UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA

18 Avenida 1 1-95. Zona 15. V.H. III Aparîado Postal No. 82.01901 Guatemala . Guatemala, C.A.

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36444-92 al 97 FAX 502-364-02-12

Guatemala, 14 de enero del 2000.

Licda. Rosa Maria Amaya Coordinadora FONACYT Consejo Nacional de Ciencia

Y Tecnologia 3a. avenida 13-28 zona 1 Guatemala, Guatemala

PROYECTO: "Marcadores moleculares en Plasmodium vivax asociados con resistencia a cloroquina y recurrencias". No. 12-97

Estimada Licda Amaya:

Atentamente me dirijo a usted para presentarle el Informe Técnico Final del proyecto arriba mencionado. De acuerdo con su solicitud, le adjunto el document0 original, tres copias y una copia en diskette (format0 Word 97).

Sin otro particular, agradezco su amable atencion.

Licda. celiacordon de Rosaies---) lnvestigadora Principal

CC: Ing. lleana Cobar, CONCYT Ing . Miguel Angel Cang a-Arg uelles, Decano l INV Licda. Ma. Eugenia Lopez, IINV-UVG

1. DATOS GENERALES DEL PROYECTO

NOMBRE DEL PROYECTO: Marcadores moleculares en Plasmodium vivax asociados con resistencia a cloroquina y recurrencias No. 12

UNIDAD EJECUTORA: Centro de Estudios en Salud Universidad del Valle de Guatemala

INS'TITUCIONES COLABORADORAS: Medical Entomology Research and Training UnitIGuatemala- MERTUG Division de Enferemedades Parasitarias Centros para el control y prevencion de Enfermedades de los Estados Unidos, US CDC

EQUIPO DE INVESTIGACION:

0

2. INTRODUCCION:

2.1 Resistencia a cloroqi~ina en Plasmodium vivax y sus implicaciones en salud para Guatemala.

FLIENTE FlNANClAMlENTO UVGIMERTUG

FONACYT FONACYT

UVGIMERTUG

UVGIMERTUG

FONACYT

Situacion de la malaria en Guatemala En Guatemala, un 35% de la poblacion total habita en areas donde se transmite

la malaria. Los datos del Ministerio de Salud para 1998 reportan 47,689 casos, los cuales representan unicamente un 25 % de los casos circulantes bajo condiciones optimas de vigilanciai, dentro del sistema operante. Para este afio las infecciones con Plasmodium vivax representaron un 95% mientras que las infecciones con P. falciparum y las asociadas representaron un 5%. Mientras que los reportes oficiales indican un aumento del 49% con relacion al ano anterior, se reconoce que la situacion es alarmante aun mas que Io aparente ya que el deterioro actual del sistema de vigilancia no permite estimar de fornia exacta la magnitud del problemaii). El examen de muestras de sangre en gotas gruesas (eslabon fundamental en la cadena de

NOMBRE

Celia Cordon- Rosales, Lcda. Norma Padilla, PhD Renata de Cabrera, Lcda Julio Lopez

Juan Garcia

Trabajadores locales ,

PUESTO

lnvestigadora principal Co-investigadora lnvestigadora asistente Técnico de campo Técnico de campo jornaleros ,

DEDlCAClON Hora-mes

2

3 6

8

8

16

TIEMPO meses

12

12 9

4.5

4.5

9 ,

vigilancia) ha disminuido en mas de un 40%, de manera semejante a otros paises del areaiii pero este factor es despreciado al estimar la incidencia de la malaria en el paisiv.

Los resultados de estudios de campo realizados por MERl'UGICDC-UVG muestran que la incidencia ha ido en marcado aumento. Plasmodium falciparum, practicamente eliminado de Guatemala en el pasado, ahora representa hasta el 20% de la infecciones de malaria en estos sitios de estudio y el numero total de casos registrados ha aumentado en un 50% en un periodo de tres aiios; aiin cuando los sitios de estudios presentan una transmision estable y no de brotes epidémicos. Adicionalmente la primeras muertes infantiles atribuibles a P. falciparum se reportaron en 1998 en el area de Ixcan, Petén. un mas, la resistencia a los antimalaricos se ha dectado en Guatemala para Plasmodium vivax, constituyendo el primer reporte para Centro America.

Control de la malaria en Guatemala En acuerdo con la Estrategia Global para el Control de la Malaria (propuesto por

la Organizacion Mundial de la Salud), el Programa Nacional para el Control de la Malaria esta intentando reducir la morbilidad de la enfermedad a través de un diagnostic0 y tratamiento inmediato, restandole énfasis a las medidas dirigidas al control del mosqi-iito vector. La quimioterapia de rutina basada en cloroquina- primaquina sigue siendo el tratamiento fundamental al igual que en el resto de paises de Centro America y Latinoamerica.

Esto es, en Guatemala, el control de la malaria depende mayormente del tratamiento eficaz de las infecciones de P. vivax y P. falciparum con cloroquinalprimaquina. Se pueden identificar al rnenos, desde el punto de vista del parasito, dos factores que reducen significativamente el impact0 de esta medida de control: cepas resistentes a cloroquina y cepas recurrentes. Actualmentes esta determinaciones pueden realizarse unicamente a través de ensayos in vivo que resultan laboriosos y requieren de una gran inversion en recurso humano. Esto se debe a que no existen métodos eficientes para el cultivo in vitro de los parasito de P. vivax. La infecciones en los seres humanos y en algunas especies de simios cons,tituyen las unica fuentes de parasitos para su estudio.

En un estudio realizado durante el periodo de julio de 1995 a junio de 1996, Padilla y Cordon-Rosales (1 997)' demostraron la existencia de cepas de P. vivax resistentes a cloroquina en el 19% (281148), y recurrencias 3 meses después de la primera infeccion en 35% (521148) de los casos captados en la Aldea El Semillero, Tiquisate, Esci-iintla. La evidencia de una disminucion en la respuesta a los tratamientos tradicionales y la ausencia de medicamentos alternativos que sean efectivos y economicos enfatizan la necesidad de una temprana deteccion de la resistencia a los medicamentos. Esto permitira un manejo mas racional de los medicamentos antimalaricos. Por Io tanto, es necesario contar con metodologias rapidas, costoleficientes y operativas dentro de los programas de control para detectar las cepas resistentes a cloroquina y recurrentes. Estas contribuiran en la adecuada

realizacion de evaluaciones epidemiologicas en asistencia de las actividades para el control de la malaria.

En el presente proyecto proponemos verificar la existencia de resistencia a cloroquina en las cepas circi-ilantes de Plasmodium vivax y trabajar en la busqueda de marcadores moleculares asociados con cepas resistentes a cloroquina y cepas recurrentes. En una etapa posterior, basandose en los resultados del presente trabajo, podran implementarse técnicas rapidas de identificacion al servicio de las operaciones de control y vigilancia de malaria en Guatemala y el resto de paises latinoamericanos donde las infecciones con P. vivax constituyen un problema de salud. . 2.2 Marcadores genéticos en el estudio de resistencia a cloroquina y

recurrencias en P. vivax.

Un marcador genético puede definirse como una secuencia variable de ADN que CO-ocurre con un rasgo fenotipico variable, ya sea porque determina este rasgo O

porque esta ligado a otra secuencia de ADN que determina el rasgov'. En el cas0 de Plasmodium, se han utilizado varios marcadores genéticos con el proposito de contribuir al entendimiento epidemiologico de la malaria y a la aplicacion eficiente de las medidas de control. En el cas0 de las dos especies de parasitos responsables de la mayoria de casos de malaria a nive1 mundial, P. falciparum y P. vivax, los estudios con marcadores genéticos han proliferado predominantemente en P. falciparum. Los factores que han determinado el avance en el conocimiento de P. falcipamm son principalmente la mortalidad infantil atribuible a esta especie de parasito, la temprana aparicion de resistencia a los medicamentos y su posibilidad de mantenimiento in vitro. El principal obstaculo en el estudio de P. vivax es su limitacion de cultivo y consecuentemente la necesidad de ,trabajar con muestras en condiciones de campo.

En el cas0 especifico de la resistencia a cloroquina en P. falcipamm se han identificado dos genes como candidatos para el estudio de este fenomeno. Estos dos genes son homologos al gen humano de "multidrug resistance" (mdr), el cual aumenta el "efl'lux" de drogas mediante la sobreproduccion de una proteina de transporte en la membrana celular. Estos genes, disignados como pfmdrl y pfmdr2, han sido clonados y secuenciados vii viii ix aunque la funcion de sus productos aun se investiga. lnicialmente se sugirio que pfmdrl conferia resistencia a cloroquina Vii ". Posteriormente se encontro que mutaciones puntuales en cinco posiciones discretas en el gene pfmdrl estuvieron correlacionadas con la resistencia a cloroquinaxii. En el cas0 de pfmdr2, su expresion no difiere en parasitos susceptibles O resistentes ix '"'. Adicionalmente estudios basados en el cruce de cepas de P. falciparum han identificado un gene adicional, cg2, como determinante de la resistencia a cloroquina en esta especie Recientemente la resistencia a cloroquina en P. falcipamm se ha encontrado asociada a alelos mutantes del gene pffcr en cruces geneticos de cepas de Asia, Africa y Sur Américaw wi. Este ultimo gene parece ser hasta la fecha el mas determinante en la resistencia a cloroquina.

Otros marcadores genéticos, no determinates en la resistencia a cloroquina, han demostrado ser altamente polimorficos para P. falciparum. De interés especial para este estudio, son aquellos que han permitido el estudio de la diversidad genética a través de la aplicacion de PCR, ya que elimina la necesidad de marripular los parasitos in vitro. Entre estos marcadores se encuentran: MSA-1 xvii xviii xix xx xxi M S A - ~ xxii xxiii xviii

1

xix CS xxiv xxv xxi l Y TRAP

En P. vivax los marcadores genéticos que han sido objeto de mas estudio son MSP-1 xxvii y CS xxviii ya que han sido propuestos como componentes de una multivacuna contra malaria. El polimorfismo se ha detectado utlizando la técnica de PCR en aislados geograficos para MSP-1 * *' Y C S xxxii xxxiii xxxi xxxiv

Adicionalmente, las diferentes variantes de la CS expresada en cepas de P. vivax han mostrado diferencias en su respuesta a los tratamientos con cloroquina -"'.

Ambos marcadores MSP-1 y CS muestran amplia diversidad genética y presentan el potencial para distinguir los genotipos de aislados de P. vivax -. Adicionalmente, los patrones de recaidas se han asociacion con cepas especificas de P. vivax -, sugiriendo que las diferencias en los patrones de recaidas (un tipo de recurrencias) son dependientes de las cepas. Por Io tanto es probable que la variacion detectada con los marcadores MSP-1 y CS contribuya a diferenciar las cepas asociadas con recurrencias en el area endémica de Guatemala.

3. Objetivos

En el presente estudio se propusieron los siguientes objetivos:

1. Verificar la presencia de cepas de P. vivax resistentes al tratamiento con cloroquina/primaq~iina.

2. Analizar la diversidad genética de los parasitos de P. vivax que circulan en comunidades dentro del area endémica para malaria en Guatemala, a través del polimorfismo presentado por algunos genes candidatos como MSP-1, CS y el homologo a pfmdrl.

3. Determinar la asociacion entre las variantes de los marcadores moleculares y las cepas de P. vivax resistentes a cloroquina y recurrentes.

4. Metodologia

Se diserio un estudio de cohorte prospectivo. El cohorte fue evaluado durante el curso de quimioterapia estandard (cloroquina-primaquina) para P. vivax y P. falcipanrm, segun fuera el caso. Se determinaron las tasas de aclaramiento a través del examen de muestras sanguineas tomadas en serie a Io largo del tratamiento supervisado, mediante examen microscopico de frotes sanguineos y pruebas de PCR en manchas

de sangre en papel filtro. Subsecuentemente los aislados se tipificaronn como como cepas resistentes a cloroquina O recurrentes y las muestras en papel filtro fueron analizadas para determinar el polimorfismo genético. Finalmente se analizo la asociacion entre las variantes detectadas y las cepas resistentes y recurrrentes.

Las actividades del estudio se presentan en el CUADRO 1. La etapa de inclusion de casos al estudio comprendio la estacion de alta transmision uunio a diciembre), luego unicamente se dio seguimiento a los casos seleccionados para el estudio. Se estimaba captar alrededor de 100 infecciones, de las cuales se esperaba que 20% correspondieran a cepas de P. vivax resistentes y 30% a cepas recurrentes. Las etapas de analisis de muestras y de datos, tomo m is tiempo del planeado debido a problemas técnicos que no pudieron anticiparse. Arnbas etapas se extendieron 6 meses mas de Io propuesto. El proyecto se dio por concluido en el mes de octubre de +-- 1999.

CUADRO 1. Cronogrania de actividades realizadas.

ACTlVl DAD

Estas actividades se realizaron hasta el mes de octubre de 1999.

Desde el punto de vista operativo el proyecto constaba de dos cornponentes: CAMPO Y DIBORATORIO.

4.1 PARTE DE CAMPO:

Sitio del estudio. El estudio se llevo a cab0 en las aldeas de El Porvenir y Las Trozas del rnunicipio de Tiquisate, Escuintla (FIGURA 1). Dentro de esta region, en la Aldea El Porvenir, nuestro grupo detecto la presencia de cepas resistentes a cloroquina y cepas recurrente durante un estudio previo (1 995-1 996). El rnunicipio de Tiquisate se encuentra dentro de la region rnalarica del sur, la segunda de rnayor importancia en Guatemala. La poblacion total del area de estudio es aproxirnadarnente de 2,500 habitantes, con una tasa de ataque para malaria de 100-250 casos/ario en prornedio. Aunque la rnalaira es endérnica durante todo el afio existen diferencias estacionales en la intensidad de la transmision. Regularmente, el periodo de rnayor transrnision ocurre durante la estacion lluviosa (rnayo a octubre).

Seleccion y reclutamiento de pacientes. Las infecciones con P. vivax se captaron a través de los puestos de colaboradores voluntarios (CV) en las aldeas del estudio; estos puestos funcionan actualrnente deritro del sistema de salud para proporcionar tratarnineto antimalarico a los pacientes rnalaricos febriles. En total se conto con la participacion de seis CV en el area de estudio y un rnicroscopista localizado en el Centro de Salud de Tiquisate. Adicionalmente dos técnicos, contratados y adiestrados dentro del proyecto, coordinaron con los CVs y microscopitas en el diagnostico, adrninistraron los tratarnientos supervisados y seguirniento de los pacientes.

Se acepto el reclutarniento de pacientes de todas las edades, con la excepcion de nirios menores a 1.5 arios de edad. La rnujeres erribarazadas fueron tratadas pero excluidas del estudio. Se requei-io un consentimiento escrito de todos los candidatos al estudio O de sus respectivos guardianes (ANEXO 1). Para cada cas0 de malaria se cornpleto una historia personal con respect0 a las infecciones previas de malaria y la inforrnacion pertinente como nurnero de dias con sintornas, auto-medicacion , etc. Se obtuvo de los participantes dos rnuestras de sangre en gota gruesa y una en pape1 filtro, al rnornento de reclutarniento (dia O). Una gota gruesa era llevada diariarnente al Ceritro de Salud de Tiquisate donde se exarninaba la lamina para dar un dlagnostico microscopico inrnediato; la otra era conservaba para mediciones mas exactas en el laboratorio. Al dia siguiente se le informaba del diagnostico al paciente; a todos aquellos negativos para malaria se les suspendia el tratarniento y los positivos continuaban con el tratarniento supervisado. A estos ultimos tarnbién se les tomaba rnuestras en los dias 3, 7, 14 y 28 (CUADRO 2). lncialrnente se habia propuesto tornar rnuestras en los meses 2, 3, 4, 5 y 6, sin embargo, est0 se elirriino debido a los recortes presupuestarios ejecutados

sobre la propuesta original. En los casos donde fue posible se obtuvo una muestra entre los 2 y 3 meses.

CUADRO 2. Esquema de seguimientos para los tratamientos supervisados con cloroquina-primaquina.

*CQ = Chloroquine 25 mg basekg. PQ = Primaquine 0.30 mg baselkg

Todas las personas que presentaron infeccion recibieron tratamiento: las que no participaron en el estudio recibieron el tratamiento de cloroquina/primaquina bajo el esquema de 5 dias, actualmente vigente dentro del Ministerio de Salud; mientras que las personas que voluntariamente aceptaron participar en el estudio recibieron un tratamiento completo de cloroquina/primq~~ina con un esquema de 14 dias.

CONCENT. CQ EN SANGRE

X

X

X

X

X X X x x x

Tratamiento supervisado. Se evaluo la respuesta parasitologica y clinica al t~atamiento con tabletas de 150 mg de cloroquina a una dosis de 25 mg cloroquina base/Kg peso durante el curso de 3 dias. Se administraron 15 mg/Kg peso en el dia O y 5mgIKg peso en los dias 2 y 3. Para eliminar las recaidas se admnistro una dosis diaria de 0.3 mg de primaquina base /Kg peso durante el transcurso de 14 dias. El esquema de seguimiento se presenta en el CUADRO 2.

PARASITEMIA GOTA

GRUESA

X

X

X

x

x x x x x x

TEMPERATURA

X

.

X

X

x

x x x x x x

DIA ESTUDIO

O

1

2

3

4-6

7

8-1 3

14

28 2 meses 3 meses 4 meses 5 rneses 6 meses

PRUEBAS PCR

X

X

X

x

x x x x x x

TRATAMlEN TO

CQ*

X

X

X

PQ*

X

X

X

X

X

X

X

X

El aclaramiento de los parasitos de la sangre se monitoreo a través del examen microscopico de las gotas gruesas y posteriormente se intento su corroboracion con la prueba de PCR en las muestras de sangre en papel, de acuerdo con el esquema en el CUADRO 2. Simultaneamente fueron empledas para medir las concentraciones de cloroquina en sangre, a través de un ensayo ELISA de inhibicion. El tratamiento supervisado inlcuyo el monitoreo de la parasiternia y sintomas, de acuerdo con el esquerna en el CUADRO 2.

Los criterios utilizados para clasificar la respuesta clinica y parasitologica al tratamiento fueron los recomendados por el documento "Antirnalarial Drug Policies", World Health Organizatiori 1994 (documento WHOlMAU94.1070) (ANEXO 2). Si las fiebres y la parasitemia persistian al dia 3 y no se detectaba otra causa para la fiebre, se admiriistraria el tratamiento alternativo con sulfadoxina-perimetamina y el caso se clasificaria como fallo terapéutico.

Finalrnente las muestras en papel filtro también fueron empleadas para detectar los polimorfismos de los genes candidatos, utilizando las técnicas moleculares basadas en la amplificacion por PCR.

4.2 PARTE DE LABORATORIO:

Diagnostic0 microscopico de malaria. Las muestras de gota gruesa fueron tenidas con Giernsa para el diagnostic0 de especie y también para calcular la densidad parasitaria, en el laboratorio de Guatemala. Esta se calculo corno no. de parasitos 1200 leucocitos x 6000 (concentracion prornedia de leucocitos por ml de sangre n la poblacion rural de Guatemala). Se mantuvieron registros separados para los estadios asexuales y gemtocitos. Un total de 200 campos 1000X se examinaron en cada lamina antes de darla por negativa. El resultado de este diagnostic0 microscopico fue empleado para clasificar la respuesta al tratamiento.

Determinacion de cloroqi.iina en sangre: Utilizando una de las muestras en papel filtro, se determino la concentracion de cloroquina en la sangre para la muestras preliminarmente clasificadas como resistentes a cloroquina, segun el examen microscopico. El método utilizado fue desarrollado por Tuenis Egglete

y el protocolo detallando la estandarizacion del mismo se describe en el ANEXO 3. Los resultados de esta prueba fueron necesario para corroborar si la persistencia de la parasitemia ocurria en presencia de las dosis letales minimas de cloroquina en sangre.

Prueba molecular confirmatoria de malaria: analisis de ADNr gen 18s. Para confirmar el resultado de la gota gruesa, se erripleo el método de Oliveira et al (1995) modificado. Este se base en la amplificacion de una region interna variable del gen ADNr 18s y la subsequente se realizo una prueba de PCR

anidada dirigida para la amplificacion del gen complet~ del ADN ribosomal 18s y la subsequente visualizacion de los productos amplificados a través de una hibridizacion no isotopica en fase liquida, tipo ELISA. La diferenciacion de especies de Plasmodium se basa en la utilizacion de sondas con secuencias repetitivas especificas. Esta prueba se aplico a todas las muestras del estudio.

Ya que esta prueba no dio los resultados esperados se procedio a emplear una prueba de PCR anidado, dirigido a la amplificacion del gen completo del ADNr 18s y la subsequente amplificacion de la region variable interna, mencionada anteriormente.. La deteccion de los productos de PCR también se realizaba en un formato de hibridizacion no isotopica en fase liquida. Esta prueba se aplico a un subco~junto de muestras y tampoco dio los resultados esperados.

Como ultimo recurso, se procedio a la clonacion de los productos amplificados de la region variable interna del gen ADNr 18s y la subsequente secuenciacion de las regiones clonadas, para algunas de las muestras que dieron resultados positivos. La estandarizacion y modificaciones del método completo se presentan en el ANEXO 4, 5 y 6.

Polimorfismo de los marcadores moleculares. Se estudio el polimorfismo de dos genes MSP-1 y CS usando como templado el ADN de los parasitos correspondientes a las muestras para los dias O de las muestras susceptibles y resistentes y adicionalmente los dias 3, 7, 14 y 28 para las resistentes segun su respuesta in vivo. Para los marcadores MSP-1 y CS se emplearon las técnicas modificadas previamente descritas por Qari et al. ( 1 9 9 3 ) ~ " ~ Kolakovich et al. (1 996)*i y Craig and Kain (1 996)-. Para el cas0 de la MSP-1 se amplifico con los primers correspondientes a las secuencias conservadas que flanquean la region variable 5 del gene MSPl (Kolakovich et al. 1996)-' y los productos de amplificacion se analizaron por SSCP (single stranded conformational polymorphism), en geles de poliacrilarnida revelados mediante tincion con plata (Craig & Kain 1996) -. Para el gen de la proteinas CS se amplifico con los primers correspondientes a la region terminal (Qari et al. 1993) *" y se revelo a traves de un formato de ELISA (Oliveira et al. 1 9 9 5 ) ~ " LOS ANEXOS 7, 8 y 9 detallan la estandarizacion y modificacion de los métodos.

Por falta de recurso y problemas técnicos en la calidad de ADN recuperado de las muestras, no puedo estudiarse el pfmdrl ni otros mejores

candidatos como el cg2 ( Su et al. 1 997)xiv y mas recientemente el pficr (Djimde et al. 1999, en preparacion)xYi para los casos de P. falciparum y menos arin para P. vivax ya que las diferencias de esta especie en comparacion con Io publicado para P. falciparum son mayores de Io previsto. Sin embargo contamos con mas muestras y la documentacion necesaria para continuar estos estudios.

5. RESULTADOS

Respuesta in vivo al tratamiento con cloroquinalprimaquina. Durante el tiempo de estudio, junio a diciembre de 1998, se captaron un total de 622 pacientes febriles en los puestos de los CVs de los cuales 344 (55%) fueron diagnosticados con infecciones malaricas. A su vez, un total de 31 8 pacientes participaron voluntariamente en el estudio, sin embargo 42 de ellos suspendieron su tratamiento resultando en 276 casos con tratamiento y seguimiento completo. Finalmente 234 casos fueron analizados ya que algunos debieron ser eliminados por errores en la toma y almacenarriiento de muestras O

concentraciones de cloroquina en sangre al dia O y103 menores a la dosis supresiva de 10 ng1mL de sangre.

En base a la respuesta parasitologica al tratamiento con cloroquinalprimaquina y aplicando los criterios de la Organizacion Mundial de la Salud (ANEXO 2) se clasificaron las infecciones en suceptibles y sospechosas resistentes. Todas las muestras de los dias O y 3 para las sospechosas resistentes fueron analizadas para determinar la presencia de cloroquina en sangre en la dosis supresiva, utilizando la prueba de ELISA de inhibicion 9 (ANEXO 3). Todas aquellas con niveles menores a 100ngImL de sangre en la muestra O o 3 fueron eliminadas en el analisis. En total se detectaron 58 infecciones clasificadas como resistentes cuyas concentraciones de cloroquina y su metabolito, decetilcloroquina (DCQ) eran mayores a a 100ngImL de sangre en los dias O y 3 (CUADRO 3).

CUADRO 3. Concentracion de cloroquina+metabolitos en muestras de los dias O y 3 para las infecciones con Plasmodium clasificadas como resistentes por su respuesta parasitologica in vivo.

para dos de un total de 58 infecciones no se pudo analizar la muestra del dia O + incluye la contracibn de cloroquina y su metabolito decetilcloroquina

DIA DESPUES DE INlClADO TRATAMIENTO Dia O Dia 3

La respuesta parasitologicas de un total de 169 infecciones con P. vivax, diagnosticadas microsc6picamente, result6 en 73.4 % infecciones con parasitas suceptibles a cloroquina, 25.4% resistentes en grado I y 1.2% resistentes en grado II. Las densidades parasitarias correspondientes a estas infecciones se presentan en el CUADRO 4 y las tendencias correspondientes en la FIGURAS 2 y 3. Estos resultados no solamente re-confirman los hallazgos del estudio anterior "sino que ademas indican un aumento en la frecuencia de los casos de P. vivax resistentes a CQ. Es muy probable que la distribucion de resistencia a

No.

56* 58

[cloroquina] ng CQImL sangre ' Media

120.0 344.0

D.S.

185.3 175.4

~eu!nbeu!~dpu!nbo~o~:, uo:, olua!uieleJl jap os~n:, la ua ~unleâp/ej wn!powseld uo:, sauop:,aJu! sel e ~ e d ( 's 'a 5 )( ) se!.ie~se~ed sapep!suaa -9 0 ~ a ~ n 3

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81 eiû PI. eia L eia E eia O eia

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CQ en P. vivax sea mas amplia no simplemente en Guatemala sino en toda la region Centroamericana, ya que las practicas sobre el diagnostico, tratamiento y control general de la malaria en conjuncion con las condiciones epidemiologicas son similares.

En el cas0 de 52 infecciones con P. falciparum, 80% presentaban parasito susceptibles, 15,4% resistentes en grado 1, 1.5 % resistentes en grado II y 3.1 resistentes en grado III. Las densidades parasitarias correspondientes a estas infecciones se presentan en el CUADRO 5 y las tendencia correspondientes en las FIGURAS 4 y 5. Esta es la primera vez que se reportan cepas de P. falciparum resistentes a CQ en el area Centroamericana. También estos resultados indican un aumento en la prevalencia de P. falciparum en el sitio de estudio en el orden de 20 veces. Ya que P. falciparum es la especie responsable de la mortalidad asociada a malaria, estos hallazgos son alarmanates.

Al comparar las infecciones con ambas especies, se distingue una densidad parasitaria total mas alta al dia O para el cas0 de P. falciparum vs. P. vivax (FIGURA 6). Esto podria explicar parcialmente la mayor severidad de los sintomas que manifiestan los pacientes con infecciones de P. falciparum en comparacion con las de P. vivax. Adicionalmente puede notarse una tendencia en el aumento de la gametocitemia al dia O con el grado de resistencia para la infecciones con P. falciparum pero no con P. vivax (FIGURA 7), en contraste con la tendencia a la disminucion de la parasitemia total en ambas especies (FIGURA 8). La alta gametocitemia de P. falciparum presupone un mayor riesgo de transmision de las cepas resistentes porque el estadio de gametocito es el infectivo para el mosquito transmisor.

Prueba molecular confirmatoria de malaria: analisis de ADNr gen 18s. Los resultados obtenidos a través de la prueba de PCR de la region interna del ADNr 18s y la hibridizacion no isotopica en fase liquida de ELISA no fueron los esperados. En el cas0 de las infecciones diagnosticadas microscopicamente como de P. vivax (dia O), solamente un 53% (50 de un total de 94) dieron resultados positivos comfirmatorios para la especie. De igual manera, para las infecciones de P. falciparum solamente un 55% (51 de un total de 92) dieron resultados confirmatorios.

.-Al aplicar la prueba con el PCR anidado, los resultados tampoco mejoraron. Se probaron un total de 60 muestras de infecciones de P. vivax, 30 susceptibles y 30 resistentes, y 39 de P. falciparum, 19 suceptibles y 20 resisstentes. En el cas0 de las infecciones resistentes, se analizaron muestras de los dlas 0,3,7,14 y 28. Igualmente, los resultados no fueron los esperados (FIGURAS 9 y IO), para ambas especies los resultados comfirmatorios al dia O fueron menores al 50% de los casos diagnosticados microscopicamente.

Finalmente se extrajo el ADN de una muestra de sangre completa de un paciente con malaria por P. vivax (parasitemia de 3+) , se amplifico por PCR anidado el gen corripleto ADNr 18s y la region variable interna y se clono exitosamente este producto en un sistema de plasmidos pCR2.1 en E. coli TOP1 OF'. Como resultado de la clonacion del gen de la 18S, si se obtuvo colonias de bacterias transformadas, de las cuales se escogieron 37 clones para ser aislados. De estos 37 clones, se determino que 32 si contenian el inserto y se escogieron tres clones para ser purificados. Se amplifico el inserto en diluciones 1 : I O y 1 :IO0 del plasmido purificado y se obtuvo bandas de amplificacion de alrededor de los 850 bp, que si corresponden con el peso molecular esperado para el inserto: aproximadamente 876 bp. El analisis de restriccion de los productos amplificados, a través de un gel de poliacrilamida al 8%, mostro la presencia de tres bandas de las cuales dos coinciden especificamente con las observadas en el control positivo (plasmido de P. vivax).

De los tres clones seleccionados para analisis de secuenciacion, se recuperaron los insertos, se amplificaron por PCR y se secuenciaron. Del proceso de secuenciacion de esta parte del gen que codifica para la region 18s de P. vivax, se obtuvo la informacion presentada en el DIAGRAMA 1, donde se muestra la ubicacion de las secuencias que coinciden parcialmente con las secuencias de las sondas utilizadas en la deteccion.

DIAGRAMA 1. Secuencia de la region del gen ADNr 18s de Plasmodium vivax clonada, a partir de una infeccion humana, mostrando los puntos de hibridizacion de las sondas empleadas para su deteccion.

1 0 1 gaaacatagttttgacttgttcaattttgttattccatgctgtagtattcaaaacgcgca 160 1 6 1 tgtatctgtttgctatgaacactttaattttactcaaag[ 2 2 1 aagattttaaaaagaaacactttaattnn 2 8 1 j g c ( 3 4 1 cgttattaaaatattggttctttgaaatt~aactacgagcgttttaactgcaacaatttt 400 4 0 1 aatatacgctattggagctggaattaccgcggctgctggcaccagacttgccctccaatt 460 4 6 1 gtattatgggaaggatttaaattcccatcattccaattacaaagccagattggccttgta 520 5 2 1 ttgttatttcttgtcactacctctcttctttagaattgggtaatttacgcgcctgctgcc 580 5 8 1 ttccttagatgtggtagctatttctcaggctccctctccggaatcgaactctaattcccc 640 6 4 1 gt tacccgtcatagcaatgt taggccaataccctaacatcaaaagctgata 6 9 1

[Sonda AL 2891 {Sonda AL 61 5)

da AL 616) nucledtidos que si corresponden con la secuencia de la sonda. nucle6tidos que no corresponden con la secuencia de la sonda.

Esta secuencia se comparo con la secuencia utilizada para el diseiio de las sondas y se determino que existe un porcentaje de correspondencia de

aproximadamente 94% entre ambas secuencias. Sin embargo, la parte de la secuencia en la que se ubican las sondas utilizadas para la deteccion se encuentra dentro del 6% donde no hay corresponencia entre una y otra, O sea, las secuencias en dicha region no son iguales. Estas comparaciones se realizaron a través del programa BLAST del National Center for Biotechnology (www.ncbi.nlrri.rrih.ciov). El CUADRO 6 compara la secuencia de las sondas utilizadas y la secuencia del gen ADNr 18s de P. vivax clonada. Estos resultados indican la baja correspondencia entre las sondas y las regiones blanco del gen en cuestion y por Io tanto explica los resultados negativos obtenidos en las pruebas de deteccion de la region especifica amplificada a partir de las muestras. •

CUADRO 6. Porcentajes de correspondencia de las secuencias de la region del gen ADNr 18s de Plasmodium vivax clonada y las sondas utilizadas para la deteccion de las regiones correspondientes amplificadas en las muestras.

Gen CS. El polimorfismo del gen CS fue analizado en las infecciones de P. vivax: 30 resistentes y 30 suceptibles en el primer dia de la infeccion (dia O). La frecuencia de los tipos 1, II y vivax-like fue la sigi-iiente para todas las infecciones al dia O fueron: 80.0% tipo 11, 11.7% infecciones mixtas tipo I+tipo II y 3.3% infecciones mixtas tipo I+ll+vivax-like; 5.0% fueron negativas para las variantes probadas. Aunque la distribucion de los tipos de CS no varia significativamente con su suceptibilidad O resistencia a cloroquina (p>0.10, 9.1.3, X 2 = 2.80952) la variante tipo-mono solamente se presento en las cepas resistentes (CUADRO 7). Ademas debe notarse que las variantes tipo I y vivax-like solamente se presentaron en asociacion con otras.

Sonda

AL 616 AL 615 AL 289

Secuencia

taa ctg ata ctt cgt atc ctt tgt gcg cat tlt gct ggc ttg gaa gtc ctt gtt

No. nucleotidos iguales entre la secuencia del gen y de la sonda 1 total de nucleotidos

de la sonda 511 8 1 211 8 11118

Porcentaje de correspondencia

28 67 6 1

CUADRO 7. Distribucion de las variantes del gen CS en las infecciones con Plasmodium vivax al dia 0, en cepas susceptibles y resistentes a cloroquina.

Tambien se determino la distribucion de las variantes durante el curso de la parasitemia en 30 de las infecciones con. P. vivax calificadas como resistentes (dias 0, 3, 7, 14 y 28). Los resultados muestran que la distribucion de las variantes no varia significativamente con el dia después de iniciado el tratamiento, p>0.10, g.1. 16, X2 = 16.89967 (CUADRO 8). Nuevamente la variante predominante en los diferentes dias es PV247, la tipo-mono solo se presenta asociada y se encuentra un bajo porcentaje (9.3%) de muestras negativas para las variantes probadas. En contraste, las infecciones mixtas con la variante tipo-mono se manifestaron en diferentes dias en las cepas resistentes y se presento un cas0 de la variante tipo I en forma aislada. Al analizar los resultados durante el curso de la parasitemia (dias O a 28) no se puede observar ningun patron en la aparicion de las variantes de la CS (FIGURAS II a 16 las indiviudales por cas0 agrupadas por dia O de parasitemia).

TlPO DE INFECCION

resistentes

CUADRO 8. Distribucion de las variantes del gens CS durante el curso de la parasitemia en infecciones con Plasmodium vivax resistentes a cloroquina.

) 5.0 (3 80.0(48) 11.7(7)

TIPO DE VARIANTES DEL GEN CS % (n)

DIAS DESPUES DE INlClADO

TRATAMIENTO

negativas TlPO II

O 3 7 14 28

TlPO DE VARIANTES DEL GEN CS % (n)

36.7 (22) ---

'I'IPO I + II

TlPO I 1 TlPO II

0.0 (O) 0.0 (O) 0.7 (1) 0.0 (O) 0.0 (O) 0.7 (1)

6.7 (4)

TlPO II + I + Vivax-li ke

TlPO II+I 1 TIPO II + I + 1 Negativas

14.7 (22) 18.0 (27) 15.3 (23) 15.3 (23) 13.3 (20) 76.7 (1 15)

2.7 (4) 1.3 (2) 0.7 (1) 2.7 (4) 1.3 (2) 8.7 (13)

vivax-like 1.3 (2) 0.7 (1) 0.7 (1) 0.0 (O) 2.0 (3) 4.7 (3)

3.3 (2) 0.0 (O) 2.7 (4) 2.0 (3) 3.3 (5) 9.3 (14)

Gen MSP-1. Todas las muestras colectadas durante el estudio ( fueron extraidas utilizando el método de Chelex-1 00 de acuerdo con el protocolo estandarizado. Sin embargo no se obtuvo ningun producto detectable en agarosa después de la arnplificacion por PCR. Es probable que los primers erripleados hayan estado en malas condiciones. Tenemos proyectado continuar el trabajo con estas muestras hasta obtener resultados sobre el polirnorfismo del gen MSP-1.

Como parte de estandarizacion de la metodologia para la deteccion de la variantes del gen MSP-1 y antecediendo a la colecta de las rnuestras del presente proyecto, se analizaron muestras colectadas previamente en la rnisma area (El Semillero, Tiquisate, Escuintla) . Este conjunto de muestras fueron colectadas en el periodo de Julio 1995 a mayo 1996 empleando la rnisrna metodologia para la deteccion in vivo de P. vivax resistente a cloroquina. A continuacion presentamos los resultados correspondientes (trabajo de tesis de licenciatura en Bioquirnica de Lucia de Urioste).

De un total de 159 rnuestras positivas por microscopia para P. vivax al dia 0, 94 dieron un resultado positivo de PCR (59.1%) mientras que en la muestras de recurrencias 18.8% (16 de 85) presentaron resultados. Al analizar la relacion entre la densidad de la parasiternia y el resultado de PCR por medio de una regression logistica, se encontro que la parasiternia determina en un 11 .O % el resultado de PCR (p=0.0355).

Se encontraron cinco patrones de banda aparentemente diferentes (A,B,C, D Y E), al analizar los productos de PCR a través del método de SSCP (FIGLIRA 17 GELES). La diferencia entre estos cinco patrones de banda pudo corroborarse a nivel de secuencia para tres de los patrones (A,B y D). Para los patrones de banda C y E no fue posible obtener una secuenciacion porque la rnuestras presentaban un producto heterogéneo que podria ser el resultado de un PCR no especifico O la presencia de una mezcla de secuencias para region P5 del gen MSP-1 en la muestra.

La distribucion de los distintos patrones de banda en la parasitemia inicial muestra que los patrones A y D son los mas prevalentes con una frecuencias de 62.8% y 21.3% respectivamente. Mientras que en las recurrencias (dias 3 a 28), las prevalencias de Dl A y E son las mayores; 43.7, 31.2 y 25.0 correspondienternente.

CUADRO 9. Distribucion de la variantes del gen MSP-1, segun los patrones de SSCP, en las parasitemias iniciales (dia O) y recurrentes (dias 3 a 28) con Plasmodium vivax

6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

PARASITEMIA

lnicial (diaO) n=94 Recurrente n=16

Los resultados del ensayo in vivo para la evaluar la respuesta de Plasmodium al tratamiento con cloroquina (1) reconfirman la presencia de P. vivax resistente a cloroquina con una prevalencia de hasta 26% después de el primer reporte para el ano de 1997 y (2) reportan un alza en la incidencia de casos de P. falciparum y por primera vez registran la presencia de P. falciparum resistente a CQ en la region Centroamericana. Estos resultados deben alertar a los programas de control de la malaria para reforzar sus medidas de prevencion y control y revisar sus politicas sobre uso de antimalaricos. Al mismo tierripo, se recomienda evaluar la presencia de Plasmodium resistente en otras regiones epidemiologicas de Guatemala, para poder determinar su impact0 en la salud de los pobladores.

A pesar que no pudo confirmase el diagnostic0 microscopico de las muestras utilizando los procedimientos publicados para el gen ADNr 18S, los resultados son de mucho interés. La clonacion y secuenciacion de una region del gen de P. vivax nos condujo a identificar por primera vez secuencias variables intra- especificas. Hasta este hallazgo, se presuporiia que la variacion en esta region del gen era unicamente a nivel inter-especifico y los métodos publicados presuponian la diferenciacion de especies basados en estas diferencias. Los resultados indican que las cepas de P. vivax circulantes en la region son diferentes a las de otras partes del mundo y por Io tanto ameritan estudios mas detallados sobre su variacion genética.

VARIANTE DEL GEN MSP-1 (%)

Se reporta polimorfismo para el gen CS en P. vivax, con la predominancia del tipo II, la presencia del tipo I unicamente en asociacion con otros tipos y la presencia del vivax-like asociadas solo en las cepas resistentes. Es el primer reporte de tipo vivax-like en Centroamérica. Sin embargo ninguno de los tipos puede asociarse con la resistencia a cloroquina. Por otro lado, las muestras negativas que constituyen hasta un 5% pueden mas bien representar otros tipos de variantes de la CS no detectables mediante las sonda de ADN empleadas. Por Io tanto seria recomendable el desarrollo de otros métodos como la

E 6.4

I

25.0

D 21.3

43.7

A 62.8

31.2

B 7.4

0.0

C 2.1

0.0

clonacion y secuenciacion del gen para poder tener mayor informacion sobre su variacion.

Se detectaron cinco variantes del gen MSP-1 en la region P5, segun los patrones de SSCP, con la predominancia del patron A en la infecciones initiales (dia O) y del patron D en las recurrencias. Sin embargo, estas asociaciones no son conlcuyentes ya que la secuencia de ADN de los patrones C y E no se pudieron realizar de manera directa. Es necesario continuar con la purificacion, clonacion y secuenciacion de estos patronres. Adicionalmente no se pudo analizar la variacion del gen MSP-1 en las muestras colectadas para el presente estudio ya que los inciadores utilizados en la amplifiûacion estaban dafiados. Ya tenemos un nuevo lote de iniciadores y re-ensayaremos las muestras colectadas.

Hasta el moment0 no hemos encontrado ningun polimorfismo de los genes CS ni MSP-1 asociados con cepas de Plasmodium resistentes a CQ. Las principales limitantes han sido (1) utilizar metodologias basadas en las variaciones reportadas para cepas de Plasmodium de otras regiones del mundo y (2) las deficiencias en infraestructi-ira y operaciones (dific~iltdad para ordenar y transportar los reactivos necesarios y la falta de equipo mas sofisticados como termocicladores con gradiente y secuenciadores automaticos). Es necesario desarrollar estudios mas basicos y detallados sobre la composicion genética y variacion de las cepas locales para poder avanzar de manera mas certera en la busqueda de marcadores asociados con resistencia a cloroquina y otros asociados con caracteristicas epidemiologicas relevantes. En este respecto, hemos iniciado la construccion de una biblioteca genomica de P. vivax que podra servir como recurso basico para futuros estudios.

Este estudio permitio colectar las muestras de P. vivax y P. falciparum resistentes y suceptibles a cloroquina que serviran como material basico para ampliar los estudios al respecto. En el mediano plazo, intentaremos amplificar los genes cg2 y pftcr asociados con resistencia en P. falciparum pues ya contamos con los inicidadores respectivos.

FIGURA 1. Localizacion del sitio de estudio para el ensayo in vivo de la respuesta de Plasmodium vivax y P. falciparum al tratamiento con cloroquina/primaquina. La estrella denota las Aldeas El Porvenir y Las Trozas en el municipio de Tiquisate, Escuintla.

resistencia

DIAS DESPUES DE INCIAD0 EL TRATAMIENTO 1 FIGURA2. Densidades parasitarias totales en las infecciones con Plasmodium vivax segun su grado de resistencia a clcoroquina (CQ), en muestras seriadas del dia O al

28 después de iniciado el tratamiento con CQIprimaquina.

resistencia CQ

mo Dl w2

n 3 *

DIAS DESPUES INlClADO TRATAMIENTO -.----_-- . -.----.m...-1...-...--.... < .-.-_-..- -1. ". . )l_ <" .---..-.--..-._--.----,---- 1 FIGURAA. Densidades parasitarias totales en las infecciones con Plasmodium falciparum segun su grado de resistencia a clcoroquina (CQ), en muestras seriadas del dia O al 28 después de iniciado el tratamiento con CQIprimaquina

DIAS DESPUES INlClADO TRATAMIENTO

resistencia CQ

mo 1 1 3 1 m2

0 3

FIGURA 5. Densidades parasitarias de formas sexuales (gametocitos) en las infecciones con Plasmodium falciparum segun su grado de resistencia a clcoroquina (CQ), en muestras seriadas del dia O al 28 después de iniciado el tratamiento con CQlprimaquina

'(03) eu!nbo~op e epua)s!saJ ap 0pe~6 ns un6as A (O elp) U O ~ ~ ~ J U ! el ap ejp Jaui!Jd le 'wn~ed13ej -d A xen,n wn!powseld U O ~ s ~ u o ! ~ ~ ~ J u ! sel ua sale)o) se!Je)!seJed sapep!suaa '8v~n9ld

i L boozr _I .-P

Diag. Microscopico:

LQ Positives

0 kgat ivos

control neg. O 3 7 14 28 I Dia toma de muestra a

Figura 9. Comparacion de los resultados de la prueba de ELISA para la deteccion del gen ADN r 1 8s de Plasmodium falciparum, en muestras de infecciones correspondientes a esta especie. Se tomaron muestras seriadas durante el curso del tratamiento con cloroquina/primaquina (dias O a1 28) ; todas las muestras fueron inicialmente evaluadas microscopicamente. Los resultados de la prueba de ELISA se calcularon de la siguiente forma: absorbanica ,,,, - ab~~rbanica pu,to ,, ,,,, la absorbancia pu, ,, , es igual a el promedio de los controles positivos. Ver ANEXO 8 para mas detalle del método.

cn L N L - ( D -

g *$ g È E E

0 sonda

sonda

a Sonda

Tipo 1

vivax-li ke

Tipo II

Figura 12. Tipos de variantes del gen CS presentes en las muestras del dia O (parasitemia inicial) para las infecciones de Plasmodium vivax resistentes a cloroquina. Eje x: no. de identificacion de las muestras. €je y: positividad para las sonda tipo 1, tipo II y10 vivax-like.

a s o n d a Fpo 1

n s o n d a vivax-like

m ~ o n d a Fpo II

Muestra

Figura 13. Tipos de variantes del gen CS presentes en las muestras del dia 3, despues de iniciado el tratamiento, para las infecciones de Plasmodium vivax resistentes a cloroquina. Eje x: no. de identificacion de las muestras. Eje y: positividad para las sonda tipo 1, tipo II y10 vivax- like.

0 Sonda Tipo 1

0 Sonda vivax-li ke

sonda Tipo II

Muestra i J Figura 14. Tipos de variantes del gen CS presentes en las muestras del dia 7, después de iniciado el tratamiento, para las infecciones de Plasmodium vivax resistentes a cloroquina. Eje x: no. de identification de las muestras. Eje y: positividad para las sonda tipo 1, tipo II y10 vivax- like.

0 Sonda Tipo 1

0 Sonda viwix-li ke

sonda Ti po II

Figura 15. Tipos de variantes del gen CS presentes en las muestras del dia 14, después de iniciado el tratamiento, para las infecciones de Plasmodium vivax resistentes a cloroquina. Eje x: no. de identificacion de las muestras. Eje y: positividad para las sonda tipo 1, tipo II y10 vivax- like.

cn -- 2: g - cn a, -= a, r 3 0 ,m € 'o cng O m r c - C m a C a,cnos --

a C cn - !! 9 g x a ~ o C L ~ QW'U Q

a i!! 0 -0 Q E cci :E Co .a, .r .= G € g g C a Q

i; O b s - O a, O" m z cn 0, a,= a, +.s+ 2 2.g s G .- C + L .- -5 5 'mg€ Ocn * ai u w * s , c n 3 m -- O Q.5 a,- Q u > S U A iz al (0 > f ;g -5

*--2 O rc \ i 'ba ,O

0 2 >, e .i! f c = s'Ou,E .9= ,m a, O, L 7 3 C L . Z ~

Ruebush, T.K., Zeissig, R., Klein, R.E. and Godoy, H. 1992. Community participacion in malaria surveillance and treatment II. Evaluation of the volunteer collaborator network of Guatemala. Am. J. Trop. Med. Hyg. 46(3):261-271.

World Health Organization. 1996. Weekly Epidemiological Record 71" year 4:25-32.

"' Pan American Health Organization. 1996. Regional Status of Malaria in the Americas 1994. Epidemiological Bulletin, 1 7(4): 1 0-1 4, Dec. 1 996

" Roberts, D.R., Laughlin L.L., Hsheih P., and Legters L.J. 1997. DDT, global strategies, and a malaria control crisis in South America. Emerging lnfectious Diseases 3(3):295-310.

Padilla N. y Cordon-Rosales. 1998. Abstmcts of Annual Meeting of the Amencan Society of Tropical Medicine and Hygiene.

" Lymbery, A.J. 1996. Finding genetic markers for complex phenotypic traits in parasites. International Journal Parasitology (26): 7-1 7.

'" Foote, S.J., Thompson, J.K., Cowman, A.F. and Kemp, D.J. 1989. Amplification fo the multidrug resistance gene in some chloroquine- resistant isolates of P. falciparurn. Ce11 57:921-930.

'"' Wilson, C.M., Serrano, A.E., Wasley, A., Bogen-Sthuiz, M.P., Shanxar, A.H., and Worth, D.E. 1989. Amplification of a generelated to mamnalian genes drug-resistent Plasmodium falciparum. Science, 244: 11 84-1 186.

"Zalis, M.G., Wilson, C.M., Zhang, Y., and Wirth, D.F. 1993. Characterization of the Pfmdr2 gene for Plasmodium falciparum. Molecular and Biochemical Parasitology 62:83-92.

' Higgins 1989a. Higgins 1989 b.

X"~oote, S.J., Kyle, D.E., Martin, R.K., Odduola, A.A., Forsyth, J., Kemp, S., and Cowman, A.F. 1990 Several alleles of the multidrug-resistance gene are closely linked to chloroquine resistance in Plasmodium falcipamm. Nature 345: 255-258.

'"' Rubio, J.P., and Cowman, A.F. 1994. Plasmodium falciparum: the pfmdr2 protein is not overexpressed in cloroquine-resistant isolates fo the malaria parasite. Expenmental Parasitology 42:83-92.

'"Su, X., Kirkman L.A., Fujioka, H., and Wellems, T.E. 1997. Complex polymorphism in a -330 kDa protein are linked to chloroquine-resistant P. falclparum in Southeast Asia and Africa. Cen 91:593-603.

" Fidock, D.A., Nomura, T., Talley, A., Su, X-S., Cooper, R.A., Wootton, J.C., and Wellems, T.E. Mutations in a putative transporter gene linked without exception to chloroquine resistance in P. falciparum (tentative title), in prepamtion.

"' Djimde, A., Doumbo, O.K., Kayentao, K., Doumbo, S., Diourte, Y., Coulibaly, D., Cortese, J.F., Ssu, X-S., Fidock, D., Nomura, T., Wellems, T.E. and Plowe, C.V. In vivo chloroquine responses and pftcr polymorphism in Bandiagra, Mali (tentative title), in preparation.

-- - -

XVii Kirnura, E., Mattei, D., Mana di Santi, S., and Scherf, A. 1990. Genetic diversity in the major merozoite surface antigen of Plasmodium falciparum: high prevalence of a third polymorphic form detected in strains derived from malaria patients. Gene. 91: 57-62

XViii Mercereau-Puijalon, O., Fandeur T., Bonnefoy, S., Jacquemot, C., and Sartou, J.L. 1991. A study of the genomoc diversity of Plasmodium falciparum in Senegal. 2. Typing by the use of the polymerase chair reaction. Acta Trop. 49: 293-304.

Snewin, V.A., Herrera, M., Sanchez, G., Scherf, A., Langsley, G., and Herrera, S. 1991. Polymorphism of the alleles of the merozoite surface antigend MSA 1 and MSA2 in Plasmodium falcipamm wild isolates from Co lombia. Mol. Biochem. Parasitol:49: 265-276. .

" Tanabe, K., Mackay, M., Goman, M., and Scaife, J.G. 1987. Allelic dimorphism in a surface antigen gene of the malaria parasite. Plasmodium falcipamm. J. Mol. Biol. 195: 31 5- 287.

mi Contarnin, H., Fandeur, T., Rogier, C., Bonnefoy, S., Konate, L., Trape, J.F., and Mercereau- Puijalon, 0. 1996. Different genetic characteristics of Plasmodium falciparum isolates colected during successive clinical malaria episodes in Sengalese children. Amencan Journal of Torpical Medicine and Hygiene 54632-643.

~i Marshall, V.M., Anthony, R.L., Bangs, M.J., Pumomo, R.F., Anders, A. and Coppel, R.L. . 1994. Allelic variants of the Plasmodium falciparum merozoite surface antigen 2 (MSA-2) in a geographically restriced area of Irain Jaya. Mol. Biochem. Parasitol. 63: 13-21.

~ i i Marshall, V.M., Coppel, R.K., Martin, A.M., Oduola, J., Anders, R.F., and Kemp, D.J. 1991. A Plasmodium falciparum MSA-2 gene apparently generated by intragenic recombination between the two allelic families. Mol. Biochem. Parasitol. 45: 349-352

"'" Arnot, D.E., Roper, C., and Bayourno, R.A.L. 1993. Digital codes from hypervariable tandemly repeated DNA sequences in the Plasmodium falcipamm circumporozoite gene can genetically barcode isolates. Mol. Biochem. Parasitol. 61 : 15-24.

xxv Lockyer, M.J., Marsh, K., and Newbold, S.I. 1989. Wild isolates of Plasmodium falciparum show extensive polymorphism in T cell epitopes of the circunsporozoite protein. Mol. Biochem. Parasitol. 37: 275-280.

XXYii del Portillo, H.A., Longacre, S., Khouri, E., and David, P.H. 1991. Primary structure of the merozoite surface antigen 1 of Plasmodium vivax reveals sequences conserved between different Plasmodium species. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 4030-4034.

x x v i i i Arnot, D., Bamwell, J.W., Tarn, J.P., Nussenzweing, V., Nussenzwein, R.S., and Enea, V. 1985. Circumsporozoite protein of Plasmodium vivax: gene cloning and characterization of the immunodominant epitope. Science 230: 815-817

nix del Portillo, H.A., D., Laura, B.P., Anrnaria, A.C. and Alexander, L. 1993. Amplification of singlecopy genes of Plasmodium vivax from two drops of peripheral blood of infected patients. J. Protozool. Res. 3: 20- 24.

- Craig, A.A., and Kain, K.C. 1996. Molecular analysis of strains of Plasmodium vivaxform paired primary and relapse infections. The Journal of lnfectious Diseases 174: 373- 379.

-' Kolakovich, K.A., Ssengoba, A., Wojcik, K., Tsubol, T., Al-Yaman, F., Alpers, M., and Adams, J.H. 1996. Plasmodium vivax: Favored gene frequencies of the merozoite surface protein-1 and the multiplicity of infection in a malaria endemic reg ion. Expreimental Parasitology, 83: 1 1-1 8.

-" Qari Shoukat H., Ya-Ping, S., Povoa M.M., Alpers M.P., Deloron P., Murphy G.S., Horjosuwarno S., and Lal, A.A. 1993. Global occurrence of Plasmodium vivax - like human riialaria parasite. Journal of lnfectious Diseases, 168: 1485-1489.

-Iii Kein, K.A., Brown, D.L., Ripley, W., and Webster, K. 1993. Response of Plasmodium vivar variants to chloroquine as determined by microscopy and quantitative polymerase chain reaction. Am. J. Trop. Med. Hyg. 49 (4):478.484.

-'"~ann, V.H., Good, M.F., and Saul, A. 1995. Diversity in the circunmsporozoite protein of Plasmodium vivas: Does it matter? Parasitology Today 1 1 : 33-36. - Cogswell, F.B. 1992. The hypnozoite and relapse in primate malaria. Clin Microbiol Rev. 5: 26-35.

-"~gglete, T. 1990. Production of monoclonal antibodies against antimalarial drugs for use in immunoassays. In: Navaratnam V., and Payne D. 1990. The Validation of Chemical and lmmunological Test for Antimalarials in Body Fluids: Papers Presented at a WHOlUniversity Sains Malaysia Worksgop. International Monogmph Senes No. 3,34-63.

Oliveira, D.A., B.P. Holloway, E.L. Durigon, W.E. Collins & A.A. Lal. 1995. Polymerase Chain Reaction and a Liquid-Phase, Nonisotopic Hybridization for Species-specific and Sensitive Detection of Malaria Infection. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 52(2): 1 39-1 44.

ANEXO 1

HOJA DE CONSENTIMIENTO

Marcadores moleculares de Plasmodium vivax asociados con resistencia a cloroquina y recurrencias

Buenos dlas (tardes), mi nombre es y trabajo en la Universidad del Valle en colaboracion con el Ministero de Salud. En esta oportunidad estamos realizando un estudio para identificar las caracteristicas de los parasitos que causan el paludismo y que ya no responden al tratamiento con cloroquina. Las pastillas que usualmente le da el Colaborador Voluntario de Malaria contienen la cloroquina y casi siempre esle mejor tratamiento para la malaria O paludismo en su comunidad.

El paludismo es un problema importante de salud publica en ciertas partes de Guatemala y actualmente se trata con cloroquina en nuestro pais. Sin embargo se ha encontrado que algunos de los parasitos del paludismo se han vuelto resistentes a la cloroquina, en varias partes del mundo y también en esta regibn de Guatemala. Las personas infectadas con estas cepas (tipos) resistentes no se curan con este medicamento. Como usted tiene paludismo ahora, le preguntamos si usted quiere participar en este estudio. Su ayuda nos permitira entender mejor Io que pasa en las comunidades con el paludismo.

Si usted decide participar en nuestro estudio, nosotros Io vamos a tratar con cloroquina y primaquina. Ademas, vamos a necesitar pincharles el dedo con una lanceta estéril , para obtener unas gotas de sangre. Se van a necesitar ocho muestras de sangre durante todo el estudio: una muestra antes de tomarse el tratamiento y al 3, 7, 14, 28 dlas y a los 2, 3, 4, 5, y 6 meses después de iniciado su tratarniento. La sangre se va a analizar para determinar la presencia de parasitos y si usted esta absorbiendo la cloroquina.

Si la cloroquina en combinacion con la primaquina no cura su paludismo, usted va a recibir otro medicamento. Si en cualquier momento, durante el estudio su paludismo se agrava, nosotros vamos a arreglar su traslado al Centro de Salud para que reciba tratamiento adicional.

No existe ningun riesgo si usted participa en el estudio. El LSnico inconveniente es el pinchazo para tomar la muestra de sangre que usualmente duele muy poco. No tenemos fondos para cubrir gastos, nada mas que el tratamiento gratis para el paludismo. Si usted decide no participar en el estudio, de todas formas va a recibir el tratamiento gratis que proporciona el colaborador voluntario de su comunidad.

Si usted participa en este estudio nos va a ayudar a entender mejor Io que pasa en comunidades con paludismo donde los parasitos se han vuelto resistentes a la cloroquina y con el tiempo poder dar mejores tratamientos. Ademas si usted vuelve a contraer paludismo, vamos a poder detectarlo en las muestras de sangre que le vamos a estar tomando y va a recibir su tratarniento mas raapido.

Nadie mas que el equipo de estudio va a saber de su participacion en el mismo. No se va a proporcionar ninguna informacion que Io identifique personalmente en cualquier reporte O

informe. Si tiene alguna pregunta acerca del estudio usted puede comunicarse con la persona encargada del Puesto de Salud de su comunidad, con el Dr. Henandez en el Centro de Salud de Tiquisate O con Lic. Celia Corddn de Rosales en la Universidad del Valle de Guatemala, al teléfono 364-0336 al 40.

Me explique correctamente O no fue los suficientemente claro (clara) y tiene alguna duda. Quiere que le explique algo mas? Tiene alguna pregunta? Usted quiere participar en el estudio?

SI EL PACIEN'TE DlCE QUE "NO":

Muchas gracias por escucharme. Aqui tiene su tratamiento para paludismo.

SI EL PACIEN'TE DlClE QUE "SI":

Muchas gracias por su colaboracion. Necesito que firme aqul abajo. Su firma constituye su acuerdo para participar en el estudio y su permis0 para tomarle las muestras de sangre. Recuerde que su participacidn es completamente voluntaria y usted puede dejar de participar en el moment0 en que usted decida sin ninguna consecuencia negativa para usted, excepto el hecho de no poder determinar si el tratamiento para paludismo era el adecuado para curar la enfermedad en su comunidad.

Nombre del participante Firma del participante

Fecha Firma del testigo

ANEXO 2

From the document "Antimalarial Drug Policies", World Health Organization 1994 WHO/MAU94.1070

Study subjects classification

1) Clinical Response:

Earlv clinical failures: Study subjects with parasitaemTa and persistent fever on day 3, i.e. 20 to 3 days afier onset of therapy as well as those whose condition has worsened before day 3.

Late clinical failures: Study subjects with initial clearance of fever (body temperature ~37 .51~) on day 3 but with persistentlrecurrent parasitaemia and recurrent fever (body temperature >37.5ic) at a later time, with or without other symptoms.

Clinical success: The remainder (excepting those withdrawn because of a change of diagnosis, see above, 6.2.2). Note that some of the clinical successes will have asymptomatic persistentlrecurrent parasitaemia.

2) Parasitoloqical response: The classification cannot be identical to the traditional S to Rlll classification. It is therefore recommended to use different labels:

3R: density on day 3 more than 25% of density on day O a alternative antimalarial therapy was required on or before day 3;

2R: positive on day 3, with a density not more than 25% of density on day 0, and either positive on day 7 or alternative antimalarial therapy was required on any of days 3 to 7;

1 R: positive on day 3 with density not more than 25% of density on day O and negative on day 7, negative on day 3 and positive on days 7 andlor 14.

0: the remainder i.e. positive on day 3 with a density not more than 25% of the density of day O and negative on days 7 and 14 or negative on days 3,7 and 14.

ANEXO 3

ELISA Para l a Deteccion de Cloroquina en Orina O Sangre (se* Egglete, 1990 con modificaciones)

Preparacidn de Standards para Curva de Calibracion:

A partir de una solucidn de 320 ng CQImL se preparan diluciones aseriadas de 320 n g h l hasta 0.078 gn/mL, de la siguiente forma:

1. Se agrega 1 mL de PBS l x , conteniendo satigre en proporcidn 1:3S, una serie de 13 tubos. 2. Al tubo 13, se agrega 1 mL de solucidn de cloroquina, en PBSIsangre 1:35, (320 nghnL) y se mezcla

bien. Para preparar la solucidn 320 ng/mL a partir de una solucidn stock de 32 ug/mL, se disuelven 10 uL del stock en 990 uL de PBSlsangre.

3. A partir de este tubo se realizan diluciones seriadas, transfiriendo 1 mL del tubo 13 al tubo 12. Se mezcla la solucidn y se repiten los mismos pasos hasta el tubo 1. Esto proporciona una serie de calibracidn de 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.313, 0.156 y 0.78 ng/mL. La serie de calibracidn debe correrse junto con las muestras en cada placa, en especial si son muestras de sangre. Si las muestras son de sangre en pape1 filtro, eluida en PBS, para la serie de calibracion debe utilizarse el mismo buffer.

Curva de Calibracibn:

Antes de realizar la prueba a las muestras, se recomienda revisar los reactivos y las condiciones de la prueba, utilizando una serie de calibracidn de cloroquina en combinacidn con varias diluciones del conjugado CQ7-HRP.

O. Se cubre la placa como se indica en los pasos 1 y 2 de la prueba de ELISA. 1. Se prepara la serie de diluciones de cloroquina en concentraciones desde 160 hasta 0.78 nglmL de

cloroquina. 2. Se agregan 50 ullpozo de la dilucidn 0.078 ng/mL a todos los pozos de la primera colurnna (Al - Hl,

y asi sucesivamente, hasta la dilucidn de 160 ng/mL en la colurnna 12 (A12 - H12). 3. Se preparan diluciones 150, 1:100, 1:200 y 1:400 a partir de la solucidn stock de conjugado CQ7-

m. 4. Se agrega 50 uLIpozo de la dilucidn 1:400 a las filas A y B de la placa (desde Al hasta B12). De igual

forma para las otras diluciones:

50 uL de 1 :200 desde C l hasta Dl2 50 uL de 1:100 desde El hasta F12, y 50 uL de 1 5 0 desde G1 hasta H12.

5. Se realiza el procedimiento normal del ELISA, a partir del paso 7. 6. Se seleccionan las condiciones mas adecuadas desde el punto de vista de la formacidn de color y

sensibilidad.

La mayoria de las lectoras de placas pueden medir densidades dpticas (D.O.) arriba de 2.0

FIGURA 1. Curva de calibracion empleada para determinar la concentracion de cloroquina en sangre a partir de las densidades opticas (D.O.) obtenidas en el ensayo de ELISA-cloroquina, en las muestras del estudio de resistencia a cloroquina en Plasmodium, realizadode junio de 1998 a febrero de 1999 en aldea El Semillero , Tiquisate , Escuintla

Calibracion ELISA CQ (conjugado 1:50)

l -l.= -1 .O -0.5 0.0 0.5 1 .O 1.5 2 .O

Log [CQ] (nglmL)

2. A continuacion se restan los valores de concentracion de cloroquina obtenidos de las muestras de sangre de las de los controles intemos para obtener el valor real en la muestra de sangre.

Preuaracion de soluciones (para 34 muestras, 12 standares y dos controles -positive y negativo-, en duplicado [ l placa de microtitulacibn] )

1. Solucion Reguladora de Fosfatos 1 X (pH 7.4) 1 X 1 OX

KC12.7 mM 0.20 g 2.00 g NaCl 137 mM 8.00 g 80.00 g KH2P04 0.20 g 2.00 g Na2HP04 1.10 g 11.00 g

Se disuelven las sales en 800 rnL de agua destilada-desionizada, Se ajusta el pH a 7.4 y se afora a 1 L. Puede esterilizarse y almacenarse entre 2 - 8 OC.

Si se utilizan fiascos de PBS Dulbecco, se agrega el contenido del fiasco a 1 L de agua destilada y se agita.

Preparacihn de Muestras:

1. Orina: se diluyen las muestras en buffer salino de fosfatos (PBS) en cuatro diluciones: 1 : 10, 1: 100, 1:lOOO y 1:10000.

2. Sangre: 2.1 Completa: se prepara la dilucion de acuerdo al limite de detecci6n requerido: 1: 100 para 50 ng de

cloroquina (CQ)/mL de sangre O 1 :50 para 25 ng CQImL. 2.2 En papel filtro: se eluye un fiagmento de papel filtro correspondiente a 5 uL de sangre en 250 uL

de PBS.

Prueba de ELISA: . 1. Se cubren las placas de microtitulacion con 100 uLIpozo de la dilucidn del anticuerpo monoclonal para

cloroquina. Para preparar la solucion stock, se agrega 200 uL de PBS al via1 F149-12. Se prepara la dilucion de trabajo agregando 100 S del stock a 11 mL de PBS l x .

2. Se cubren las placas y se dejan incubar 2 h a temperatura ambiente. 3. Se descarta la solucidn y las placas se desaguan rhpidamente dos veces con solucion PBSîïween 20

0.05% seguido de dos incubaciones de 1 min. cada una con la misma solution. 4. Se agregan 50 ul/pozo de cada una de las diluciones de la muestra. 5. Se agregan 50 uLIpozo de cada una de las diluciones de los estandares para la cuva de calibracion. 6 . Se agregan 50 uL1placa de una solucion de conjugado CQ7-HRP. 7. Se mezcla agitando suavemente, se cubre la placa y se incuba la placa una hora a temperatura

ambiente. 8. Se lava las placas de igual forma que en el paso 3. 9. Se agrega 100 U p o z o de solucion de sustrato y se incuba 30-45 min. en la oscuridad, a temperatura

ambiente. 10. Se detiene la reaccion agregando 50 ullpozo de H2SO4 1 M O HCI 2 N. 1 1. Se lee la placa a 492 (490) nm. Si la formacion de color es fuerte, se puede leer a 450 nm..

Prueba de ELISA de correcci6n (control interno):

1. Se pone a eluir un bocado de papel filtro de sangre negativa en 300 uL de PBS 1X por dos horas a temperatura ambiente para obtener el mismo background.

2. Se eluye un bocado de papel filtro del control interno ( hrea de papel sin sangre a la par de la gotita que se tom6 como muestra) en 250 uL del eluido de sangre negativa toda la noche a 4°C.

3. Realizar todos los pasos de la prueba de la misma manera que para las muestras.

Chlculo de los Resultados:

1. Para analizar los datos, se grafica los valores de D.O.(eje y) vrs el log de la concentraci6n de cloroquina (eje x). Se obtiene la ecuacidn de la c w a m b conveniente y se extrapolan los valores de D.O. de las muestras para deterrninar la concentraci6n de cloroquina tanto en las muestras de sangre

.- como en las de los controles internos. La FIGURA 1 presenta la cuva le calibracion utilizada para el anhlisis de muestras del estudio.

2. Solucion de Lavado (1 L)

Solucion reguladora de fosfatos 10 X 100 mL Tween 20 500 uL Agua destilada desionizada 900 mL

Si se utilizo PBS Dulbecco, solamente se agrega 500 uL de Tween 20.

3. Solucion stock de cloroquina

Se prepara una solucibn madre de cloroquina (320 ug/mL) disolviendo 32 mg (0.032 g) de cloroquina (Sigma) en 100 mL de PBS. La solucion stock (320 ng/mL) se prepara diluyendo 10 uL de solucion madre en 10 mL de PBS.

4. Solucion diluvente para coniugado

PBS 1X Albumina bovina sdrica (BSA) Tween 20

Se disuelve la BSA en el PBStTween.

5. Solucion de Coniugado:

Al via1 de conjugado CQ7-HRP se le agrega 200 uL de PBS para preparar el stock. La solucion de trabajo se prepara agregando 100 uL de stock a 5 mL de solucion diluyente.

6. Solucion de Sustrato:

Se disuelve una tableta de fosfato/citrato/ureaper6xido, pH 5 en 100 mL de agua destilada. A 10 mL de esta solucion se le agrega 5 mg (0.005 g) de orto-fenilendiamino (OPD).

7. Acido Clorhidrico. 2 N (500 mL1

Acido clorhidrico Agua destilada-desionizada

- En campana de extraccion, muy lentamente, se agrega el hcido fosforico al agua y se agita bien.

8. Diluvente PBSIsanme 1 :35: Sangre fiesca 432.60 uL PBS l x 14,567.40 uL

Referencia:

Egglete, T. 1990. Production of monoclonal antibodies against antirnalarial drugs for use in imrnunoassays. In: Navaratnarn V., and Payne D. 1990. The Validation of Chernical and Immunological Test for Antimalarials in Body FIuids: Papers Presented at a WHOIUniversity Sains Malaysia Worksgop. International Monograph Series No. 3, 34-63.

Ultima fecha de actualizaci6n: 8/W99

ANEXO 4

PCR PARA AMPLIFICACION DE LA REGION 18s DEL ADNR DE PLASMODIUMSP

1. EXTRACCION ADN

La extraccion de las muestras se realizo utilizando el kit comercial IsoQuick.

2 . REACCION DE PCR

a. Amplification del gen completo de la region 18s (2.2 kb, utilizando los primers proporcionados por 1. Goldrnan, US CDC; DIAGRAMA 1). Antes de preparar lamezcla de PCR se dejan todos los materiales y reactivos bajo una lhmpara de luz ultravioleta por 15 min. A continuacion, se preparan las dos mezclas, dependiendo de la cantidad de muestras a procesar, las cuales se dividen posteriormente en los îubos de reaccion.

Mezcla 1 (25 ullmuestra): en cada tub0 de reaccion se colocan 23 uL de la mezcla 1 y posteriormente se agregan los 2 uL de muestra.

Mezcla 2 (25 ullmuestra):

Volumen por cada muestra

(uL) 2.0 0.15

0.15

0.88

2 1.97

Reactivo (concentracion del stock)

Muestra (ADN extraido) Primer AL 1 10 (100 uh4) 5' AAC CTG GTT GAT CTT GCC 3' Primer AL 11 1 (100 uM) 5' TAA TGA TCC TTC CGC AGG 3' DNTP's, solucion stock (20 mM clu) H20

Concentracion final

1 uM

1 uM

0.2 mM clu

Reactivo (concentracion del stock)

Se agregan dos gotas de aceite minera1 a cada tub0 y se realiza el PCR de acuerdo al siguiente programa (termociclador Perkin-Eimer):

Buffer (1 0X) Taq (5 u/uL) Hz0

Etapa Temperatura ("C) Tiempo Desnaturalizacion inicial 94 2 min

Concentraci6n final

Desnaturalizacion Hibridacion

Volumen por cada muestra

1 X 3.75 u

10 seg 30 seg

(uL) 5

0.75 19.25

Extension I l

68 2 min

b. Se prepara una segunda reaccion del amplification para una region interna del gen, (0.67 kb, s e g h Oliveira et al. 1995; DIAGRAMA 1) de la siguiente forma:

10 seg 30 seg

2 min extendido 20 seg / ciclo

7 min

20 ciclos Desnaturalizacion Hibridacion

Extension

Extension final

Se agregan dos gotas de aceite mineral a cada tubo y se realiza el PCR de acuerdo al siguiente programa (termociclador Perkin-Elmer):

94 3 7 68

68

React ivo (concentracion del stock)

Muestra (productos del primer PCR; gen completo) Primer BI0 1 (100 uM) 5' ATC AGC m TGA TGT TAG GGT ATT G 3' Primer AL553 (100 uM) 5' TCC TAT TAA TCG TAA CTA AGC 3' DNTP's, solucion stock (20 mh4 clu) Buffer 1 OX Taq (5uIuL) Hz0

Diez microlitros de producto de PCR se mezclan con 2 uL de colorante (loading buffer, Sigma) y se separan en un gel de agarosa al 1% en TBE l x , conteniendo bromuro de etidio (l:32000). La electroforesis se realiza por 1 hora a 80 volts y luego se fotograffa el gel con luz W.

Concentracion final

l u M

1 uM

0.2 mM c/u 1 X

2.5 u

Etapa Desnaturalizacion inicial

45 ciclos Desnaturalizacion Hibridacion Extension Extension final

3. PREPARACION DE SOLUCIONES:

Volumen por cada muestra .

2

0.5

0.5

0.5 5

0.25 4 1.25

a:- Buffer TBE 10X

Temperatura (OC) 95

94 37 72 72

Tris base 108.00 g Acido Borico 55.00 g EDTA 0.5 M, pH 8.0 40.00 mL (7.44 g de EDTANa2.2H20 en 40 mL, se ajusta el pH con hidroxido de sodio en perlitas). Agua destilada desionizada hasta los 1000 mL

Tiempo 5 min

1 min 1 min 2 min min

Especificaciones de Reactivos

REACTIVO CASA COMERCIAL Primer Bio 1 Primer AL553 Primer AL 1 1 0 Primer AL 1 1 1 Deoxinuclétidos tri-fosfato

~. 1 NUMERO DE CATALOGO ]

Dttp Taq DNA polimerase y buffer de

Macromolecular Resources Macromolecular Resources Macromolecular Resources Macromolecular Resources

Promega

reaccion 10X con cloniro de magnesio. IsoQuick (kit comercial de extraccion de ADN)

-- --- --- --

Promega U123 1 M2865

Orca Research Inc. MXT-020-100

DIAGRAMA 1. Diagrama del gen ADNr 18s y ubicacibn de sondas utilizadas para su deteccibn en fase liquida y no radiactiva.

A. Gen 18s del ADN ribosomal de Plasmodium vivax (Gene Bank, accession No. U93233)

1 ggataactac ggaaaagctg tagctaatac ttgctttagc actcttgatt catttcttga 6 1 gtgtgtactt gttaagcctt ttaagaaaaa agttattaac ttagggaatt ataacaaaga

12 1 agtgacacgt aatggatccg tccattttta gtgtgtatca atcgagtttc tgacctatca I'riiiier Hio I 18 1 gcmtgatg ttagggatt ggcctaacat ggctatgacg ggtaacgggg aattagagtt 241 cgattccgga gagggagcct gagaaatagc taccacatct aaggaaggca gcaggcgcgt 301 aaattaccca attctaaaga agagaggtag tgacaagaaa taacaataca aggccaatct 36 1 ggctttgtaa ttggaatgat gggaatttaa aaccttccca aaactcaatt ggagggcaag 42 1 tctggtgcca gcagccgcgg taattccagc tccaatagcg tatattaaaa ttgttgcagt 48 1 taaaacgctc gtagttgaat ttcaaagaat cgatatttta agcaacgctt ctagcttaat . , , L L . . I ~ I ( T

541 ccaca . - i \ L L , )rLga attatgt gttcttttaa 601 ttaaaatgat tccttthag gactttcttt gcttt-=-II =g.i ,~=icir~ gtactttga u i l i,i + L :QO 661 gtaaattaga gtgttcaaag caaacagata tagcattgcg cgtttgaata ctacagcatg 72 1 gaataacaaa attgaacaag tcagaatttt gttctttttt cttattttgg cttagttacg Primer AL553 78 1 attaatagga gtagcttggg ggcatttgta ttcagatgtc agaggtgaaa ttcttagatt 84 1 ttctggagac aaacaactgc gaaagcattt gcctaaaata cttccattaa tcaagaacga 90 1 aagttaaggg agtgaagacg atcagatacc gtcgtaatct taaccataaa ctatgccgac 96 1 taggctttgg atgaaagatt ttaaaataag aattttctct tcggagttta ttcttagatt

102 1 gcttccttca gtgccttatg agaaatcaaa gtctttgggt tctggggtga gtattcgcgc 108 1 aagcgagaaa gttaaaagaa ttgacggaag ggcaccacca ggcgtggagc ttgcggctta 1 14 1 atttgactca acacgggaaa actcactagt ttaagacaag agtaggattg acagattaat 120 1 agctctttct tgatttcttg gatggtgatg catggccgtt tttagttcgt gaatatgatt 126 1 tgtctggtta attccgataa cgaacgagat cttaacctgc taattagcgg caaatacgat 132 1 atattcttac gtgggactga attcggttga tttgcttact ttgaagaaaa tattgggaaa 13 8 1 cgtaacagtt tccctttccc ttttctactt agttcgcttt tcatactgtt tctttttcgc 144 1 gtaagaatgt atttgcttga ttgtaaagct tcttagagga acgatgtgtg tctaacacaa 1 50 1 ggaagtttaa ggcaacaaca ggtctgtgat gtccttagat gaactaggct gcacgcgtgc 156 1 tacactgata tgtataacga gttattaaaa ttacgattca gcttgctgtt tcgtamtt 162 1 cctccactga aaagtgtagg taatctttat cagtacatat cgtgatgggg atagattatt 168 1 gcaattatta atcttgaacg aggaatgcct agtaagcatg attcatcaga ttgtgctgac 174 1 tacgtccctg cccmgtac acaccgcccg tcgctcctac cgattgaaag atatgatgaa 1 80 1 ttgtttggac aagaaaaagg gggattatat ctcctttttt ctggaaaaac cgtaaatcct 1 86 1 atcttttaaa ggaaggagaa gtc

B. Gen 18s del ADN ribosomal de Plasmodium falciparum (GeneBank, accession No. M19172)

1 aacctggttg atcttgccag tagtcatatg cttgtctcaa agattaagcc atgcaagtga 6 1 aagtatatat atattttata tgtagaaact gcgaacggct cattaaaaca gttatagtct

12 1 acttgacatt tttattataa ggataactac ggaaaagctg tagctaatac ttgctttatt 18 1 atccttgatt tttatcmg gataagtatt tgttaggcct tataagaaaa aagttattaa 24 1 cttaaggaat tataacaaag aagtaacacg taataaattt attttattta gtgtgtatca 301 atcgagtttc tgacctatca gcttttgatg ttagggtatt ggcctaacat ggctatgacg Primer Bio I 361 ggtaacgggg aattagagtt cgattccgga gagggagcct gagaaatagc taccacatct 42 1 aaggaaggca gcaggcgcgt aaattaccca attctaaaga agagaggtag tgacaagaaa 48 1 taacaatgca aggccaam ttggmtgt aattggaatg gtgggaam aaaaccttcc 54 1 cagagtaaca attggagggc aagtctggtg ccagcagccg cggtaattcc agctccaata 60 1 gcgtatatta aaattgttgc agttaaaacg ctcgtagttg aamcaaag aatcgatatb 66 1 ttattgtaac tattctaggg gaactatttt agcttttggc ttîaatacgc ttcctctatt 72 1 attatgttct ttaaataaca aagattcm ttaaaatccc cacttttgct mgcttttt 78 1 tggggatttt gttacmga gtaaattaga gtgttcaaag caaacagtta aagcatttac 84 1 tgtgtttgaa tactatagca tggaataaca aaattgaaca agctaaaatt ttttgttctt 901 ttttcttatt ttggcttagt tacgattaat aggagtagct tggggacatt cgtattcaga Primer A L 3 3 96 1 tgtcagaggt gaaattctta gattttctgg agacgaacaa ctgcgaaagc amgtctaa

102 1 aatacttcca ttaatcaaga acgaaagtta agggagtgaa gacgatcaga taccgtcgta 108 1 atcttaacca taaactatgc cgactaggtg ttggatgaaa gtgttaaaaa taaaagtcat 1 14 1 cmcgaggt gacttttaga ttgcttcctt cagtacctta tgagaaatca aagtctttgg 120 1 gttctggggc gagtattcgc gcaagcgaga aagttaaaag aattgacgga agggcaccac 126 1 caggcgtgga gcttgcggct taamgact caacacgggg aaactcacta gtttaagaca 132 1 agagtaggat tgacagatta atagctcm cttgamct tggatggtga tgcatggccg 13 8 1 tttttagttc gtgaatatga mgtctggt taattccgat aacgaacgag atcttaacct 144 1 gctaattagc ggcgagtaca ctatattctt amgaaatt gaacataggt aactatacat 150 1 ttattcagta atcaaattag gatattttta ttaaaatatc cttttccctg ttctactaat 1561 aaattgtttt ttactctatt tctctcttct tttaagaatg tacttgcttg attgaaaagc 162 1 ttcttagagg aacattgtgt gtctaacaca aggaagttta aggcaacaac aggtctgtga 168 1 tgtccttaga tgaactaggc tgcacgcgtg ctacactgat atatataacg agtttttaaa 174 1 aatatgctta tamgtatc mgatgctt ataffltgca tacttttcct ccgccgaaag 180 1 gcgtaggtaa tcmatcaa tatatatcgt gatggggata gattattgca attattaatc 186 1 ttgaacgagg aatgcctagt aagcatgatt catcagattg tgctgactac gtccctgccc 192 1 mgtacaca ccgcccgtcg ctcctaccga ttgaaagata tgatgaattg mggacaag 198 1 aaaaattgaa ttatattctt tttittctgg aaaaaccgta aatcctatct tttaaaggaa 204 1 ggagaagtcg taacaaggtt tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta

Nota: No se incluye la ubicaci6n de los primers del gen completo (AL 110, AL I l l ) , ya que se encuentran ubicados fuera de las secuencias reportadas para este gen.

Referencia: Oliveira, D.A., B.P. Holloway, E.L. Durigon, W.E. Collins & A.A. Lal. 1995. Polyrnerase Chain Reaction and a Liquid-Phase, Nonisotopic Hybridization for Species-specific and Sensitive Detection of Malaria Infection. Am J Trop Med Hyg 52(2):139-144.

Ultima fecha de actualizaci6n: 28NIW1999

ANEXO 5

DETECCION DE PRODUCTOS DE AMPLIFICACION DEL GEN ADNr 18 S DE PLASMODIUM SP. A TRAVÉS DE ELISA NO RADIOACTIVO.

1. PROCEDIMIENTO DE ELISA

a. Se cubren las placas de microtitulacion E.I.A.R.I.A. (Costar, fondo plano) con 100 uL/pozo de una solucion de 2ng/uL de albhnina bovina sérica biotinilada, en PBS. Se incuba a 4°C toda la noche.

b. Las placas se lavan ires veces por tres min. cada vez con una solucion de PBSITeen 20 0.05%. b

c. Se saturan las placas con 100 uL de una solucion de 10 ng/uL de streptavidina en buffer de ensayo (PBS con gelatina 5% y Tween 20 0.15%) y se incuban 1 h a 37°C.

d. Se lavan las placas como anteriormente y se pueden utilizar inmediatamente O almacenar a -20°C.

e. Se agregan 5 uL de productos de PCR a dos diferentes soluciones de 100 uL de buffer de hibridacion, cada una conteniendo una concentraci6n fmal de 200 ng,mL de cada sonda especifica para cada especie:

Plasmodium falciparum: PFD3 Dig (5' TAA TAA TAG AGG AAG CGT A n 3') PFD 1 O Dig (5' CCT ATG TTC AAT TTC AAA TAA 3') TM40 Dig (5' TAG TTC CCC TAG AAT AGT TAC AAT 3')

Plasmodium vivax: AL6 16 Dig (5' GAT ACG AAG TAT CAG TTA 3') AL6 15 Dig (5' AGC AAA ATG CGC ACA AAG 3') AL289 Dig (5' TAA CAA GGA CTT CCA AGC C 3')

El DIAGRAMA 1 indica la posiciones de hibridizacion esperarada para cada una de las sondas.

f. Se desnaturaliza a 95°C por 5 min y se hibridiza a temperatura ambiente por 30 min.

g. La placa de microtitulacion se transfiere al baiio térmico y se incuba a 37°C por 1 h.

h. Se lavan las placas tres veces por 3 min. cada vez con soluci6n de lavado.

i. Se agregan 100 uLIplaca de una soluci6n de fiagmento Fab anti-digoxigenina-peroxidasa en buffer de ensayo a una dilusion 1:5000. La soluci6n restante se guarda como control para ser probada con la soluciOn de sustrato. Se incuba la placa a 37°C por media hora.

j. Se lavan las placas tres veces por 3 min. cada vez con soluci6n de lavado.

k. Se agregan 75uLIpozo de soluci6n de 3,3',5,5'-tetramethyl-benzidina (TMB, 4g/L en buffer de citratos, conteniendo 0.02% de H202) y, después de 10 min, se detiene la reaccion con 75uUpozo de

. hcido fosforico 2 M.

1. Se leen las placas con una lectora de placas de microtitulaci6n a 450 nm. Se calcula un punto de corte para cada placa, utilizando la siguiente f6rmula:

Punto de corte = X + t 95y% /,,, (DS), donde

X = promedio de absorbancias de muestras normales DS = desviacibn estandar del promedio.

2. PREPARACION DE SOLUCIONES @ara 24 muestras = 1 placa de microtitulaci6n)

a. Solucion Reguladora de Fosfatos 1 X (pH 7.4) - 1 X 1 OX

KC12.7 mM 0.20 g 2.00 g NaCl 137 mM 8.00 g 80.00 g KH2P04 0.20 g 2.00 g NaHP04 1.10 g 11.0 g

Se disuelven las sales en 800 mL de agua destilada-desionizada, Se ajusta el pH a 7.4 y se afora a 1 L. Puede esterilizarse y almacenarse entre 2 - 8 OC.

. b. Solucion de Lavado (1 L) -

Solucidn reguladora de fosfatos 10 X 100 mL Tween 20 500 uL Agua destilada desionizada 900 mL

c. Solucion de ensayo (25 mL) -

PBS l x Gelatina Tween 20

Se disuelve la gelatina en el PBSITween.

d. Solucion SSC 4 X (100 mL) -

NaCl 0.15 M Citrato de sodio, 0.015 M

Se disuelven las sales en 100 rnL de agua destilada-desionizada.

e. Solucion de Hibridizacion (20 mL) -

Solucidn SSC, 4 X HEPES, 20 mM EDTA, 2 mM Tween, 20 0.15% Agua destilada-desionizada

Se preparan dos soluciones (una para cada pool de sondas) conteniendo cada una 200 ng/mL de cada .- una de las sondas, en buffer de hibridizacion. Para 6 mL de buffer de hibridizacion se agregan las

siguientes cantidades de cada una de las sondas especificas a cada especie de Plasmodium:

Para solucion de hibridizacion para P. vivm AL 615 Dig (596 ug/mL) 2.02 uL AL 616 Dig (420 ug/mL) 2.86 uL A1 280 Dig (309 ug/mL) 3.58 uL

Para solucidn de hibridizacidn para P. falciparum TM 40 Dig (346 ug.rnL) 3.46 uL PFD3 Dig (368 ug/mL) 3.26 uL PFD 1 0 Dig (348 ug/mL) 3.44 uL

f. Acido fosforico, 2 M (500 mL) -

Acide fosfdrico (85%, 1.685g/mL) Agua destilada-desionizada

En Campana de extracci6n, muy lentamente, se agrega el hcido fosfdrico al agua y se agita bien. . g, Solucidn de conjugado (12 mL)

Fragrnento Fab anti-digoxigenina-peroxidasa Soluci6n de ensayo

Solucidn de sustrato -TMB Microwell Peroxidase Substrate System- (10 mL)

Solucidn TMB (0.4 g L ) Solucidn de peroxidasa (0.02% H202)

Se dejan estabilizar las dos soluciones a temperatura ambiente y se mezclan. La solucidn debe permanecer de color claro.

3. Especificaciones de Reactivos

NUMERO DE CATALOGO 1 207 733

50-65-00 50-76-0 1 S-4762 A-8549

REACTIVO Fragment0 Fab anti- digoxigenina-peroxidasa TMB Microwell Peroxidase Substrate System Streptavidina Albumina Bovina SCrica Biotinilada

CASA COMERCIAL Boehringer-Mannheim

Kiekegaard & Peny

Sigma Sigma

DIAGRAMA 1. Diagrama del gen ADNr 18s y ubicaci6n de sondas utilizadas para su detecci6n en fase liquida y no radiactiva.

A. Gen 18s del ADN ribosomal de Plasmodium vivai: (Gene Bank, accession No. U93233)

1 ggataactac ggaaaagctg tagctaatac ttgctttagc actcttgatt catttcttga 6 1 gtgtgtactt gttaagcctt ttaagaaaaa agttattaac ttagggaatt ataacaaaga

121 agtgacacgt aatggatccg tccattttta gtgtgtatca atcgagtttc tgacctatca Primer Bio I 18 1 gcttitgatg iîagggîait ggcctaacat ggctatgacg ggtaacgggg aattagagtt 24 1 cgattccgga gagggagcct gagaaatagc taccacatct aaggaaggca gcaggcgcgt 30 1 aaattaccca attctaaaga agagaggtag tgacaagaaa taacaataca aggccaatct 36 1 ggctttgtaa ttggaatgat gggaatttaa aaccttccca aaactcaatt ggagggcaag 42 1 tctggtgcca gcagccgcgg taattccagc tccaatagcg tatattaaaa ttgttgcagt 48 1 taaaacgctc gtagttgaat ttcaaagaat cgatatttta agcaacgctt ctagcttaat \ O I ~ L L ~ . l L - b 16 541 ccacaiL ,LI ; . IL.ILI~L~~ drcga -( L.! X I . ~Lattatgt gttcttttaa - < i 1, .; l c t l l q

60 1 ttaaaatgat tccttttaag gactttcttt gctttgg~rt Sgaaytcçtt gttactttga Soildci AL 289 66 1 gtaaattaga gtgttcaaag caaacagata tagcattgcg cgtttgaata ctacagcatg 721 gaataacaaa attgaacaag tcagaatttt gttctttttt cttattttgg cttagttacç Primer AL553 78 1 anaatagga gtagcttggg ggcatttgta ttcagatgtc agaggtgaaa ttcttagatt 84 1 ttctggagac aaacaactgc gaaagcattt gcctaaaata cttccattaa tcaagaacga 90 1 aagttaaggg agtgaagacg atcagatacc gtcgtaatct taaccataaa ctatgccgac 96 1 taggctttgg atgaaagatt ttaaaataag aamtctct tcggagttta ttcttagatt

102 1 gcttccttca gtgccttatg agaaatcaaa gtctttgggt tctggggtga gtattcgcgc 108 1 aagcgagaaa gttaaaagaa ttgacggaag ggcaccacca ggcgtggagc ttgcggctta 1 14 1 atttgactca acacgggaaa actcactagt ttaagacaag agtaggattg acagattaat 120 1 agctctttct tgatttcttg gatggtgatg catggccgtt tttagttcgt gaatatgatt 1261 tgtctggtta attccgataa cgaacgagat cttaacctgc taattagcgg caaatacgat 132 1 atattcttac gtgggactga attcggttga tttgcttact ttgaagaaaa tattgggaaa 138 1 cgtaacagtt tcccmccc ttttctactt agttcgcttt tcatactgtt tctttttcgc 144 1 gtaagaatgt atttgcttga ttgtaaagct tcttagagga acgatgtgtg tctaacacaa 150 1 ggaagtttaa ggcaacaaca ggtctgtgat gtccttagat gaactaggct gcacgcgtgc 156 1 tacactgata tgtataacga gttattaaaa ttacgattca gcttgctgtt tcgtattttt 162 1 cctccactga aaagtgtagg taatctttat cagtacatat cgtgatgggg atagattatt 168 1 gcaattatta atcttgaacg aggaatgcct agtaagcatg attcatcaga ttgtgctgac 174 1 tacgtccctg cccmgtac acaccgcccg tcgctcctac cgattgaaag atatgatgaa 180 1 ttgtttggac aagaaaaagg gggattatat ctcctttttt ctggaaaaac cgtaaatcct 186 1 atcttttaaa ggaaggagaa gtc

B. Gen 18s del ADN ribosomal de Plasmodium falciparum (Gene Bank, accession No. M19172)

1 aacctggttg atcttgccag tagtcatatg cttgtctcaa agattaagcc atgcaagtga 61 aagtatatat atattttata tgtagaaact gcgaacggct cattaaaaca gttatagtct 12 1 acttgacatt tttattataa ggataactac ggaaaagctg tagctaatac ttgctttatt 18 1 atccttgatt tttatctttg gataagtatt tgttaggcct tataagaaaa aagttattaa 24 1 cttaaggaat tataacaaag aagtaacacg taataaattt attttattta gtgtgtatca 301 atcgagtttc tgacctatca gcttttgdtg ttagggvdtt ggcctaacat ggctatgacg Primer Bio I 36 1 ggtaacgggg aattagagtt cgattccgga gagggagcct gagaaatagc taccacatct 42 1 aaggaaggca gcaggcgcgt aaattaccca attctaaaga agagaggtag tgacaagaaa 48 1 taacaatgca aggccaattt ttggttttgt aattggaatg gtgggaattt aaaaccttcc 54 1 cagagtaaca attggagggc aagtctggtg ccagcagccg cggtaattcc agctccaata 60 1 gcgtatatta aaattgttgc agttaaaacg ctcgtagttg aatttcaaag aatcgatatt 661 ttattgtaac tattctaggg gaactatttt agcttttggc tttaatacgc ttcctctatt Sonda TM40 72 1 attatgttct ttaaataaca aagattcttt ttaaaatccc cacttttgct tttgcttttt Sonda PFD3 78 1 tggggatttt gttactttga gtaaattaga gtgttcaaag caaacagtta aagcatttac 84 1 tgtgtttgaa tactatagca tggaataaca aaattgaaca agctaaaatt ttttgttctt 901 ttttcttatt ttggcttagt tacgattaat aggagtagct tggggacatt cgtattcaga Primer AL553 961 tgtcagaggt gaaattctta gattttctgg agacgaacaa ctgcgaaagc atttgtctaa 102 1 aatacttcca ttaatcaaga acgaaagtta agggagtgaa gacgatcaga taccgtcgta 108 1 atcttaacca taaactatgc cgactaggtg ttggatgaaa gtgttaaaaa taaaagtcat 1 14 1 ctttcgaggt gacttttaga ttgcttcctt cagtacctta tgagaaatca aagtctttgg 120 1 gttctggggc gagtattcgc gcaagcgaga aagttaaaag aattgacgga agggcaccac 1261 caggcgtgga gcttgcggct taatttgact caacacgggg aaactcacta gtttaagaca 132 1 agagtaggat tgacagatta atagctcttt cttgatttct tggatggtga tgcatggccg 13 8 1 tttttagttc gtgaatatga tttgtctggt taattccgat aacgaacgag atcttaacct 144 1 gctaattagc ggcgagtaca ctatattc:: Liirtga,i'irt gadcataggt aactatacat Sond'i I'FD 10 150 1 ttattcagta atcaaattag gatattttta ttaaaatatc cttttccctg ttctactaat 156 1 aaattgtttt ttactctatt tctctcttct tttaagaatg tacttgcttg attgaaaagc 162 1 ttcttagagg aacattgtgt gtctaacaca aggaagttta aggcaacaac aggtctgtga 168 1 tgtccttaga tgaactaggc tgcacgcgtg ctacactgat atatataacg agmttaaa 174 1 aatatgctta tatttgtatc tttgatgctt atattttgca tacttttcct ccgccgaaag 1 80 1 gcgtaggtaa tctttatcaa tatatatcgt gatggggata gattattgca attattaatc 1861 ttgaacgagg aatgcctagt aagcatgatt catcagattg tgctgactac gtccctgccc 192 1 tttgtacaca ccgcccgtcg ctcctaccga ttgaaagata tgatgaattg tttggacaag 1981 aaaaattgaa ttatattctt ttttttctgg aaaaaccgta aatcctatct tttaaaggaa 204 1 ggagaagtcg taacaaggtt tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta

Referencia:

Oliveira, D.A., B.P. Holloway, E.L. Durigon, W.E. Collins & A.A. Lal. 1995. Polymerase Chain Reaction and a Liquid-Phase, Nonisoiopic Hybridization for Species-specific and Sensitive Detection of Malaria Infection. Am J Trop Med Hyg 52(2): 139-144.

Ultima fecha de actualizaci6n: 28NllV99

ANEXO 6

CLONACION DEL GEN ADNr 185 DE PLAMODZZ/M W A X

Para descartar la posibilidad de la presencia de secuencias diferentes entre los parhsitos que se utilizaron para el diseilo de las sondas y los presentes en las muestras, se procedi6 a la clonaci6n del gen para su posterior secuenciaci6n,lo que permitira comparar arnbas secuencias. Para la clonaci6n del gen se realizaron los siguientes procedimientos:

1. PROCEDIMIENTOS GENERALES DE CLONACION . Extraccion de ADN de una muestra de sangre completa de un paciente con malaria por P. vivax (parasitemia +++), utilizando el k i t comercial de extraccion orghica IsoQuick (Orca Research, Cat. No. MXT-020-100) Amplificacion del gen completo de la region 185 (primers Dr. I r a Goldman). Amplificacion de una region interna del gen de la 185 (primers Dra. Oliveira). Purificacion de los productos de PCR a través del k i t comercial Wizard PCR Preps, DNA Purification System (Promega, Cat. No. A7170). Ligacion de productos purificados al plhmido vector pCR2.1 del k i t comercial TA Cloning K i t (Invitrogen, Cat. No. K2000-J10). Transformacion de bacterias cornpetentes (E coli modificadas -TOP10F4-) segun protocolo del k i t comercial TA Cloning K i t (Invitrogen, Cat. No. K2000-J10). Seleccion de clones transformados a través del método descrito por Liska, V. Y R. Ruprecht, 1999 (ver protocolo adjunto), con algunas modificaciones. Purificacion de clones transformados a través del k i t comercial QIAprep Spin Plasmid Miniprep K i t (QIAgen, Cat. No. 27104). Amplificacion por PCR de clones transformados (utilizando primers M l 3 forward and M l 3 reverse) para verificar peso molecular del inserto (ver protocolo adjunto). Andisis con enzimas de restriction del producto de la amplification para comparar productos obtenidos con los esperados (ver protocolo adjunto). Secuenciaci6n del inserto (Iaboratorios CDC, Atlanta, EEUU).

2. Preparacion Rapida del ADN de Plasmidos para Seleccion de Clones (Protocolo modificado del descrito por Liska, V. & R.M. Ruprecht, 1999)

a. Se agregan 30 uL de medio LB (Luria Broth) Iiquido en un tub0 conico de 0.5 mL, resistente al calor.

b, Se inocula cada tub0 con cada una de las colonias de bacterias que se presumen transformadas, utilizando un palillo de dientes. Simultheamente, se pica cada colonia escogida en una caja de Petri conteniendo medio LB solido y el antibiotico apropiado, para guardar una réplica de ese clon.

c. Se agrega a cada tub0 30 uL de una mezcla 1:l:l de fenoI:cloroformo:buffer de montaje (40% sucrosa, 100 mM EDTA, pH 8.0, 1% SDS, 0.25% azul de bromofenol y 1 ug/mL Rnasa). Se mezcla cada tub0 5 veces utilizando la micropipeta.

d. Se cierran los tubos y se centrifugan a 3250 rpm durante 10 min.

e. De la fase acuosa (superior) se cargan 15 uL en un gel de agarosa al 0.7%, conteniendo 0.1 ug/mL de bromuro de etidio. Se corre el gel a 80 volts por 1 hora y se visualizan las bandas bajo la luz UV. Se fotografia el gel.

f. PREPARACION DE SOLUCIONES:

f.1. Medio LB liquido (100 mL)

Base LB 1.55 g Agua destilada-desionizada . 100 mL .

f .2. Buffer de montaje (1 mL)

Sucrosa 0.4 g EDTA 0.5 M, pH 8.0 200 UL SDS (dodecil sulfato de sodio) 0.01 g Azul de bromofenol 0.0025 g Rnasa A (500 ug/mL) 10 UL Agua destilada-desionizada 800 UL

Referencia:

Liska, V. & R.M. Ruprecht. 1999. Rapid Minipreparation of Plasmid bNA for Screening Multiple Colonies. BioTechniques, 26(1):66-68.

3. PCR Para la Amplification de Insertos en E. coli con los Primers Universales Ml3 forward y M l 3 reverse

a. Para amplificar el inserto clonado dentro de bacterias E col/ transformadas (TOPlOF') se prerara la siguiente mezcla (50 uL) de PCR por cada clon a analizar:

React ivo (concentracion del stock)

Plasmido purificado en dilucion 1:10 Primer Ml3 forward (20 pmoles/uL) g t cgt qac tqg qaa aac Primer M l 3 reverse (20 pmoles/uL) cag gaa aca qct atg ac DNTP's, solucion stock (2.5 mM d u ) Taq (5u/uL) Buff er 10X Hz0

Volumen por cada muestra

(uL) 1 1

1

4 0.4 5

37.6

b. Se agregan dos gotas de aceite mineral a cada tubo y se realiza el PCR de acuerdo al siguiente programa siguiente (termociclador Perkin-Elmer):

c. biez microlitros de producto de PCR se mezclan con 2 uL de colorante (loading buffer, Sigma) y se separan en un gel de agarosa al 1% en TB€ lx, conteniendo bromuro de etidio (1:32000). La electroforesis se realiza por 1 hora a 80 volts y luego se fotografia el gel con luz UV.

Etapa besnaturalizacion inicial

35 ciclos besnaturalizacion Hibridacion Extension Extension final

d. PREPARACION bE SOLUCIONES:

d.1. Buffer TBE 10X

Temperatura ( O C )

94

94 45

. 72 . 72

Tris base 108.00 g Acido Borico 55.00 g EDTA 0.5 M, pH 8.0 40.00 mL (7.44 g de EbTANa2.2H20 en 40 mL, se ajusta el pH con hidroxido de sodio en perlitas). Agua destilada desionizada hasta los 1000 mL

Tiempo 5 min

30 seg 30 seg

1 min, 30 seg

min

4. Anhlisis de Restriccion con la Enzima Alu I

a. Para cada producto de PCR se prepara la siguiente mezcla de digestion (20 uL):

b. Esta mezcla se deja digerir toda la noche a 37°C en baiio de agua.

Reactivo (concentracion del stock)

Producto de PCR Buff er 10X AIU r BSA 10X (Albumina bovina sérica) Hz0

Volumen por cada muestra

(uL) 2 2

0.5 0.2 15.3

Los productos de la digestion se corren en un gel de poliacrilamida al 8%. Inicialemente, se Iimpia el sistema de vertida del gel, vidrios y espaciadores (Miniprotean II, Bio-Rad) utilizando metanol absoluto.

A continuacion se prepara el gel de la forma siguiente:

Solucion stock de acrilamida/bis-acrilamida 38.5% 2.52 mL Buffer TBE 10X 0.60 mL Glicerol 0.60 mL Agua destilada 8.28 mL Persulfato de amonio 25% . 12 UL

Esta solucion se degasifica durante 15 min en chmara al vacio y a continuacion se agregan 12 uL de TEMED (N,N,N1,N'-tetrametiletilendiamino). Se mezcla e inmediatamente se vierte la solucion entre los vidrios y se coloca el molde para la formacion de los pozos, cuidando que no se formen burbujas. Se deja polimerizar por 45 min.

Se ensamblan los geles en el porta-electrodo y en la ccimara interna, se vierte buffer de corrida (TB€ lx). Las muestras se preparan mezclando 5 uL de muestra con 2 uL de buffer de corrida; de los marcadores de peso molecular se utilizan 2 uL. Se cargan las muestras y los marcadores de peso molecular en el gel.

Se arma la ccimara de electroforésis, se llena con buffer de corrida, se coloca una barrita magnética en el interior y se pone sobre el agitador magnético, dentro de un ban0 de hielo.

Se corre el gel a corriente constante (8 mA) durante aproximadamente 1 hora.

Se desarma el sistema, se separan los geles de los vidrios y se procede a la tincion con plata.

Para la tincion se colocan los geles por 3 min en solucion fijadora. A continuacion se colocan en solution para coloracion durante 5 min.

Se lavan dos veces por 20 seg cada vez y una vez por 2 min con agua destilada- desionizada.

Posteriormente se colocan los geles en solucion reveladora hasta que aparezcan las bandas. Para parar la reaccion se colocan los geles por 2 min. en solucion fijadora y luego por 10 min en agua destilada-desionizada.

m. Se fotografia el gel utilizando pelicula blanco-negro.

n. PREPARACION DE SOLUCIONES:

n.l. Buffer TBE 10X

Tris base 108.00 g Acido B6rico 55.00 g EDTA 0.5 M, pH 8.0 40.00 mL (7.44 g de EDTANa2.2H20 en 40 mL, se ajusta el pH con hidroxido de sodio en perlitas). Agua destilada desionizada hasta los 1000 mL

. n.2. Soluci6n stock de acrilamida/bisacrilamida 38.5% (500 mL)

Acrilamida 187.5 g Bis-acri lamida 5.0 g Agua destilada-desionizada 500.0 mL

n.3. Soluci6n fijadora (500 mL)

Etanol95% 52.5 mL Acido acético glacial 2.5 mL Agua destilada-desionizada hasta 500 mL

Nitrato de plata 0.6 g Soluci6n f ijadora 300 mL

n.5. Solucion de revelado (200 mL)

Hidroxido de sodio 6 9 Formaldehi'do 6 mL Agua destilada-desionizada hasta 200 mL

Ultima fecha de actualizaci6n: 23B(i/1999

ANEXO 7

PCR PARA AMPLIFICACION DEL GEN CS DE PLASMODIUM VIVAX (Segun Shoukat Quari, personnal communication )

1. EXTRACCION La extraccion de las muestras se realizo utilizando el kit comercial IsoQuick (ORCA Research).

2 . PCR

a. Amplification del gen completo de la region de Circumsporozoite Surface Protein ( CS). El DIAGRAMA 1 del ANEXO 8 muestra la posicion donde hibridizan los prirners empleados. Antes de preparar la mezcla de PCR se dejan todos los materiales y reactivos bajo una l h p a r a de luz ultravioleta por 15 min. A continuacion, se prepara la mezcla de la forma siguiente:

Mezcla : volumen final: 50 uL

(concentracion del stock)

b. Se realiza el PCR de acuerdo al siguiente programa (termociclador Genius):

Etapa Desnaturalizacion inicial

10 ciclos Desnaturalizacion Hibridacion Extension

20 ciclos Qesnaturalizacion Hibridacion

Extension

Extension final

Temperatura (OC) 94

94 3 7 68

94 3 7 68

68

Tiempo 2 min

10 seg 30 seg 2 min

10 seg 30 seg

2 min extendido 20 seg / ciclo

7 min

c. Amplification de una region interna del fkagrnento completo de Circumsporozoite Surface Protein (CS) amplificado en los pasos anteriores. Se prepara la reaccion del segundo PCR asimétrico de la siguiente forma:

d. Se realiza el PCR de acuerdo al siguiente programa (termociclador Genius):

e. Diez microlitros de producto de PCR se mezclan con 2 uL de colorante (loading buffer, Sigma) y se corren en un gel de agarosa al 1% en TBE lx, conteniendo bromuro de etidio (l:32000). Se corre por 1 hora a 80 volts y luego se fotografia con luz UV.

Etapa Desnaturalizacion inicial

10 ciclos Desnaturalizacion Hibridacion Extension

20 ciclos Desnaturalizacion Hibridacion

Extension

Extension final

Temperatura (OC) 94

94 37 68

94 3 7 68

68

Tiempo 2 min

10 seg 30 seg 2 min

10 seg 30 seg

2 min extendido 20 seg / ciclo

7 min

f. PREPARACION DE SOLUCIONES:

f. 1. Buffer TBE 10X

Tris base 108.00 g Acido Borico 55.00 g EDTA 0.5 M, pH 8.0 40.00 mL (7.44 g de EDTANa2.2H20 en 40 mL, se ajusta el pH con hidroxido de sodio en perlitas). Agua destilada desionizada hasta los 1000 mL .

Referencia:

Oliveira, D.A., B.P. Holloway, E.L. Durigon, W.E. Collins & A.A. Lal. 1995. Polymerase Chain Reaction and a Liquid-Phase, Nonisotopic Hybridization for Species-specific and Sensitive Detection of Malaria Infection. Am J Trop Med Hyg 52(2): 139-144.

Ultima fecha de actualizaci6n: 23NIW1999

ANEXO 8

DE'TECCION DE PRODUCTOS DE AMPLIFICACION DE LA REGION CS DE PLASMODIUM VlVAXA TRAVÉS DE ELISA NO RADIOACTIVO

(segun Oliveira et al, 1995 con rnodificaciones).

1. Procedimiento ELISA

1. Se cubren las placas de microtitulacion E.I.A.1R.I.A. (Costar, fondo plano) con 100 uWpozo de una solucion de 2ng/uL de albumina bovina sérica biotinilada, en PBS (24 uL stock BSAl12 mL PBS lx) . Se incuba a 4°C toda la noche.

2. Las placas se lavan tres veces por tres min. cada vez con una solucion de PBSITween 20 0.05%.

3. Se saturan las placas con 100 uL de una solucion de 10 ng/uL de streptavidina en buffer de ensayo (1 10 uL stock streptavidina -1mgfmL-Ill mL buffer de ensayo). Se incuban 1 h a 37°C.

4. Se lavan las placas como anteriormente y se pueden utilizar inmediatamente O alrnacenar a -20°C.

5. Se agregan 5 uL de productos de PCR a tres diferentes soluciones de 100 uL de buffer de hibridacion, por duplicado, cada una conteniendo una concentracion fuial de 200 ng/mL de cada sonda especifica para cada tipo, ademas de controles negativos ( sangre de personas que no tienen malaria y agua como control de los reactivos) y controles positivos (p!asmidos) del tipo 1 y II:

Plasmodium vivax tipo 1 AL 1 16 Dig (stock 100 ng/uL) Plasmodium vivax tipo II AL 114 Dig (stock 100 ng/uL) Plasmodium vivax-like AL 240 Dig (stock 100 ng/uL)

Secuencias de las sondas: AL 116 Dig (tipo 1) 5'-GGTGATAGAGCAGATGGA-3' AL 114 Dig (tipo II) 5'-ATCAACCAGGAGCAAATG-3' AL 240 Dig (vivax-like) 5'- AGGTGGAGCAGCAGC-3'

El DIAGRAMA 1 muestra la posicion de hibridizacion de las sondas empleadas para la visualizacion de los productos de amplification.

6. Se desnaturaliza a 95°C por 5 min y se hibridiza a temperatura ambiente por 30 min.

7. Luego la placa de microtitulacion se incuba a 37°C por 1 h.

8. Se lavan las placas tres veces por 3 min. cada vez con solucion de lavado.

9. Se agregan 100 uLIplaca de una solricion de fragment0 Fab anti-digoxigenina-peroxidasa en buffer de ensayo a una dilusion 1:5000. La solucion restante se guarda como control para ser probada con la solucion de sustrato. Se incuba la placa a 37°C por media hora.

LO. Se lavan las placas tres veces por 3 min. cada vez con solucion de lavado.

11. Se agregan 75uL/pozo de solucion de 3,3',5,5'-tetramethyl-benzidina (TMB, 4giL en buffer de citratos, conteniendo 0.02% de H202) y, después de 10 min, se detiene la reaccion con 75uLIpozo de acido fosfbrico 2 M.

12. Se leen las placas con una lectora de placas de microtitulacion a 450 nm.

13. El promedio de las absorbancias de cada muestra se compara con un punto de corte que se obtiene mediante la formula: [X normales + ( t 95%n-1 x DS )] para saber si es positivo O negativo. Se calcula un punto de corte para cada placa.

II. PREPARACION DE SOLUCIONES (para 24 muestras = 1 placa de microtitulacion)

1. Solucion Reguladora de Fosfatos 1 X (pH 7.4) - 1 X 1 OX

KC12.7 mM 0.20 g 2.00 g NaCl 137 mM 8.00 g 80.00 g KH2P04 0.20 g 2.00 g NaHP04 1.10 g 1 1 .O0 g

Se disuelven las sales en 800 mL de agua destilada-desionizada, Se ajusta el pH a 7.4 y se afora a 1 L. Puede esterilizarse y alrnacenarse entre 2 - 8 OC.

2. Solucion de Lavado (1 L) -

Solution reguladora de fosfatos 10 X Tween 20 Agua destilada desionizada

3. Solucion de ensayo -

PBS l x Gelatina Tween 20

Se disuelve la gelatina en el PBSITween.

4. Solucion SSC 4 X (100 mL) -

NaCl 0.15 M Citrato de sodio, 0.0 15 M

Se disuelven las sales en 100 mL de agua destilada-desionizada.

5. Solucion de Hibridizacion (20 (12

Solucion SSC, 4 X - HEPES, 20mM

EDTA, 2 mM Tween, 20 0.15% Agua destilada-desionizada

Se preparan dos soluciones (una para cada pool de sondas) conteniendo cada una 200 ngtrni, de cada una de las sondas, en buffer de hibridizacion

6 . Acido fosfbrico, 2 M (500 mL)

Acido fosforico (8596, 1.685g/mL) Agua destilada-desionizada

En campana de extraccion, muy lentamente, se agrega el hcido fosforico al agua y se agita bien.

7. Solucion de coniugado ( 1 2 mL)

Fragment0 Fab anti-digoxigenina-peroxidasa Solucion de ensayo

8 . Solucion de sustrato -TMB Microwell Peroxidase Substrate systém, Kiekegaard & Perry- ( 1 0 mL)

Solucion TMB ( 0 . 4 g/L) Solucion de peroxidasa (0.02% H 2 0 2 )

Se dejan estabilizar las dos soluciones a temperatura arnbiente y se mezclan. La solucidn debe pennanecer de color claro.

Referencia:

Oliveira, D.A., B.P. Holloway, E.L. Durigon, W.E. Collins & A.A. Lal. 1995. Polymerase Chain Reaction and a Liquid-Phase, Nonisotopic Hybridization for Species-specific and Sensitive Detection of Malaria Infection. Am J Trop Med Hyg 52(2):139-144.

Ultima fecha de actualizacibn: 23NlIV99

DIAGFUMA 1. Secuencias esperadas del gen CS de Plasmodium vivax y los tipos detectados usando las sondas publicadas por Oliveira et al. 1995, de acuerdo con la variacion en los fragmentos repetitivos.

A. Plasmodium vivax CS Tipo 1 Ml1926 GI:160166

Primer Al 60 Primer Al 61 @dda@ A*L .-% -a l$6&@$ a*er - Sitios de union = 10 (1 completo, 9 incompletos por

5 y 7 bases)

1 ctgcataagg caaactcaca aacatccaaa aaaatataca tatatatatt tatatacacg 61 tgtatatatt attaagcggc ttaagttaag caagcaaaac agccaaaggc ctacaagtgt

12 1 aaacagcttc ctgcacacac gtatatacca gaacaagatg aagaacttca ttctcttggc 18 1 tgtttcttcc atcctgttgg tggacttgtt ccccacgcac tgcgggcaca atgtagatct 24 1 gtccaaggcc ataaatttaa atggagtaaa cttcaataat gtagacgcca gttcacttgg 30 1 cgcggcacac gtaggacaaa gtgctagccg aggcagagga cttggtgaga acccagatga 36 1 cgaggaagga gatgctaaaa aaaaaaagga tggaaagaaa gcagaaccaa aaaatccacg

,&*vgt* w> u

42 1 tgaaaataag ctgaaacaac GC' -- caggagac&E " A &Eca&gg,% cagccagcag gagactygï~;,~ "+ \ Y

48 1 agaggacag ccagcaggig a t a g a ~ ~ ~ g ~ ~ g ~ a c a a c c a gcaggagata W . gagcagctgg Wu.-

54 1 acaaccagca ggagaGgR kafatgggaca gccagcagga *- - g a c a g a s g " a"gacagcc 60 1 agcaggagac aeag9aj$tg &caaccagc aggagacaga g&ga&g& aaccagcagg 66 1 tgatagagca gctggacaac cagcaggtga tagagcagct ggacaaccag caggaga'%g

r - è . ; . 72 1 agcaaakg8a cagccagcag gagatagagc agctggacag ccagcaggag a@igc@

W T ~ - 78 1 tg@cagcca gcaggagata gagcagctgg acagccagca ggag;a@g<yg cag&&ca 84 1 gccagcagga gatagagcag ctggacagcc agcaggagat agagcagctg gacagccagc 90 1 aggagataga gcagctggac agccagcagg agatagagca gctggacagc cagcaggaaa 96 1 tggtgcaggt ggacaggcag caggaggaaa cgcaggagga ggacagggac aaaataatga 102 1 aggtgcgaat gccccaaatg aaaagtctgt gaaagaatac ctagataaag ttagagctac 108 1 cgttggcacc gaatggactc catgcagtgt aacctgtgga gtgggtgtaa gagtcagaag 1 14 1 aagagttaat gcagctaaca aaaaaccaga ggatcttact ttgaatgacc ttgagactga 120 1 tgtttgtaca atggataagt gtgctggcat atttaacgtt gtgagtaatt cattagggct

- 126 1 agtcatattg ttagtcctag cattattcaa ttaagtagct gacatccatt attttcggcg 132 1 tcctccacgg tgcatattaa gtgttttgtg ttttgtacat gcacataaat acttgcccgt 13 8 1 agggacatga tttttttccc tttcttatga atgttccctg ctgtttgcac gtaactgtat 144 1 gtacgtgcgc gtaaggcata gtaagtaaca cctcttacac attatgcgct tacgcacaat 1501 cagttgtgca attctagaaa acacgatatg agtattttta aacacttatc gtccaaaaaa 156 1 acaaaaaaaa cagaaaaaac agaaaaaaca gaaaaaacaa aaaaaaacaa aaaaaaacaa 162 1 aaaaaaacaa aaaaaacaca tttatattaa cttttccttt ttgattgacc cttttttgac 168 1 gtatattttt tttttttttt cgtatgtatt atatatactg cttaacgtag agaacttaaa

1 74 1 ttttgagaat gtattttttt ttaacaagtt aaaaaaagaa ctggtatttt tgggaattca 1 80 1 aaaaatttgc aaattcaaaa gaggcgagtt aaaatttgcg ccgtggcaaa cggggtgcgt 186 1 gcgggagtcg tgcaaatgtg gcttatatcc ggggg

//

B. Plasmodium vivax CS tipo I I S48805 GI: 260098

@$@&1142&91 Sitios de union = 2 (todos completos)

kt@. c a z @ 3 P M - v sw@ r *al -Pb

1 gcaaatgggg ctggcaaga acghga'gba * t g g c t g gc&F&g@ $w&,I"j 6 1 ggagcaggtg atcaaccagg a

//

C. Plasmodium vivax-like / (clone P21114)

Primer Al 60 Primer Al 61 - -

Sonda A1 240 ,aVivax-like Sitios de union = 13 (todos completos)

1 atgaagaact tcattctctt ggccgtttct tccatcctgt tggtggactt gttccccaca 6 1 cactgcgggc ataatgtaga tctctccagg gccataaatt taaatggagt aagcttcaat

12 1 aatgtagacg ccagttcact tggcgcacga caggtaagac aaagtgctag ccgaggcaga 18 1 ggacttggtg agaacccaaa agacgatgaa aaagctgata aaccaaaaaa aaaggacgaa 24 1 aaaaaagtag aaccaaaaaa gccacatgaa aataagctga aacaaccagt cccaggagca 3 0 1 aatcaggaag gcggagcagc agccccagga gcaaatcagg &Eh$# $f@ h e c c c a

\-~g*"WBa-+~ :* Y

3 6 1 ggtgcaaatc agg&fgs ag@@a@fc i,i/+$*w ccag e gcaa accagg~*&&i&g 42 1 gcccaggag caaaccagga ar@ggagca d c c c a g gagcaaatca ggaaggcgga 48 1 gcagcagccc caggagcaaa tcaggaagf$ g&ffc&e&- ccccaggtgc aaaccaggaa 54 1 ggtggagcqg cagccccagg agcaaaccag gaaggcggag cagcagcccc aggagcaaat 601 caggaaggcg gagcagcagc 66 1 gcaaaccagg aa&tggagc 72 1 ccaggagcaa accaggga& 78 1 &aBaccag gagcaaacca

$- 84 1 Bgagdaggag pccaggagc aaaccaggga ggtgcaaagt cagcaggagg acagggacaa 90 1 aataatgaag gtgcgaataa gccagatgaa aagcatgtga aagaatacct agagaaaatt 96 1 agatctaccg ttggcaccga atggactcca tgcagtgtaa cctgtggaaa gggtgtaaga 102 1 gttagaagaa aacttagtgc aggtgacaaa aaaccagata agcttactct gaatgacctt 108 1 gaggcagaag tttgtacaat ggataagtgc tctggcatat ttaacgttgt gagtaattca

'-

1 141 ttagggctag tcatattgtt agtcctagca ttattcaatt aa //

AMPLIFICACION DEL GEN MSP-1 DE PLASMODIUM VIVAX Y DETECCTION DE POLIMORFISMO DE LA REGION P5

I V . MATERIALES Y METODOS

A. METODOS

NOTA: La forma de preparacion de las soluciones mencionadas en el método, aparece detallada

en la seccion de apéndice D.

1. COLECTA DE MUESTRAS . .

La toma de muestras se hizo durante julio de 1995 hasta mayo de 1996, en la aldea El

Semillero, localidâd del municipio de Tiquizate. departamento de Escuintla, Guatemala. Para la

toma de muestras se hizo un pinchazo con lanceta en el dedo, se tomo una gota de sangre y se

puso sobre un portaobjetos para hacer el diagnostico de malaria. El diagnostico se hizo por una

tincion con Geimsa. Ademas se pusieron tres gotas de sangre de aproximadamente 100 pl cada

una, sobre papel filtro. Después de ser secada al aire e identificada, cada tira de papel filtro con

sangre se guardo en una bolsa plastica individual. Las muestras se mantuvieron a temperatura

ambiente en una desecadora con silica gel por varios meses en el laboratorio en la ciudad de

Guatemala. Este procedimiento de colecta de muestras se hizo para cada paciente en varios dias:

el dia cero (dia que se diagnostico la enfermedad y se empezo con el tratamiento), dia 3, dia 7, dia

14, dia 28,3 meses, 6 meses y 8 meses después.

2. EXTRACCION DE ADN DE P. vivax

2.a. METODO CHELEX-PROTEINASA K

Se corta con tijeras y pinzas la gota de sangre sobre papel filtro. Se coloca la gota de

sangre sobre papel en tubos de 1.5ml y se agrega 1 ml de saponina 0.5% en PBS. Se deja

incubando a 4°C toda la noche.

Se aspira la solucion café y se reemplaza con 1 ml de PBS, se incuba a 4°C durante 15-30

min. Se aspira el PBS, dejando por Io menos 50 pl de solucion y se macera con pistilos estériles.

Se agregan 200 pl de solucion de extraccion de ADN y se incuba por 2 horas a 50°C. Se agregan

20 pl de solucion de chelex al 50% y se mezcla en vortex durante treinta segundos. Se colocan

los tubos en un bloque térmico a 100°C por 30 min. (mezclando brevernente durante y despues de

la incubacion). Se centrifuga a 10,000 g por 2 min (a temperatura ambiente) y se recobra el

sobrenadante. Se pone el sobrenadante en un tubo nuevo y se centrifuga bajo las mismas

condiciones anteriores. colectando el sobrenadante en un tub0 nuevo.

Se hace una precipitacion de ADN con etanol, agregando acetato de sodio 3M para lograr

una concentracion de 0.3M (aprox. 16.6~1 para 150~1) y dos voliimenes de etanol absoluto frio. Se

deja precipitando a 4°C durante toda la noche. Se centrifuga por 10 min a 14,000 rpm y 4°C y se

descarta el sobrenadante. Se agregan 500 pl de etanol al 70% frio, se centrifuga por 5 min a

14,000 rpm y 4"C, se descarta el sobrenadante y se deja secar. Por ultimo, cuando ya esté seco,

se agregan 20 pl de solucion de TE y se mezcla fuertemente (dejando reposar toda la noche a

4°C).

. . *" Para las muestras que no se logran amplificar por PCR utilizando el ADN molde extraido por el

método anterior, se procede a hacer la extraccion siguiente:

2.b. METODO FEN0L:CLOROFORMO

Se agrega un volumen de fenol:CHC13 :alcohol isoamilico (25:24:1) a la solucion de ADN

concentrado, mezclando en el vortex a grado 3 por 5 min. Se centrifuga por 10 minutos a 12,000

rpm y temperatura ambiente, se transfiere el sobrenadante a un tubo nuevo cuidando de no

aspirar la fase organica que se encuentra debajo de la acuosa (la que contiene el ADN).

Se vuelve a extraer la fase acuosa con un volumen de CHC13:alcohol isoamilico (24:l) de la

misma forma que la extraccion anterior. A la fase acuosa (sobrenadante) se le hace una

precipitacion de ADN con etanol, como se indica en el procedimiento 2.a.

3. AMPLlFlCAClON DE ADN

REACCION DE PCR

Se hace la mezcla de reaccion para el total de tubos que se van a preparar. La mezcla

debe contener cada reactivo en las proporciones indicadas en el cuadro 8 del apéndice D. Se

ponen 50 pl de esta mezcla por tubo y agregan 3 gotas de aceite mineral estéril. Los tubos con la

mezcla anterior se ponen bajo luz UV por 10 min., se agrega el ADN molde y se introducen en el

termociclador. Para agregar la enzima Taq se realiza un "hot start" PCR y se deja correr el

programa de amplification (cuadro 9 del apéndice D). Los productos de PCR obtenidos se guardan

a -20°C.

Nota: si el resultado del PCR obtenido con estas proporciones de reactivos es negativo, entonces

se procede a aumentar la cantidad de ADN molde O de magnesio.

4. DETECCION DE PRODUCTOS DE PCR

Se prepara un gel de agarosa al 1 % en TBE (incorporando el bromuro de etidio a la mezcla

del gel). Se mezcla 2 pl de buffer de montaje y 10 pl de producto de reaccion de PCR y se pone

esta mezcla en un pozo del gel, cargando el nijmero de muestras que sea necesario.

Dejar correr la electroforesis por una hora a 80 V, ver el gel final bajo luz UV y tomar

fotografia.

5. SSCP

5.a. PREPARACION DEL GEL 8% ACRILAMIDA

Preparar un gel de acrilamida al 8% (apéndice D) y dejar polirnerizar.

5.b. PREPARACION DE LA MUESTRA

Se mezcla 4p1 de producto de PCR y 9p1 de buffer de desnaturalizacion, se calienta a 95°C

por 3 min y se pasa inmediatamente a hielo por 5 min. Se carga 8pI de la mezcla por pozo.

Para correr el gel, se pone en un ban0 de hielo con agitacion constante. Se corre a 8mA,

corriente constante y voltaje maximo, usando amortiguador TBE 0.5X.

5.c. TlNClON DEL GEL CON PLATA

El gel se remoja agitando con 200 ml de acido acético al 10% por 30 min. Se lavan los

geles 4 veces agitando, 2 minllavado, con 250 ml de ddHzO por lavado. Luego se incuba agitando

por 30 min en 150 ml de la solucion de tincion (AgN03), después se lava el gel agitando por 15 seg

con 250 ml de ddH,O.

Por ultimo el gel se incuba, con agitacion constante, en 150 ml de solucion de revelado fria

(aprox. 10°C). Las bandas aparecen unos pocos minutos después y la reaccion se detiene

agregando acido acético al 10%. El gel se pone entre papel filtro y pldstico y se deja en el secador

de geles por una hora y media.

6. SECUENCIACION

Los productos de PCR son purificados con el kit DNA Purification System Wizard PCR

Preps de Prornega. Al final del procedirniento se hace una precipitacion con etanol y se deja secar

al aire.

Los productos de PCR purificados son enviados para ser secuenciados a:

Macromolecular Resources

Colorado State University

Department of Biochernistry, 355 MRB . .

Fort Collins, CO. 80523

B. MATERIALES

1. EQUIPO

- Beakers de 40,80, 100,250 y 500 ml

- Erlenmeyers de 125 y 500 ml

- Probetas de 10,50, 100 y 500 ml

- Frascos Wheaton de 125, 250, 500 y 1,000 ml

- Pipetas Pasteur

- Bulbos para pipeta

- Pipetas desechables Falcon de 1,2, 5, 10 y 25 ml

- Filtros Nalgene

- Termometro

- Cronornetros

- Pisetas

- Guantes

- Espatulas

- Frijoles magnéticos

- 'Kimwipes

- Desecadora

- Parafilm

- Papel alurninio

- Papel encerado

- Marcadores para tubos marca Sigma

- Lancetas MediPoint

Toallitas con alcohol Kendall Webcol

Papel filtro Schleicher and Schuell # 903

Bolsas plasticas

Tijeras

Pinzas

Tubos Eppendorf de 0.5 y 1.5 ml

Micropipetas de 2, 10, 20, 100, 200 y 1,000 pl

Puntas para micropipeta de 0.5-10, 0.5-20, 40-200 y 50-1,000 11

Puntas bloqueadas para micropipeta de 0.5-7 0, 0.5-20,40-200 y.50-1,000 pl

Descarte de puntas

Gradillas para tubos Eppendorf +

Tubos conicos de 12 ml Falcon

Pistilos

Camara de electroforesis marca Fotodyne, incluyendo moldes y peines

Film Polaroid 3000 ISO, 667

Sistema de electroforesis para geles de poliacrilamida marca BioRad

Vidrios para geles de poliacrilamida

Papel filtro para secar geles marca BioRad

Plastico para microondas marca Handy Wrap

DNA Purification System Wizard PCR Preps de Promega

2. APARATOS

- Estufalagitador marca Corning

- Refrigeradora a 4°C

- Congelador a -20°C

- Vortex

- Autoclave

- Bano térmico Grant (20-90°C)

- Pipeteador automatico - Balanza analitica marca Mettler, modelo AE 163

- Balanza marca Sartorius

- Bloques térmicos

- Medidor de pH

- Centrifuga refrigerada marca Hettich, modelo EBA 12R

- Termociclador marca MJ Research, modelo PTC-100

- Fuente de poder marca Scotlab PANREAC

- Transluminador UV marca Fotodyne

- Sistema fotogrdfico marca Fotodyne, modelo MP-ST

- Agitador orbital marca Bellco Biotechnology

- Secador de geles rnarca BioRad, modelo 543

REACTIVOS (BM = Biologia Molecular)

Cloro comercial

Silica gel para desecadora marca Sigma

Alcohol absoluto Merck

Saponina Sigma

PBS Dubelco's Sigma

Proteinasa K marca Sigma para uso en BM

Trizma base marca Sigma para uso en BM

Trizma-HCI anhidro marca Sigma, grado reactivo

EDTA sa1 disodica dihidratada, rnarca Sigma para uso en BM

Dodecil sulfato de sodio (SDS, lauryl sulfate), marca Sigma uso en BM

Acido borico Sigma para uso en BM

Chelex 100 (acido iminodiacético), resina quelante marca Sigma

Acetato de sodio Merck

Fenol:cloroformo:alcohol isoamilico (25:24:1 v/v) ultra puro, rnarca GibcoBRE

Buffer 10X de reaccidn de la Taq ADN polimerasa con MgCl* , Promega

Deoxinucleotidos trifosfato (dNTPs) dATP, dCTP, dG'rP y dTTP, Promega

Oligonucleotido iniciador K2A 5'- TAC TAC TTG ATG GTC CTC -3' , Operon Technologies

Oligonucleotido iniciador K2B 5'- TTG TGA CAT GCG TAA GCG -3' , Operon Technologies

Aceite mineral rnarca Sigma para uso en BM

Taq ADN polimerasa donada por el Dr. Black

Agarosa para uso rutinario marca Sigma

Bromuro de etidio marca Fisher Biotech, grado de pureza para electroforesis

Buffer 6X de montaje para PCR marca Sigma

Marcadores de peso molecular para PCR (50-2,000 bp)marca Sigma

Hidr6xido de sodio marca Sigma y grado reactivo

~ o n & n i d a marca Sigma

Azul de bromofenol marca BioRad reactivo con pureza para electroforesis

Xileno cinole marca BioRad reactivo con pureza para electroforesis

Acrilamida marca BioRad reactivo con pureza de electroforesis

N,N'-metilen-bis-acrilamida marca Sigma

Glicerol marca Sigma

- Persulfato de amonio rnarca BioRad reactivo con pureza de electroforesis

- TEMED rnarca BioRad reactivo con pureza de electroforesis

- Acido acético rnarca Merck

- Nitrato de plata para analisis rnarca Meck

- Formaldehido al 37% rnarca Merck

- Carbonato de sodio anhidro rnarca Sigma, grado analitico

- Tiosulfato de sodio rnarca Sigma

1. Solucion PBS 1X

Disolver una pastilla de PBS Dubelco's Sigma en 1 litro de ddH20.

2. Solucion de extraccion de ADN

Amortiguador de reaccion: 0.01 M Tris (pH 7.8)

0.005 M EDTA

0.5% SDS

Al amortiguador de reaccion agregarle proteinasa-K . . (solution stock de 20 mglml en agua) para . . ajustar una concentracion final en la rnezcla de reaccion de 50 pglml.

3. Solucion TE

1.5760 g Tris-HCI

0.3722 g EDTA

Disolver en 1,000 ml de agua y llevar a pH 8

4. Mezcla de reaccion para el PCR

CUADRO 9

Primer K2A (100 PM)

Prlrner K2B (100 PM)

DNTPs (20 mM de du)

Buffer 10X

Taq (5 unidades/pl)

ddH10

TOTAL 50 PL

1 PM

0.2 mM (cada uno)

l x 1.5 unidades

0.5

0.5

5

0.3

43

I 5. Programa de amplificacion para el PCR

CUADRO 10 m PROGRAMA DEL TERMOCICLADOR PARA EL PCR

Termociclador marca MJ Research, modelo PTC-100

Desnaturalizacion

Hibridizacion l I

t 1 Extension 1 72 1 2 1

Soluci6n TBE 1X

TBE 10X (1 Lt): 108 g Tris-base

55 g acido borico

I 40 ml solucion EDTA 0.5M (pH 8)

Hacer una dilucion del TBE 10X con dH,O para ajustar una concentracion lx.

1 I

Gel de acrilamida al 8% 1 Mezclar :

I 2.52 ml solucion stock 38.5% acrilamida (1 87.5 g acrilamida, 5.0 g bisacrilamida en

500 ml de agua totales)

0.60 ml TBE 10X (concentracion final 0.5X) 1 0.60 ml glicerol (concentracion final de 5%)

8.28 ml ddH;?O

( 12.0 ml volumen total

Extensio final I 72

Filtrar la rrièzcla y degasificar con vacio. Agregar 12pl de TEMED y 12pl de persulfato de

l monio 25% plv (62.5mg en 250 pl ddH20). Verter inmediatamente en placas bien Iimpias.

10

I. Amortiguador de desnaturalizacion (SSCP)

( Solucion 90% formamida, 20 mM NaOH. 0.0590 a w l de bromofenol. 0.05% xileno cianol, en

jH20.

9. Solucion de tincidn con AgNOj

Solucion con 0.10% AgNO, y 0.1 5% formaldehido al 37%

Mezciar: O.15g AgNO.

225~1 formaldehido al 37%

1 150 ml dH20 (la solucion debe prepararse fresca y guardarse en la obscuridad)

10. Solucion de revelado . . . Solucidn con 3% de Na2C03, 0.15% formaldehido al 37% y 0.0002% tiosulfato de sodio

I Mezclar: 150 ml dHzO

4.59 Na2C03

225yl formaldehido al 37%

1.51.11 tiosulfato de sodio (0.225g10.5ml de H20)

(notar que los ultimos dos reactivos se agregan inmediatamente antes de usar la solucion)

I