó mayor positividad a cualquiera de los virus

estudiados en los casos del rango de edad de 12 a 23 meses (grupo 2) con 52,7%,

seguido del rango de 24 a 59 meses (grupo 3) con 48,1% y 34,1% para el rango de 0 a

11 meses (grupo 1), contrario para controles cuyos valores fluctuaron entre 12,8% y

16,7%, mayor para el grupo 1 (Tabla 24).

En el grupo 1 se observaron diferencias estadísticamente significativas entre casos y

controles para NoVGII y RoV (Tabla 24). Sin embargo, en el grupo 2 y 3 la diferencia

fue significante adicionalmente para AdV entre casos y controles (Tabla 24). Tabla 24 Distribución de virus identificados por grupos de edad en casos y controles

*La positividad a virus en cada columna no fue única por paciente. En un mismo individuo se

presentaron coinfecciones (2 o más virus).

Virus

0 – 11 Meses (n=252)

P

12 – 23 meses (n=292)

P

24 – 59 meses (n = 266)

Casos

(n= 126)

Controles

(n=126) OR - IC

Casos

(n=146)

Controles

(n=146) OR - IC

Casos Controles

P

(n=133) (n= 133) OR - IC

n % n % n % n % N % n %

Norovirus

GI 4 3,2 4 3,2 1.00

1,00

(0,24 - 4,08) 6 4,1 5 3,4 1.00

1,20

(0,36 -4,05) 6 4,5 6 4,51 1.00

1,00

(0,31 -3,18)

Norovirus

GII 17 13,5 6 4,8 0.02

3,11

(1,18 - 8,19) 39 26,7 8 5,5 <0.01

6,28

(2,82 -

14,01)

16 12,0 3 2,26 <0.01 5,92

(1,68 -20,85)

Sapovirus 5 4,0 9 7,1 0.41 0,53

(0,17 - 1,65) 9 6,2 5 3,4 0.41

1,85

(0,60 -5,66) 10 7,5 4 3,01 0.16

2,62

(0,80 - 8,58)

Astrovirus 7 5,6 1 0,8 0.06 7,35

(0,89 - 60,66) 5 3,4 3 2,1 0.72

1,69

(0,39 -7,20) 7 5,3 3 2,26 0.33

2,40

(0,60 - 9,51)

Adenovirus 2 1,6 1 0,8 1.00 2,01

(0,18 -22,52) 6 4,1 0 0,0 0.02 / 5 3,8 0 0 <0.01 /

Rotavirus 8 6,3 0 0,0 <0.01 / 12 8,2 1 0,7 <0.01

12,98

(1,66 -

101,21)

20 15,0 1 0,75 <0.01

23,36

(3,08 -

176,82)

Total virus 43 34,1 21 16,7 <0.01 2,59

(1,42 - 4,70) 77 52,7 22 15,1 <0.01

6,28

(3,60 -

10,98)

64 48,1 17 12,8 <0.01 6,32

(3,43 -11,67)

Resultados

68

Respecto a la presencia de síntomas relacionados a la infección viral, NoVGII, fue

identificado cuando los niños tenían la presencia del 60% de disentería seguido de

42,6% de vómitos, 36,6 de diarrea, 31% de fiebre y 19,5% de dolor abdominal en el

sexo femenino. En el masculino el síntoma con mayor frecuencia fue disentería en

45,5%, seguido de vómitos en 41,3%, diarrea en 40,2%. Fiebre y dolores abdominales

en proporciones muy parecidas, 35,8% y 34,5%, respectivamente.

En los casos del sexo femenino en los que se identificó NoVGI, se les relacionó con la

presencia de fiebre en 15,5%, 11,5% de vómitos, 11,4% diarrea, 12,2% dolor

abdominal y 9,0% de fiebre, este agente a diferencia de NoVGII no estaba presente

cuando el paciente presentaba disentería. Al igual que en los casos del sexo femenino,

cuando se presentó positividad por AsV, el principal síntoma fue la fiebre en 13,8%,

seguido de diarrea 12,7% y vómito en 11,5%.

SaV se identificó más frecuentemente en pacientes que referían todos los síntomas

previamente descritos, tanto en los casos del sexo femenino como del masculino.

En los casos positivos para RoV, la presencia de dolor abdominal se observó en 39,0%

del sexo femenino seguido de diarrea con 26,8%. En el sexo masculino, la fiebre fue

en 24,4% y después el dolor abdominal en el 21,8%.

AdV no se correlacionó con la presencia de disentería, ni en el sexo femenino ni el

masculino, adicionalmente el sexo masculino no presentó fiebre cuando presentaban

infección con este agente (Gráfico 6).

Grafico 6. Identificación de norovirus GI/GII, rotavirus, sapovirus, astrovirus y adenovirus en presencia

de diarrea, disentería, vómito, fiebre, dolor abdominal en el sexo femenino y masculino.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Fem

enin

o

Mas

culi

no

Fem

enin

o

Mas

culi

no

Fem

enin

o

Mas

culi

no

Fem

enin

o

Mas

culi

no

Fem

enin

o

Mas

culi

no

Diarrea Disenteria Vómito Fiebre Dolor

abdominal

Porc

enta

je

Síntomas

Rotavirus

Adenovirus

Sapovirus

Astrovirus

Norovirus GII

Norovirus GI

Resultados

69

En los tres rangos de edad NoV fue el virus más frecuente, seguido de RoV (Gráfico

7). NoVGI, no estuvo presente en los niños que presentaban disentería en el segundo

y tercer rango de edad, por el contrario si en los otros síntomas. En los tres rangos la

fiebre fue el principal síntoma con un 12,5%, 10,2 y 13,3%, respectivamente.

NoVGII, fue el agente que en los tres rangos de edad presentaron disentería, en 50%

en los rangos 1 y 2 y el 75% en el rango 3. Datos similares a los de la presencia de

SaV, a diferencia en el grupo tres, el principal síntoma fue el dolor abdominal.

AsV, no se identificó en los niños del rango 1 que presentaron disentería. El mayor

síntoma para los tres grupos, fue el dolor abdominal en 28,6%, 10,0% y 12,5%,

respectivamente. Síntoma igual en la infección con RoV.

Grafico 7 Identificación de norovirus GI/GII, rotavirus, sapovirus, astrovirus y adenovirus en

presencia de diarrea, disentería, vomito, fiebre, dolor abdominal en los tres rangos de edad.

No es observaron diferencias estadísticamente significativas cuando se presentaron

casos de disentería. Sin embargo, si se presentaron en los casos con fiebre cuando se

identificaron AsV y RoV. El dolor abdominal fue más frecuente en los casos de

NoVGII y RoV (Tabla 25).

En los casos con infecciones únicas fue más alta la presencia de diarrea (92,31%)

seguido de vómito (86,71%), fiebre (68,53%) y dolor abdominal (53,85%). La

frecuencia de síntomas en los casos con infecciones dobles fue similar al grupo de

infección única (Tabla 25).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 - 11 12 - 2324 - 59 0 - 11 12 - 2324 - 59 0 - 11 12 - 2324 - 59 0 - 11 12 - 2324 - 59 0 - 11 12 - 2324 - 59

Diarrea Disenteria Vómito Fiebre Dolor abdominal

Porc

enta

je

Síntomas

Rotavirus

Adenovirus

Sapovirus

Astrovirus

Norovirus GII

Norovirus GI

Resultados

70

Tabla 25 Proporción de diarrea, diarrea sanguinolenta (disentería), vómito y dolor abdominal en casos

de EDA con infección por virus diarreagénicos

Infección Casos

identificados

Diarrea Disentería Vómito Fiebre Dolor abdominal

n % n % n % n % n %

Única 143 132 92,31 13 9,09 124 86,71 98 68,53 77 53,85

Doble 19 19 100 2 10,53 16 84,21 4 21,05 8 42,11

Triple 1 1 100 - - 1 100 1 100 1 100

Total 163 152 93,25 15 9,20 141 86,50 103 63,19 86 52,76

Agentes virales p p p p p

Norovirus GI 16 14 87,5 1.00 1 6,25 0.24 12 75 0.70 15 93,75 0.25 7 43,75 0.83

Norovirus GII 72 67 93,06 <0.01 9 12,5 0.85 64 88,89 <0.01 27 37,5 0.16 42 58,33 <0.01

Astrovirus 19 19 100 <0.01 1 5,26 0.34 15 78,95 0.02 15 78,95 0.03 13 68,42 <0.01

Sapovirus 24 23 95,83 0.34 3 12,5 0.61 21 87,50 0.04 20 83,33 0.19 15 62,50 0.14

Adenovirus 14 13 92,86 <0.01 - - - 11 78,57 <0.01 5 35,71 1.00 6 42,86 0.12

Rotavirus 40 37 92,5 <0.01 3 7,5 0.61 36 90,00 <0.01 28 70 <0.01 28 70 <0.01

Total 185 173 93,51 17 9,189 159 85,95 110 59,46 111 60

Discusión

71

5. DISCUSIÓN

El principal objetivo de este estudio fue la identificación de agentes virales

diarreagénicos en niños menores de cinco años de edad de Bucaramanga y su área

metropolitana, con el fin de conocer la prevalencia de NoV GI/GII, SaV, AsV, AdV y

RoV, relacionados a enfermedad diarreica aguda en niños con o sin EDA.

Del total de las muestras analizadas, 30,1% fueron positivas para algún agente viral,

14,7% identificados como NoV, 3,8% fueron NovGI y 10,9% NovGII, seguido de RoV

y SaV, cada uno en 5,1%, AsV 3,2% y AdV en 1,7%. Este es el segundo reporte

realizado sobre la detección simultánea de diferentes agentes virales por técnicas

moleculares, en la población menor de cinco años en Bucaramanga y su área

metropolitana en Santander, Colombia.

De forma general en este estudio, NoV fue identificado con una prevalencia de 14,7%

considerándose el agente viral más frecuente, a nivel mundial la prevalencia de este

virus oscila entre 6 al 19% (Mousavi et al., 2015). Los datos reportados de este estudio

son concordantes con las investigaciones realizadas a nivel mundial para determinar la

epidemiología de gastroenteritis asociada a infecciones mixtas y la prevalencia de NoV

en niños menores de cinco años. En Irán, de 170 muestras analizadas, 15 fueron

positivas para NoV, lo que equivale al 8,8% (Mousavi et al., 2015). Adicionalmente,

otros países como Brasil y Bolivia, han demostrado prevalencias más altas después de

la introducción de la vacuna para RoV, en 32,6% y 34,3% respectivamente (Portal et

al., 2016; McAtee et al., 2016). Los datos indican que después de la implementación

de la vacuna de RoV a nivel mundial se ha logrado la disminución de casos o la

severidad de otros, pero ha aumentado la prevalencia de las infecciones causadas por

NoV.

En Qatar, muestras de materia fecal de personas de diferentes grupos de edad,

procesadas mediante qPCR, evidenciaron a NoV en 12,2% de los niños menores de 1

año y 20,7% entre las edades de 1 a 10 años (AlThani et al., 2013). Estos datos son

mayores en frecuencia que los de este estudio, pero menores a los reportados por Huhti

et al., 2011 en Finlandia, durante los años 2000 al 2002. En ese trabajo NoV fue

detectado en 192 de 485 episodios de gastroenteritis de 405 niños. En Colombia, un

estudio realizado en el año 2009, para determinar la prevalencia de NoV, evidenció

que al igual que en este estudio, NoV, fue el principal agente diarreagénico identificado

en dos regiones Colombianas, Bogotá en 9% y el Chocó con el 8%, seguido de las

infecciones por RoV (Fernández et al., 2015). Los resultados de estos trabajos son

variables indicando que el número de identificaciones dependen del número de

pacientes incluidos, las técnicas utilizadas, el área geográfica y factores del huésped.

A pesar de la alta prevalencia de NoVs, sólo una pequeña parte se confirma mediante

pruebas de laboratorio. El corto curso de la infección y la dificultad para disponer de

procedimientos diagnósticos adecuados hacen que la enfermedad sea subvalorada. En

los últimos 15 años, la disponibilidad de métodos diagnósticos moleculares sensibles

como RT-PCR han permitido esclarecer el papel etiológico de diferentes agentes

virales, principalmente el de NoV (Lopman 2006; Glass, 2000).

Discusión

72

El género NoV está clasificado en 7 genogrupos (GI-GVII), subdivididos en 41

genotipos. Siendo GI, GII y GIV implicados en las infecciones de los humanos (Vinjé

el at., 2015). El genotipo GII.4 es el más frecuente en los casos esporádicos y de brotes

de EDA a nivel mundial, tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo

(Vinjé el at., 2015; Vega et al., 2014; Fu et al., 2014).

En este trabajo se identificaron los dos genogrupos NoVGI, NoVGII y los genotipos

más prevalentes relacionados con brotes a nivel mundial, mediante métodos

moleculares y filogenéticos. NoV se detectó en 21,7% (88/405) de los casos y 7,9% de

los controles (32/405), con resultados similares a los obtenidos en Brasil en una

población de niños con y sin diarrea, mayores de 3 años de edad, en los que la carga

viral fue cuantificada por qPCR y al igual que en este estudio los virus también fueron

genotipificados. Este agente viral tuvo prevalencias del 17% (40/229) en niños

sintomáticos y 13% (12/90) en asintomáticos, respectivamente (Barreira et al., 2010).

En Zanzíbar, Tanzania, NoVGII fue el agente más correlacionado en los casos de EDA

en un 17,1%, a diferencia del 4,1%, en los controles, presentado una tasas de detección

global de 19%, el 20% de casos y el 2,4% de controles (Elfving et al., 2014).

El genotipo de NoVGI, ha sido más relacionado en la ruta de transmisión por

alimentos, a diferencia del genotipo GII, que es de persona a persona (Verhoef et al.,

2015). De acuerdo a los genotipos se puede reconocer la vía de transmisión de estas

infecciones.

Los análisis filogenéticos de este estudio demostraron que el genotipo de NoVGI con

mayor frecuencia fue GI.2 con 70,9%, relacionado con cepas que han estado presentes

en Southampton/Inglaterra, China, Bélgica/Europa y Rusia, seguido de GI.1, GI.3 y

GI.5 en 29%, 3,2% y 12,9%, respectivamente. Dos muestras identificadas como

NoVGI presentaron 2 genotipos diferentes una GI.1/GI.2 y la otra GI.2/GI.5. El

genotipo de NoVGII con mayor identificación fue GII.4 con 56%, genéticamente

correlacionadas con genotipos identificados en Australia, USA, Taiwan, y

Southampton/Inglaterra. Los otros genotipos en menor proporción identificados

fueron GII.3, GII.5, GII.6, GII.7, GII.9, GII.13, GII.14 y GII.17 (1,09%, 5,4%, 7,6%,

2,1%, 2,1%, 4,3%, 20,8%, 1,09%, cada uno). Según los datos a nivel mundial,

actualmente NoVGII, está presente en un 89% de los casos, a diferencia de un 11% de

NoVGI, principalmente NoVGI.1 (Vega et al., 2014). En Estados Unidos, se ha

demostrado que los brotes causados por alimentos están relacionados con los genotipos

GI.3, GI.6, GI.7, GII.3, GII,4, GII.6 y GII.12 (Verhoef et al., 2015). Observándose

circulación de estas cepas también en Santander.

Diferentes estudios han demostrado la epidemiología y la distribución de estos

genotipos a nivel global, datos que son congruentes con los encontrados en esta

investigación. Según lo reportado por Portal et al., 2016, NoVGII fue el principal

agente viral en EDA y mediante genotipificación se demostró la clasificación de

alguno de los genotipos en GII.3 (n=1), GII.4 (6), GII.5 (1), GII.7 (2), GII.12 (1) y

GII.16 (1). Evidenciando que el genotipo más frecuente fue el GII.4.

Discusión

73

Adicionalmente, en una cohorte de 373 niños de la India, aproximadamente en un

tercio de los niños, se asoció la presencia de diarrea a la infección con NoV. Los

genotipos circulantes de NoV fueron GI.3 y GII.4 en 40,3% y 53,0% respectivamente.

En otro estudio realizado en niños menores de cinco años, con gastroenteritis en Hanoi,

Vietnam, el genotipo más prevalente de NoVGII fue GII.4 en 93%, seguido de otros

menos identificados como GII.3 (4,4%), GII.13 (1,7%), GII.2 (0,6%). No se

identificaron cepas de NoVGI (Trang et al., 2012). La alta incidencia de estos

genotipos en la población infantil indican la necesidad de la implementación de

estudios sobre la caracterización adicional de las cepas, la infección asintomática, la

excreción y la respuesta inmune para mejorar, la comprensión de la infección por

norovirus (Menon et al., 2016).

Aunque varios genotipos pueden cocircular en la comunidad, las cepas GII.4 han sido

responsables de la mayoría de los brotes desde mediados de 1990, estudios recientes

han demostrado que las cepas GII.4 han evolucionado con el tiempo en nuevas

variantes emergentes (Constantini et al., 2010). Numerosos estudios realizados a nivel

mundial para determinar la prevalencia de NoV, han relacionado las infecciones

causadas por este virus con el mayor porcentaje de EDA, debido en gran parte a la

reducción de las infecciones por RoV, por implementación de la vacuna.

Estudios a nivel mundial como los reportados por Chieochansin et al., 2015 en

Thailand, Azaran et al., 2016 en Iran, Hassan et al., 2013 en Bangladesh, señalan a

RoV como el principal agente causal de diarrea en niños menores de cinco años. Este

virus presenta una alta variabilidad genética. Entre los grupos de importancia clínica

se encuentra, el grupo A, relacionado con EDA en niños, el grupo B, implicado

principalmente en casos de EDA en adultos.

Las infecciones de RoV oscilan entre el 28% y el 50% (Azaran et al., 2015). RoV, en

nuestros resultados fue el segundo agente viral identificado con 5,1%, por ELISA y en

50% de estos se les identificaron los dos genotipos VP4 y VP7. Estos datos fueron

menores comparados con el 43% identificado en Bogotá, entre abril de año 2000 y

febrero de 2001, en niños menores de cinco años (Cáceres et al. 2005), lo que evidencia

una buena efectividad de la vacuna en estas poblaciones, luego de su introducción en

todo el territorio nacional.

Otras investigaciones realizadas en diferentes regiones Colombianas, han evidenciado

la presencia de RoV. En Bogotá y Chocó 5,5 % de RoV estaban presentes en las

infecciones, en niños con o sin diarrea. A diferencia de lo encontrado en nuestros datos,

en un estudio descriptivo transversal realizado en Bucaramanga, para la identificación

de la prevalencia de agentes patógenos comunes asociados con EDA, en niños menores

de cinco años, se encontró la presencia de RoV, en 44,4%, como principal agente

causante de episodios de diarrea. Cabe resaltar que este estudio no tuvo en cuenta otros

agentes virales relacionados con EDA (Yepes et al., 2009).

Es importante resaltar que las infecciones causadas por RoV son más graves que las

causadas por NoV, pero en la actualidad con la presencia de la vacunación han

disminuido las infecciones, sin embargo se han subestimado las infecciones

gastrointestinales por NoV (Donaldson et al., 2008, Fernández et al. 2015).

Discusión

74

En América Latina entre los años 2003 al 2005 se evaluó la eficacia de la vacuna

(Rotarix), suministrada en diferentes países, determinándose que ningún niño de la

cohorte vacunada tuvo más de un episodio de gastroenteritis grave por RoV, durante

los 2 años de seguimiento, por el contrario la incidencia de gastroenteritis grave en el

grupo placebo fue mayor. Aunque mayor frecuencia de RoV se evidenció en los casos,

que en los controles (Paternina et al., 2015). En este estudio todos los niños clasificados

como casos habían sido vacunados con al menos una dosis y dos de los controles no

habían sido vacunados, lo cual indica que no fueron protegidos contra la infección.

Resaltando que la vacuna disponible en Colombia es Rotarix, vacuna basada en la cepa

atenuada G1P8.

Los genotipos de RoV que identificamos fueron clasificados de acuerdo al genotipo.

Para VP4 se identificó P[8] (91,5%) y P[4] (16,6%). Los genotipos VP7, fueron G12

(62,5%), G9 (29,1%) y G2 (8,3%). Las cepas tanto con VP4 como VP7 fueron G12P[8]

en 62,5%, seguido de 29,1% de G9P[8] y 8,3% para G2P[4]. Esto fue similar a lo

observado en los aislados de muestras clínicas de niños con EDA en la unidad de

cuidados hospitalarios de Riyadh, en Arabia, Saudita. Entre 2011 a 2012, el genotipo

VP4, que mostraron el 96,7% eran los genotipos P[8], seguido de 2,6% P[4] y 0,66%

P[6], sin embargo 11,7% de las muestras no fueron tipificables. En el genotipo VP7 se

identificó, GI en 61,7%, G2 en 5,5%, 3,9% G3, 3,9% G4, 18,8% G9, 6,3% G12 y el

25,1% no se genotipificaron. Las cepas con los dos genotipos fueron G1P [8] (61,9%),

G9P [8] (16,8%), G12P [8] (6,2%), G3P [8] (4,4%), G4P[8] (3,5), G2P [8] (2,6%),

G2P [4] (2,6%), G1P [4] (0,88%) y G12P [6] (0,88%) (Aly et al., 2015).

Las cepas circulantes a nivel mundial incluyen G1P[8], G2P[4], G3P[8], G4P[8] y

G9P[8], relacionadas con un 80% a 90% en las infecciones RoV, siendo estas cepas

las identificadas también en nuestro estudio (Aly et al., 2015; Pelaez et al., 2014).

En los años 2002 y el 2003, en Colombia los genotipos de RoV que circularon fueron

G1P[8], G2P[4] y G3P[8], cepas que también fueron identificadas en este estudio

(Urbina et al., 2008). En Bogotá el genotipo G1P8 en 36,9%, 18,4% en Cali y 14% en

Facatativá. Sin embargo, en la región Atlántica se han encontrado en menor

proporción, con 5,3% en Cartagena y 4,1% en Barranquilla. Otro estudio realizado

entre los años 2008 al 2012, realizado en la vigilancia activa de las cepas presentes

antes y después de la introducción de la vacuna de RoV, demostró que el genotipo G2

fue el más prevalente en 54%, seguido de G9 (14%) y entre el P el genotipo P[4] fue

el más prevalente en 47%, seguido de P[6] en 27% y P[8] en 10%. Siendo G2P4, la

cepa que cocirculó antes y durante la introducción de la vacuna, destacando que su

prevalencia fue disminuyendo desde el 2008 al 2012 entre 47% a 32% (Pelaez et al.,

2014). Después de la introducción de la vacuna de RoV, la prevalencia de infección

ha disminuido, al igual que la severidad. Sin embargo, se observan diversos genotipos

circulando en las poblaciones pediátricas.

Los otros agentes virales que se identificaron en este estudio fueron SaV, AsV y AdV

con una frecuencia de 5,1%, 3,2% y 1,7%, respectivamente. Estos datos son

concordantes con lo reportado globalmente, donde son menos frecuentes en las heces

de niños, sin embargo se han realizado otras investigaciones para su identificación

como las realizadas en Kenya, Africa, en el que se encontró a SaV en un rango de 4 a

Discusión

75

6%, seguido de AsV entre 3 al 8% (Shioda et al., 2016). En Francia, durante enero a

diciembre del 2007, se identificó AdV, AsV en 5% y 1,8%, respectivamente. A

diferencia de los porcentajes identificados en Holanda, AdV tuvo mayor prevalencia

con 9,9%, seguido de AsV con 6,0% y SaV en 0,4% (Van Maarseveen et al., 2010).

En Colombia, también han sido identificados estos agentes en las regiones de Tunja,

Boyacá, en el que el 3,61% de las muestras fueron positivas para AsV, con mayor

proporción del evento en pacientes de 1 a 4 años (Ramírez et al., 2014). En Cartagena

y Quibdó, se encontró una prevalencia global de 2,8% de AsV (Fernández et al., 2005).

Adicionalmente, AdV fue el virus menos prevalente en este trabajo, cuya prevalencia

fue de 1,7 %, similar a lo reportada por Urbina et al., 2008, en el que se identificó en

1,35%, en niños de las tres regiones Colombianas.

En las regiones Bogotá, Facatativá, Cartagena y Quibdó, durante el periodo

comprendido entre 1996 y el año 2002 se determinó la baja presencia, pero alta

importancia de la infección por estos virus (Urbina et al., 2008).

Los ensayos moleculares han sido de gran utilidad en la identificación de las causas de

enfermedad diarreica aguda, principalmente en las infecciones asintomáticas (Elfving

et al., 2014), estudios previos han demostrado que los métodos moleculares presentan

alta sensibilidad analítica comparados con las técnicas convencionales (Sinha et al.,

2013; Khamrin et al., 2011).

La detección temprana de los agentes virales en especial de NoV y RoV es crucial para

controlar la propagación de la enfermedad en los brotes, por eso es de vital importancia

el empleo de técnicas, que permitan el conocimiento de la etiología de la enfermedad

gastrointestinal (Costantini et al., 2010). Una gran variedad de técnicas se han

empleado en la identificación de agentes virales diarreagénicos, sin embargo los

ensayos RT-qPCR en combinación con análisis de secuencias, han dado lugar a una

mejor comprensión de la importancia de estos virus, en el impacto de la gastroenteritis

epidémica y una causa importante de gastroenteritis esporádica. Por lo que estas

técnicas presentan buena especificidad y sensibilidad, adicionalmente requieren de

menor cantidad de material genético para realizar la identificación (Costantini et al.,

2010; Khamrin et al., 2011; Sidoti et al., 2015).

En algunas regiones colombianas, los reportes que existen son fundamentados en la

identificación de agentes virales como NoV, RoV, AsV, AdV y pocos han sido

dirigidos al conocimiento de SaV. Para Santander este es el segundo informe de la

prevalencia de estos agentes virales, relacionados con la enfermedad diarreica aguda.

En esta investigación se identificaron 201 muestras con infección única y 20 con

infección múltiple, de las cuales 19 fueron causadas por dos clases de virus y solo una

muestra presentó infección triple (SaV, AsV y NoVGII). En el estudio de Yan et al.,

2003 se reportan infecciones únicas causadas por NoV, SaV y AsV en 42, 16 y 4 de

62 muestras positivas, respectivamente. Sin embargo, Román et al., 2003 muestra que

el agente más prevalente en su estudio fue RoV en 25 % seguido de 3 % AdV y AsV.

En este se evidenció la presencia de infecciones mixtas por RoV/AsV y RoV/AdV en

niños. Las coinfecciones son importantes en el diagnóstico y el tratamiento de

Discusión

76

pacientes con gastroenteritis, puesto que el intestino puede alojar una variedad de

patógenos, no solo virales sino parasitarios y bacterianos que ayudan a potenciar las

manifestaciones clínicas (Zhang et al., 2016).

Está claro que NoV y RoV tienen un gran impacto en las enfermedades diarreicas en

los niños, las coinfecciones con otros patógenos entéricos incrementan la gravedad de

la diarrea. Estos resultados deben servir de evidencia para los servicios de salud pública

en la planificación y desarrollo de programas de intervención (Zhang et al., 2016).

Las principales infecciones virales en este estudio, se presentaron en el sexo masculino

a diferencia en lo reportado en Colombia por el Sivigila durante este año,

principalmente se ha visto implicado el sexo femenino en un 55,1%.

El principal agente relacionado con los síntomas de diarrea, vómito, fiebre, dolor

abdominal fue NoV, siendo presente la diarrea en 93,0%. Estos datos concuerdan con

lo reportado por Patel et al. 2009.

En una cohorte de 373 niños de la India, se evidenció que de 1856 episodios de diarrea,

207 (11,2%), presentaron infección con NoV y de los 147 episodios de vómito sólo 30

(20,4%) fueron positivos para norovirus en las heces (Menon et al., 2016). El principal

síntoma identificado en RoV fue la diarrea en 92,5%, seguido de vómitos en 90%,

datos que se correlacionan con lo reportado a nivel mundial y nacional. En Brasil

según Neves et al., 2016, la diarrea fue la principal manifestación clínica en 93,6% y

luego vómitos en 59,6% de niños a quienes se les demostró infección por RoV. En

niños de la ciudad de Cartagena y Sincelejo con infecciones por RoV se observaron

episodios de vómitos y diarreas acompañados de fiebre y dolor abdominal (Urbina el

at. 2003).

Los virus identificados no presentaron un patrón de estacionalidad marcado durante el

año de estudio, puesto que se identificaron en todos los 18 meses. NoVGII, fue el único

virus en el que se observó mayor frecuencia durante los meses de junio a diciembre en

los casos. Es importante mencionar que durante esta temporada hubo mayor

recolección de muestras. A diferencia de lo reportado en la literatura en los países

desarrollados, las infecciones se correlacionan con los meses de invierno (Urbina et

al., 2003; Vinjé et al., 2015).

Conclusiones

77

6. CONCLUSIONES

En este estudio de casos y controles en niños menores de cinco años de

Bucaramanga se identificaron seis virus (NoVGI, NoVGII, SaV, AsV, AdV y

RoV), siendo NoV y RoV los virus más frecuentes.

El género NoV fue el más frecuente y presentó asociación estadísticamente

significativa con la EDA (p<0.01), el subtipo más común fue el NoV GI.2 y NoV

GII.4.

Rotavirus se identificó en 42 pacientes, 40 en los casos y 2 en los controles (p<0.01),

todos vacunados, lo que podría indicar que aunque la vacuna no confirió protección

contra la infección, sí disminuyó la severidad.

Los análisis de las secuencias de rotavirus en las dos bases de datos fueron

concordantes.

Se implementaron técnicas moleculares para la identificación de cinco virus

diarreagénicos, se determinaron los genogrupos de NoVGI, NoVGII y el género

RoV. Lo que permite evidenciar que los genotipos circulantes en Colombia no

tienen comportamiento similar a las de otros países.

La etiología de la diarrea aguda en niños varía en diferentes grupos de edad. La alta

frecuencia de la infección por virus diarregénicos sugiere la demanda urgente de

nuevo desarrollo de vacunas virales, al igual que el empleo de técnicas diagnósticas

moleculares.

Recomendaciones

78

7. Recomendaciones

Este es el segundo reporte realizado en el departamento de Santander, que permite el

conocimiento de la epidemiología de los agentes virales relacionados con EDA, en

niños menores de cinco años, que aporta bases para el progreso de investigaciones

futuras, direccionadas hacia disminución de estas infecciones, en la comunidad

pediátrica.

1. Divulgación de los datos, a las instituciones de salud participantes, para

concientizar no solo al personal de salud si no a la comunidad del impacto de

estos virus en la salud de la comunidad pediátrica.

2. Investigaciones futuras deben ser desarrolladas con el fin de recomendar la

implementación de técnicas rápidas para la identificación de los agentes virales

diarreagénicos.

3. Teniendo en cuenta que la prevalencia de NoV ha aumentado en los últimos

años y adicionalmente se identifica de forma frecuente en acientes sintomáticos

y asintomáticos, se recomienda realizar un estudio para determinar la

susceptibilidad de la infección por NoV, mediante búsqueda de receptores

celulares que permita el cocimiento de los factores que predisponen al

individuo a la infección. Esto ayudaría a implementar estrategias

farmacológicas y farmacocinéticas para el control de dicha enfermedad.

Referencias

79

7. REFERENCIAS

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312-323. doi: 10.1016/j.virol.2005.11.015

Zhirakovskaia, E. V., Tikunov, A. Y., Bodnev, S. A., Klemesheva, V. V., Netesov, S.

V., & Tikunova, N. V. (2015). Molecular epidemiology of noroviruses associated with

sporadic gastroenteritis in children in Novosibirsk, Russia, 2003-2012. J Med Virol,

87(5), 740-753. doi: 10.1002/jmv.24068

Referencias

99

Anexos

100

8. ANEXOS

ANEXO 1. Protocolo: Extracción de ARN.

Equipos Vortex vx-200 Labnet International Inc.

Centrifuga (Labnet C2500-R)

Reactivos y materiales Tubos eppendorf de 1.5ml

agua ultra pura DEPC (Dietilpirocarbonato) (Life Technologies, Carlsbad,

USA)

Micropipeta de 200 μl, 1000 μl.

Puntas de 20 μl, 200μl, 1000 μl.

Kit Viral QIAamp RNA mini.

Etanol (96 – 100%).

Procedimiento 1. Dilución 1:10 de las muestras de materia fecal:

1.1. En tubos eppendorf de 1.5 ml previamente marcados con el nombre de la

muestra, adicionar 1000 µl de agua DEPC, UltraPure DEPC-Treated Water.

1.2. Adicionar para las muestras que son liquidas 100 µl de Materia fecal y las que

son sólidas una cantidad equivalente a 1 gr de materia fecal.

1.3. Mezclar con vortex durante 15 segundos.

1.4. Centrifugar el mix durante 5 min a máxima revolución (13000 rpm).

1.5. Transferir el sobrenadante a un tubo eppendorf de 1.5ml limpio.

1.6. Descartar el pellet.

1.7. Realizar el paso 1.4.

1.8. Usar el sobrenadante para realizar la extracción de RNA.

2. Extracción de RNA viral mediante la utilización del kit QIAamp viral RNA

(QIAgen):

2.1 Pipetear 560 µl de buffer AVL preparado (contiene carrier ARN en un tubo 1.5

ml).

2.2 Adicionar 20 µl de Fago MS2 previamente preparado siguiendo el protocolo

MS2 Bacteriophage (ATCC15597 – B1).

2.3 Añadir 140 µl de sobrenadante de la dilución, al búffer AVL-carrier ARN en

el tubo de eppendorf. Mezclar en un vórtex durante 15 segundos.

2.4 Incubar a temperatura ambiente (15-25 ° C) durante 10 minutos.

2.5 Centrifugar brevemente el tubo para eliminar las gotas del interior de la tapa.

2.6 Añadir 560 µl de etanol (96-100%) a la muestra, y mezclar por un vórtex por

15 segundos. Después de mezclar, centrifugar brevemente el tubo para quitar

gotas del interior de la tapa.

2.7 Adicionar 630 µl de la solución de la etapa 5 a la columna QIAamp Mini (en

un tubo recolector de 2 ml) sin mojar el borde. Cerrar el tapón y centrifugar a

6.000 x g (8.000 rpm) durante 1 min. Colocar la columna QIAamp Mini en un

tubo recolector de 2 ml limpio, y desechar el tubo que contiene el filtrado.

2.8 Abrir cuidadosamente la columna QIAamp Mini, y repetir el paso 2.6.

Anexos

101

2.9 Abrir cuidadosamente la columna QIAamp Mini, y añadir 500 µl de Buffer

AW1. Centrifugar a 6000 x g (8.000 rpm) durante 1 min. Colocar la columna

QIAamp Mini en un tubo recolector limpio de 2 ml (suministrado por el kit), y

desechar el tubo que contiene el filtrado.

2.10 Abrir cuidadosamente la columna QIAamp Mini, y añadir 500 µl de Buffer

AW2. Centrifugar a toda velocidad (20.000 x g; 14.000 rpm) durante 3

minutos. Continuar directamente con el paso 2.11, o para eliminar cualquier

posibilidad de presencia de Buffer AW2, realice el paso 2.10, y después

continúe con el paso 2.11.

2.11 Recomendado: Colocar la columna QIAamp Mini en un nuevo tubo de

recolección de 2 ml (no incluido), y desechar el tubo con el filtrado. Centrifugar

a máxima velocidad durante 1 minutos.

2.12 Colocar la columna QIAamp Mini en un tubo de eppendorf de 1,5 ml limpio

(no suministrado). Deseche el tubo de extracción que contiene el filtrado. Abrir

cuidadosamente la columna QIAamp Mini y añadir 60 µl de buffer AVE

equilibrado a temperatura ambiente. Cerrar el tapón, e incuba a temperatura

ambiente durante 1 minutos. Centrifugar a 6000 x g (8.000 rpm) durante 1

minutos.

Anexos

102

ANEXO 2. Protocolo: Extracción de ADN.


Centrifuga (Labnet C2500-R).

Bloque seco (Labnet AccuBlock – Digital Dry Bath).

Reactivos y materiales Tubos eppendorf de 1.5ml, 2.ml.

agua grado molecular (Científica Senna, Mexico).

Micropipeta de 200 μl, 1000 μl.

Puntas de 20 μl, 200μl, 1000 μl.

Kit QIAamp RNA stool mini.

Etanol (96 – 100%).

Procedimiento 1. Dilución 1:10 de las muestras de materia fecal:

1.1 En tubos eppendorf de 1.5 ml previamente marcados con el nombre de la

muestra, adicionar 1000 µl de agua DEPC, UltraPure DEPC-Treated

Water.

1.2 Adicionar para las muestras que son liquidas 100 µl de Materia fecal y las

que son sólidas una cantidad equivalente a 1 gr de materia fecal.

1.3 Mezclar con vortex durante 15 segundos.

1.4 Centrifugar el mix durante 5 min a máxima revolución (13000 rpm).

1.5 Transferir el sobrenadante a un tubo eppendorf de 1.5ml limpio.

1.6 Descartar el pellet.

1.7 Realizar el paso 1.4.

1.8 Usar el sobrenadante para realizar la extracción de ADN.

2. Extracción de ADN viral mediante la utilización del kit QIAamp viral RNA

(QIAgen):

2.1 Transferir 200 μl del sobrenadante de la dilución a un tubo eppendorf de

2ml.

2.2 Adicionar 1400 μl de buffer ASL a cada muestra. Llevar al vortex

cuidadosamente durante 1 min hasta que la muestra quede totalmente

homogénea.

2.3 Incubar la suspensión por 5 minutos a 70°C, en bloque seco.

2.4 Mezclar en vortex durante 15 segundos y centrifugar la muestra a alta

velocidad durante 1 minuto para sedimentar las partículas de las heces.

2.5 Pipetee 1.200 µl del sobrenadante en un nuevo tubo eppendorf de 2.0ml

(no proporcionado) y descarte le pellet.

Nota: los tubos de 2ml usados deben ser suficientemente amplio para

acomodar la tableta InhibitEX. Transferir una pequeña cantidad del pellet

no afectara el procedimiento.

2.6 Adicionar 1 tableta InhibiteX a cada muestra y mezclar con vortex

inmediatamente durante 1 minuto hasta que la tableta este totalmente

suspendida. Incubar la suspensión durante 1 minuto a temperatura

Anexos

103

ambiente para dejar que los inhibidores se absorban en la matrix

InhibitEX.

2.7 Centrifugue la muestra a alta velocidad durante 3 minutos para ligar los

inhibidores del pellet a la matrix InhibitEX.

2.8 Pipetee todo el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf de 1.5 ml (no

proporcionado) y descarte el pellet. Centrifugue la muestra a alta

velocidad por 3 minutos.

2.9 Pipetee 15 μl de proteinasa K en un nuevo tubo de microcentrifuga de 1.5

ml (no proporcionado).

2.10 Pipetee 200 μl del sobrenadante obtenido en el paso 2.8 al tubo

eppendorf de 1.5 ml que contiene proteinasa k.

2.11 Adicionar 200 μl de buffer AL y llevar al vortex durante 15 seg.

Nota: no adicionar proteinasa k directamente al buffer AL. Es esencial

que la muestra y el buffer AL sean mezclados homogéneamente.

2.12 Incubar a 70°C durante 10 minutos. Centrifugue brevemente para

remover las gotas de la tapa (este es opcional).

2.13 Adicione 200 μl de etanol (96 -100%) para la lisis, y mezclar por vortex

rapidamente. Centrifugue brevemente para remover las gotas de la tapa

(este es opcional).

2.14 Rotule la tapa de una mini columna QIAamp y colóquela en un tubo.

Agregar cuidadosamente el lisado completo de la etapa 2.13 a la columna

de centrifugación QIAamp sin humedecer el borde. Cerrar la tapa y

centrifugar a máxima velocidad durante 1 min. Colocar la columna de

centrifugación QIAamp en un nuevo tubo de de 2 ml y desechar el tubo

que contiene el filtrado.

2.15 Cerrar la columna cada paso con el fin de evitar la formación de

aerosoles durante la centrifugación. Si el lisado no ha pasado

completamente a través de la columna después de la centrifugación,

centrifugar de nuevo hasta que la columna de centrifugación QIAamp este

vacía.

2.16 Abrir cuidadosamente la columna QIAamp y agregar 500 μl de buffer

AW1. Cerrarla y centrifugar a alta velocidad durante 1 minuto. Colocar la

columna de QIAamp en nuevo tubo de 2 ml y descartar el tubo que

contienen el filtrado.

2.17 Abrir cuidadosamente la columna QIAamp y agregar 500 μl de buffer

AW2. Cerrarla y centrifugar a alta velocidad durante 3 minutos. Colocar

la columna de QIAamp en nuevo tubo de 2 ml y descartar el tubo que

contienen el filtrado.

2.18 Recomendado: Colocar la columna de centrifugación QIAamp en un

nuevo tubo de de 2 ml (no proporcionado) y deseche el tubo con el

filtrado. Centrifugar a máxima velocidad durante 1 min. Este paso ayuda

a eliminar los residuos del buffer AW2.

2.19 Transferir la columna de centrifugación QIAamp, con la etiqueta a un

tubo eppendorf de 1.5 ml (no se incluyen). Abrir cuidadosamente la

columna de centrifugación QIAamp y pipetear 200 μl Buffer AE

directamente sobre la membrana QIAamp. Cierre la tapa e incube durante

1 min a temperatura ambiente, a continuación centrifugue a máxima

velocidad durante 1 min para eluir el ADN.

Anexos

104

ANEXO 3. Protocolo: Reacción en Cadena de la Polimerasa

Transcripción Reversa en Tiempo Real (RT-qPCR) múltiple.


Centrífuga (Labnet C2500-R).

Termociclador CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad,

Hercules, California, USA).

Reactivos y materiales Tubos eppendorf de 0.2ml, 1.5ml.


Micropipeta de 2μl, 20 μl, 200 μl, 1000 μl.

Puntas de 10μl, 20μl, 200μl, 1000 μl.

kit One-Step RT- PCR (TaqMan® Life Technologies, Carlsbad, USA).

Procedimiento RT-qPCR múltiples para ARN de Norovirus GI – GII y Sapovirus – Astrovirus.

1. Limpiar el área de trabajo, mantener los reactivos en hielo hasta su uso,

agitar los primers y las sondas durante 5 segundos, realizar spin para

eliminar burbujas de aire.

2. Realizar el master mix en un tubo eppendorf de 1.5ml usando los reactivos

del protocolo Ag - path one - step RT-PCR kit (TaqMan® Life

Technologies, Carlsbad, USA) de acuerdo a la tabla.

Sapovirus/Astrovirus Norovirus GI/GII

Componente Volumen (µl) Componente Volumen (µl)

2X RT-PCR

buffer 12.5

2X RT-PCR

buffer 12.5

Agua libre de

nucleasas

grado biología

molecular.

2.5

Agua libre de

nucleasas grado

biología

molecular.

1.08

AsFF (10 μM)

0.6 Detector enhancer 1.67

AsFR (10 μM)

0.6 Cog 1F (10 μM) 1

AstZFB (10 μM)

0.25 Cog 1R (10 μM) 1

SaV 124F (10

μM) 1.0 Ring 1E (10 μM) 0.5

SaV 1F (10 μM) 1.0 Cog 2F (10 μM) 1

SaV 5F (10 μM) 1.0 Cog 2R(10 μM) 1

SaV 1245R (10

μM) 1.0 Ring 2 (10 μM) 0.5

SaV124TP (10

μM) 0.25 MS2.F (10 μM) 0.25

SaV 5TP (10 μM) 0.25 MS2.R (10 μM) 0.25

Anexos

105

25 X Enzima RT-

PCR 1

MS2.P 0.25

25 X Enzima RT-

PCR 1

3. Determinar el número de reacciones por ensayo:

Si el número de muestras incluidas son de 1 a 14, se recomienda hacer

una reacción más.

Si el número de muestras incluidas son más de 15, se recomienda

preparar el master mix para dos muestras más.

4. Adicionar 22 μl de master mix en cada pozo de las placas de PCR de 96

pozos.

5. Adicionar 3 μl de agua libre de RNasas, a los controles negativos NTC.

6. Adicionar 3 μl de RNA de cada muestra en cada pozo.

7. Centrifugar para eliminar burbujas de aire, durante 1min a 2.500 rpm a 4

°C.

8. Seguir condiciones de amplificación usando el termociclador CFX96

Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules,

California, USA).

RT-qPCR múltiples para ADN de Adenovirus:

1. Limpiar el área de trabajo, mantener los reactivos en hielo hasta su uso,

agitar los primers y las sondas durante 5 segundos, realizar spin para

eliminar burbujas de aire.

2. Realizar el master mix en un eppendorf usando los reactivos del

protocolo Ag - path one - step RT-PCR kit (TaqMan® Life Technologies,

Carlsbad, USA) de acuerdo a la tabla.


2X RT-PCR buffer 12,5

Agua libre de nucleasas 4,33

Detección Enhancer 1,67

JTVFF (10 μM) 1

JTVFR (10 μM) 1

JTVFAP (10 μM) 0,5

25X RT-PCR enzima 1

Total 22

3. Determinar el número de reacciones por ensayo:

Si el número de muestras incluidas son de 1 a 14, se recomienda hacer

una reacción más.

Ciclos Tiempo Temperatura (°C)

1 10 min 45

1 10 min 95

45 (Norovirus)

40 (Sapovirus -

Astrovirus)

15 sec 95

1 min 60

Anexos

106

Si el número de muestras incluidas son más de 15, se recomienda

preparar el master mix para dos muestras más.

4. Adicionar 22 μl de master mix en cada pozo de las placas de PCR de 96

pozos.

5. Adicionar 3 μl de agua libre de RNasas, a los controles negativos NTC.

6. Adicionar 3 μl de RNA de cada muestra en cada pozo.

7. Centrifugar para eliminar burbujas de aire, durante 1min a 2.500 rpm a 4

°C.

8. Seguir condiciones de amplificación usando el termociclador CFX96

Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules,

California, USA).

Ciclos Tiempo Temperatura (°C)

1 10 min 45

1 10 min 95

40 15 sec 95

1 min 60

Anexos

107

ANEXO 4. Protocolo: Protocolo Transcripción Reversa (RT) RNA de Norovirus

GI/GII con el kit AB High Capacity cADN Reverse Transcription.



Termociclador C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad, California, USA).

Reactivos y materiales Tubos eppendorf de 0.2ml, 1.5ml.




kit AB High Capacity cADN Reverse Transcription (TaqMan® Life

Technologies, Carlsbad, USA).

Procedimiento 1. Preparar el master mix siguiendo las instrucciones en la siguiente tabla,

mantener todos los reactivos en hielo.

Componentes Volumen (µl)

10x RT buffer 2

25x dNTP MIX (100mM) 0,8

10x RT random primers 2

Reverse transcriptase 1

Rnase inhibitor 1

Nuclease-free water 3,2

Total 10

2. Pipetear 10 µl de master mix en cada pozo de la placa de PCR con 96 pozos.

3. Pipetear 10 µl de RNA de las muestras en cada pozo. Pipetear de arriba abajo

dos veces para mezclar.

4. Cerrar los tubos.

5. Realizar spin a los tubos para eliminar burbujas de aire.

6. Mantener en hielo la placa con los tubos hasta que se inicie el proceso en el

termociclador C1000 Touch Thermal Cycler.

7. Condiciones de los ciclos:

Paso 1 Paso 2 Paso 3 Paso 4

Temperatura 25 °C 37 °C 85 °C 4 °C

Tiempo 10 min 120 min 5 min ∞

Anexos

108

ANEXO 5. Protocolo: Purificación del producto de PCR con el kit QIAquick PCR

purification.



Reactivos y materiales Tubos eppendorf de 1.5ml.



kit QIAquick PCR purification (QIAgen)

Procedimiento 1. Adicionar 5 volúmenes de buffer PB a un volumen de reacción de PCR y

mix.

2. Transferir el mix anterior columna (suministrada en el kit.

3. Centrifugar durante un minuto a máxima revolución

4. Descartar el volumen del tubo recolector

5. Adicionar 750μl de buffer PE a la columna.

6. Centrifugar durante 1 minuto a máxima revolución.

7. Descartar el volumen del tubo recolector.

8. Centrifugar nuevamente por un minuto.

9. Transferir la columna a un tubo eppendorf de 1.5ml.

10. Adicionar 50 µl eluyente para ADN (buffer EB)

ANEXO 6. Protocolo: Polymerase Chain Reaction (PCR) convencional de la

región C, Norovirus.







Go Taq G2 Hot start Green master mix (Promega, Madison, USA)

Procedimiento 1. mantener limpio el área de trabajo.

2. Alistar los tubos eppendorf de 0.2µl.

3. Preparar el master mix en tubos eppendorf de 1.5ml.

4. Realizar el master Mix con Go Taq G2 Hot start Green master mix, PCR

supermix (Invitrogen), como se describe en la tabla.

Anexos

109


Green mix 25

Primer forward 2

Primer reverse 2

Agua 18

cADN 3

Total 50

5. Usar el termociclador C1000 Touch Thermal Cycler con las siguientes condiciones

de ciclado. Ciclos Tiempo Temperatura

1 3 min 94 °C

40

30 seg 94 °C

30 seg 50°C

1 Seg 72 °C

1 7 min 73 °C

6. Visualizar los productos de PCR mediante electroforesis en geles de agarosa al 2

% durante 25 minutos a 200 voltios y 300 amp. Estos deben ser visualizados con

Sybr Safe (Invitrogen) bajo luz UV.

Anexos

110

ANEXO 7. Protocolo: Protocolo de clonación.






kit QIAquick PCR purification Kit (QIAgen, Valencia, USA)

vector p-GEM (Promega, Madison, USA)

Medio y caldo Luria Bertani

Ampicilina

Procedimiento

1. Purificación del producto de PCR

1.1 Del producto de PCR realizar Purificación del producto de PCR, como el anexo

5.

2. Ligación en el vector p-GEM

2.1 cuidadosamente centrifugar los tubos que contiene el vector PGEM-T, control

del ADN y buffer de ligación.

2.2. Preparan las reacciones adicionando a un tubo de PCR de 0,2 ml, según

reactivos presentes en la tabla.

Reactivos

Reacción

muestras µl

Control

positivo

µl

Control

negativo

µl

2X Buffer ligación rápida, T4 ADN

ligasa

5 5 5

Vector pGEM-T (50ng) 1 1 1

Producto de PCR 3 - -

ADN control inserto - 2 -

T4 ADN ligasa (3 Unidades/µl) 1 1 1

Volumen final de agua deshionizada 10 10 10

2.3 Las reacciones se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente.

3. Transformación.

3.1 Mantener todos los tubos eppendorf en hielo

3.2 Del producto de incubación, adicionar 5µl, a cada tubo eppendorf

3.3 Adicionar al mismo tubo 100 µl de células competentes.

3.4 Incubar durante 20 minutos,

3.5 Transferir los tubos a agua con una temperatura de 42 °C durante 2 minutos.

3.6 Transferir los tubos nuevamente a hielo durante 5 minutos

3.7 Adicionar 950 µl de medio caldo súper óptimo con la represión catabólica

(Presencia de Glucosa) SOC de (Invitrogen, Carlsbad, USA).

3.8 Incubar durante 1 hora 37 °C en agitación 150 r.p.m.

3.9 Transferir 100 µl de este contenido anterior a cajas de Petri que contengan medio

Luria Bertani (LB) más ampicilina a 100 mg /ml.

https://en.wikipedia.org/wiki/Catabolite_repression

Anexos

111

3.9 Incubar las cajas durante toda la noche a 30 °C.

3.10 Al día siguiente, observar las colonias de color blanco crecidas en las cajas de

Petri.

3.11 Cultivar las colonias crecidas en un nuevo medio LB.

3.12 Incubar toda la noche.

3.13 Al siguiente día realizar extracción de material genético, adicionando una colonia

a 20 µl de agua grado molecular.

3.14 Transferir estos tubos al termociclador a una temperatura de 100 °C durante 5

minutos, pasado este tiempo centrifugar durante 2 minutos, finalmente transferir los

tubos a hielo durante 5 minutos para proceder con la PCR.

4. PCR para visualización del inserto

4.1 En un tubo de PCR adicionar 12.5 µl Green mix, 1 µl primer forward, 1 µl primer

reverse, 9.5 agua y 1 µl de ADN con las condiciones de la PCR convencional tabla.

Ciclos Tiempo Temperatura

1 3 min 94 °C

40

30 seg 94 °C

30 seg 50°C

1 Seg 72 °C

1 7 min 72 °C

4.2 Visualizar, el producto en gel de agarosa al 2 %.

4.3 cultivar las colonias originales que contienen las muestras, en caldo LB más

ampicilina, toda la noche en agitación a 150 r.p.m.

Anexos

112

ANEXO 8. Protocolo: Extracción del plásmido.






kit QIAprep Spin Miniprep (QIAgen, Canada, USA).

Procedimiento

1. Resuspender el pellet de la bacteria E. coli clonada crecida en 250 µl de buffer P1.


3. Adicionar 250 µl de buffer p2, invertir los tubos de 4 a 6 veces.

4. Adicionar 350 µl de buffer N3, realizar inversión de 4 a 6 veces.

5. Centrifugar por 10 minutos a 13.000 r.p.m.

6. Transferir este contenido a una columna suministrada por el kit.

7. Centrifugar durante 30 a 60 segundos.

8. Descartar el residuo.

9. Lavar la columna con 500 µl buffer PB.

10. Centrifugar durante 1 minuto.

11. Lavar nuevamente con 750 µl buffer PE.

12. Centrifugar nuevamente.

13. Transferir la columna a un tubo eppendorf de 1.5 ml nuevo, para eludir la muestra,

adicionando 50 µl de buffer EB.


15. El ADN a una concentración 100 ng/µl que se obtenga sera enviado a

secuenciación a GENEWIZ con los primers seleccionados del plásmido. Forward:

5´-(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)-3´ y reverse: 5´-

(TCACACAGGAAACAGCTATGAC)-3´.

Anexos

113

ANEXO 9. Protocolo: Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) para la

identificación de Rotavirus



Espectrofotómetro.




AccuDiag™ Rotavirus (Fecal) ELISA Kit (Diagnostic Automation®,

Calabasas, USA).

Procedimiento

1. Romper el número de pozos necesarios (número de muestras más dos pozos para

los controles).

2. Añadir 100 μl de control negativo para el pozo 1 y 100 μl de control positivo para

el pozo 2 (sin diluir).

3. Añadir 100 μl de sobrenadante de las heces a las pruebas adecuadas.

4. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos, luego lave.

5. Añadir 2 gotas de reactivo 1 (solución de azul) a cada pocillo.


7. Añadir 2 gotas de reactivo 2 (solución de color rojo) a cada pocillo.


9. Añadir 2 gotas cromógeno a cada pocillo.

10. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.

11. Añadir 2 gotas de solución a cada pocillo.

12. Lea los resultados visualmente o en un espectrofotómetro mediante una lectura

bichromatica, con la absorbancia establecidas a 450nm y 620-650 nm.

El lavado consistirá en utilizar el tampón de lavado diluido para cubrir a la parte

superior de cada pozo, la agitación y recarga de los pozos en un total de 3 veces.

Evitar la generación de burbujas en los pozos durante el paso de lavado. Controles

deben incluirse cada vez que el kit se ejecuta.

Interpretación de los resultados Visual

Reactiva: cualquier muestra bien distinta y que evidencia color amarillo.

No reactivo: cualquier muestra que no desarrolla color amarillo.

Anexos

114

ANEXO 10. Protocolo: PCR para la identificación de rotavirus







Go Taq G2 Hot start Green master mix (Promega, Madison, USA)

Procedimiento 1. mantener limpio el área de trabajo.

2. Alistar los tubos eppendorf de 0.2µl.

3. Preparar el master mix en tubos eppendorf de 1.5ml.

4. Realizar el master Mix con Go Taq G2 Hot start Green master mix, PCR

supermix (Invitrogen), como se describe en la tabla.


Green mix 25

Primer forward 2

Primer reverse 2

Agua 18

cADN 3

Total 50

5. Usar el termociclador C1000 Touch Thermal Cycler con las siguientes condiciones

de ciclado.

Condiciones del ciclado VP4


1 10 min 95

35

1 min 94

1 min 50

1 min 72

1 10 min 73

Condiciones del ciclado VP7


1 10 min 95

40

1 min 94

3 min Gradiente 45 a 65

1 min 72

1 10 min 73

Anexos

115

6. Visualizar los productos de PCR mediante electroforesis en geles de agarosa al 2

% durante 25 minutos a 200 voltios y 300 amp. Estos deben ser visualizados con

Sybr Safe (Invitrogen) bajo luz UV.

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